Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции

Иванкова, Анна Викторовна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Иванкова, Анна Викторовна Казань 2010 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.03

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции

004616067

На правах рукописи

Иванкова Анна Викторовна

РОЛЬ ВИЧ-1 БЕЛКА NEF В ЦИТОКИН-ИНДУЦИРОВАННОЙ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСА И РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань-2010

- 2 лен 2070

004616067

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Бойчук Сергей Васильевич

доктор медицинских наук Мустафин Илыиат Ганиевич

доктор медицинских наук, профессор Цибулькин Анатолий Павлович доктор медицинских наук, профессор Фассахов Рустэм Салахович Российский государственный медицинский университет, г. Москва

Защита диссертации состоится « 26 » ноября 2010г. в 9 час. 30 мин. на заседании диссертационного Совета Д 208.034.01 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, корпус Б).

Автореферат разослан » ..

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

^^2010,

Л.Н. Залялютдинова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Патогенез ВИЧ-инфекции состоит из различных процессов (Cohén О, et. al., 1997), среди которых ведущая роль принадлежит расстройствам функциональных возможностей иммунной системы, включая ее клеточное звено - Т- и В-лимфоциты (Т-Лф и В-Лф), антиген-презентирующие клетки (АПК) и flp.(Espert L., et al., 2008)

У ВИЧ-инфицированных лиц на всех стадиях заболевания выявляются признаки хронической активации иммунной системы и нарушения, связанные с продукцией и секрецией цитокинов (Diamond D.C. et al., 1988; Biggs B.A. et al., 1995; Kedzierska K. et al., 2001; Fanales-Belasio E., 2010; Lañe H.C., 2010). В частности, происходит «переключение» работы от Т-хелперов первого типа (Т-helper 1, Thl), связанное со сниженным образованием интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (ИФН-у), на Th2, а именно увеличение секреции ИЛ-4, ИЛ-10, а также повышение продукции провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, и фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-а), что в свою очередь индуцирует репликацию ВИЧ-1 и, главным образом, экспрессию вируса посредством взаимодействия NF-kB с длинным терминальным повтором (LTR, long terminal repeat). Такая «нефизиологическая» продукция цитокинов нарушает клеточный иммунный ответ (Kedzierska К., et al., 2001).

Способность иммунокомпетентных клеток продуцировать вирус зависит от уровня Т-лимфоцитарной активности и стадии моноцитарно-макрофагальной дифференцировки (Zack J, et al., 1990; Sonza S. et al., 1996). Известно, что эффективная репликация вируса происходит в активированных CD4 Т-Лф (Korin Y.D, et al., 1998; Бойчук С.В., Мустафин И.Г., 2004). Одна из ключевых ролей в процессах активации и пролиферации Т-Лф in vivo отводится цитокинам (Granucci F., et al., 2001,2003).

Наряду с «дисбалансом» цитокинов, ведущим звеном в патогенезе ВИЧ-инфекции является гибель С04+Т-Лф. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что большинство С04+Т-Лф, подвергающихся апоптозу в периферической крови и лимфатических узлах у ВИЧ-1 инфицированных пациентов, являются неинфицированными клетками окружения (Cossarizza А., 2008; Espert L., et al., 2008; Lañe H.C., 2010; Lenassi M., et al., 2010). Запрограммированная гибель этих неинфицированных Т-Лф окружения получила название «эффекта байстэндер». Механизмы снижения абсолютного количества С04+Т-Лф остаются дискуссионными до настоящего времени. Это может быть обусловлено способностью вирусного белка Nef оказывать влияние на апотоз инфицированных и неинцицированных вирусом иммунокомпетентных клеток. В частности, имеется значительное количество исследований, которые указывают на участие ВИЧ-1 белка Nef в реализации «эффекта байстэндер» (Finkel Т.Н., et al., 1995; Katsikis P.D., et al., 1995; Muro-Cacho C.A., et al., 1995; Badley A.D., et al, 1998; Jekle A, et al, 2003; Yue F.Y, et al, 2005; Cossarizza A, 2008; Espert L, et al, 2008; Lenassi M, et al, 2010).

В настоящее время известно, что основные функции вирусного белка Nef направлены на эффективную вирусную репликацию (Federico M., 2008), обеспечение инвазивности ВИЧ-1 (Stewart S.A., et al., 2000; Geyer M., et al., 2001; Greene W.C., Peterlin B.M., 2002), а также поддержание жизнеспособности инфицированных Лф (Collins K.L., et al., 1998; Yokoyama W.M., 1998; Geleziiuias R., et al., 2001; Blagoveshenskaya A.D., et al., 2002; James C.O., et al., 2004; Lindwasser O.W., et al., 2007; Lane H.C., 2010).

Таким образом, в данном исследовании была предпринята попытка изучить влияние ВИЧ-1 белка Nef на репликацию ВИЧ-1 и процесс апоптоза Лф в условиях цитокин-опосредованной активации клеток.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение роли ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса, активации и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить способность ВИЧ-1 белка Nef влиять на цитокин-индуцированную репликацию вируса.

2. Исследовать влияние Nef на активацию инфицированных Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а).

3. Определить наличие или отсутствие зависимости между активацией инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дие/ (Nef-) Лф и репликацией вируса.

4. Изучить роль белка Nef в апоптозе лимфоцитов.

Научная новизна

Научная новизна работы состоит в том, что впервые исследовались свойства ВИЧ-1 белка Nef по его влиянию на репликацию вируса и апоптоз Лф в условиях цитокин-индуцированной активации клеток.

Впервые показано, что для высоких уровней репликации ВИЧ-1 in vitro в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), и, предположительно высоких вирусных нагрузок in vivo, необходимо наличие в структуре вируса белка Nef.

Научно-практическая ценность

Создание in vitro уникальной модели, отражающей основные этапы развития ВИЧ-инфекции в организме больного (в присутствии таких цитокинов, как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), необходимо для более детального изучения и понимания звеньев патогенеза ВИЧ-инфекции in vivo. Изучение способности вирусного белка Nef обеспечивать защиту от гибели продуктивно инфицированных Лф и напротив, индуцировать апоптоз неинфицированных

(«байстевдер») клеток в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), впервые позволило оценить значимость совместного участия цитокинов и данного белка в патогенезе ВИЧ-инфекции in vitro.

Полученные данные могут стать основой для последующих исследований и разработок более эффективных путей элиминации ВИЧ-1 из организма пациента, а также создания новых средств терапии ВИЧ-инфекции и СПИДа.

Основные положения дисссртации, выносимые на защиту

1. Способность ВИЧ-1 белка Nef усиливать репликацию вируса в лимфоцитах обусловлена их преактивацией цитокинами, в первую очередь, ИЛ-7 и ИЛ-2, затем по убыванию ИЛ-4 и ФНО-а.

2. ВИЧ-1 белок Nef поддерживает жизнеспособность продуктивно инфицированных лимфоцитов (клеток с активной вирусной репликацией) в наибольшей степени в условиях преактивации клеток ИЛ-2 и ИЛ-7 в то же время, индуцируя табель неинфицированной популяции лимфоцитов по механизму апоптоза в присутствии цитокинов - в первую очередь, ФНО-а, затем ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-2.

Личный вклад диссертанта

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных результатов достигалась путем проведения достаточного количества экспериментов. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программ Microsoft Excel для Windows 2003 и BIOSTATISTICA (S. A. Glantz, McGraw Hill). Результаты анализировались с использованием параметрических и непараметрических критериев. Уровень статистической значимости (р) считали < 0,05. Корреляционный анализ производился с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г).

Сведения об апробации результатов диссертации

Материалы дисссртации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (2008,2009,2010 гг.), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009г.), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 85-летию создания кафедры инфекционных болезней КГМУ, «Актуальные вопросы инфектологии» (Казань,20 Юг.), совместном заседании кафедр патофизиологии, клинической иммунологии с аллергологией ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», аллергологии и иммунологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росздрава», сотрудников Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ (Казань, 2010 г.).

Публикации материалов исследования

Результаты диссертационного исследования отражены в 13 научных работах, в том числе 2 статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций - 2,0 у.п.л., в том числе авторское участие —1,2 у.п.л.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (для преподавания раздела «Иммунодефицита. Особенности врожденного и адаптивного иммунитета»), кафедры клинической иммунологии с аллергологией (для преподавания раздела «Молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета») ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», а также в лаборатории иммунологии для культивирования клеточных культурх и инфицирования их ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дrief (Nef-) штаммами по разработанной методике.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 236 источника, из которых 223 зарубежных авторов. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 35 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования

Выделение и культивирование лимфоцитов периферической

крови

Объектом исследования явилась венозная кровь 30 здоровых доноров (17 мужчин, 13 женщин) в возрасте от 25 до 50 лет. До взятия биологического материала после разъяснительной беседы от всех испытуемых было получено письменное добровольное согласие на участие в исследовании, которое проведено с разрешения Локального Этического Комитета ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию» (выписка из протокола Бюро №1 от 01 июля 2009г.). Перед забором крови донорам проводились общеклинические, вирусологические и серологические анализы. Предметом исследования являлись лимфоциты (Лф), выделенные из венозной крови.

Лимфоциты выделяли центрифугированием на градиенте плотности Фиколл-Пака («Sigma», в соотношении крови и раствора 2:1) в течение 30-ти минут, 1500 об/мин., при комнатной температуре. В стерильных условиях ламинарного бокса («Labconco», США) мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) в концентрации 500 х 103/мл вносили в лунки 24-х луночных плоскодонных планшетов («Orange scientific», Бельгия) в среду RPMI 1640 с добавлением L-глутамина («Биолот», г.Санкт-Петербург), эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», г.Санкт-Петербург), и

антибиотиков («Sigma», США). В клеточные культуры вносили цитокины в концентрациях: ИЛ-2 («Sigma», США) - 10 ME/мл, ИЛ-4 («Biosource», USA) -3 нг/мл, ИЛ-7 («National Cancer Institute», США) - 15 нг/мл, ФНО-а («Biosource», США) - 2,5 нг/мл. Использованные концентрации цитокинов были определены с помощью литературных данных (Unutmaz D., et al., 1994, 1995, 1999; Smithgall M.D., et al., 1996; Chun T.W., et al., 1998; Steffens C.M., et al., 2002; Ducrey-Rundquist О., et al., 2002; Wang F.X., et al., 2005; Бойчук C.B. с соавт., 2006). Клетки культивировали в течение 11-ти дней в С02-инкубаторе («Joan», США) при 37°С.

Культивирование лимфоцитов периферической крови, инфицированных

ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Anef(Nef-)

МНПК культивировали в плоскодонных 24-х луночных планшетах с целью последующего моделирования ВИЧ-инфекции in vitro. Инфицирование клеточных культур производили непосредственно в 1-й день, через 2 часа после внесения цитокинов. Для инфицирования клеточных культур использовался лабораторный штамм ВИЧ-1 NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, США), далее именуемый как ВИЧ-1 (Nef+), и его рекомбинантное производное, содержащее делецию гена nef (далее ВИЧ-1 Дnef (Nef-)). Инфекционная доза в обоих случаях была эквивалентной и составляла 1000 пкг/мл (характеризует содержание в среде RPMI 1640 сердцевинного белка вируса p24sas). Культивирование инфицированных BH4-l(Nef+) и ВИЧ-1 Дnef (Nef-) клеточных культур осуществляли тем же методом, что и неинфицированных в течение 11 -ти дней (см. описание выше).

Изучение репликации BH4-I(Nef+) и ВИЧ-1 A nef (Nef-) in vitro

Репликацию вируса в инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 A nef (Nef-) клеточных культурах оценивали на 3, 6-й, 9-й и 11-й день культивирования по содержанию сердцевинного вирусного белка р24вщ (пкг/мл) в супернатантах культур методом иммуноферментного анализа (ИФА). Применялась тест-система «ДС-ИФА-ВИЧ-АГ-скрин» («Диагностические системы», г. Нижний Новгород), по методике производителя. Также в целях установления концентрации белка p24sa® в супернатантах культур использовали стандарт, с концентрацией данного белка 11 нг/мл («Bio-Rad», Франция). Учет результатов осуществляли на планшетном фотометре Multiskan EX («Thermo Labsystem», Финляндия).

Определение количества продуктивно инфицированных ВИЧ-1 (Nef-) и

ВИЧ-1 Anef (Nef-) лимфоцитов in vitro

С этой целью использовали мкАТ IgGi к сердцевинному белку ВИЧ-1 p24sag, конъюгированных с флуорохромом PE («Beckman Coulter», США), которые добавляли в клеточные образцы, взятые на 3, б-й, 9-й и 11-й дни культивирования. Затем образцы выдерживали в темноте в течение 30 мин, после чего вносили по 1 мл холодного (+4°С) раствора Cell Wash. Проводили центрифугирование при комнатной температуре - 5 минут, 1500 об/мин. Супернатанты удаляли, а к клеточному осадку добавляли 200 мкл холодного раствора (+4°С) Cell Wash. Оценка результатов производилась с помощью

проточного цитометра FACSCalibur («Becton Dickinson», США) в программе CellQuest.

Исследование активациониого статуса лимфоцитов

Определение в культурах клеток количества С04+Т-Лф, их активации проводили на 3, 6, 9 и 11 день по следующей методике. К 100 мкл клеточной суспензии, взятой из каждого планшета, добавляли мкАТ: а) 5 мкл мкАТ к молекуле CD4, конъюгированных с флуорохромом РегСР («Becton Dickinson», США); б) 5 мкл мкАТ к молекуле CD25, конъюгированных с флуорохромом FITC («Сорбент», г. Москва); в) 5 мкл мкАТ к молекулам HLA-DR, конъюгированных с флуорохромом РЕ («Сорбент», г. Москва). Клетки инкубировали в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. Далее в пробирку с клетками добавляли 2 мл холодного раствора (+4°С) Cell Wash («Becton Dickinson», США). Проводили центрифугирование при комнатной температуре - 5 минут, 1500 об/мин. Супернатанты удаляли, а к клеточному осадку добавляли 200 мкл холодного раствора (+4°С) Cell Wash. Оценка результатов производилась с помощью проточного цитометра FACSCalibur («Becton Dickinson», США) в программе CellQuest.

Изучение апоптоза лимфоцитов

Для оценки апоптоза Лф были выбраны следующие критерии: снижение величины трансмембранного митохондриального потенциала (Д4*ш) на фоне одновременной экспрессии молекул фосфатидилсерина (ФС) (Mower D.A., et al., 1994; Castedo M., et al., 1996; Бойчук C.B., 2002; Мустафин И.Г., Бойчук C.B., 2003; Мустафин И.Г., 2005). Для исследования запрограммированной гибели клеток использовались флуорохромы (DiOC6, MC 540) и AnnexinV, конъюгированный с флуорохромом FITC (AnnV-FITC). Результаты оценивали с использованием проточного цитометра FACSCalibur в программе CellQuest.

Для исследования апоптоза продуктивно инфицированных популяций (BM4-l(Nef+) и ВИЧ-1 Але/ (Nef-)) Лф применялся AnnV-FITC. AnnV-FITC, как и MC 540, способен специфически связываться с молекулами ФС. Клетки, взятые из планшета, дважды отмывали холодным (+4°С) фосфатно-солевым буфером (pH = 7,4). Затем клетки ресуспензировали в специальном буфере, содержащем 0,1 M HEPES, 1,4 M NaCl, 25 mM СаС12 (pH = 7,4). Далее к 200 мкл клеточной суспензии добавляли 5 мкл раствора AnnV-FITC («PharMingen», США). Далее клетки инкубировали в течение 5 минут в темноте при комнатной температуре. После чего непосредственно производили окраску полученных клеточных суспензий на предмет выявления инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1Лпе/ (Nef-) популяций Лф. Для окраски использовались мкАТ IgGj к сердцевинному белку ВИЧ-1 p24gag, конъюгированных с флуорохромом РЕ («Beckman Coulter», США). Методику см.выше.

Оценку результатов проводили на проточном цитометре FACSCalibur в программе CellQuest.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Влияние ВИЧ-1 белка Nef на регуляцию процесса репликации ВИЧ-1 в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) in vitro При исследовании способности ВИЧ-1 белка Nef оказывать влияние на репликацию вируса было установлено следующее: при инфицировании Лф in vitro ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1Дnef (Nef-) без предварительного внесения цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) репликация вируса отсутствовала. Напротив, при внесении ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дне/ (Nef-) в культуры Лф в присутствии выше перечисленных цитокинов, наблюдалась репликация вируса (р<0,001). Пик репликации в обоих случаях инфицирования приходился на 6-й день культивирования клеток (р<0,001). Однако уровни репликации ВИЧ-1 были выше в случае внесения в супернатанты клеточных культур ВИЧ-1 (Nef+) по сравнению с ВИЧ-1 Anef (Nef-) инфицированием в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7 с 3 по 11-й дни, а также в присутствии ИЛ-4 и ФНО-а с 6-го по 11-й дни культивирования Лф (р<0,001). Таким образом, полученные результаты позволяют судить о том, что ВИЧ-1 белок Nef способствует индуцированной цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) репликации вируса.

Влияние ВИЧ-1 белка Nef на активационный статус инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Anef (Nef-) Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФИО-a) in vitro

Для исследования механизмов, обуславливающих способность вирусного белка Nef инициировать цитокин-опосредованную репликацию ВИЧ-1, была проведена оценка активационного статуса культивированных лимфоцитов. Было установлено, что в инфицированных ВИЧ-1 (Nef+), ВИЧ-1 Дnef (Nef-) и неинфицированиых (контроль) Лф без цитокинов активация СБ4+Т-Лф отсутствовала. При внесении ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Anef (Nef-) в культуры клеток в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) отмечалось статистически значимое (р<0,001) увеличение количества активированных С04+Т-Лф на 6-й день культивирования клеток, с постепенным уменьшением к 11-му дню. Аналогичная тенденция наблюдалась при исследовании активационного статуса неинфицированиых СБ4+Т-Лф в присутствии выше перечисленных цитокинов. Однако количество активированных СЭ4+Т-Лф достоверно преобладало в инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) по сравнению с ВИЧ-1 Дnef (Nef-) и неинфицированными культурами Лф (р<0,001). Следовательно, ВИЧ-1 белок Nef может обеспечивать передачу активационных сигналов СЭ4+Т-Лф в условиях преактивации их цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а). Полученные результаты количественного анализа подтверждаются данными цитометрии (см. рис. 1 и 2).

Potior N DG novirus-ÇD^^ÇD*-

I. Il Р2 3,1%

■ 1

.....ÏÔ» CD25 FITC-H

Эопсг N Dl virus 2-C025<HL/VCD4 conlro! P2

3,3%

n.t»...... ,

Без вируса, без цитокинов, ВИЧ-1 (Nef+) без цитокинов (контроль) (контроль)

ВИЧ-1Ди<?/ (Nef-) без цитокинов(контроль)

Donar N Пй no vlrivs-OD25JHLAiCn4 IL-2

l P2

1И i'i 21.7%

..........¡2» ......¡2» ' ' ""1> '

CD25 FITC-H

Без вируса, в присутствии ИЛ-2

17,4%

Без вируса, в присутствии ИЛ-4

Oooot N Об no viTUS-CD2b'HLAJCQ4 11.

.47,6%

Без вируса, в присутствии ИЛ-7

DonorN D virus 2-C025JHUVCD't II 1

1 | У 49,8%

3 | . ¿f.«

CD2S FITC-H

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии

ИЛ'2

Our.orWD

¡Я | P2 , 32%

Э,1'

"" ¿»»г» "*

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии ИЛ-4

s 2-CD2SMUVCD< 1U-7 _

■60%

r^il'l,......Г~'ГТ1ГШ| 'l I 1.1"^-1— -'-IT-;

GD2S PITC-H

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии ИЛ-7

DonorN DE wrus T-CD2fiJHLWOCï4 IL-2

I| Й 20,9%

CD25 FITC-H

ВИЧ-1 Дnef (Nef-) в присутствии ИЛ-2

rys 1-CD2WLA<C.О* IL

16,9%

ВИЧ-1Дnef (Nef-) в присутствии ИЛ-4

И ■■}&■■ . virus i-CD2S/blUVCD4 IL-7 P2 51,2%

CD25FJTC-H

ВИЧ-1 Ада/ (Nef-) в присутствии ИЛ-7

ММ па vlruS-CD2SlHL2VCDa TNF

-21%

Без вируса, в присутствии ' ФНО-а

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии ФНО-а

virus 1-CD2SIHI./VCD4 TNF

(1 P 2

23,3%

соаб fitc-h

ВИЧ-1Дяе/ (Nef-) в присутствии ФНО-а

Рис. 1. Активация С04+Т-Лф, оцененная по количеству (в %) С04+/С025+Т-Лф, в неинфицированных, инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1Дие/' (Nef-) культурах, инкубированных в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) на 6-й день культивирования (цитомегрические данные)

Примечание: на гистограммах - уровни флуоресценции по CD4 /CD25"

JonorN С>6 no v»us-C075fHLWCD4

■А

à 1,9%

HLA-DR РЕ-Н

g H rua ^-C026")LA/OD< çonlro:

2,2% «

HLA-DR РЕ-Н

sî 1(1,1% .

Я-

HLA-DR PE-H

Без вируса, в присутствии ИЛ-2

R" iS rW>vli\JS-CD;5/H(r*/CD4 IL-«

" .....Ъ ' ^^^ ......

Без вируса, в присутствии ИЛ-4

Donor N D6 nov|rus-CD25/4LA/CD4 IL-7

H LA DR PE-H

Без вируса, в присутствии ИЛ-7

il noviruc-CP26<Hl-A>CD« TNF P3

6,4%

Без вируса, в присутствии ФНО-а '

Donor N DB ^ -- 1

32,1% P3

HLA-DR РЕ-Н

Donor N D6 vlrue Î-CDSS/HLA/CD4 >L-4

il | 18,3% «

... ..j.

HLA'OR P6-H

Donor N De irus 2-CD2SfHLMCD* IL-7

гШ

43,5%

HLA-DR PE-H

ВИЧ-1 (Nef+) в присугствии ИЛ-7

s 7-CD2S/HLAfCD4 TNf

-2 6 ,-4% -

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии ФНО-а

Без вируса, без цитокинов ВИЧ-1 (Nef+) без [цтгокинов (контроль) (контроль)

il i D6 virui 1-CD25/HLATC04 conlro 2,1% p=

HLA-DR PE-H

ВИЧ-Ше/ (Nef-) без цитокинов (контроль)

1<Н 11.6% „,

HLA-DR РЕ-Н

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии ИЛ-2

ВИЧ-1Дие/ (Nef-) в присутствии ИЛ-2

5,9% "

HLA-OR РЕ-Н

ВИЧ-1 (Nef+) в присутствии ИЛ-4

ВИЧ-1Лие/ (Nef-) в присутствии ИЛ-4

JJonor N Dfi vinjs 1-CD2S/H1 л/СО, Ч

"То3 '''"'"''¡'s-

HLA-DR РЕ-Н

ВИЧ-1Дnef (Nef-) в присутствии ИЛ-7

virus 1-CD2SÎHLAÎCD« TNF

6,8%

.......................■ HLA-DR PE-H

ВИЧ-1Дяе/ (Nef-) в присутствии ФНО-а

Рис. 2. Активация С04Т-Лф, оцененная по количеству (в %) CD47HLA-DF^T-Лф, в неинфицированных, инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 A nef (Nef-) культурах, инкубированных в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) на 6-й день культивирования (цитометрические данные) *

Примечание: на гистограммах -уровни флуоресценции по CD4 '/HLA-DR'

Взаимосвязь между процессами активации инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 ânef (Nef-) Лф и репликацией ВИЧ-1 in vitro. Далее необходимо было установить наличие или отсутствие взаимосвязи между процессами активации инфицированных ВИЧ-1 (Nef+), ВИЧ-lzfne/ (Nef-) Лф и репликацией ВИЧ-1 in vitro. В настоящем исследовании была обнаружена статистически достоверная сильная прямая зависимость между количеством активированных СТ)4+Т-Лф и уровнями репликации ВИЧ-1 (Nef+) (г > 0,74, р < 0,001) и умеренная прямая зависимость (г от 0,26 до 0,74, р < 0,05) между репликацией ВИЧ-1 Arn?/ (Nef-) и числом активированных клеток. Следовательно, это позволяет сделать вывод о том, что репликация ВИЧ-1 in vitro происходит только в активированных цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) С04+Т-Лф и не зависит от наличия в структуре вируса белка Nef.

Максимальные уровни репликации вируса в присутствии всех ранее отмеченных цитокинов наблюдались при инфицировании клеток ВИЧ-1 (Nef+) по сравнению с ВИЧ-1Аие/ (Nef-) Лф (р < 0,001). Следовательно, белок Nef обеспечивает передачу активационных сигналов инфицированным Т-Лф. Вследствие чего, данный вирусный белок способствует эффективной репликации ВИЧ-1 в активированных цитокинами Т-Лф in vitro.

Полученные результаты коррелируют с литературными данными. ВИЧ-1 проникает как в активированные, так и в «покоящиеся» Т-Лф. Однако в «покоящихся» клетках не завершается синтез вирусной ДНК (Zack J, 1990), так как образованная в результате обратной транскрипции, провирусная ДНК не встраивается в геном клетки хозяина. Для того чтобы это произошло, необходима активация Т-Лф и перемещение вирусного преинтеграционного комплекса из цитоплазмы в ядро. Nef образует соединения с микродоменами мембраны клеток, обеспечивая, активацию Т-Лф (Wang J. К, et al, 2000). Последние данные свидетельствуют в пользу того, что Nef способен ингиЗировать TCR-опосредованную активацию Т-Лф. ВИЧ-1 белок Nef нарушает формирование функциональных иммунологических синапсов между ВИЧ-инфицированными Т-Лф и АПК, уменьшая, тем самым перенос Lck и TCR (Espert L, et al, 2008). Таким образом, резюмируя все выше изложенное, можно сказать, что ВИЧ-1 белок Nef обеспечивает создание в инфицированных Т-Лф оптимальных условий для репликации ВИЧ-1.

Влтние ВИЧ-1 белка Nef на регуляцию процесса апоптоза лимфоцитов в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) при инфицировании клеточных культур in vitro ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Anef

(Nef-)

Следующим этапом исследования явилось определение роли вирусного белка Nef в апоптозе Т-Лф в присутствии цитокинов. Общее количество С04'Т-Лф в инфицированных ВИЧ-1 (Nef+), ВИЧ-1 Anef (Nef-) и не инфицированных культурах Лф в отсутствии цитокинов (контроль) было примерно одинаковым и достигало минимума на 11-й день культивирования. Таким, образом, ВИЧ-1 белок Nef в отсутствии цитокинов не оказывал влияния

на количество СЭ4+Т-Лф в клеточных культурах. Однако в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) данный белок индуцировал потери С04+Т-Лф (р<0,001). При этом Nef обеспечивал гибель СЭ4+Т-Лф по механизму апоптоза. В наибольшей степени эта способность проявлялась в присутствии ФНО-а.

Обнаруженные свойства вирусного белка Nef способствовать апоптозу инфицированных Лф и обеспечивать репликацию ВИЧ-1 в присутствии цитокинов in vitro, явились важной предпосылкой для исследования следующего вопроса: какая популяция Лф под влиянием ВИЧ-1 белка Nef погибает по механизму апоптоза - клетки с активной вирусной репликацией (продуктивно инфицированные) или неинфицированные Лф окружения («байстендер»)?

Цитометрические данные апоптоза продуктивно инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных Лф в ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1Дnef (Nef-) культурах, инкубированных в присутствии цитокинов (ИЛ-2 и ИЛ-7) представлены на рисунке 3.

Лф в ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1Дие/ (Nef-) культурах, инкубированных в присутствии цитокинов (ИЛ-2 и ИЛ-7) - 6-й день культивирования*"

Примечание: по оси абсцисс -уровень экспрессии вирусного белка р24т; по оси ординат -уровень экспрессии молекул ФС (флуоресценция ArmV-FITC). Лф с признаками апоптоза (в %) - в левом верхнем (неинфицированные клетки) и правом верхнем (продуктивно инфицированные ВИЧ-1 клетки) квадратах

Согласно рис. 3, Лф, имеющие признаки апоптоза, являются в основном р248а8-негативными клетками, т.е. неинфицированными ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дие/ (Nef-) (левые верхние квадраты). При этом количество продуктивно инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дnef (Nef-) Лф (р248Щ-позитивных клеток) с признаками апоптоза в клеточных культурах незначительное (правые верхние квадраты).

Данные цитометрического анализа (см. рис. 3) подтверждаются подсчетом абсолютного количества клеток с признаками апоптоза. В присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7 в инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дnef (Nef-) культурах Лф по механизму апоптоза погибали преимущественно неинфицированные клетки (р<0,001). Наибольшее количество апоптотирующих неинфицированных Лф в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7 отмечалось в ВИЧ-1 (Nef+) культурах (р < 0,001). При этом с б-го по 11-й дни культивирования продуктивно инфицированных (р248а8-позитивных) клеток с признаками апоптоза было больше в ВИЧ-1 Дие/ (Nef-) клеточных культурах по сравнению с ВИЧ-1 (Nef+) Лф (р<0,05 и р<0,001).

Таким образом, ВИЧ-1 белок Nef индуцирует апоптоз преимущественно неинфицированной популяции Лф, одновременно поддерживая жизнеспособность продуктивно инфицированных клеток.

Согласно литературным источникам при проникновении ВИЧ-1 в организм развивается достаточный по силе иммунный ответ, которому способствует, наряду с определенными вирусными белками, включая белок Nef, секреция Th2 провоспалительных цитокинов, которые активируют Т-Лф (Green D.R., Reed J.C., 1998; Eckstein D.A., et al., 2001; Scales D„ et al., 2001; Granucci F., et al., 2003; Le Pett S., Kelleher Anthony D., 2003; Бойчук C.B. с соавт., 2006), тем самым, стимулируя репликацию вируса и, обеспечивая, последующее распространение ВИЧ-1. Таким образом, активированные Т-Лф должны подвергаться активационно-индуцированному апоптозу (activation-induced cell death, AICD) (Cossarizza A., 2008). Ввиду того, что под влиянием белка Nef активация инфицированных Т-Лф приводит к эффективной репликации вируса в этих клетках (Swingler S., et al., 1999; Blaak H., et al., 2000; Greenway A.L., et al., 2003; Бойчук C.B., Мустафин И.Г., 2004), Nef способен «защищать» инфицированные С04+Т-Лф от апоптоза разнообразными механизмами (Schwartz О., et al., 1996; Geleziunas R., et al., 2001; Wolf D., et al., 2001; Blagoveshenskaya A.D., et al., 2002; Greene W.C. et al., 2002; James C.O., et al., 2004). В тоже время неинфицированные «байстэндер» CD4 *Т-Лф подвергаются AICD (Rafaeli Y., et al., 1998; de Oliveira Pinto L.M., et al., 2002; Lelievre J.D., et al., 2005; Fluur C., et al., 2007; Sirskij D., et al., 2008). AICD является результатом стимуляции клеток цитокинами и реализуется посредством CD95 и CD 178 (Badley A.D., et al., 1997) Однако ведущая роль в «эффекте байстэндер» принадлежит вирусному белку Nef (Okada H., et al., 1998; Bossy-Wetzel E., Green D.R., 1999; Xu X.N., et al., 1999; Zauli G., et al., 1999; Geleziunas R., et al., 2001; Rasola A., et al., 2001; James C.O., et al., 2004; Cossarizza A., 2008, Lenassi M., et al., 2010). Вследствие того, что ВИЧ-1 белок Nef обеспечивает передачу активационных сигналов Т-Лф в присутствии цитокинов, как было показано

выше, тем самым, данный белок повышает чувствительность этих клеток к апоптозу (Garg H., Blumenthal R., 2006).

Максимальные количества апоитотирующих клеток наблюдались в пристутствии ФНО-а в обоих случаях инфицирования вероятно вследствие того, что после его связывания с TNF-рецепторами (TNF-R1) происходит мобилизация белка TRADD, который является «доменом смерти», и запускает программу апоптоза (Hsu H., et al., 1995).

Полученные результаты настоящего исследования демонстрируют положительное участие ВИЧ-1 белка Nef в репликации вируса, передаче активационных сигналов и индукции апоптоза преимущественно неинфицированных С04+Т-Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) in vitro. В тоже время белок Nef поддерживает жизнеспособность продуктивно инфицированных Т-Лф, тем самым, обеспечивая циркуляцию вируса в организме ВИЧ-инфицированного. Созданная in vitro модель, отражающая основные этапы патогенеза ВИЧ-инфекции в организме инфицированного пациента, позволяет сделать заключение о негативной роли вирусного белка Nef в течение данного заболевания.

В свою очередь, полученные результаты о свойствах вирусного белка Nef могут быть использованы для изыскания способов элиминации ВИЧ-1 из организма инфицированного пациента и создания новых, более эффективных средств терапии ВИЧ-инфекции.

Выводы

1. В отсутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) in vitro репликация вируса в ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Диef (Nef-) инфицированных Лф отсутствует. Способность цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а инициировать репликацию ВИЧ-1 в С04+Т-лимфоцитах зависит от наличия в клетках вирусного белка Nef.

2. Вирусный белок Nef обеспечивает передачу активационных сигналов инфицированным С04+Т-лимфоцитам в условиях их преактивации in vitro цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а).

3. В наибольшей степени способность ВИЧ-1 белка Nef индуцировать эффективную репликацию вируса проявляется при активации С04+Т-Лф ИЛ-2 и ИЛ-7, далее по убыванию - ИЛ-4 и ФНО- а.

4. ВИЧ-1 белок Nef индуцирует апоптоз преимущественно неинфицированной популяции С04+Т-лимфоцитов в присутствии цитокинов (в первую очередь, в присутствии ФНО-а, затем по убыванию -ИЛ-4, ИЛ-2 и ИЛ-7), одновременно поддерживая жизнеспособность продуктивно инфицированных клеток в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7 in vitro.

Практические рекомендации

1. Повышение в крови ВИЧ-1-инфицированного концентрации цитокинов (в первую очередь, ФНО-а, затем ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-2) является негативным фактором для развития, течения и прогноза ВИЧ-инфекции в большей степени у лиц с быстрым прогрессированием (инфицированных ВИЧ-1 (Nef+)) заболевания по сравнению с пациентами, имеющими длительно непрогрессирующее течение заболевания (инфицированных ВИЧ-1 Дnef (Nef-)).

2. Предложенные модели ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дне/(Nef-) инфицирования клеточных культур в условиях преактивации Т-лимфоцитов цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) in vitro могут быть использованы для дальнейших исследований патогенеза ВИЧ-1 инфекции и разработки эффективных средств терапии данного заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дунаев П.Д. Репликация ВИЧ-1 в лимфоцитах периферической крови : роль ВИЧ-1 белка Nef и активации клеток / П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова // Молодые ученые в медицине: тез. докл. XIII Всерос. науч.-цракт. конф. с междунар. участием, Казань, 2324 апреля 2008г. - Казань: Медок, 2008. - С. 200-201.

2. Влияние ВИЧ-1 белка nef па цитокин-индуцированную репликацию ВИЧ-1 в CD4+-лимфоцитах / C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова // Российский иммунологический журнал: тез. докл. Объединенного иммунологического форума, Санкт-Петербург, апрель-сентябрь 2008г. - СПб., 2008. - Т.2. - Ks 2-3. - С. 268-269.

3. Дунаев П.Д. Влияние цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) на репликацию ВИЧ-1 в С04+-Т-лимфоцитах / П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова // Молодые ученые в медицине: тез. докл. XIV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Казань, 29-30 апреля 2009г. -Казань, 2009.-С. 165.

4. Инфицирование ВИЧ-1 лимфоцитов in vitro, проинкубированных с цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), снижает их активацию / П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, М.В. Макарова // Российский аллергологичсский журнал: тез. докл. X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященного 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо, Казань, 20-23 мая 2009г. - Казань: Идел-Прссс, 2009. - С. 219.

5. Роль эндотелиальных клеток и белка Nef в репликации ВНЧ-1 / М.В. Макарова, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, A.B. Иванкова И Ипфекционные болезни. - Москва: Династия, 2009. - Том 7. - № 3. - С. 18-24.

6. Роль ВИЧ-1 белка Nef в патогенезе ВИЧ-1 ннфекции / A.B. Иванкова, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, М.В. Макарова // Казанский медицинский журнал. - 2010. - Том 91. - №1. - С.79 - 85.

7. Повышение концентраций цитокинов IL-4, IL-7 и TNF-a в периферической крови ВИЧ-ипфицировапных лиц следует считать неблагоприятным фактором, обеспечивающим прогрессирование заболевания / П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова, C.B. Бойчук, И.Г. Муетафии И Российский аллергологический журнал: труды Национальной конференции «Аллергология и иммунология - практическому здравоохранению», Москва, 25-26 февраля 2010г. -М., 2010. - №1. - выпуск 1. - С. 65 - 66.

8. Иванкова A.B. Влияние ВИЧ-1 белка Nef на общее количество CD4+ Т-Лф и их активацию в присутствии цитокинов in vitro / A.B. Иванкова, П.Д. Дунаев // Актуальные вопросы инфектолопш: материалы юбилейной научно-практической конференции,

посвященной 85-летию создания кафедры инфекционных болезней КГМУ, Казань, март 2010г. - Казань, 2010. - С. 38.

9. Дунаев П.Д. Исследование экспрессии активациониых маркеров у продуктивно инфицированных ВИЧ-l и неинфицированных лимфоцитов / П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова // Актуальные вопросы инфсктолопш: материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 85-летию создания кафедры инфекционных болезней КГМУ, Казань, март 2010г. - Казань, 2010. - С. 37.

10. Иванкова A.B. Влияние ВИЧ-1 белка Nef на апогггоз лимфоцитов в условиях щлокил-индуцироваиной активации клеток in vitro / A.B. Иванкова, П.Д. Дунаев // Молодые ученые в медицине: тез. докл. XV Веерос. науч.-практ. конф., Казань, 2-3 апреля 2010г. -Казань, 2010.-С. 276.

11. Дунаев П.Д. Влияние цитокинов на регуляцию процесса апоптоза лимфоцитов при их инфицировании in vitro ВИЧ-1/ П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова // Молодые ученые в медицине: тез. докл. XV Всерос. науч.-практ. конф., Казань, 2-3 апреля 2010г. - Казань, 2010.-С. 275.

12. Влияние цитокинов на репликацию ВИЧ-1 и регуляцию апогггоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции in vitro / П.Д. Дунаев, A.B. Иванкова, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафшг // Астраханский медицинский журнал: материалы 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань, 5-8 мая 2010г. - Астрахань, 2010. - Том 5. -№ 1.-С. 100-102.

13. Наличие в структуре ВИЧ-1 белка Kef обусловливает неблагоприятное течение инфекции в условиях цитокин-индуцировашюй активации Т-лимфоцитов // A.B. Иванкова, П.Д. Дунаев, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин // Российский аллергологический журнал: '[руды Межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы», Санкт-Петербург, 2730 сентября 2010г. - СПб.,2010. - №5, выпуск 1. - С. 124-125.

Список сокращений ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа ВНО - вирус иммунодефицита обезьян ИЛ - иитерлейюш мкАТ - моноклональные антитела Мкл - микролитр Мл - миллилитр Нг - нанограмм II кг- пикограмм

AnnV-FITC - белок аннексии 5, конъюгированиый с флуорохромом К1ТС

CD - группа дифференцировки

DiOCí - флуорохром дигексилокарбоцианина йодвд

FITC - флуорохром флуоресцегш изотиоцианат

Ig - иммуноглобулины

LCK - лейкощггарно-специфическая киназа

МС 540 - флуорохром мероциании 540

NF-kB - ядерный фактор «каппа-би»

РЕ - флуорохром фикоэритрин

РегСР - флуорохром перридин хлорофильный белок

TCR - антиген-распознаюший рецептор Т-лимфоцитов

TRADD - ассошшрованный с рецептором ФИО «домен смерти» (tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein)

Подписано в печать 25.10.10 г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,0. Тираж 120. Заказ № 352. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Вестфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 236-62-72

Оглавление диссертации Иванкова, Анна Викторовна :: 2010 :: Казань

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СВОЙСТВАХ ВИЧ-1 БЕЛКА NEF, ЕГО РОЛИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ВИЧ

ИНФЕКЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. ВИЧ-1 и его белки. Структура и основные функции ВИЧ-1 белка

1.2. Клеточные эффекты белка Nef.

1.3. Современные представления об основных типах клеточной смерти, их значимость при ВИЧ-инфекции.

1.4. Влияние ВИЧ-1 белка Nef на апоптоз CD4+ Т-лимфоцитов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика объекта и предмета исследования.

2.2. Выделение и культивирование лимфоцитов периферической крови.

2.3. Культивирование лимфоцитов периферической крови, инфицированных ВИЧ-1 (Nef*-) и ВИЧ-1 Дгсе/(Nef-).

2.4. Изучение репликации ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 ùmef (Nef-) in vitro.

2.5. Определение количества продуктивно инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Anef (Nef-) лимфоцитов in vitro.

2.6. Исследование активационного статуса лимфоцитов.

2.7. Исследование апоптоза лимфоцитов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3 Л. Влияние ВИЧ-1 белка Nef на регуляцию процесса репликации

ВИЧ-1 в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) in vitro.

3.2. Влияние ВИЧ-1 белка Nef на активационный статус инфицированных Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-а) in vitro.

3.3. Взаимосвязь между процессами активации инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Дие/(Nef-) Лф и репликацией ВИЧ-1 in vitro.

3.4. Влияние ВИЧ-1 белка Nef на регуляцию процесса апоптоза лимфоцитов в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО- а) при инфицировании клеточных культур in vitro ВИЧ-1 (Nef+) и

ВИЧ-1 Anef (Nef-).

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Иванкова, Анна Викторовна, автореферат

Актуальность темы

Патогенез ВИЧ-инфекции состоит из различных процессов [53], среди которых основная роль принадлежит расстройству функциональных возможностей иммунной системы, включая ее клеточное звено — Т- и В-лимфоциты (Т-Лф и В-Лф), АПК и др [75].

У здоровых лиц СБ4+Т-Лф участвуют в иммунном ответе к инфекционным агентам посредством скоординированной секреции цитокинов, действующих как факторы роста, созревания и активации эффекторных клеток иммунной системы [154]. У ВИЧ-инфицированных лиц на всех стадиях заболевания выявляются признаки хронической активации иммунной системы и нарушения, связанные с продукцией и секрецией цитокинов [103, 108, 142, 149, 153]. В частности, происходит «переключение» работы от Thl, связанное со сниженным образованием ИЛ-2 и ИФН-у, на Th2, а именно увеличение секреции ИЛ-4, ИЛ-10, а также повышение продукции провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, и ФНО-а, что в свою очередь индуцирует репликацию ВИЧ-1 и, главным образом, экспрессию вируса посредством взаимодействия NF-kB с LTR. Такая «нефизиологическая» продукция цитокинов нарушает клеточный иммунный ответ [149].

Способность иммунокомпетентных клеток продуцировать вирус зависит от уровня Т-лимфоцитарной активности и стадии моноцитарно-макрофагальной дифференцировки [106, 123]. Известно, что репликация вируса происходит в активированных СБ4+Т-Лф [3, 152]. Однако имеются данные в пользу того, что репликация ВИЧ-1 и ВИО in vivo происходит в Т-Лф с низкими уровнями экспрессии классических маркеров активации [95, 104, 136, 181]. Одна из ключевых ролей в процессах активации и пролиферации Т-Лф in vivo отводится цитокинам [61, 139]. В частности, ИЛ-2 индуцирует пролиферацию и активацию как CD4+ так и СБ8+Т-Лф [228], потенцирует цитотоксичность CD8+T-JI(|) и NK-клеток, стимулирует функцию В-Лф, таким образом, играя важную роль в распространении вирусной инфекции и элиминации внутриклеточных патогенных, микроорганизмов [45, 51, 170, 174]. ИЛ-7 — важнейший цитокин, играющий ключевую роль в процессах лимфопоэза и пролиферации Лф [83]. Основной мишенью ИЛ-7 являются «наивные» С04+Т-Лф [132]. Эти свойства ИЛ-7 были также обнаружены и у лиц с иммунодефицитами [4, 137, 145, 195]. Установлено, что у ВИЧ-инфицированных пациентов высокий уровень ИЛ-7 в сыворотке обратно пропорционален количеству С04+Т-Лф. Это может являться компенсаторным механизмом в ответ на лимфопению, но в то же время, выявленная способность ИЛ-7 инициировать репликацию ВИЧ-1 [4, 137, 145] может являться фактором, способствующим прогрессированию заболевания. Поэтому была выдвинута гипотеза о том, что секреция ИЛ-7 увеличивает истощение количества СБ4+Т-Лф [5, 83, 137]. Известно, что ИЛ-4 действует как главный аутокринный фактор роста и активации Th2 [70].

Влияния цитокинов на ВИЧ-1 могут носить ингибиторный, стимулирующий и бифункциональный характер (как подавляющий, так и стимулирующий), что может свидетельствовать о регулирующем влиянии на течение ВИЧ-инфекции и репликацию ВИЧ-1 in vivo целого комплекса цитокинов, которые вырабатываются разнообразными клетками. Имеются сведения о том, что ИФН-а, ИФН-ß, ИЛ-10, ИЛ-13 и ИЛ-16 являются ВИЧ-супрессорными цитокинами, в то время как ФНО-а, КСФ-ГМ, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-15, ИЛ-18 способствуют репликации ВИЧ-1 [149].

Наряду с «дисбалансом» цитокинов, ведущим звеном в патогенезе ВИЧ-инфекции является гибель СБ4+Т-Лф [154]. Помимо апоптоза CD4+T-Лф у пациентов со СПИД, также отмечается запрограммированная гибель других типов неинфицированных клеток (С08+Т-Лф, В-лимфоцитов, тимоцитов и нейронов) [30¿ 31].

Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что большинство СБ4+Т-Лф, подвергающихся апоптозу в периферической крови и лимфатических узлах у ВИЧ-1 инфицированных пациентов, являются неинфицированными клетками окружения [56, 64, 75, 101, 152, 153]. Запрограммированная гибель этих неинфицированных Т-Лф окружения получила название «эффекта байстэндер». Несмотря на то, что снижение абсолютного количества СТ)4+Т-Лф является одним из общепринятых критериев, используемых в оценке стадии ВИЧ-инфекции, а также эффективности проводимой терапии ВИЧ-инфицированным лицам, механизмы снижения их абсолютного количества остаются дискуссионными до настоящего времени. Это может быть обусловлено способностью вирусного белка Nef оказывать влияние на апотоз инфицированных и неинцицированных вирусом иммунокомпетентных клеток. В частности, имеется значительное количество исследований, которые указывают на участие белка ВИЧ-1 Nef в реализации «эффекта байстэндер» [29, 80, 134, 135, 171, 188].

Белок Nef первоначально был назван «негативным регуляторным фактором», так как имелись сведения его отрицательного влияния на вирусную репликацию путем подавления транскрипции от LTRs [22]. Однако появление данных о том, что Nef необходим для поддержания высокой вирусной нагрузки у инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО) макак [133], дало основание предположить, что этот белок положительно влияет на репликацию вируса иммунодефицита человека. В настоящее время известно, что основные функции вирусного белка Nef направлены на эффективную вирусную репликацию [165], обеспечение инвазивности ВИЧ-1 [17, 87, 88, 94, 124], а также поддержание жизнеспособности инфицированных Лф [29, 66, 73, 78, 111, 113, 117, 153, 160, 233]. Таким образом, в данном исследовании была предпринята попытка изучить влияние ВИЧ-1 белка Nef на репликацию ВИЧ-1 и процесс апоптоза Лф в условиях цитокин-опосредованной активации клеток.

Цель исследования: изучить роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса, активации и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.

Задачи исследования:

1. Изучить способность ВИЧ-1 бежа Nef влиять на цитокин-индуцированную репликацию вируса.

2. Исследовать влияние Nef на активацию инфицированных Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а).

3. Определить наличие или отсутствие зависимости между активацией инфицированных ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1Дяе/ (Nef-) Лф и репликацией вируса.

4. Изучить роль белка Nef в апоптозе лимфоцитов.

Объект и предмет исследования

Методы исследования

Для выполнения работы применялись методы патофизиологии, иммунологии, молекулярной биологии: выделение и культивирование лимфоцитов периферической крови, инфицирование лимфоцитов штаммом ВИЧ-1 и его рекомбинантным производным с делецией по гену nef, метод проточной цитометрии для изучения активационного статуса и определения маркеров апоптоза лимфоцитов, иммуноферментный анализ.

Достоверность полученных данных и их научная новизна

Научно-практическая ценность

Изучение способности вирусного белка Nef обеспечивать защиту от гибели продуктивно инфицированных Лф и напротив, индуцировать апоптоз неинфицированных («байстэндер») клеток в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а), впервые позволило оценить значимость совместного участия цитокинов и данного белка в патогенезе ВИЧ-инфекции in vitro.

Полученные в ходе исследования результаты свидетельствуют в пользу положительного влияния ВИЧ-1 белка Nef на репликацию вируса, активацию ЛФ и апоптоз неинфицированных Т-Лф, а также поддержание жизнеспособности продуктивно инфицированных клеток в условиях цитокин-индуцированной активации Лф.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Способность ВИЧ-1 белка Nef усиливать репликацию вируса проявляется в присутствии цитокинов, в первую очередь, ИЛ-7 и ИЛ-2, затем по убыванию ИЛ-4 и ФНО- а.

2. ВИЧ-1 белок Nef поддерживает жизнеспособность продуктивно инфицированных лимфоцитов (клеток с активной вирусной репликацией) в наибольшей степени в условиях преактивации клеток ИЛ-2 и ИЛ-7 в то же время, индуцируя гибель неинфицированной популяции лимфоцитов по механизму апоптоза в присутствии цитокинов - в первую очередь, ФНО-а, затем ИЛ-4, ИЛ-2, ИЛ-7.

Личный вклад диссертанта

Автором была выбрана тема, составлена программа, определены этапы диссертационной работы, проведен анализ научной литературы по изучаемой проблеме, выполнены экспериментальные исследования по влиянию ВИЧ-1 белка Nef на процессы активации, апоптоза лимфоцитов, роли данного белка в репликации ВИЧ-1. Экспериментальные работы проводились в лаборатории иммунологии Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ (заведующий лабораторией, д-р мед. наук Мустафин И. Г.). Автором выполнена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретация полученных данных.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (2008, 2009, 2010гг.), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009г.), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 85-летию создания кафедры инфекционных болезней КГМУ, «Актуальные вопросы инфектологии» (Казань, 2010г.), совместном заседании кафедр патофизиологии, клинической иммунологии с аллергологией ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», аллергологии и иммунологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росздрава», сотрудников Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ (Казань, 2010г.).

Публикации по теме диссертации

Основные результаты диссертационного исследования отражены в 13 научных работах, в том числе 2-х статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией.

Общий объем публикаций - 2,0 у.п.л., в том числе авторское участие -1,2 у.п.л.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (для преподавания раздела «Иммунодефициты. Особенности врожденного и адаптивного иммунитета») и кафедры клинической иммунологии с аллергологией (для преподавания раздела «Молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета») ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», а также в лаборатории иммунологии для культивирования клеточных культурх и инфицирования их ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 Anef (Nef-) штаммами по разработанной методике.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 236 источников, из которых 223 зарубежных авторов. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 35 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции"

ВЫВОДЫ

1. В отсутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) in vitro репликация вируса вВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-1 A nef (Nef-) инфицированных Лф отсутствует. Способность цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а инициировать репликацию ВИЧ-1 в СБ4+Т-лимфоцитах зависит от наличия в клетках вирусного белка Nef.

2. Вирусный белок Nef обеспечивает передачу активационных сигналов инфицированным СБ4+Т-лимфоцитам в условиях их преактивации in vitro цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а).

3. В наибольшей степени способность ВИЧ-1 белка Nef индуцировать эффективную репликацию вируса проявляется при активации CD4+T-Лф ИЛ-2 и ИЛ-7, далее по убыванию - ИЛ-4 и ФНО- а.

4. ВИЧ-1 белок Nef индуцирует апоптоз преимущественно неинфицированной популяции С04+Т-лимфоцитов в присутствии цитокинов (в первую очередь, в присутствии ФНО-а, затем по убыванию - ИЛ-4, ИЛ-2 и ИЛ-7), одновременно поддерживая жизнеспособность продуктивно инфицированных клеток в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-7 in vitro.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Повышение в крови ВИЧ-1-инфицированного концентрации цитокинов (в первую очередь, ФНО-а, затем ИЛ-4, ИЛ-2, ИЛ-7) является негативным фактором для развития, течения и прогноза ВИЧ-инфекции в большей степени у лиц с быстрым прогрессированием заболевания (инфицированных ВИЧ-1 (Nef+)) по сравнению с пациентами, имеющими длительно непрогрессирующее течение заболевания (инфицированных ВИЧ-1 Anef (Nef-)).

2. Предложенные модели ВИЧ-1 (Nef+) и ВИЧ-lAwe/ (Nef-) инфицирования клеточных культур в условиях преактивации Т-Лф цитокинами (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ФНО-а) in vitro могут быть использованы для дальнейших исследований патогенеза ВИЧ-1 инфекции и разработки эффективных средств терапии данного заболевания.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Иванкова, Анна Викторовна

1. Бойчук С. В. Апоптоз: характеристика, методы изучения и его роль в патогенезе атопических заболеваний / С. В. Бойчук, И. Г. Мустафин, Р. С. Фассахов // Казанский медицинский журнал. 2000. - № 3. — С. 217222.

2. Бойчук С. В. Механизмы апоптоза лимфоцитов при атопических заболеваниях : дис. . д-ра мед. наук / С. В. Бойчук ; Казан, гос. мед. ун-т. Казань, 2002. - 234 с.

3. Бойчук С. В. Роль интерлейкина-7 в регуляции апоптоза CD4 Т-лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 / С. В. Бойчук, И. Г. Мустафин, М. В. Макарова // Нижегородский медицинский журнал. 2006. - № 4. — С. 35-39.

4. Бойчук С. В. Роль эндотелиальных клеток и ВИЧ-1 белка Nef в патогенезе ВИЧ-инфекции: новые механизмы репликации ВИЧ-1 / С. В. Бойчук, И. Г. Мустафин // Медицинская иммунология. 2004. - Т. 6, №6.-С. 499-506.

5. Дунаев П. Д. Роль цитокинов в репликации ВИЧ-1 и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции : дис. канд. мед. наук / П. Д. Дунаев ; Казан, гос. мед. ун-т. Казань, 2009. - 142 с.

6. Лимфоциты. Методы : пер. с англ. / под ред. Дж. Клауса. М. : Мир, 1990.-400 с.

7. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / под ред. С. Гланца. -М. : Практика, 1998.-495 с.

8. Мустафин И. Г. Роль апоптоза лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-инфекции : дис. . д-ра мед. наук / И. Г. Мустафин ; Казан, гос. мед. ун-т. — Казань, 2005. 252 с.

9. Робинсон М. В. Апоптоз клеток иммунной системы / М. В. Робинсон, В. А. Труфакин // Успехи современной биологии. — 1991. Т. 111, № 2. -С. 246-259.

10. И. Смирнов И. Е. Апоптоз и патологический процесс. Научный центр здоровья детей РАМН Электроный ресурс. / И. Е Смирнов, С. С. Паунова. Режим доступа: http://www.nczd.ru/art7.htm. свободный.

11. Цыпленкова В. Г. Апоптоз / В. Г. Цыпленкова, Н. Н. Бескровнова // Архив патологии. 1996. - Т. 58, № 5. - С. 71-74.

12. Ярилин А. А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии / А. А. Ярилин // Актуальные проблемы патофизиологии / под ред. Б. Б. Мороза. М. : Медицина, 2001. - С. 13-56.

13. A natural variability in the proline-rich motif of Nef modulates HTV-1 replication in primary T cells / О. T. Fackler et al. // Curr. Biol. 2001. -Vol. 11, N16.-P. 1294-1299.

14. A nonsecreted variant of interleukin-4 is associated with apoptosis: implication for the T helper-2 polarization in HIV infection / E. Ledru et al. //Blood. -2003. Vol. 101, N 8. - P. 3102-3105.

15. A novel CDK9-associated C-type cyclin interacts directly with HTV-1 Tat and mediates its high-affinity, loop-specific binding to TAR RNA / P. Wei et al. // Cell. -1998. Vol. 92, N 4. - P. 451-62.

16. Absence of intact nef sequences in a long-term survivor with nonprogressive HIV-1 infection / F. Kirchhoff et al. // N. Engl. Med. J. 1995. - Vol. 332, N 2. - P. 228-232.

17. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I / P. Widlak et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, N 51. -P. 48404-48409.

18. Activation of Bcl-2 promoter-directed gene expression by the human immunodeficiency virus type-1 Tat protein / Z. Wang et al. // Virology. -1999. Vol. 257, N 2. - P. 502-510.

19. Active HTV protease is required for viral infectivity / N. E. Kohl et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85, N 13. -P. 4686-4690.

20. Adams J. M. The Bcl-2 protein family: Arbiters of cell survival / J. M. Adams, S. Cory//Science. 1998.-Vol. 281, N 5381.-P. 1322-1326.

21. Ahmad N. Nef protein of HIV-1 is a transcriptional repressor of HIV-1 LTR / N. Ahmad, S. Venkatesan // Science. 1988. - Vol. 241, N 4872. -P. 1481-1485.

22. Aiken C. Nef stimulates human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis / C. Aiken, D. Trono // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N 8. -P. 5048-5056.

23. Alhatib G. Cell type-specific fusion cofactors determine human immunodeficiency type 1 tropism for T-cells lines versus primary macrophages / G. Alhatib, C. C. Broder, E. A. Berger // Journal of Virology. 1996. - Vol. 70, N 8. - P. 5487-5494.

24. Analysis of the SH3-binding region of HIV-1 nef: Partial functional defects introduced by mutations in the polyproline helix and the hydrophobic pocket / H. M. Craig et al. // Virology. 1999. - Vol. 262, N 1. - P. 55-63.

25. Apoptosis and expression of inducible nitric oxide synthase are mutually exclusive in renal mesangial cells / D. D. Nitsch et al. // Am. J. Pathol. -1997. Vol. 150, N 3. - P. 889-900.

26. Apoptosis enhancement by the HIV-1 Nef protein / A. Rasola et al. // J. Immunol. -2001. Vol. 166, N 1. - P. 81-88.

27. Apoptosis mediated by HIV protease is preceded by cleavage of Bcl-2 / P. R. Stark et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93, N 115. -P. 9571-9576.

28. Apoptosis occurs predominantly in bystander cells and not in productively infected cells of HIV- and SIV-infected lymph nodes / T. H. Finkel et al. // Nat. Med.-1995.-Vol. 1,N2.-P. 129-134.

29. Apoptosis of CD8+ T cells is mediated by macrophages through interaction of HTV gpl20 with chemokine receptor CXCR4 / Herbein G. et al. // Nature. 1998. - Vol. 395, N 6698. - P. 189-194.

30. Apoptosis of CD4+ and CD 19+ cells during human immunodeficiency virus type 1 infection correlation with clinical progression, viral load, and loss of humoral immunity / A. Samuelsson et al. // Virology. - 1997. - Vol. 238, N2.-P. 180-188.

31. Arends M. J. Apoptosis. The role of the endonuclease / M. J. Arends, R. G. Morris, A. H. Wyllie // Am. J. Pathol. 1990. - Vol. 136, N 3. - P. 593-608.

32. Ashkenazi A. Death receptors: Signaling and modulation / A. Ashkenazi, V. M. Dixit // Science. 1998. - Vol. 281, N 5381. -P. 1305-1308.

33. Autophagy pathway intersects with HTV-1 biosynthesis and regulates viral yields in macrophages / G. B. Kyei et al. // J. Cell Biol. 2009. -Vol. 186, N2.-P. 255-268.

34. Bartz S. R. Human immunodeficiency virus type 1 Tat induces apoptosis and increases sensitivity to apoptotic signals by up-regulating FLICE/caspase-8 / S. R. Bartz, M. Emerman // J. Virol. -1999. Vol. 73, N 3. - P. 19561963.i

35. Bauer G. Reactive oxygen and nitrogen species: Efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis / G. Bauer // Anticancer Res. 2000. - Vol. 20, N 6B. - P. 4115-4139.

36. Bcl-2 modulation of apoptosis induced by anticancer drugs / T. C. Fisher et al. // Cancer Res. 1993. - Vol. 53, N 14. - P. 3321-3326.

37. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly / T. Kuwana et al. // Mol. Cell. 2005. - Vol. 17, N 4. - P. 525-35.

38. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors / X. Luo et al. // Cell. -1998. Vol. 94, N 4. - P. 481-490.

39. Biochemical mechanisms of IL-2-regulated Fas-mediated T cell apoptosis / Y. Rafaeli et al. // Immunity. -1998.-Vol. 8, N 5. -P. 615-623.

40. Biology of nitric oxide signaling / L. Liaudet et al. // Crit. Care Med. -2000. Vol. 28, Suppl. 4. - P. N37-N52.

41. Bossy-Wetzel E. Caspases induce cytochrome c release from mitochondria by activating cytosolic factors / E. Bossy-Wetzel, D. R. Green // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, N25. -P. 17484-17490.

42. Bour S. The HIV type 1 vpu protein specifically binds to the cytoplasmic domain of CD4: Implications for the mechanism of degradation / S. Bour, U. Schubert, K. Strebel //J. Virol. 1995. - Vol. 69, N 3. -P. 1510-1520.

43. Briggs S. D. Affinity of Src family kinase SH3 domains for HIV Nef in vitro does not predict kinase activation by Nef in vivo / S. D. Briggs, E. C. Lerner, T. E. Smithgall // Biochemistry. 2000. - Vol. 39, N 3. - P. 489-495.

44. Brinchmann J. E. Differential responses of T cell subsets: possible role in the immunopathogenesis of AIDS / J. E. Brinchmann // AIDS. 2000. - Vol. 14, N12.-P. 1689-1700.

45. Broker L. E. Cell death independent of caspases: a review / L. E. Broker, F. A. Kruyt, G. Giaccone // Clin. Cancer Res. 2005. - Vol. 11, N 4. -P. 3155-3162.

46. Caby M. P. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma / M. P. Caby//Int. Immunol. -2005. -Vol. 17,N7.-P. 879-887.

47. CC CKR5: a RANTES, MIP-1 alpha, MlP-lbeta receptor as a fusion cofactor for macrophage tropic HIV-1 / G. Alkhatib et al. // Science. 1996. -Vol. 272, N 5270. - P. 1955-1958.

48. Cell Death Independent of Caspases: A Review / L. E. Broker, F. A. E. Kruyt, G. Giaccone //Clin. Cancer. -2005. Vol. 11, N 9. -P. 3155-3162.

49. Characterization and molecular basis of the oligomeric structure of HIV-1 nef protein / S. Arold et al. // Protein Sci. 2000. - Vol. 9, N 6. - P. 11371148.

50. Clinical effects and toxicity of interleukin-2 in patients with cancer / M. T. Lotze et al. // Cancer. 1986. - Vol. 58, N 12. - P. 2764-2772.

51. Cohen G. B. The selective down-regulation of class I major histocompatibility complex proteins by HIV-1 protects HIV-infected cells from NK cells / G. B. Cohen, R. T. Gandhi, D. M. Davis et al. // Immunity. -1999.-Vol. 10, N6.-P. 661-671.

52. Cohen O. Host factors in the pathogenesis of HIV disease. / O. Cohen, A. Kinter, A. S. Fauci // Immunol. Rev. 1997. - Vol. 159, N 8. - P. 31-48.

53. Complementation cloning of an MHC class II transactivator mutated in hereditary MHC class II deficiency (or bare lymphocyte syndrome) / V. Steimle et al. // Cell. 1993. - Vol. 75, N 1. -P. 135-146.

54. Cossarizza A. T-cell repertoire and HTV infection: facts and perspectives (Editorial Review) / A. Cossarizza // AIDS. 1997. - Vol. 11, N 9. -P. 1075-1088.

55. Cossarizza A. Apoptosis and HIV Infection: About Molecules and Genes / A. Cossarizza// Curr. Pharm. Des. 2008. - Vol. 14, N3. - P. 237-244.

56. Co-translational myristoylation alters the quaternary structure of HIV-1 Nef in solution / C. A. Denis et al. // Proteins. 2005. - Vol. 60, N 1. -P. 658-669.

57. CXCR4 utilization is sufficient to trigger CD4+ T cell depletion in HIV-1-infected human lymphoid tissue / M. L. Penn et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96, N 2. - P. 663-668.

58. Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of resting human T lymphocytes / D. Unutmaz et al. // J. Exp. Med. 1999. - Vol. 189, N 11. -P. 1735-1746.

59. Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis / D. A. Mower etal.// J. Immunol. 1994. - Vol. 152, N 4. - P. 4832-4842.

60. Dendritic cell regulation of immune responses: a new role for interleukin 2 at the intersection of innate and adaptive immunity / F. Granucci et al. // EMBO J. -2003. Vol. 22, N 11. - P. 2546-2551.

61. Deniaud A. Mitochondrial membrane permeabilization by HIV-l Vpr / A. Deniaud, C. Brenner, G. Kroemer // Mitochondrion. 2004. - Vol. 4, N 2-3. -P. 223-233.

62. Disruption of the yc cytokine network in T cells during HIV infection / D. Sirskij et al. // Cytokine. 2008. - Vol. 43, N 8. - P. 1-14.

63. Dissociation of the CD4 down-regulation and viral infectivity enhancement functions of human immunodeficiency virus type 1 Nef / M. A. Goldsmith et al. // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N 4. - P. 4112-4121.

64. DNA damage triggers a prolonged p53-dependent G1 arrest and long-term induction of Cipl in normal human fibroblasts / A. Di Leonardo et al. // Genes Dev. 1994. - Vol. 8, N 21. - P. 2540-2551.

65. Down-regulation of CD4 molecules by the expression of Nef: a quantitative analysis of CD4 antigens on the cell surfaces / M. Inoue et al. // Int. Immunol. 1993. - Vol. 5, N 9. -P. 1067-1073.

66. Dual role of HTV Tat in regulation of apoptosis in T cells / T. W. McCloskey et al. // J. Immunol. -1997. Vol. 158, N 2. - P. 1014-1019.

67. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways / D. Vercammen et al. // J. Exp. Med. -1998. -Vol. 188, N5.-P. 919-930.

68. Ducrey-Rundquist O. Modalities of Interleukin-7-induced human immunodeficiency virus permissiveness in quiescent T lumphocytes / O. Ducrey-Rundquist, M. Guyader, D: Trono // J. Virol: 2002. - Vol. 76, N 18. -P. .9103-9111.

69. Early production of IL-4 and induction of Th2 responses in the lymph node originate from an MHC class I-independent CD4+NK1.1- T cell population / T. von der Weid et al. // J. Immunol. 1996. - Vol. 157, N 10. -p. 4421-4427.

70. Eguchi Y. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis / Y. Eguchi, S. Shimizu, Y. Tsujimoto // Cancer Res. -1997. -Vol. 57, N10.-P. 1835-1840.

71. Ellis R. E. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans / R. E. Ellis, D. M. Jacobson, H. R. Horvitz // Genetics. 1991. - Vol. 129, N 1. - P. 79-94.

72. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein / O. Schwartz et al.'// Nat. Med. -1996. -Vol. 2, N 3. P. 338-342.

73. Enhanced HIV expression during Th2-oriented responses explained by the opposite regulatory effect of IL-4 and IFN-y on fiisin/CXCR4 / G. Galli et al. //Eur. J. Immunol. 1998. - Vol. 28,N 10. -P. 3280-3290.

74. Espert L. What is the role of autophagy in HIV-1 infection? / L. Espert, P. Codogno, M. Biard-Piechaczyk // Autophagy. 2008. - Vol. 4, N 3. -P. 273-275.

75. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane / A. M. Booth et al. // J. Cell Biol. 2006. - Vol. 172, N6.-P. 923-935.

76. Fackler O. T. Modulation of the immunological synapse: a key to the HTV-1 pathogenesis? / O. T. Fackler, A. Alcover, O. Schwartz // Nature Rev. Immunology. -2007. Vol. 7, N 5. -P. 310-317.

77. Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals / P. D. Katsikis et al. // J. Exp. Med. 1995. - Vol. 181, N 6. - P. 2029-2036.

78. Fas-induced caspase denitrosylation / J. B. Mannick et al. // Science. -1999. Vol. 284, N 5414. - P. 651-654.

79. Fevrier B. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages / B. Fevrier, G. Raposo // Curr. Opin. Cell. Biol. 2004. - Vol. 16, N4.-P. 415-421.

80. Fry T. J. Interleukin-7: master regulator of peripheral T-cell homeostasis? / T. J. Fry, C. L. Mackall // Trends Immunol. 2001. - Vol. 22, N 10. -P. 564-571.

81. Fulda S. Exploiting death receptor signaling pathways for tumor therapy / S. Fulda, K. M. Debatin // Biochim. Biophys. Acta. -2004. Vol. 1705, N 1. -P. 27-41.

82. Garg H. HIV gp41-induced apoptosis is mediated by caspase-3-dependent mitochondrial depolarization, which is inhibited by HIV protease inhibitor nelfinavir / H. Garg, R. Blumenthal // J. Leukoc. Biol. 2006. - Vol. 79, N 2. -P. 351-362.

83. Gene expression profiling of host response in models of acute HTV infection / S. E. Bosinger et al. // J. Immunol. 2004. - Vol. 173, N 11. -P. 6858-6863.

84. Genomic structure of an attenuated quasi species of HIV-1 from a blood transfusion donor and recipients / N. J. Deacon et al. // Science. 1995. -Vol. 270, N5238. - P. 988-991.

85. Geyer M. Structure-function relationships in HIV-1 Nef / M. Geyer, O. T. Fackler, B. M. Peterlin // EMBO Rep. 2001. - Vol. 2, N 7. - P. 580-585.

86. Gozuacik D. Authophagy and cell death / D. Gozuacik, A. Kimchi // Curr. Top. Dev. Biol. 2007. - Vol. 78, N 7. - P. 217-245.

87. Gpl20 is present on the plasma membrane of apoptotic CD4 cells prepared from lymph nodes of HIV-1-infected individuals: an immunoelectron microscopic study / I. Sunila et al. // AIDS. 1997. - Vol. 11, N 1. -P. 27-32.

88. Green D. R. Mitochondria and apoptosis / D. R. Green, J. C. Reed // Science. 1998. - Vol. 281, N 5381. -P. 1309-1312.

89. Green D. R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors / D. R. Green //Cell.-2000.-Vol. 102,N1.-P. 1-4.

90. Greenberg A. H. Activation of apoptosis pathways by granzyme B / A. H. Greenberg // Cell Death Differ. 1996. - Vol. 3, N 3. -P. 269-274.

91. Greene W. C. Charting HIV's remarkable voyage through the cell. Basic science as a passport to future therapy / W. C. Greene, B. M. Peterlin // Nature Med. 2002. - Vol. 8, N 4. - P. 673-680.

92. Haase A. T. Perils at mucosal front lines for HIV and SIV and their hosts / A. T. Haase // Nature Rev. Immunol. 2005. - Vol. 5, N 8. - P. 783-792.

93. Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor / L. Ravagnan et al. //Nat. Cell Biol. -2001. Vol. 3, N 9. - P. 839-843.

94. Hersey P. Overcoming resistance of cancer cells to apoptosis / P. Hersey, X. D. Zhang // J. Cell. Physiol. 2003. - Vol. 196, N 1. - P. 9-18.

95. Hierarchical regulation of mitochondrion-dependent apoptosis by BCL-2 subfamilies / H. Kim et al. // Nat. Cell Biol. 2006. - Vol. 8, N 12. -P. 1348-1358.

96. High expression of APO-1 (CD95) on T lymphocytes from human immunodeficiency virus-1-infected children / K. M. Debatin et al. // Blood. 1994. - Vol. 83, N 10. -P. 3101-3103.

97. HIV enters cells via endocytosis and dynamin-dependent fusion with endosomes / K. Miyauchi et al. // Cell. 2009. - Vol. 137, N 3. -P. 433-444.

98. HTV Nef is secreted in exosomes and triggers apoptosis in bystander CD4+ T cells/M. Lenassi et al.//Traffic.-2010.-Vol. 11,N1.-P. 110-122.

99. HIV/SIV escape from immune surveillance: focus on Nef / M. Tolstrup et al. // Curr. HIV Res. 2004. - Vol. 2, N 2. - P. 141-151.

100. HIV-1 actively replicates in naive CD4+ T cells residing within human lymphoid tissues / D. A. Eckstein et al. // Immunity. 2001. - Vol. 15, N 4. -P. 671-682.

101. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse / C. Jolly et al. // J. Exp. Med. 2004. - Vol. 199, N 2. - P. 283-293.

102. HIV-1 entry into quiescent primary lymphosytes: molecular analysis reveals a labile, latent viral structure / J. Zack et al. // Cell. 1990. - Vol. 61, N 2. -P. 213-222.

103. HIV-1 genes Vpr and Nef synergistically damage podocytes, leading to glomerulosclerosis / Y. Zuo et al. // J. Am. Soc. Nephrol. 2006. - Vol. 17, N10.-P. 2832-2843.

104. HIV-1 infection of human macrophages impairs phagocytosis and killing of Toxoplasma gondii / B. A. Biggs et al. // J. Immunology. 1995. - Vol. 54, N11.-P. 6132-6139.

105. HTV-1 Nef associated PAK and PI3-kinases stimulate Akt-independent Bad-phosphorylation to induce anti-apoptotic signals / D. Wolf et al. // Nat. Med. -2001.-Vol. 7, N11.-P. 1217-1224.

106. HTV-1 Nef control of cell signalling molecules: multiple strategies to promote virus replication / A. L. Greenway et al. // J. Biosci. 2003. - Vol. 28, N10.-P. 323-335.

107. HIV-1 Nef down-regulates MHC-1 by a PACS-1 and PI3K-regulated ARF6 endocytic pathway / A. D. Blagoveshchenskaya et al. // Cell. - 2002. -Vol. Ill, N6.-P. 853-866.

108. HIV-1 Nef enhances both membrane expression and virion incorporation of Env products. A model of the Nef-dependent increase of HIV-1 infectivity /1. Schiavoni et al. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, N 22. - P. 22996-3006.

109. HIV-1 Nef inhibits ASK1-dependent death signaling providing a potential mechanism for protecting the infected host cell / R. Geleziunas et al. // Nature.-2001.-Vol. 410, N 6830.-P. 834-838.

110. HTV-1 Nef intersects the macrophage CD40L signaling pathway to promote resting-cell infection / S. Swingler et al. // Nature. 2003. - Vol. 424, N6945.-P. 213-219.

111. HIV-1 Nef mediates lymphocyte chemotaxis and activation by infected macrophages / S. Swingler et al. // Nature Med. 1999. - Vol. 5, N 9. -P. 997-1003.

112. HTV-1 protease cleavages procaspase 8 in vivo / Z. Nie et al. // J. Virol. -2007.-Vol. 81, N 12.-P. 6947-6956.

113. HIV-1 protein Nef protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes / K. L. Collins et al. // Nature. 1998. - Vol. 391, N6665.-P. 397- 401.

114. HTV-1 Tat targets microtubules to induce apoptosis, a process promoted by the pro-apoptotic Bcl-2 relative Bim. / D. Chen et al. // EMBO J. -2002. -Vol. 21, N24.-P. 6801-6810.

115. HIV virology and pathogenetic mechanisms of infection: a brief overview / E. Fanales-Belasio et al. // Ann. 1st. Super Sanit. 2010. - Vol. 46, N. 1. -P. 5-14.

116. Horuk R. Chemokine receptors and HIV-1: the fusion of two major research fields / R. Horuk // Immunol. Today. 1999. - Vol. 20, N 2. - P. 89-94.y1 1!

117. Hsu H. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-kappa B activation / H. Hsu, J. Xiong, D. V. Goeddel // Cell. 1995. -Vol. 81,N4.-P. 495-504.

118. Human immunodeficiency virus type 1 Nef binds to tumor suppressor p53 and protects cells against p53-mediated apoptosis / A. L. Greenway et al. // J. Virol. 2002. - Vol. 76, N 19. - P. 2692-2702.

119. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein sensitizes CD4(+) T lymphoid cells to apoptosis via functional up-regulation of the CD95/CD95 ligand pathway / G. Zauli et al. // Blood. 1999. - Vol. 93, N 3. -P. 1000-1010.

120. Human immunodeficiency virus type 1 replication is blocked prior to reverse transcription and integration in freshly isolated peripherial blood monocytes / S. Sonza et al. // J. Virol. 1996. - Vol. 70, N 6. - P. 38633869.

121. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr induces apoptosis through caspase activation / S. A. Stewart et al. // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N 7. -P. 3105-3111.

122. Human immunodeficiency virus type-1 infection impairs the formation of the immunological synapse / M. I. Thoulouze et al. // Immunity. 2006. -Vol. 24, N34.-P. 547-561.

123. Identification of HTV-1 envelope glykoprotein in the serum of AIDS and ARC patients/ S. K. Oh et al. // J. Acquired Immune Defic. Syndr. 1992. -Vol. 5, N3. -P. 251.

124. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction / R. Hegde et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, N 1. - P. 432-438.

125. Identification of the Nef-associated kinase as p21-activated kinase 2 / G. H. Renkema et al. // Curr. Biol. 1999. - Vol. 9, N23. -P. 1407-1410.

126. IL-7 is a potent and proviral strain-specific inducer of latent HTV-1 cellular reservoirs of infected individuals on virally suppressive HAART / F. X. Wang etal.//J. Clin. Invest.-2005.-Vol. 115, N23.-P. 128-137.

127. IL-7 up-regulates HTV-1 replication in naturally infected peripheral blood mononuclear cells / M. D. Smithgall et al. // J. Immunol. 1996. -Vol. 156, N6.-P. 2324-2330.

128. IL-7-dependent extrathymic expansion of CD45RA+ T cells enables preservation of a naive repertoire / M. V. Soares et al. // J. Immunol. 1998. -Vol. 161, N 11. -P. 5909-5917.

129. Importance of the nef gene for maintenance of high virus loads and for development of AIDS / H. W. 3rd Kestler et al.*// Cell. 1991. - Vol. 65, N4.-P. 651-662.

130. In vivo analysis of Fas/FasL interactions in HTV-1 infected patients / A. D. Badley et al. // J. Clin. Invest. 1998. - Vol. 102, N 1. - P. 79-87.

131. In vivo evolution of Human Immunodeficiency Virus Type 1 toward increased pathogenicity through CXCR4-mediated killing of uninfected CD4 T cells/ A. Jekle et al. // J. Virol. 2003. - Vol. 77, N 10. - P. 5846-5854.

132. In vivo HIV-1 infection of CD45RA+ CD4+ T cells is established primarily by syncytium-inducing variants and correlates with the rate of CD4+ T cell decline / H. Blaak et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97, N3.-P. 1269-1274.

133. Increased production of IL-7 accompanies HIV-1-mediated T-cell depletion: implications for T-cell homeostasis / L. A. Napolitano et al. // Nat. Med. -2001.-Vol. 7, N 1. P. 73-79.

134. Inducible IL-2 production by dendritic cells revealed by global gene expression analysis / F. Granucci et al. // Nat. Immunol. 2001. - Vol. 2, N9.-P. 882-888.

135. Induction of HTV-1 replication in latently infected CD4+ T cells using a combination of cytokines / T. W. Chun et al. // J. Exp. Med. 1998. -Vol. 188, N1.-P. 83-91.

136. Inhibition of apoptosis by zinc: a reappraisal / D. Barbieri et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol. 187, N3. -P. 1256-1261.

137. Inhibition of CD4+ T cells function by the HIV envelope protein gpl20 / D. C. Diamond et al. // J. Immunology. 1988. - Vol. 141, N 11. -P. 3715-3717.

138. Interactions between Nef and AIP1 proliferate multivesicular bodies and facilitate egress of HTV-1 / L. J. Costa et al. // Retrovirology. 2006. - Vol. 14, N7.-P. 3-33.

139. Interference of HTV-1 Nef in the sphingomyelin transduction pathway activated by tumour necrosis factor-alpha in human glial cells / A. Richard et al. // AIDS. -1997. -Vol. 11, N1.-P. 1-7.

140. Interleukin 7 increases human immunodeficiency virus type 1 LAI-mediated Fas-induced T-cell death / J. D. Lelievre et al. // J. Virol. 2005. - Vol. 79, N5.-P. 3195-3199.

141. Interleukin-7-treated naive T cells can be productively infected by T-cell-adapted and primary isolates of human immunodeficiency virus 1 / C. M. Steffens et al. //Blood. 2002. - Vol. 99, N 9. -P. 3310-3318.

142. Isolation of a human gene that inhibits HTV-1 infection and is suppressed by the viral vif protein / A. M. Sheehy et al. // Nature. 2002. - Vol. 418, N 21.-P. 646-650.

143. Kedzierska K. Cytokines and HIV-1: interactions and clinical implications / K. Kedzierska, S. M. Crowe // Antivir. Chem. Chemother. 2001. - Vol. 12, N3.-P. 133-150.

144. Kerr J. F. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics / J. F. Kerr, A. H. Wyllie, A. R. Currie // J. Cancer. 1972. - Vol. 26, N 4. - P. 239-57.

145. Klionsky D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade / D. J. Klionsky // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. -Vol. 8, N11.-P. 931-937.

146. Korin Y. D. Progression to the Gib phase of the cell cycle is required for completion of induced human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription in T cells / Y. D. Korin, J. A. Zack // J. Virol. 1998. - Vol. 72, N4.-P. 3161-3168.

147. Lane H. C. Pathogenesis of HIV infection: total CD4+ T-cell pool, immune activation, and inflammation / H. C. Lane // Top HIV Med. 2010. - Vol. 18, Nl.-P. 2- 6.

148. Le Pett S. Cytokines therapies of HTV-1 infection / S. Le Pett, A. D. Kelleher // Expert Rev. Anti-infect. Ther. 2003. - Vol. 1, N 1. - P. 89-102.

149. Lentivirus Nef specifically activates Pak2 / V. K. Arora et al. // J. Virol. -2000.-Vol. 74, N23-P. 11081-11087.

150. Levine B. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy / B. Levine, D. J. Klionsky // Dev. Cell. -2004. Vol. 6, N 4. - P. 463-477.

151. Levine B. Autophagy in cell death: an innocent convict? / B. Levine, J. Yuan//J. Clin. Invest. -2005. Vol. 115, N 10. -P. 2679-2688.

152. Levine B. Autophagy in the pathogenesis of disease / B. Levine, G. Kroemer // Cell. 2008. - Vol. 132, N 1. - P. 27-42.

153. Li L. Y. Endonuclease Gis an apoptotic DNase when released from mitochondria / L.Y. Li, X. Luo, X. Wang // Nature. 2001. - Vol. 412, N6842.-P. 95-99.

154. Lindwasser O. W. Mechanisms of CD4 down-regulation by the Nef and Vpu proteins of primate immunodeficiency viruses / O. W. Lindwasser, R. Chaudhuri, J. S. Bonifacino // Cur. Mol. Med. 2007. - Vol. 7, N 10. -P. 171-184.

155. Macrophage-dependent apoptosis of CD4+ T lymphocytes from HIV-infected individuals is mediated by FasL and tumor necrosis factor // A. D. Badley etal.//J. Exp. Med. 1997. - Vol. 185, N1.-P. 55-64.

156. Marsh J. W. The numerous effector functions of Nef / J. W. Marsh // Arch. Biohem. Biophys. 1999. - Vol. 365, N 2. - P. 192-198.

157. Massive infection and loss of CD4+ T cells occurs in the intestinal tract of neonatal rhesus macaques in acute SIV infection / X. Wang et al. // Blood. -2007.-Vol. 109, N3.-P. 1174-1181.

158. Mattapallil J. J. Massive infection and loss of memory CD4+ T cells in multiple tissues during acute SIV infection / J. J. Mattapallil et al. // Nature. 2005. - Vol. 434, N 6. - P. 1093-1097.

159. Maurizio F. Role of the HTV-1 regulatory protein Nef / F. Maurizio // Future HIV Ther. 2008. -Vol. 2, N 1. - P. 37-45.

160. McConkey D. J. Apoptosis — molecular mechanisms and biomedical implications / D. J. McConkey, B. Zhivotovsky, S. Orrenius //Molec. Aspects Med.-1996.-Vol. 17, N1.-P. 1-110.

161. McConkey D. J. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis / D. J. McConkey // Toxicol. Lett. -1998. Vol. 99, N 3. -P. 157-168.

162. Metabolic catastrophe as a means to cancer cell death / S. Jin et al. // J. Cell Sci. -2007. -Vol. 120. -Pt. 3. P. 379-389.

163. Miller R. H. HTV accessory proteins as therapeutic targets / R. H. Miller, N. Sarver // Nat. Med. 1997. - Vol. 3, N 4. - P. 389-394.

164. Mule J. J. The anti-tumor efficacy of lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin 2 in vivo / J. J. Mule, S. Shu, S. A. Rosenberg // J. Immunol. 1985. - Vol. 135, N 1. - P. 646-652.

165. Muro-Cacho C. A. Analysis of apoptosis in lymph nodes of HIV-infected persons / C. A. Muro-Cacho, G. Pantaieo, A. S. Fauchi // J. Immunol. 1995. -Vol. 154, N 10. - P. 5555-5566.

166. Nagata S. The Fas death factor / S. Nagata, P. Golstein // Science. 1995. -Vol. 267, N 5203. - P. 1449-1456.

167. Nagata S. Apoptosis by death factor / S. Nagata // Cell. 1997. - Vol. 88, N3.-P. 355-365.

168. Napolitano L. A. Approaches to immune reconstitution in HIV infection / L. A. Napolitano//Top. HIV Med.-2003.-Vol. 11,N55.-P. 160-163.

169. Nef increases the synthesis of and transports cholesterol to lipid rafts and HIV-1 progeny virions / Y. H. Zheng et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. Vol. 100, N 45. - P. 8460-8465.

170. Nef induces multiple genes involved in cholesterol synthesis and uptake in human immunodeficiency virus type 1-infected T cells / A. B. van Wout et al. // J. Virol. 2005. - Vol. 79, N 15. - P. 10053-10058.

171. Nef is physically recruited into the immunological synapse and potentiates T cell activation early after TCR engagement / D. Fenard et al. //J. Immunol. -2005. Vol. 175, N 9. - P. 6050-6057.

172. Nef modulates the immunogenicity of Gag encoded in a non-infectious HTV DNA vaccine / G. Arrode et al. // Vaccine. 2008. - Vol. 26, N 31. -P. 3795-3804.

173. Nef-induced alteration of the early/recycling endosomal compartment correlates with enhancement ofHIV-1 infectivity/R. Madrid et al:.-// J. Biol; Chem. 2005. - Vol. 280, N 6. - P. 5032-5044.

174. Nicholson D. W. Caspases: Killer proteases / D. W. Nicholson, N. A. Thornberry // Trends Biochem. Sci. 1997. - Vol. 22, N 8. - P. 299-306.

175. Nonproliferating bystander CD4+ T cells lacking activation markers support HTV replication during immune activation / D. Scales et al. // J. Immunol. -2001. Vol. 166, N 10. - P. 6437-6443.

176. Okada H. Inhibition of HIV-1 Nef-induced apoptosis of uninfected human blood cells by serine/threonine protein kinase inhibitors, fasudil hydrochloride and M3 / H. Okada, R. Takei, M. Tashiro // FEBS Lett. 1998. - Vol. 422, N3.-P. 363-367.

177. Oligomerization is required for HTV-1 Nef-induced activation of the Src family protein-tyrosine kinase, Hck / H. Ye et al. // Biochemistry. 2004. -Vol. 43, N 50. - P. 15775-15784.

178. Pathogenicity and immunogenicity of attenuated, nef-deleted HIV-1 strains in vivo / P. R. Gorry et al. // Retrovirology. 2007. - Vol. 4, N 23. - P. 66.

179. Phillips D. M. The role of cell-to-cell transmission in HTV infection / D. M. Phillips // AIDS. 1994. - Vol. 8, N 6. -P. 719-731.

180. Popik W. Human immunodeficiency virus type 1 uses lipid raft-co-localized CD4 and chemokine receptors for productive entry into CD4+ T cells / W. Popik, T. M. Alee, W. C. Au // J. Virol. 2002. - Vol. 76, N 10: -P. 4709-4722.

181. Potential role for TL-7 in Fas-mediated T cell apoptosis during HTV infection / C. Fluur et al. // J. Immunol. 2007. - Vol. 178, N 8. - P. 5340-5350.

182. Preferential Apoptosis of HTV-1-Specific CD4+ T Cells / Y. Y. Feng et al. //J. Immunol. 2005. - Vol. 174, N 9. - P. 2196-2204.

183. Propagation and dissemination of infection after vaginal transmission of simian immunodeficiency virus / C. J. Miller et al. // J. Virol. 2005. -Vol. 79, N7.-P. 9217-27.

184. Regulation of membrane trafficking and subcellular organization of endocytic compartments revealed with FM1-43 in resting and activated human T cells / A. F. Fomina et al. // Exp. Cell Res. 2003. - Vol. 291, N l.-P. 150-166.

185. Requirement of human immunodeficiency virus type 1 nef for in vivo replication and pathogenicity / B. D. Jamieson et al. // J. Virol. 1994. -Vol. 68, N6.-P. 3478-3485.

186. Richter C. Control of apoptosis by the cellular ATP level / C. Richter et al. //FEBS Lett.-1996.-Vol. 378, N34.-P. 107-110.

187. Roeth J. F. Human immunodeficiency virus type 1 Nef: adapting to intracellular trafficking pathways / J. F. Roeth, K. L. Collins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. - Vol. 70, N 87. - P. 548-563.

188. Rubbert A. New aspects of the pathogenesis of HTV infections? / A. Rubbert // Zentralbl. Cynakol. 1999. - Vol. 121, N 11. - P. 543-545.

189. Ruiz-Mateos E. Endogenous IL-7 is associated with increased thymic volume in adult HIV-infected patients under highly active antiretroviral therapy / E. Ruiz-Mateos // AIDS. 2003. - Vol. 17, N 11. - P. 947-954.

190. Savill J. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis / J. Savill, V. Fadok, P. Henson, C. Haslett // Immunol Today. 1993. - Vol. 14, N 3. -P. 131-136.

191. Schorey J. S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology / J. S. Schorey, S. Bhatnagar // Traffic. 2008. - Vol. 9, N 6. -P. 871-881.

192. Schreck R. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HTV-1 / R. Schreck, P. Reiber, P. A. Baeuerle // EMBO J. -1991. Vol. 10, N 8. -P. 2247-2258.

193. Schwarz K. B. Oxidative stress during viral infection: a review / K. B. Schwarz //Free Radic. Biol. Med. -1996. Vol. 21, N 5. - P. 641-649.

194. Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations duing early lymphocyte apoptosis / M. Castedo et al. // J. Immunol. 1996. -Vol. 157,N2.-P. 512-521.

195. Sherr C. J. Cancer cell cycles / C. J. Sherr // Science. 1996. -Vol. 274, N5293.-P. 1672-1677.

196. Shintani T. Autophagy in health and disease: a double-edged sword / T. Shintani, D. J. Klionsky // Science. 2004. - Vol. 306, N 5698. - P. 990-995.

197. Signaling but not trafficking function of HIV-1 protein Nef is essential for Nef-induced defects in human intra-thymic T-cell development / V. Stove et al. // Blood. 2003. -Vol. 102, N 8. - P. 2925-2932.

198. Simons M. Exosomes vesicular carriers for intercellular communication / M. Simons, G. Raposo // Curr. Opin. Cell Biol. - 2009. - Vol. 21, N 4. -P. 575-581.

199. Species-specific exclusion of APOBEC3G from HIV-1 virions by vif / R. Mariani et al. // Cell. -2003. -V. 114, N 1. -P. 21-31.

200. Specific and distinct determinants mediate membrane binding and lipid raft incorporation of HIV-1(SF2) Nef / S. I. Giese et al. // Virology. 2006. -Vol. 355, N2.-P. 175-191.

201. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide / H. Steller // Science. -1995. Vol. 267, N 5203. - P. 1445-1449.

202. Stevenson M. HIV-1 pathogenesis / M. Stevenson // Nature Med. 2003. -Vol. 9, N7. -P. 853-860.

203. Stimulation of human immunodeficiency virus type 1 expression by ceramide / B. Papp et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - Vol. 10, N7.- P. 775-780.

204. Strasser A. The role of BH3-only proteins in the immune system / A. Strasser //Nat. Rev. Immunol. -2005. Vol. 5, N 3. - P. 189-200.

205. Striking similarities between HIV-1 Env protein and the apoptosis mediating cell surface antigen Fas. Role in the pathogenesis of AIDS / J. F. Zagury et al. //Biomed. Pharmacother. -1993. Vol. 47, N 8. -P. 331-335.

206. Susceptibility of HTV-1-TAT transfected cells to undergo apoptosis. Biochemical mechanisms / A. Macho et al. // Oncogene. 1999. - Vol. 18, N52.-P. 7543-7551.

207. T-cell dynamics during acute SIV infection / J. J. Mattapallil et al. // AIDS. -2004.-Vol. 18, N8.-P. 13-23.

208. TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearing the TCR/CD3/zeta complex/ N. Blanchard et al. // J. Immunol. -2002. Vol. 168, N 7. -P. 3235-3241.

209. The decreased replicative capacity of simian immunodeficiency virus SIVmac239A(nef) is manifest in cultures of immature dendritic cells and T cells / D. Messmer et al. // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N 5. - P. 2406-2413.

210. The HIV-1 viral protein R induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore / E. Jacotot et al. // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 191, N 1. - P. 33-46.

211. The Nef protein of HTV-1 associates with rafts and primes T cells for activation / J. K. Wang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -Vol. 97, N1.-P. 394-399.

212. The release of cytochrome C from mitochondria: A primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis / R. M. Kluck et al. // Science. 1997. - Vol. 275, N5303.-P. 1132-1136.

213. Thornberry N. A. Caspases: Enemies within / N. A. Thornberry, Y. Lazebnik//Science. 1998. - Vol. 281, N5381. -P. 1312-1316.

214. Toxic proteins released from mitochondria in cell death. / X. Saelens et al. // Oncogene. 2004. - Vol. 23, N 16. -P. 2861-2874.

215. Transgenic mice expressing human immunodeficiency virus type 1 in immune cells develop a severe AIDS-like disease / Z. Hanna et al. // J. Virol. -1998. Vol. 72, N 1. - P. 121-132.

216. Type 1/type 2 cytokine modulation of T-cell programmed cell death as a model for human immunodeficiency virus pathogenesis / M. Clerici et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. Vol. 91, N 25. -P. 11811-1185.

217. Unutmaz D. Antigen-independent activation of naive and memory resting T cells by a cytokine combination / D. Unutmaz, P. Piled, S. Abrignani // J. Exp. Med.-1994.-Vol. 180,N3.-P. 1159-1164.

218. Vaux D. L. The molecular biology of apoptosis / D. L. Vaux, A. Strasser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93, N 6. - P. 2239-2244.

219. Villa P. Caspases and caspase inhibitors / P. Villa, S. H. Kaufmann, W. C. Earnshaw // Trends Biochem. Sci. 1997. - Vol. 22, N 10: - P. 388-393.

220. Waldmann T. A. T-cell receptors for cytokines: targets for immunotherapy of leukemia/lymphoma / T. A. Waldmann // Ann. Oncol. 2000. - Vol. 11, Suppl. l.-P. 101-106.

221. Westendorp M. O. Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by fflV-l Tat and gpl20 / M. O. Westendorp et al. // Nature. 1995. -Vol. 375, N 6531. - P. 497-500.

222. Wong-Staal F. HTVes and their replication / F. Wong-Staal // Fundamental Virology / eds.: F. Wong-Staal et al.. New York : Raven Press, Ltd, 1991. -P. 112-124.

223. Wu Y. Selective transcription and modulation of resting T cell activity by preintegrated HIV DNA / Y. Wu, J. W. Marsh // Science. 2001. - Vol. 293, N5534.-P. 1503-1506.

224. Xu X. N. Induction of Fas ligand expression by HIV involves the interaction of Nef with the T cell receptor zeta chain / X. N. Xu et al. // J. Exp. Med. -1999.-Vol. 189, N9.-P. 1489-1496.

225. Yokoyama W. M. Natural killer cell receptors / W. M. Yokoyama // Cur. Opin. Immunol. 1998. - Vol. 10, N 3. -P. 298-305.

226. Youle R. J. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death / R. J. Youle, A. Strasser // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. - Vol. 9, N4.-P. 47-59.

227. ZAP-70 kinase regulates HTV cell-to-cell spread and virological synapse formation / N. Sol-Foulon et al. // EMBO J. 2007. - Vol. 26, N2,-P. 516-526.

228. Zur Struktur und Funktion bei HIV/ H. R. Gelderblom et al. // AIFO. -1993.-Vol. 5, N 1. —P. 231.

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции

Оглавление диссертации Иванкова, Анна Викторовна :: 2010 :: Казань

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Иванкова, Анна Викторовна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Роль ВИЧ-1 белка Nef в цитокин-индуцированной репликации вируса и регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Иванкова, Анна Викторовна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций