Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Цитокины в иммунопатгенезе и клинических проявлениях ВИЧ-инфекции

РГБ ОД 1 1 ММ»

На правах рукописи

КАЛИНИНА Наталия Михайловна

ЦИТОКИНЫ В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ И КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЯХ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 1996

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней с курсом лаборатоной дианостики СПИД Санкт-Петебургской медицинской академии последипломного образования и в лаборатории иммунофармаколопш ГосНИИ особо чистых биопрепаратов.

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

профессор А.Г. Рахманова

доктор биологических наук, профессор С.А. Кетлинский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор А.Т. Журкин

член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук профессор O.A. Дунаевский

доктор медицинских наук профессор Б.В. Пипегин

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт 1риппа

РАМН

Зашита состоится ".М? " марта 1996 г. в II час. на заседании диссертационного совета Д 074.16.05 при Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования по адресу: 193015, Санкт-Петербург, ул.Салтыкова-Щедрина, 41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии. ^

Автореферат разослан "^У " 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

доцент В.К.Пригожина

Актуальность проблемы

ВИЧ-инфекция и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) являются наиболее интенсивно изучаемыми в истории биомедицинских исследований [Покровский В.И., 1989, 1994; Рахманова А.Г., 1992; Хаитов P.M., 1992; Сизякина Л.П., 1994.; Пннегин Б.В., 1994; Fauci, 1991; Matsuyama, 1991; Levy J.A., 1993 и другие]. Хотя течение инфекции, вызываемой ВИЧ, может варьировать - общая направленность развития болезни неизменна [Хаитов P.M., 1992; Покровский В.И., 1994; Blattner W., 1988, Freed Е.О., 1990; Fauci А., 1991; Habeshaw Т.А., 1994; Bentwich Z., 1995,]. Первичная инфекция ВИЧ характеризуется развитием выраженного гуморального и клеточного ответа на вирус и последующим наступлением клинически латентного периода (медиана 10 лет), в течение которого у пациентов не обнаруживается никаких симптомов заболевания [Покровский В.В. с соавт., 1990; Amadori А., 1991; Hoffman G., 1991; Nindall В., 1991; Levy J„ 1993, Mahalingam M., 1993; Fust G., 1995]. Клинические проявления болезни возникают в период сформировавшегося синдрома приобретенного иммунодефицита, когда отсутствие реактивности иммунной системы приводит к множеству энпортунистических инфекций, поражению органов и смерти [Tersmenne М., 1990; Rosenberg Z.E., 1991; Ulich T.R., 1993].

Все исследователи единогласны в мнении, что ВИЧ играет первую золь в инициации и развитии патологического процесса [Blattner W., 1988; Bagasra О., 1992; Michael N.L., 1992]. Тем не менее немало южных спорных вопросов, касающихся патогенеза ВИЧ-инфекшш, с тмунологической и вирусологической точки зрения остаются ^решенными. Как показано многими авторами [Schnittman S.M., 1989; Zözenberg Z., 1990; Daar E„ 1991; Graciosi C., 1992; Plantalco G., 1993], шел о инфицированных ВИЧ периферических мононуклеарных клеток [вляется низким, хотя при этом абсолютное количество CD4 шмфоцитов прогрессивно снижается в циркуляции и необратимо 1арушаются функции иммунной системы у большинства пациентов Rinaldo С., 1989; Moore J., 1991; Micali S., 1993; Miedema F., 1994]. вышесказанное стимулирует поиск механизмов иммунных нарушений, |Ссониированных с ВИЧ-инфекцией, вызывающих дисфункцию и

разрушение иммуноцитов и приводящих в конечном счете к гибели больного.

Как известно, вирусы (и особенно ВИЧ) для своего существования и репликации не только нарушают, но и используют защитные механизмы хозяина [Fauci А., 1988; Kim S., 1990; Hoffman G., 1991; Fauci A., 1992; Butera, 1993; Hadeshaw T.A., 1994]. Это касается в полной мере взаимодейстия между ВИЧ и цитокиновой сетью: увеличение синтеза и продукции ряда цитокинов способствует экспрессии вируса [Matsuyama Т., 1988, 1991; Kobayashi N.. 1991; Emilie D., 1993; Poli G., 1993]. ВИЧ использует- активацию синтеза цитокинов для регуляции своей экспрессии в клетке, находясь в "дремлющем" состоянии до тех пор, пока не появятся соответствующие внеклеточные условия [Matsuyama Т., 1989; Kobayashi N.. 1991; Mabondzo А., 1991; Butera S.T., 1993]. ВИЧ в свою очередь играет активную роль в регуляции синтеза и продукции цитокинов [Nakajima К., 1989; Kobayashi N.. 1990; Merril J.E., 1991; Scott-Algara D., 1991; Rautonen J., 1991; Clouse К., 1991; Buonaguro L„ 1992]. В настоящее время известно, что ВИЧ иншбирует продукцию ИЛ-2 и ИФН-у, относящихся к цитокинам, синтезирующихся первым типом Т-хелперов (Txl), тоща как продукция цитокинов, синтезируемых Т-хелперами второго типа (Тх2), не ингибируется вирусом [Has С., 1990; Allouche M., 1990; Lafeuillade L., 1991; Maza О., 1993; Montaner L., 1994; Mosmann N.R., 1994]. Нарушения в синтезе цитокинов при ВИЧ-инфекции инициирует переключение иммунного ответа с Txl типа на Т-2, способствуя стимуляции гуморального звена иммунитета [Clerici M., 1993; Mannetti R., 1994; Montaner L., 1994; Del Prete G., 1994; Graziosi C„ 1994; Maggi E., 1994].

Возникновение лихорадки, кахексии, церебральных нарушений, анемии, воспалительных процессов на коже и слизистых, саркомы Капоши, диарреи и других клинических проявлений опосредовано в определенной мере гиперпродукцией провоспалительных цитокинов -ФНО-а, ИЛ-lß, ИЛ-6 [Blatteis С.М., 1990; Kluger M.J., 1991; Kolias G., 1993; Remick D.G., 1993; Ulich T.R., 1993].

Вышеизложенное определяет актуальность изучения продукции медиаторов иммунитета - цитокинов при ВИЧ-инфекции и особенно тех, которые непосредственно принимают участие в репликации ВИЧ.

Цель работы

Обосновать роль нарушений в цитокиновой сети иммунной системы в патогенезе и клинических проявлениях ВИЧ-инфекции.

Основные задачи исследования

1. Изучить характер взаимодействия ВИЧ и клеток иммунной системы хозяина с помощью синтетических пептидов, гомологичных структуре гликопротеина Ер120, и определить способность этих пептидов индуцировать синтез цитокинов.

2. Выявить маркеры генетической детерминированности особенностей продукции цитокинов и показать взаимосвязь нарушений в синтезе изучаемых цитокинов и изменений других показателей иммунной системы с продукцией белка р24 и клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции.

3. Определить критерии нарушения функциональной активности клеток иммунной системы на основании изучения спонтанной и индуцированной продукции цитокинов и представить взаимосвязь характера этих изменений с показателями клеточного иммунитета в динамике развития ВИЧ-инфекции.

4. Установить взаимосвязь между нарушением продукции цитокинов, клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции и прогрессией заболевания.

Научная новизна

На основании комплексных клинико-иммунологических исследований сформулирована научно обоснованная концепция, определяющая роль цитокинов в иммунопатогенезе и клинических проявлениях ВИЧ-инфекции.

Доказана генетическая детерминированность уровня продукции ФНО-а, одного из патогенетических факторов, способствующего репликации вируса, определяющего множественные изменения в иммунной системе, характер течения и скорость прогрессировать ВИЧ-инфекции.

Сформулированы иммунологические и иммупогенетические критерии прогнозирования темпов прогрессирования ВИЧ-инфекции.

На модели с использованием синтетических пептидов, гомологичных структуре белка gpl20, показан механизм взаимодействия между белками ВИЧ и клетками иммунной системы.

Показано, что прогрессирующее снижение уровня индуцированной продукции ИЛ-2 in vitro у больных ВИЧ-инфекцией не коррелирует со снижением относительного и абсолютного числа клеток, несущих ИЛ-2 рецептор (CD25) in vivo.

Установлено, что соотношение между спонтанной и индуцированной продукцией воспалительных цитокинов отражает степень декомпенсации функции клеток иммунной системы в ходе ВИЧ-инфекции.

Показано, что уровень антигенемии в ходе ВИЧ-инфекции положительно коррелирует с уровнем ФНО-а и отрицательно с уровнем интерферона-a в сыворотке крови.

Практическая значимость работы

1. В результате проведенных исследований обоснована необходимость включения определения спонтанной и индуцированной продукции цитокинов (ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-6, ИНФ-а) в клинический мониторинг больных ВИЧ-инфекцией с целью оценки характера течения заболевания и проведения адекватной терапии.

2. На основании данных HLA типирования и определения маркеров активации иммунной системы выявлены и охарактеризованы "группы риска" со злокачественным течением заболевания, требующие раннего назначения этиотропных препаратов.

3. Выявленная высокая степень положительной корреляции между уровнями продукции белка ВИЧ р24 и ФНО-а позволяет использовать каждый из этих показателей для оценки эффективности противовирусной терапии.

Положения, выносимые на защиту

Обосновано положение о наличии генетически детерминированной продукции ФНО-а, цитокина, инициирующего экспрессию генов ВИЧ и определяющего темпы прогрессировать ВИЧ-инфекции.

Активация генов цитокинов и их синтез обусловлен связыванием белка gpl20 ВИЧ с молекулой CD4.

Соотношение между спонтанной и индуцированной продукцией цитокинов отражает степень декомпенсации функции клеток иммунной системы при ВИЧ-инфекции, определяющих прогрессировать болезни. Установлено, что снижение коэффициентов соотношения спонтанной и индуцированной продукций ИЛ-1Р, ФНО-а и ИЛ-б в динамике разития ВИЧ-инфекции сопровождается снижением продукции ИЛ-2 и уровня СБ4 клеток.

Обосновывается положение о роли интерферона а в эндогенной противовирусной защите у пациентов с низким уровнем репликации ВИЧ, определяемого по содержанию белка р24 в сыворотке.

Активация иммунной системы, вызванная гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, способствует репликации вируса и вызывает каскад нарушений других медиаторов иммупитета. Совокупность этих изменений приводит к прогрессированию иммунодефицита и темпов развития ВИЧ-инфекции.

На защиту выносится положение о целесообразности включения па ранних сроках болезни в комплексную терапию пациентов с ВИЧ-инфекцией и генетически детерминированной высокой продукцией ФНО-а лекарственных средств, подавляющих синтез и продукцию провоспалительных цитокинов.

Многолетнее наблюдение (более 3 лет) за пациентами с благоприятным течением болезни позволило выявить иммуногенетическне и иммунологические критерии, характерные для пациентов - долгожителей; постоянное присутствие высокого уровня интерферона а и низкого уровня ФНО-а и р24 в сыворотке крови; низкий процент клеток с "активационными" маркерами; наличие антигенов-"протекторов" в НЬА фенотипе.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях: Кейстоунской международной конференции по молекулярной и клеточной биологии, 25 января - 8 февраля 1992 г. (США); 3-й Международной конференции по цитокинам во Флоренции, 28-30 марта 1994 г.. Италия; 5-го Международного конгресса по ФНО в Монтерее, Калифорния, 30 мая - 3 июня 1994 года, США; 1-го

Международного симпозиума по ВИЧ и цитокинам в Реймсе 14-17 марта 1995 г., Франция; Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация и СПИД" (Ленинград, 1991 г.); 1-й, 2-й и 3-й международных конференциях "СПИД, рак и ретровирусы человека" (С.Петербург, 1993, 1994, 1995 гг.), 1-го съезда иммунологов СССР (Дагомыс, 1990 г.), 1-го съезда иммунологов России (Новосибирск, 1992); Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний" (Звенигород, 1990 г.).

По теме исследования опубликовано 35 работ в международных, отечественных журналах и сборниках научных трудов.

Практическая реализация работы

В практику клинико-иммунологаческого мониторинга больных ВИЧ-инфекцией, находящихся на лечении в больнице N 30 им.С.П.Боткина и Республиканской инфекционной больнице клиническом центре СПИД включено определение продукции цитокинов (ИЛ-1(3, ФНО-а, ИНФ-а) с целью оценки характера течения заболевания и проведения адекватной терапии. Определение уровней продукции белка ВИЧ р24 и ФНО-а. в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией используется для оценки эффективности противовирусной терапии. Материалы исследования используются в учебном процессе преподавателями кафедры инфекционных болезней Медицинской академии последипломного образования Санкт-Петербурга.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, клинической характеристики обследованных пациентов, четырех разделов собственных исследований, обсуждения результатов и концепции о роли цитокинов в иммунопатогенезе ВИЧ-инфекции, выводов и указателя литературы.

Основной текст изложен на 190 страницах машинописи, работа иллюстрирована 54 таблицами и 11 рисунками. Указатель литературы содержит 306 работ.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Обследовано 157 пациентов (69 детей и 88 взрослых) с ВИЧ-1 инфекцией, находившихся на лечении в Санкт-Петербургской инфекционной больнице N30 им. С. П. Боткина и Республиканской инфекционной больнице - клиническом центре СПИД. Диагноз пациентам был поставлен на основании клинических и эпидемиологических данных, результатов иммуноферментного анализа и подтвержден данными иммуноблоттинга с белками вируса иммунодефицита человека и гибридизации РНК вируса с олигонуклеотидными пробами.

Из 69 обследованных детей у 68 (98,5%) инфицирование ВИЧ произошло в результате парентеральных контактов с инфицированной кровью, ее продуктами или через медицинский инструментарий. У одного ребенка был выявлен вертикальный путь трансмиссии вируса от инфицированной матери. В обследованной группе превалировали пациенты в возрасте до 6 лет (73,8%), мужского пола (65,2%). В момент обследования все дети находились на этапе вторичных клинических проявлений инфекции (Покровский В.И., 1989). Пациенты получали специфическую терапию (азидотимидин и аналога). У 30% детей иммунологические и клинические параметры были изучены в динамике. У большинства обследованных детей отмечался неблагоприятный преморбидный фон, связанный с предсуществующими парентеральному инфицированию ВИЧ тяжелыми заболеванями, которые сопровождались у детей вторичными иммунодефицитными состояниями и способствовали быстрому развитию клинических проявлений болезни. Выявленные изменения со стороны внутренних органов и систем у детей, больных ВИЧ-инфекцией, соотносились со стадией заболевания. Так длительная лихорадка наблюдалась в стадии IIIA у 23,5%, а в стадии HIB уже у 81,0% детей. У всех больных в стадии СПИД отмечалось снижение веса. Поражения кожи и слизистых встречались в конце заболевания у 85100% детей. Характерным для группы ВИЧ-инфицированных детей являлась гепатомегалия, выявляемая у каждого ребенка уже в III А стадии. У обследованных детей выявлялись множественные

сопутствующие "СПИД-маркерные" инфекции. Наиболее часто встречающимися были герпетическая (у 66,7% пациентов), кашшдозная (у 80,9%) и цитомегаловирусная (у 52,4%) инфекции, а также инфекции, вызванные гемолитическим стрептококком (у 42,9% обследованных) и золотистым стафилококком (в 61,9% пациентов). Было выявлено сравнительно небольшое число детей, больных ВИЧ-инфекцией, с лейко- и лимфопенией. Другой особенностью обследованных была стойкая и выраженная анемия, которая встречалась у 52,9% пациентов в стадии ША, а в стации СПИД - у 85,7%.

Из 88 обследованных взрослых у 45 (51,1%) инфицирование ВИЧ произошло в результате гетеросексуальных, у 38 (43,2%) - в результате гомосексуальных контактов с ВИЧ-инфицированными партнерами, а у 5 женщин (5,7%) - в результате кормления грудью ВИЧ-инфицированных детей [Покровский В.В., 1982]. В обследованной группе взрослых превалировали пациенты в возрасте от 20 до 40 лет (84,1%), мужчины составляли 61,4%. В момент обследования 12,5% взрослых больных были в бессимптомной и 30,7% - в стадии персистирующей генерализованной лимфоаденопатии. Эти пациенты чувствовали себя практически здоровыми и не отмечали изменений трудоспособности. 45,4% взрослых пациентов получали специфическую терапию (азидотимидин и аналоги). У 53,4% взрослых иммунологические и клинические параметры были изучены в динамике. Изменения со стороны внутренних органов и систем наростали у взрослых и у детей, больных ВИЧ-инфекцией, по мере прогрессирования заболевания. Длительное повышение температуры отмечалось у 61,5% больных ШБ стадии и 100% больных в стадии СПИД. Поражение кожи и слизистых смешанной этиологии (бактериальной, вирусной, грибковой) отмечалось в ША стадии более чем у половины больных.

Обращает на себя внимание высокая частота встречаемости гепатомегалии у взрослых больных ВИЧ-инфекцией на этапе первичных клинических проявлений инфекции, что связано, по-видимому, не только с основным заболеванием, но и с вирусным гепатитом В, хроническим алкоголизмом. В отличие от обследованных детей в группе взрослых больных в 7,9% была выявлена гистологически подтвержденная саркома Капоши. У обследованных взрослых пациентов выявлялось множество сопутствующих заболеваний, как характерных "СПИД-

маркерных", так и отягощающих течение основного заболевания. Наиболее часто встречающимися СПИД-маркерными инфекциями в группе обследованных взрослых были герпетическая и кандидозная инфекции. Пневмоцистоз, в частности пневмоцистная пневмония, встречалась реже в группе обследованных взрослых по сравнению с группой обследованных детей (5,7% по сравнению с 14,5% в группе детей). В группе взрослых больных ВИЧ-инфекцией выявлены следующие отягощающие заболевания: сифилис у 20,4%, гоноррея у 8,0%, туберкулез у 17,0% и хронический алкоголизм у 18,2% пациентов. Выявлено небольшое число больных, страдающих анемией - 20,4%, в противоположность обследованным детям. Число взрослых больных с лейкопенией и лимфопенией нарастало по мере прогрсссирования заболевания, причем эти больные составили 25,0 и 27,3% в ШБ и IIIB стадии соответственно (больные дети с лейкопенией и лимфопенией составили лишь 8,7 и 7,2% соответственно).

В связи с тем, что большинство обследованных нами детей с ВИЧ-инфекцией (89,9%) страдали рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных нутей, в качестве контроля были использованы иммунологические и пммуногенетические показатели 58 детей часто и длительно болеющих (ЧДБ) острыми респираторными вирусными заболеваниями.

Контрольной группой при изучении питокиновош статуса, показателей клеточного иммунитета у взрослых больных ВИЧ-инфекцией была группа жителей Санкт-Петербурга, состоящая из 80 человек, в возрасте от 23 до 55 лет, в которую вошли 50 кадровых и безвозмездных доноров и 30 волонтеров, не имеющих хронических заболеваний. В контрольной группе было 50 женщин (62,5%) и 30 мужчин (37,5%). При изучении особенностей распределения HLA антигенов в группе взрослых больных ВИЧ-инфекций в качестве сравнения использовались данные распределения HLA среди здоровых жителей С.-Петербурга: для антигенов HLA-A,B в группе, состоящей из 494 человек [Bubnova L.N., 1991], для антигенов HLA-DR в группе, состоящей из 412 человек [Беляева Е.В., Калинина Н.М., 1988].

При выполнении исследования были использованы следующие основные методы:

- индукция синтеза цитокинов [Birx D., 1990; Ameglio J.C., 1994] в мононуклеарах периферической крови под воздействием ЛПС-

содержащего фармакопейного препарата продигиозана,

форболмирнстатацетата и синтетических пептидов из структуры gpl20;

- определение уровней цитокинов в сыворотке крови и супернатантах клеточных культур с использованием биолошческих тестов и иммуноферментного анализа;

- определение р24 антигена ВИЧ в биолошческих жидкостях больных ВИЧ-инфекцией методом иммуноферментного анализа;

- HLA типирование и количественное определение субпопуляций лимфоцитов с использованием микроварианта двухступенчатого комплементзависимого лимфоцитотоксическош теста (стандартная методика NIH USA);

- методы статистической оценки ассоциаций HLA антигенов с заболеванием [Певницкий JI.A., 1988];

- метод конкурентного связывания с анти-С04 моноклональными антителами для оценки связывающей активности пептидов, гомологичных стрктурс gpl20, с CD4 рецептором;

- метод лимитирующих разведений с целью клонирования Т-клеточной линии Jurkat и получения CD4 обогащенного клона клеток;

- методы математической обработки полученных результатов с использованием критериев Стыодента и Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты исследования

Изучение взаимодействия ВИЧ и клеток иммунной системы с помощью синтетических пептидов из структуры гликопротеина gpl20

Задачами этого раздела диссертационной работы явилось исследование способности связывания с CD4 рецептором пептидов из различных областей гликопротеина gpl20, т.е. картирование региона, способного при связывании CD4 молекулы индуцировать продукцию цитокинов, а также выявление различий в индукции цитокинов в мононуклеарах периферической крови здоровых и больных ВИЧ-инфекцией людей. Участки gpl20, использованные в работе, были представлены синтетическими пептидами, гомологичными N- и С-концевым регионам этой молекулы и С04-связывающему региону (использована нумерация последовательности аминокислот по Starcich et al., 1986).

С04-связывающая активность синтетических пептидов была проанализирована на двух типах СБ4 клеток: клоне ЗОб трансформированной линии Т-лимфоцитов 1игка1 и мононуклеарах периферической крови человека. В проведенном анализе для сравнения использовался рекомбинантный белок §р120. Белок gpl20 связывал С04 лимфоциты клона Звб в концентрации Ю-12. 10-7М тогаа как пептиды обладали значительно меньшей связывающей активностью 10-Ю. ]0-5м_ Наиболее выраженную активность проявляли два пептида с последовательностью аминокислот 426-452 (СП Х1-27) и 436-451 (СП Х1-16), входящих в "классический" С04 связывающий регион. При этом пептид 426-440, входящий в структуру СП Х1-27, не обладал связывающей активностью. Эти данные могут указывать, что наиболее вероятным участком в СЭ4 связывающей активности §р120 является последовательность пептида СП Х1-16. С другой стороны (таблица 1) оказалось, что в связывании С04 молекулы участвует не только участок с аминокислотной последовательностью 369-384, который структурно примыкает к С04-связывающему региону, но и пептид 255-272.

Таблица 1

Относительное количество С1)4(+) лимфоциров мононуклеаров

Пептиды Концентрация в М

10-5 10-6 10-7 10-8 10-У Ю-10 ю-п 10-12 10-1-3

СП-Х1-27 (426-452) 51,4 47,2 42.9 26.5 20,3 0

СП-Х1-27А (426-452*) 0 0

СП-Х1-16 (436-451) 35,3 34,0 24.5 23.5 20.1 0

СП-Х1-15 (426-440) 37,6 20,2 0

СП-1Х-16 (369-384) 27,7 23.7 12.3 0

СП-ХУ1-18 (255-272) 58,8 49,3 38,2 0

СП-Ш-12 (507-518) 0

* - В этом пептиде искусственно введены дведелеции в позициях 442 и 443.

Обращает на себя внимание отсутствие связывающей активности пептида 426-452, в котором наш были введены делении в позиции 442 и 443. Этот результат показывает, что наиболее активным является С-копцевая часть пептида, начиная с 440 по 452 позиции. Сравнительный анализ связывания CD4 молекулы па мононуклеарах периферической крови доноров показал, что пептиды, относящиеся к одному CD4 связывающему региону, обладают различной активностью. Для объяснения получеппых данных, что с CD4 молекулой связываются пептиды, не входящие в "классический" CD4-связывающий регион [Laskyetal, 1989], мы предположили наличие нескольких добавочных сайтов связывания ВИЧ со своим рецептором - молекулой CD4, которые способствуют максимальной эффективности проникновения вируса в клетку.

Известно, что связывание gpl20 с CD4 клетками у больных ВИЧ-инфекцией приводит к продукции фактора некроза опухоли-a (ФНО-а), который непосредственно участвует в репликации вируса [Merril, 1989] и индуцирует продукцию ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-2 и их рецепторов, которые в свою очердь способствуют экспрессии вирусного генома [Poli, 1994]. В связи с этим была изучена продукция ФНО-а мононуклеарами периферической крови доноров, обработанными in vitro пептидами, повторяющими структуру gpl20.

Таблица 2

Продукция ФНО-а (пг/мл) мононуклеарами периферической крови

доноров, индуцированная под воздействием _синтетических пептидов из йр!20_

Пептиды Концентрация пептидов б мкг/мл

50,0 5,0 0,5 0,05

СП-Х1-27 (426-452) 452,1+59,1 368,2+40,6 217,2+30,1 <20,0

СП-Х1-16 (436-451) <20,0 <20,0

СП-Х1-15 (426-440) 470,9+38,2 320,0+25,1 <20,0 <20,0

СП-1Х-16 (369-384) 205,1+19,2 97,5+10,1 <20,0 <20,0

CTI-XV1-18 (255-272) 242,1+18,1 179.8+16,8 28,1+1,8 <20,0

Контроль <20.0 1

Примечание. Пептид СП-Ш-12 (507-518) не исследовали.

В таблице 2 приведены результаты, свидетельствующие о том, что пептиды из §р 120 с разной активностью способны индуцировать синтез ФНО-а в мононуклеарах периферической крови.

Более подробный анализ данных 1-2 таблиц говорит о несовпадении между связывающей активностью ряда пептидов и индукцией синтеза ФНО-а. Так, пептид 436-451, обладающий наибольшей связывающей С04 активностью не индуцирует синтез ФНО-а. С другой стороны пептид 426-440, являясь активным индуктором ФНО-а, умеренно проявляет себя в реакции связывания с СБ4 молекулой. Два пептида - 255-272 и 369-384, которые не входят в "классический" С04 связывающий регион, но, по нашим данным, участвуют в связывании §р120 с С04 молекулой, обладают также способностью индуцировать синтед ФНО-а.

Нами была изучена способность пептида СП-Х1-27, обладающею высокой СЭ4 связывающей и ФНО-а шщупирутощей активностями стимулировать продукцию ФНО-шщуцируемых цитокинов. Результаты изучения представлены в таблице 3.

Таблица 3

Продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови под воздействием пептида СП-Х1-27 (100 мкг/мл)

Группы N Спонтанная (I) и индуцированная пептидом (П) продукция цитокинов:

ФНОа(пг/мл) I П ИЛ-1Р(пг/мл) I II ИЛ-6(ед/мл) I П ИЛ-6(ед/мл) I П

Больные ВИЧ-инфекцией (в стадии ПБ) 24 351,2 516,0** 300,0 728,0 450,0 1100,0 0 1,5

Доноры кропи 23 69,7 370,7* 80,0 1200,0** 140,0 1600,0** 0 12,8**

Дети ЧДБ ОРВИ 27 226,6 487,1** 120,0 680,0* 180,0 720,0* 0 16,4*

* - Ри<0,05; ** - Ри<0,01

Ри - различия между спонтанной и индуцированной продукцией цитокина оценивались по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

Как видно из таблицы, пептид 426-452 (СП-Х1-27) активирует синтез ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6 и ИЛ-2 у больных ВИЧ-инфекцией и у ВИЧ-неинфнцированных лиц - взрослых и детей, входящих в обследованные нами контрольные группы. Обращает на себя внимание резкое снижение продукции ИЛ-2 у больных в стадии генерализованной лимфоадснопатии в ответ на воздействие пептида, подтверждающее раннее исчезновение ростового фактора Т-хелперов при ВИЧ-инфекции.

Полученные нами данные показали также высокую степень корреляции между уровнями продукции ФНО-а и белка р24 мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ-инфекцией in vitro од воздействием пептида 426-452 (СП-Х1-27), что выражалось увеличением продукции ФНО-а с 351,2 до 516,0 пг/мл (Pu<0,05), a продукции р24 с 70,5 до 134,4 пг/мл (Ри<0,05). Коэффициент корреляции между индуцированной пептидом продукцией ФНО-а и р24 был равен 0,74. Полученные результаты свидетельствуют, что именно связывание gpl20 с CD4 приводит к индукции синтеза ФНО-а, что в свою очередь способствует репликации вируса, находящегося в "дремлющем" состоянии в клетке. Результаты работы указывают также на то, что не только "классический" CD4 связывающий регион gpl20 вовлекается в контакт с CD4+ мононуклеарами и индуцирует синтез ФНО-а, но и другие смежные регионы, представленные в нашей работе пептидами 255-272 и 369-384 из 2 константного и 2 вариабельного регионов. Индукция под воздействием пептида 426-452, в момент его связывания с молекулой CD4, ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-2 еще раз подчеркивает значение взаимодействия между вирусом и клеткой-мишеныо как для дальнейшего размножения вируса, так и инициации того каскада изменений в иммунной системе, который в результате приводит к иммунодефициту при ВИЧ-инфекции.

Генетическая детерминированность собенностей течения ВИЧ-инфекции

Роль фактора некроза опухоли в экспрессии вируса иммунодефицита человека, выраженное неравновесное сцепление между аллелями ФНО и HLA, ассоциации между различными ФНО аллелями и уровнем экспрессии цитокина, выявленные корреляции между HLA аллелями и характером течения ВИЧ инфекции, определили необходимость

исследования НЬА детерминированности продукции фактора некроза опухоли-а, одного из главных патогенетических факторов профессии ВИЧ-инфекции. С целью доказательства НЬА-детерминированности способности мононуклеаров периферической крови продуцировать ФНО-а все больные были распределены нами в две группы - носителей определенного НЬА антигена и тех, в чьем генотипе отсутствовал этот антиген. В каждой нз групп оценивалась спонтанная продукция ФНО-а. Наличие или отсутствие тех или иных НЬА антигенов в фенотипах по разному влияет на спонтанную продукцию ФНО-а мононуклеарами больных ВИЧ-инфекцией. Суммарно данные о влиянии наличия в фенотипе больного тех или иных НЬА-А.В.БК антигенов на спонтанную продукцию ФНО-а представлены в таблице 4.

Таблица 4

Распределение антигенов локуса НЬА-А,В,Б11 по влиянию

на спонтанную продукцию ФНО-а при ВИЧ-инфекции

Влияние на спонтанную продукцию ФНО-а (Ри достоверно) Антигены локусов НЬА

А В

Снижение 19,28 7,12,13 2,6

Повьппение 1 8,16,35,40,41 1,3

Отсутствие изменеий 2,3,9,10,11 5,14,15,17,18, 21,22,27 4,5,7

Ввиду наличия высокой степени корреляции (г=0,741) между уровнем спонтанной продукции ФНО-а и р24 антигенемией у больных ВИЧ-инфекцией НЬА антигены, входящие в 1-ю группу могут быть условно названы "антигенами-протекторами" (т.е. способствующими более медленной профессии заболевания), во 2-ю группу - "антигенами-провокаторами" (способствующими быстрой прогрессии заболевания и наступлению стадии СИД). Для того, чтобы понять, что происходит со спонтанной продукцией ФНО-а в случае присутствия двух антигенов "провокаторов" в НЬА фенотипе больного, математическая обработка данных по спонтанной продукции ФНО-а была осуществлена в 4 группах: 1-й и 2-й, где был в наличии один из 011 антигенов-"провокаторов", 3-й, где выявлялись в фенотипе два ОИ. антигена-"провокатора", 4-й, гае отсутствовали эти антигены.

Таблица 5

Спонтанная продукция ФНО-а (пг/мл) мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ-инфекцией (п=132) с наличием или отсутствием

НЬА-БШ, ЖЗ, антигенов в НЬА фенотипе

Н^А-БЯ фенотип Число наблюдений Среднее арифметическое и пределы колебаний Ри между группами

I. ОШ+ОКЗ- 30 1207,0 (0-6000) I и II р>0,05 I и III р<0,05 I и IV р<0,05

II. 0111-0113+ 31 960,0 (0-5390) II и I р>0,05 II и III р<0,05 II и IV р>0,05

111.0111+0113+ 11 2229,6 (0-4600) III и I р<0,05 III и II р<0,05 III и IV р<0,05

IV. ОЮ-ОЫЗ- 60 610,7 (0-7700) IV и I р<0,05 IV и II р>0,05 IV и III р<0,05

Полученные данные (таблица 5) говорят о суммарном отрицательном эффекте наличия в фенотипе 2-х антигенов-"провокаторов" (спонтанная продукция ФНО-а в 3-й группе была достоверно выше, чем в 1-й и 2-й группах).

С целью определения влияния наличия тех или иных НЬА антигенов в фенотипе больною на характер течения заболевания взаимосвязь антигенов со спонтанной продукцией ФНО-а была оценена в условной шкале баллов следующим образом: каждый антиген-"протектор" +2 балла, каждый антиген-"провокатор" -2 балла, антигены, не влияющие на спонтанную продукцию ФНО-а - 0 баллов. В связи с наличием у каждого пациента 2 антигенов локуса А, 2 антигенов локуса В, 2 антигенов локуса ОИ, теоретически фенотип больного мог быть описан величинами от +12 до -12 баллов. В качестве критериев характера течения заболевания использовались сроки от момента инфицирования до момента обследования (в месяцах) с проекцией на клиническую стадию заболевания в момент обследования и число С04 лимфоцитов в

периферической крови. Данные, представленные в таблице 6, отражают взаимосвязь между динамикой снижеия СБ4 лимфоцитов и НЬА фенотипом в группе детей в возрасте до 6 лет, гае сроки от момента инфицирования были известны достаточно точно.

Таблица 6

Взаимосвязь между количеством С04 лимфоцитов

и НЬА фенотипом обследованных детей_

I группа II группа

Стадии заболевания N С 04 ■х мм3 Сроки от момента заражения (мес.) Средняя сумма баллов по НЬА фенотипам N С04 3 Сроки от момента заражения (мес.) Средняя сумма баллов по НЬА фенотипам

ША 17 831,4 42,6 +1,64 6 658,7* 29,7** -4,67

ШБ 8 722,0 47,8 +2,0 5 565,0* 28,8 -3,14

ШВ 7 815,4 42,4 +0,28 7 337,2* 34,3 -2,85

* - Ри<0,05; ** - Ри<0,01 при сравнении больных I и II групп.

Как видно из таблицы, бальная оценка фенотипов отражала характер течения заболевания: в I группе детей (с достоверно большим снижением числа Т-хелперов и достоверно меньшими сроками от момента заражения) описывлась отрицательными величинами, во II руппе (с достоверно меньшим снижением числа Т-хелперов и юстоверно большими сроками от момента заражения) была больше юля.

Полученные данные доказывают НЬА детерминированность уровней 1родукцйи ФНО-а мононуклеарами периферической крови, [вляющегося ведущим фактором иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции. Выделение антигенов, связанных с более высокой продукцией фактора 1екроза опухоли-а, и предложенная выше комплексная оценка фенотипа юзволяет выделить группы лиц с наследственной предрасположенностью : высокой скорости прогрессирования заболевания, тяжелому течению ШЧ-инфекции (клинические проявления, опосредованные высокой гродукцией ФНО-а) и выработать тактику ведения таких больных.

Изучение продукции провоспалительных цитокинов у больных ВИЧ-инфекцией in vivo

В связи с тем, что высокий уровень ФНО-а, циркулирующего в периферческой крови, способствует быстрому наступлению клинических проявлений ВИЧ-инфекции и СПИД, у взрослых и детей, больных ВИЧ-инфекцией, были изучены особенности продукции ФНО-а in vivo в сравненимс другими параметрами иммунного статуса.

Результаты определения ФНО-а в образцах сыворотки крови обследованых пациентов и ВИЧ-негативных лиц представлены в таблице 7.

Таблица 7

ФНО-а в образцах сыворотки крови обследованных лиц (пг/мл)

Группы Возраст (годы) ВИЧ(-) ВИЧ (+)

IIB ИВ IIIA ШБ IIIB

Взрослые 18-50 п=50 38,9 п=11 179,9 п=27 290,0* п=24 310,0* п=14 355,0* п=12 428,0*

Дети: 1-6 п=28 п=2б п=8 п=16

108,9 309,0* 1061,0* 1363,0**

7-14 П—11 п=8 п=6 п=5

143,7 418,0* 820,0* 920,0*

* - Pu<0,05; ** - Ри<0,01.

Несмотря на значительные индивидуальные различия уровня ФНО-а в сыворотках крови больных одной и той же клинической стадии средние величины (М), как видно из таблицы, достоверно выше, чем в группе ВИЧ-негативных лиц. Эта закономерность отмечается при исследовании ФНО-а в обеих группах (взрослых и детей) больных ВИЧ-инфекцией.

Для подтверждения взаимосвязи между уровнем продукции ФНО-а in vivo и антигенемией в тех же образцах сыворотки больных ВИЧ-инфекцией был определен белок р24. Динамика изменения уровня белка р24 в образцах сыворотки крови в ходе ВИЧ-инфекции представлена в таблице 8.

Динамика изменения уровня белка р24 в ходе ВИЧ-инфекции

Группы Возраст (годы) ВИЧ(-) ВИЧ (+)

IIB ИВ IIIA ШБ IIIB

зрослые 18-50 п=50 0 11=11 82,0 п=27 67,0 п=24 101,0 п=14 251,0* п=12 231,0*

I е т и: 1-6 п=28 п=26 п=8 п=16

0 83,0 67,0 204,0*

7-14 п=11 п=8 п=6 п=5

0 48,0 72,0 124,0

Ри<0,05.

Несмотря на индивидуальные особенности, выявляемые при гределении белка р24 у больных одной и той же стадии заболевания ак и в случае определения ФНО-а), отмечается следующая тенденция: момент наступления клинических проявлений болезни и, особенно алии СПИД уровень р24 антигенемии возрастает и в ряде случаев зличия становятся достоверными по сравнению с более ранними алиями заболевания (в группе взрослых - стадии ШБ и IIIB по авнению с IIB и IIB; в ipynne детей 1-й возрастной группы IIIB по авнению с группой IIIA).

Результаты определения коэффициента корреляции между уровнем НО-а в образцах сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией и »личеством белка р24 выявили высокую степень взаимпосвязи между ими параметрами (г=0,84),что характеризует прогностическую ценность :ределения в сыворотке крови пациентов ФНО-а в ходе иммуноло-ческого мониторинга для оценки эффективности проводимой терапии.

Как известно, ФНО-а оказывает прямое цитопатическое действие на онически инфицированные Т-хелперы [Biswas, 1994], кроме того, в де работ обсуждается роль ФНО-а в инициации генетически ограммируемой табели (аноптоза) Т-хелперов [Estaquer J., 1994]. йствителыю, изучение в динамике состояния иммунитета больных -ТЧ-инфекцией детей, подтвердило способность ФНО-а действовать топатически на Т-хелперы. Так, вслед за повышением ФНО-а в :воротке крови, в связи с интеркуррентными инфекциями отмечалось

снижение абсолютного числа Т-хелперов в периферической крови (таблица 9).

Таблица 9

Изменения уровней ФНО-а и С04 лимфоцитов в периферической крови в ходе бактериальной пневмонии у двух детей, больных ВИЧ-инфекцией

Возраст Стадия Дата иссле- ФНО-а CD4 в мм3

(в годах) дования пг/мл

3,5 IIIB 03.04.91 1100,0 953

17.04.91 7100;0 335

3,0 ШБ 03.04.91 1000,0 2151

17.04.91 4600,0 1023

У взрослых и детей, больных ВИЧ-инфекцией, были также изучены особенности продукции ИЛ-ip in vivo. Несмотря на индивидуальные различия продукции ИЛ-ip, в сыворотках крови больных одной и той же клинической стадии средние величины (М), достоверно увеличивались по мере перехода в последующие на стадии болезни в сравнении с ВИЧ-негативным контролем, а в стадии СПИД также в сравнении с больными в доклинических стадиях и стадии IIIA. Эти закономерности отмечаются при исследовании ИЛ-ip в обеих группах (взрослых и детей) больных ВИЧ-инфекцией.

Как известно, шперпродукция ИЛ-ip и ФНО-а амплифицирует актвацию иммунной системы и, в частности, Т-лимфоцитов. Количество клеток, несущих маркеры CD25 и HLAII, отражают степень активации иммунной системы, вызванную гиперпродукцией цитокинов, и возможность горизонтального распространения ВИЧ-инфекции. Увеличение клеток, несущих "активационные маркеры" было впервые описано нами в 1990 году [Калинина Н.М. и соавт., 1990].

Если в начальных стадиях заболевания активация Т-лимфоцитов определяется как увеличением числа клеток, несущих ИЛ-2 рецептор, так и антигены гистосовместимости II класса, то в дальнейшем активация клеток характеризуется преимущественно увеличением синтеза антигенов гистосовместимости II класса. Этот факт можно объяснить уменьшением продукции ИЛ-2 и элиминацией ИЛ-2 зависимых клеток путем апоптоза.

Изучение продукции интерферона а у больных ВИЧ-инфекцией in vivo

Существующие различные точки зрения на значение определения интерферона-a [Hess G., 1991; Brinchmati 1, 1991] в сыворотке крови пациентов с целью оценки противовирусной защиты побудили нас исследовать данный цитокин в сыворотке крови в сравнении с уровнем антигепемии в различные стадии заболевания. Уровни ИНФ-а в сыворотке крови обследованных пациентов представлены в таблице 10.

Таблица 10

ИФН-а в образцах сыворотки крови обследованных лиц (пг/мл)

Группы Возраст (годы) ВИЧ(-) ВИЧ (+)

IIB ИВ IIIA ШБ IIIB

Взрослые 18-50 п=50 10,0 п=11 67,0* п=27 61,0* п=24 62,5* п=14 34,0 п=12 27,0

Дет и: 1-6 п=28 п=26 п=8 п=16

85,8 74,0 23,0* 9,7*

7-14 п=11 п=8 п=6 п=5

76,0 46,0 32,0 20,0*

* Ри<0,05 по сравнению с ВИЧ(-).

Из таблицы впдно, что по мере прогресспровапия заболевания снижается гровень ИНФ-а в сыворотке крови у взрослых больных, хотя в стадиях 11Б-ША то уровень достоверно выше, чем у здоровых людей. При анализе данных в рунпах обследованных детей, с одной стороны часто и длительно болеющих ютрымн респираторными инфекциями и с другой - ВИЧ-инфекцией, видпо, что щтерфероновая противовирусная зашита в группе детей с ВИЧ-инфекцией [еадекватна по сравпешпо с группой ЧДБ ОРИ детей в период ремиссии и не гожет противодействовать размножению вируса.

Динамическое наблюдение за пациентами с благоприятным течением [нфекции в течение 3 и более лет выявило постоянное присутствие остаточно высокого уровня интерферона а и низкого уровня белка р24 5ИЧ в сыворотке крови.

Определение цитокинов в сыворотке крови выявило пшерпродукцию [ровоспалительных цитокинов, уровень которых увеличивается по мере [рогрессирования заболевания. Уровень противовирусной защиты в олышшетве случаев был неадекватен и не предотвращал развитие аболевания.

Изучение продукции провоспалительных цитокинов -ФНО-а, ИЛ-Р, Ш1-6 мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ-инфекцией in vitro

Особенности продукции воспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6) мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ-инфекцией были изучены в 24-часовой культуре клеток in vitro.

Спонтанная продукция ФНО-а мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ-инфекцией, как взрослых, так и детей, была существенно выше, чем в контрольных группах, что является отражением предсуществующй активации клеток, связанной с ВИЧ-инфекционным процессом.

Для характеристики функциональной активности мононуклеаров периферической крови in vitro сследовалась индуцированная продукция ФНО-а под воздйствием ЛПС содержащего фармакопейного препарата продишозана и форболмиристатацетата - ФМА. Данные изучения представлены в таблице 11.

Результаты, представленные в таблице 11, отражают изменения, которые происходят в функциональной активности мононуклеаров периферической крови взрослых больных ВИЧ-инфекцией. Уже в доклинических стадиях заболевания соотношение между индуцированной и спонтанной продукцией ФНО-а снижается в 5 раз по сравнению с контролем. Такое изменение соотношения между спонтанной и индуцированной продукцией цитокина в этих стадиях связано с активацией функциональной активности МНПК и появлением практически у всех пациентов спонтанной продукции ФНО-а. В стадии СПИД отсутствуют пациенты с ответом на оба индуктора и только треть из них отвечает на ЛПС антиген. Ввиду нарушений функции мононуклеаров 20-30% пациентов в стадиях IIIA-IIIB в ответ на индуктор снижают продукцию ФНО-а, при этом индекс соотношения спонтанной и индуцированной продукции цитокина у этих пациентов был меньше единицы. Нарушения функциональной активности мононуклеаров периферической крови у детей, больных ВИЧ-инфекцией, и изменения в индуцированной продукции ФНО-а в 24-часовой культуре клеток представлены в таблице 12.

Особенности индуцированной продукции ФНО-а в 24 часовой культуре

мононуклеаров (2х10(' в мл) периферической крови взрослых, __больных ВИЧ-инфекцией__

Группы Число Средние значения Число пациентов с Число

обследо- в индекса! И) сохраненным ответом на пациен-

ванных группе соотношения индукторы (И>2) в % тов с

индуцированной и И<1

спонтанной продук- ЛИС ФМА ЛПС и в %

ции ФНОа в группе ,ФМА

ВИЧ(-) 50 23.20 100,0 100,0 100,0 0

ВИЧ(+)

ИБ 11 4,60* 100,0 100,0 100,0 0

ИВ 27 3,80* 92,5 88,8 88,8 0

IIIA 24 1,82* 33,3 12,5 12,5 20,8

ШБ 14 1.81* 28.6 14,3 7.2 21.4

ШВ 12 1,63* 33.3 8,3 0 33.3

Ри<0,05 при сравнении с ВИЧ (-).

Таблица 12

Особенности индуцированной продукции ФНО-а в 24-часовой культуре

мононуклеаров (2х106 в мл) периферической крови детей, ___больных ВИЧ-инфекцией__

Группы Число Средние значения Число пациентов с Число

обследо- в нндекса(И) сохраненным ответом на пациен-

ванных группе соотношения инду- индукторы (И>2) в % тов с

цированной и И<1

спонтанной продук- ЛПС ФМА ЛПС и в %

ции ФНОа в группе ФМА

1-6 лет

ВИЧ(-) 28 2.84 85.7 75,0 63,6 0

ВИЧ(+)

IIIA 26 1,56 38,5 19,2 15.4 15.4

ШБ 8 1,37 37,5 12,5 0 25.0

ШВ 16 1.07 31,2 0 0 31.2

7-14 лет

ВИЧ(-) 11 3.04 81.8 63,6 54.5 0

ВИЧ(+)

IIIA 8 1.66 50,0 37,5 25,0 12.5

ШБ 6 1.52 50,0 33,3 16,7 16.7

IIIB 5 1,50 40.0 20,0 0 20.0

Изменения в функциональной активности МНПК детей, больны ВИЧ-инфекцией, и в группе взрослых оказались сходными. В младше! возрастной группе детей, больных ВИЧ-инфекцией уже в стадии III] отсутствовали пациенты, отвечающие на оба индуктора, что отражае большую выраженность нарушений функции клеток иммунной систем! пациентов этого возраста по сравнению с детьми 7-14 лег и взрослыми Активация мононуклеаров периферической крови взрослых и детей больных ВИЧ-инфекцией, возникает уже в ранних стадиях заболевани и сопровождается спонтанной продукцией ИЛ-ip. По мер прогрессирования заболвания спонтанная продукция ИЛ-1| увеличивается и становится достоверно более высокой в сравнении i лицами контрольных ipynn. При изучении индуцированой продукцш ИЛ-ip МНПК взрослых и детей, больных ВИЧ-инфекцией, выявляютс: в целом те же изменения, что наблюдались и при изучении синтез ФНО-а. Уже в начальных стадиях заболевания соотношение межд; индуцированной и спонтанной продукцией ИЛ-ip снижается, причег изменения в доклинических стадиях связаны с активацией МНПК i появлением практически у всех пациентов спонтанной продукции ИЛ-If Исследование спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-1 мононуклеарами периферичесакой крови больных ВИЧ-инфекцией 1 лиц контрольных групп in vitro выявили более значительное нарушение этой функции клеток. В стадиях клинических проявлкений ВИЧ инфекции, как в группе взрослых, так и в группах детей, отмечаете: резкое снижение индекса соотношения индуцированной и спонтанно! продукции ИЛ-6 (меньше единицы), в абсолютном большинстве случае; не только отсутствует ответ на индукторы, но и уровень индуцированное продукции ИЛ-6 становится ниже спонтанной.

Данные изучения спонтанной и индуцированной продукции ФНО-а ИЛ-ip, ИЛ-6 мононуклеарами периферической крови демонстрирую' однонаправленные нарушения функциональной активности иммуноцито - повышение спонтанной продукции и снижение индуцированной. Те> не менее эти изменения не идентичны, что отражает, по-видимому различия в индукции экспрессии их генома, процессинга и выход цитокинов из клетки в условиях ВИЧ-инфекции. Особенно ранши изменения в функциональной активности мононуклеарных клеток : течение ВИЧ-инфекции проявляются в нарушении синтеза ИЛ-6. Эт<

положение подтверждается данными, что уже во ПБ стадии резко усиливается спонтанная продукция ИЛ-6, которая начиная с IIIA стадии находится на предельном уровне, а также тем, что число пациентов с индексом соотношения индуцированной и спонтанной продукции цитокина меньше единицы достигает 90-100% уже в стадии IIIA. Упомянутые выше нарушения совпадают с активацией В-лимфоцитов, что проявляется в экспрессии активационных антигенов HLAII на поверхности их клеточных мембран.

Изучение продукции HJI-2 мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ-инфекцией in vivo

В данной главе проведено сравнение показателей индуцированной фодукции ИЛ-2 in vitro, характеризующие функциональную активность Гх 1 типа, определяющую их способность к пролиферации и Т-угеточному иммунному ответу, с числом Т-хелперов, несущих рецептор ; ИЛ-2, общим числом Т-хелперов и коэффициентом соотношения "D4/CD8 лимфоцитов in vivo. Данные сравнительного изучения продукции ИЛ: in vitro и параметров Т-клеточяого иммунитета in vivo у взрослых больных ШЧ-инфекцией и в контрольной группе представлены в таблице 13.

Как следует из данных таблицы, уже в стадии ПБ снижается продукция ИЛ-в ответ на антиген (индуктор). За счет пшерпродукцшг ФНО-а в этой же тадии происходит увеличение синтеза ИЛ-2 рецептора на клетках и число леток с плотностью ИЛ-2 репепторов па поверхности, доступной дня ыявлегшя с помощью моноклоналышх антител достоверно увеличивается ?и<0,05). Число Т-хелперов практически не изменяется, хотя коэффициент оотпошения CD4/CD8 снижается. Это снижение объясняется, по-видимому, велнчепием специфических CD8 цитотоксических лимфоцитов в ответ на остуштение антигена (вируса) в организм. Далее, со стадии ИВ(ЛАП) до IB (СПИД) отмечается прогрессивное снижение продукции ИЛ-2 МНПК в гвет на индукторы. Увеличивается с 22,2 до 66,6% число пациентов, не родуциругощих при стимуляции антигеном (индуктором) Ш1-2. Число Т-глперных клеток, несущих CD25 рецептор, резко снижается как по сравнению контролем, так и со стадией ПБ. Число Т-хелперов также снижается и роисходнт это в основном за счет Txl. Доказательством этого положения ожет служить тот факт, что при исследовании индуцированной продукции xl-клеточного ростового фактора - ИЛ-2 in vitro оказалось, что несмотря па ), что Т-хелперы составляют 30-40% от общего числа Т-лпмфоцитов в /льтуре, продукция ИЛ-2 в ответ на индукторы отсутствует.

Взаимосвязь между продукцией ИЛ-2 в 24-часовой культуре мононуклеаров

(2х10б в мл) периферической крови взрослых, больных ВИЧ-инфекцией, __и параметрами Т-клеточного иммунитета in vivo_

Индуциро- Число Число CD4

Группы Число ванная про- пациентов Число CD25 лимфоци-тов

обсле- в дукция ИЛ-2 с отсутствием лимфо- в мм3

дован- группе МНПК ответа tía цитов и CD4/CD8

ных (2x106 в мм3) ед/мл индукцию в % в мм3 коэффициент

ВИЧ(-) 50 14,6 0 304 890 1,23

ВИЧ(+)

IIB 11 4,9* 0 338* 752 0,90

IIB 27 3,5* 22,2 278 597 0,86*

niA 24 2,1* 29,2 245 510 0,66*

ШБ 14 1Д* 42,8 160* 460* 0,61*

HIB 12 1,1* 66,6 111* 224* 0,43*

* - Pu<0,05 с ВИЧ(-) контролем.

Сходные результаты по сравнительному изучению продукции ИЛ-2 МНПК in vitro в сравнении с параметрами Т-клеточного иммунитета in vivo были получены в обеих возрастных группах детей. Снижение продукции ИЛ-2 в ответ на индукторы было более выраженным в группах детей по сравнению с группой взрослых больных ВИЧ-инфекцией, а число лиц, не продуцирующих ИЛ-2 в ответ на индукторы в стадии СПИД достигало 87,5 и 80,0% соответственно.

Несоответствие между резким снижением продукции ИЛ-2 уже на ранних стадиях ВИЧ-инфекции и увеличение клеток, несущих низкоаффинный ИЛ-2 рецептор (CD25), вызванное гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, приводит, по всей вероятности, к инициации апоптотических процессов в Тх 1 типа, что в дальнейшем вызывает (наряду с результатами прямого цитопатическош действия ФНО-а) резкое снижение общего числа Т-хелперов на периферии.

Роль нарушений продукции цитокинов в клинических проявлениях ВИЧ-инфекции

По мере прогрессирования ВИЧ-инфекции увеличиваются уровни циркулирующих в сыворотке крови провоспалительных цитокинов -ФНО-а, ИЛ-р, ИЛ-б. Дейстие этих цитокинов не ограничивается иммунной системой. В случае длительной шперпродукнии они инициируют множественные патологические изменения в органах и тканях. По мере прогрессирования заболевания в обследованных группах взрослых и детей, больных ВИЧ-инфекцией нарастали клинические проявления, которые исследователи связывают с гиперпродукцией цитокинов. Для подтверждения положения, что циркулирующие в крови провоспалительные цитокины вызывают характерные клинические проявления у взрослых и детей, больных ВИЧ-инфекцией, пациенты в стадиях ША и ШБ - стадиях клинических проявлений ВИЧ-инфекции, выделяемых в других классификациях как нреСПИД или СПИД-ассоциированный комплекс, были разделены на две группы. В 1-ю группу вошли пациенты с уровнями циркулирующих в крови ИЛ-1Р и ФНО-а ниже 200,0 пг/мл, во 2-ю - выше 200,0 пг/мл. В таблице 14 представлены данные по частоте встречаемости клинических симптомов, связанных с пшерпродукцией провоспалительных цитокинов у детей, Зольных ВИЧ-инфекцией.

Как видно из таблицы, у детей с высокими уровнями циркулирующих в крови провоспалительных цитокинов в териферической крови возрастает частота выявления длительного товышения температуры в 10 раз, ВИЧ-энцефалопатий - в 2,8 раза, шемий - в 2,3 раза, тромбоцитопений - в 1,6 раза. В 1,8 раза чаще встречается значимое снижение веса, астенопевротический синдром выявляется чаще в 1,6. Дети с диаррейным синдромом были только в руппе с высоким уровнем циркулирующих провоспалительных 1ИТОКИНОВ в периферической крови.

В таблице 15 представлены сравнительные данные по частоте ¡ыявления клинической симптоматики, связанной с пшерпродукцией фовоспалительных цитокинов, у взрослых пациентов с разными ровнями циркулирующих эндогенных иммуномедиаторов.

Клинические проявления в группах детей, больных ВИЧ-инфекцией,

с различными уровнями провоспалительных цитокинов, _циркулирующих в периферической крови_

Клинические проявления Число детей (в %) с клиническими проявлениями при уровне цитокинов в крови (пг/мл):

ИЛ-1(5 88,(0-200) 1 ФНО-сс 91,1(0-200) < (п=20) ЛЛ-1Р 1227,0(250-4000) ЭНО-а 809,5(300-2400) (п=28)

1. Длительное повышение температуры 5,0 53,6

2. Снижение веса 40,0 75,0

3. Диаррея 0 0

4. Патология ЦНС: б) астеноневротический синдром в) ВИЧ-энцефалопатия 20,0 10,0 32,1 28,6

5. Анемия 30,0 71,4

6. Тромбоцитопения 15,0 25,0

Таблица 15

Клинические проявления в группах взрослых, больных ВИЧ-инфекцией,

с различными уровнями провоспалительных цитокинов, _циркулирующих в периферической крови_

! Клинические проявления Число взрослых (в %) с клиническими прояв-леш!ями при уровне цитокинов в крови (пг/мл):

ШЫР 144,1(0-200) ФНО-а 75,7(0-200) (п=21) ИЛ-1Р 958,0(250-2400) ФНО-а 618,6(250-2000) (п=17)

1. Длительное повышение температуры 4,8 52,9

2. Снижение веса 14,3 58,8

3. Диаррея 0 11,8

4. Патология ЦНС: б) астеноневротический синдром в) ВИЧ-энцефалопатия 23,8 0 58,8 70,6

5. Анемия 4,8 29,4

6. Тромбоцитопения 14,3 82,4

7. Саркома Капоши 0 17,6

У взрослых пациентов изменения частоты выявления клинических симптомов в группе с низкими и высокими уровнями циркулирующих в периферической крови цитокинов имели свои особенности. Так, ВИЧ-энцефалопатия, диаррейпый синдром, саркома Капоши встречались только у пациентов с высоким уровнем циркулирующих в крови провоспалительных цитокинов. В группе взрослых больных с уровнями провоспалительных цитокинов менее 200 пг/мл по сравнению с пациентами с высоким содержанием провоспалительных цитокинов в циркулирующей крови, встречалось реже длительное повышение температуры в 11,0 раз, снижение веса в 4,1, астеноневротический синдром в 2,5, анемия в 6,1, тромбоцитопения в 5,8 раза. Анализ данных таблиц 14 и 15 показывает, что группы взрослых больных ВИЧ-инфекцией с высокими и низкими уровнями провоспалительных цитокинов, циркулирующих в периферической крови, отличаются более резко между собой по клинической симптоматике, нежели сравниваемые группы детей. Это наблюдение можно объяснить неустойчивостью гомеостаза у детей, в условиях которого даже незначительные количества циркулирующих в крови цитокинов вызывают бурную реакцию со стороны органов и систем, подвергающихся их воздействию.

Полученные нами данные указывают, что циркулирующие в крови фовоспалителыше цитокины не только определяют скорость хэризонтального распространения инфекции, усиливают репликацию шруса, но и тяжесть ее клинических проявлений.

Вывод ы:

1. Комплексными многолетними клинико-иммунолошческими гсследованиями, включающими определение продукции цитокинов, гоказателей клеточного иммунитета и уровня антигенемии, 'становлена роль цитокинов в иммунопатогенезе , клинических гроявлениях ВИЧ-инфекции и разработаны подходы к прогнозированию ечения заболевания

2. Изучение синтетических пептидов, гомологичных структуре ;р 120, показало, что С04-связывающий регион оболочечного белка

вируса выполняет различные функции: одни из ею участков способствуют прикреплению вируса, тогда как друте приводят к активации клетки, выражающейся в продукции цитокинов, имеющих важное клиническое и патогенетическое значение.

3. Изменение в цитокиновой сети в начальной стадиях ВИЧ-инфекции выражается в шперпродукции провоспалительных цитокинов и прогрессирующем снижении продукции ИЛ-2, являющею основным ростовым фактором Txl.

4. Увеличение продукции ИЛ-б с параллельным снижением способности клеток синтезировать ИЛ-2 в динамике ВИЧ-инфекции отражает переключение клеточного иммунитета на гуморальный, которое наиболее выражено в стадиях III Б и III В.

5. Снижение коэффициентов соотношения между спонтанной и индуцированной продукцией ИЛ-ß, ФНО-а и ИЛ-б в ходе ВИЧ-нфекции свидетельствуют о снижении реактивности мононуклеарных клеток периферической крови в ответ на неспеиифические антигены, что совпадает с наступлением иммунодефицитного состояния.

6. Данные исследования концентрации ФНО-а в сыворотке больных ВИЧ-инфекции и белка ВИЧ р24 демонстрируют высокую позитивную корреляцию между ними (г=0,87), отражают тяжесть состояния, эффективность проводимой противовирусной терапии.

7. Активация клеток иммунной системы, вызываемая пшерпродукцией провоспалительных цитокинов и характеризующаяся появлением большого числа клеток, несущих "активационные антигены'^ является неблагоприятным прогностическим признаком и требует использования препаратов, подавляющих гиперпродукцию провоспалительных цитокинов, при ВИЧ-инфекнии.

8. Выявлена взаимосвязь HLA фенотипа с уровнем продукции ФНО-а. Присутствие в HLA фенотипе антигенов AI, В8, 16, 35, 40, 41, DR1,3, связанных с высокой продукцией ФНО-а, генетически детерминирует злокачественное течение и быстрое прогрессирование заболевания, тогда как антигенов А19,28,

32

B7,12,13,DR2,6, связанных с низкой продукцией ФНО-а, доброкачественное течение и медленное прогресснрование.

9. Содержание интерферона-a в сыворотке крови снижается в динамике заболевания и отрицательно коррелирует с содержанием белка р24, что указывает на существование эндогенной противовирусной защиты при ВИЧ-инфекции, хотя и недостаточной для элиминации вируса.

10. Провосгхалительные питокины участвуют при ВИЧ-инфекции в возникновении ряда клинических симптомов: лихорадки, снижении веса, энцефалопатии, диарреи, анемии, тромбоцитопении.

11. Выявлены и обоснованы иммуногенетические и тммунологические критерии медленной прогрессии заболевания: 1аличие HLA антигенов"протекторов" в фенотипе пациента; высокий фовень продукции интерферона-a, эндогенного фактора фотивовирусной защиты; низкий процепт клеток с "активационными" 1аркерами CD25 и HLA II.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Распределение HLA-DR антигенов среди жителей г.Лешшграда // 5естник АМН СССР - 1988 - N 7- с.15-17 (соавтор Беляева Е.В.).

2. Изучение структурно-функциональной организации иитерлейкина-и интерлейкина-2 // Докл. АН СССР - 1989 - т. 307 - N 3 - с. 747-751 :оавторы Колобов A.A., Колодкин Н.И., Симбирцев A.C., Кетлинский !.А., Кауров O.A.).

.3. Изучение биологической активности рекомбинанстного нтерлейкина-lß человека. Анализ лимфоцитактивирующих свойств // [ммунология -1990 - N6 - с. 39-42 (соавторы Симбирцев A.C., [игарева Н.В., Кетлинский С.А., Винецкий Ю.П., Машко C.B.).

4. Синтез и биологическая активность синтетических нептидов-рагментов белков вируса иммунодефицита человека // Тезисы докл. сес. симпозиума по химии пептидов. - Рига - 1990- с. 11 (соавторы русако А.Н., Симбирцев A.C., Пигарева Н.В., Кетлинский С.А.).

5. Сравнительный анализ биоактивности синтетических пептидных иммуномодуляторов // Тез. докл. Всес. симпозиума по химии пептидов. -Рига-1990-с,85 (соавторы Симбирцев А.С.,Пигарева Н.В.,Конусова В.Г.).

6. Клинико-иммунологическая характеристика минфицированных ВИЧ в ^Ленинграде // Иммунология - 1990 - N 4 - с.24-27 (соавторы Рахманова А.Г., Кетлинский С.А., Исаков В.А.).

7. Молекулы CD4, CD8, CD3, CD25 при ВИЧ-инфекции // Материалы Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний - Звенигород - 1990 - с.43 (соавторы Рахманова А.Г., Кетлинский С.А.,Исаков В.А.).

8. Выявление первых случаев инфицирования вирусом иммунодефицита человека в г. Ленинграде // Иммунология - 1990 - N 5 - с.9-12 (соавторы Козлов А.П., Емельянов А.В., Малых А.Г.).

9. Purification and characterization of the immunostimulatory properties of recombinant human interleukin-ip // Eur. Cytokine Netw.- 1991 - v.2-N 1., - p. 17-26 (co-authors Ketlinsky S., Simbirtsev A., Poltorak A., Solovieva L., Konusova V., Pigareva N.).

10. Human IL-ip: purification, biological and immunochemical characterization // Abstr. of International Conference on Medical Biothehnology, Immunization and AIDS - Leningrad - 1991 - P.S7-5. (coauthors Simbirtsev A., Poltorak A., Konusova V., Pigareva N.).

11. Preparation of liposomes with affinity towards human immunodeficiency virus // Abstr. of International Conference on Medical Biothehnology, Immunization and AIDS - Leningrad - 1991- p.Sl-19. (coauthors Poltorak A, Chernyavsky V.M.).

12. Changes in cellular immunity and cytokine levels in HIV positive patients // Abstr. of International Conference on Medical Biothehnology, Immunization and AIDS - Leningrad - 1991 - P.S7-13. (co-authors Ketlinsky S.A, Prokopiev A.A, Tsvetkova S.N.).

13. The preparations of liposomes of directed action // Abstracts of 17th Intern. Congress of Chemoterapy - Berlin.- June, 23-28 - 1991, p.32 (coauthors Poltorak A., Chernyavsky V.M.).

14. Зависимость между продукцией ФНО-а, HLA фенотипом и течением ВИЧ-инфекции // Актуальные проблемы ВИЧ-инфекции и СПИД. С.-Петербург, НИИЭМ им. Пастера, 1991 - с. 17 (соавторы Кетлинский С.А., Цветкова С.Н., Бубнова Л.Н.).

15. ИЛ-ip и ФНО-а в сыворотках крови детей, больных ВИЧ-инфекцией // Актуальные проблемы ВИЧ-инфекции и СПИД. СПб, НИИЭМ им.Пастера,1991- с. 18 (соавт. Рахманова А.Г., Цветкова С.Н.).

16. Фактор некроза опухоли альфа и интерлейкина 1 бета в плазме крови больных ВИЧ-инфекцией // Вестник РАМН - 1992 - N 9-10 - с. 36-41 (соавторы Рахманова А.Г., Цветкова С.Н., Кетлинский С.А.).

17. Ghanges in cellular immunity and cytokine levels in HIV positive persons // J.Cell.Biochem., 1992, S168B, P. 284. (co-authors Ketlinsky S.A., Prokopiev A.A., Tsvetkova S.N., Rakhmanova A.G.).

18. Endogenous TNF-a production and HLA phenotypes in HIV patients 7 Abst. of Inter. Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses -18-22 November 1992 - St.Petersburg - p.32 (co-authors Ketinsky S., Bubnova L., Haldeeva N., Rakhmanova A., Koslov A.).

19. TNF-a serum levels spontaneous and induced production by PBMC n HIV patients // Abst. of Inter. Conference on AIDS, Cancer and Human letroviruses - 18-22 November 1992 - St.Petersburg - p.80 (co-author Cetlinsky S., Haldeeva N., Rakhmanova A.).

20. Cytokines production by PBMC in HIV patients // Abst. of 2-nd Inter. Conf. AIDS, Cancer and Human Retroviruses" - November 29 December 3 1993 -t.Petersburg - p.22 (co-authors Prokopiev E.D., Haldeeva N.A., Pigareva N.V.).

21. Changes in spontaneous and induced TNF-a production in HIV tifected children // Abst. of 2-nd Inter.Conference "AIDS, Cancer and luman Retroviruses" - November 29 - December 3 1993 - St.Petersburg -.23 (co-authors Ketlinsky S.A., Khaldeeva N.A., Rakhmanova A.G.).

22. Mechanisms of in vivo IL-1 induced immunomodulation // Abstract ook of 3rd International Conference on cytokines-Italy, Florence March 28-30994 - p.26 (co-authors Simbirtsev A., Konusova V., Pigarev N., Kotov A.).

23. Proinflammatory cytokines and p24 antigenemia in HIV patients // abstract- book of 3rd Internationa] Conference on cytokines - Italy Florence March 28-30 1994 - p.92 (co-authors Prokopieva E., Ketlinsky S.).

24. Epitope on gpl20 important in CD4 binding and TNF-a induction /nthesis identified by biological testing on synthetic peptides // Abstract □ok of 3rd International Conference on cytokines - Italy Florence - March 8-30 1994 - p.93 (co-authors Ketlinsky S., Prusakov A., Kaurov O.).

25. Epitope on gpl20 important in CD4 binding and TNF-a induction rathesis identified by biological testing on synthetic peptides // European

Citokine Network - 1994 - V.5 - N 2 - p. 169 (co-authors Ketlinsky S., Prusakov A., Kaurov 0.).

26. TNF, HLA and progression of HIV intection // European Cytokin Network - 1994 - V.5 - N.2 - p. 170 (co-authors Ketlinsky S., Bubnova L.).

27. Цитокиновый статус, иммунологические и иммуногенетические показатели в группе детей, часто болеющих острыми респираторными инфекциями // Иммунология - 1995 - 2 - с.40-43 (соавторы Кетлинский С.А., Норка А.В., Халдеев Н.А., Цветкова С.Н., Бубнова JI.H.).

28. Спонтанная и индуцированная продукция ФНО-а у детей с ВИЧ-инфекцией // Иммунология - 1995 - 2 - с. 16-18 (соавторы Кетлинский С.А., Халдеева Н.А., Рахманова А.Г., Пинскер A.M.).

29. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакций воспаления иммунитета // Иммунология - 1995 - 3 - с.30-44 (соавтор Кетлинский С.А.).

30. TNF-a, HLA and developing of AIDS // European Cytokine Network - 1995 March - Sp. I - p.18 (co-author Ketlinsky S.).

31. HIL induced IL-lp, TNF-a, IL-6, IL-2 disregulation and AID developing // European Cytokine Network - 1995 March - Sp.I - p. 18 (coauthors Ketlinsky S., Rakhmanova A.).

32. Антигены гистосовместимости - кофакторы прогрессии ВИЧ-инфекции // Тезисы 3-й международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" - С.-Петербург - 1995 - с.85.

33. Использование показателей клеточного иммунитета в наблюдении за больными ВИЧ-инфекцией в динамике // Тезисы 3-й международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" - С.Петербург - 1995 - с. 87.

34. Воздействие белков вируса гриппа на иммунокомпетентные клетки организма хозяина // Вестн. РАМН - 1995 - N9 - с. 15-18 (соавторы Жилинская И.Н., Полякова Е.П., Пучкова Г.Ф.).

35. Взаимосвязь между антигенами гистосовместимости, фактором некроза опухоли-а и течением ВИЧ-инфекции // Вестн. АМН России -1996 - N 1 - с.84-89.

36. Структурно-функциональный анализ гликопротеина gpl20 вируса иммунодефицита человека с помощью синтетических пептидов, гомологичных его структуре // Вестн. АМН России - 1996 (принята к опубликованию; соавторы Кетлинский С.А.,Прусаков А.Н.,Кауров О.А.).