Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль апоптоза лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-инфекции

На правах рукописи

МУСТАФИН ИЛЫПАТ ГАНИЕВИЧ

РОЛЬ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КАЗАНЬ - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Зубаиров Дилявер Мирзабдуллович

доктор медицинских наук, доцент Бойчук Сергей Васильевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Цибулькин Анатолий Павлович

доктор медицинских наук, профессор Поздеев Оскар Кимович

доктор медицинских наук, профессор Горбунова Нигелла Анатольевна

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет (Москва)

Защита диссертации состоится 2005 года в

часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при Казанском государственном медицинском университете по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан

005 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор А.П. Киясов

¿006-4 \g\is

3

//¿Ш 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Многочисленные исследования, посвященные процессу програмированной клеточной гибели (апоптозу), показали важную роль апоптоза в физиологических и патологических процессах организма (Kerr J.F.R., 1972; Ярилин A.A., 1997; Jacobson MD., 1997) . Апоптозу принадлежит ведущая роль в поддержании гомеостаза организма. В наиболее общей форме назначение апоптоза состоит в поддержании постоянства численности клеток, их соотношения и удалении генетически дефектных клеток (Ярилин A.A., 1998).

Вместе с тем следует выделить и патологическую роль апоптоза, проявляющуюся нарушениями механизмов регуляции процессов программируемой клеточной гибели (ГПСГ), что может быть одним из главных звеньев патогенеза различных заболеваний. В частности, повышенная активация ПКГ является одним из звеньев нейродегенеративных (LaFerla F.M., 1995) и миелодиспластических заболеваний, ишемических повреждений различных органов (Saikumar Р., 1998) и других патологических состояний. Напротив, ингибирование процессов ПКГ наблюдается при опухолевых процессах (Levine A. J., 1994; Frassantino М.А., 1998), аутоиммунных (Kaneko Н., 1996; Никонова М.Ф., 1997). Данное положение можно отнести и к ряду вирусных заболеваний, сопровождающихся нарушениями регуляции клеточной гибели. При этом отмечается как повышение апоптоза (цитомегаловирусная инфекция), так и его ингибирование (вирус герпеса, бакуловирус, вирус Эпстайн-Барр) (Jerome К. R., 1998; Yang Y.L., 2000; Benetti L., 2004).

Ведущим звеном патогенеза ВИЧ-инфекции является развитие вторичного иммунодефицита вследствие развития дисфункции и уменьшения количества С04+Т-лимфоцитов (Сй4+Т-Лф) (Fauci A.S., 1988; Levy J.А., 1993; Mellors J., 1996; Badley A.D., 2000). Инфицированию ВИЧ-1 также подвержены макрофаги, гистиоциты, дендритные клетки.

Несмотря на то что выявлено несколько причин уменьшения числа С04+Т-Лф при ВИЧ-инфекции, ведущим фактором, обуславливающим снижение абсолютного числа С04+Т-Лф, безусловно, является их гибель по механизму апоптоза (Badley A.D., 2000). Многочисленные механизмы, вносящие свой вклад в ВИЧ-ассоциированный апоптоз лимфоцитов, включают хроническую иммунологическую активацию; gp120/160-связывание С04-рецептора; усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, B-клетками и С08+Т-клетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов или вирусных белков, убивающих неинфицированные С04+Т-клетки.

Механизмы апоптоза инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных С04+Т-Лф остаются до настояще] ными. С одной

стороны, логичными выглядят результаты исследований, иллюстрирующих ослабление программы апоптоза в инфицированных ВИЧ-1 С04+Т-ЛФ и клеточных линиях, что в свою очередь, является необходимым фактором, обеспечивающим создание резервуаров для репликации ВИЧ-1 и предпосылок для усиления репликации вируса (Antoni В., 1995; Rapaport Е., 1998). С другой стороны, имеются также многочисленные данные об усилении гибели С04+Т-Лф, а также различных клеточных линий, инфицированных ВИЧ-1 (Noraz N., 1997; Herbein G., 1998; Gandhi R., 1998). Данное противоречие может быть лишь отчасти объяснено различиями в используемых для инфицирования лабораторных штаммах ВИЧ-1 (Rapaport Е., 1998).

Наличие на клеточной поверхности Fas-рецепторов (CD95, АРО-1), определяющих способность клеток к восприятию апоптогенных стимулов и приводящих к гибели клетки по механизму апоптоза, признается рядом исследователей ведущим механизмом апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции. Т-клетки ВИЧ-инфицированных пациентов проявляют как увеличенную экспрессию рецептора Fas, так и повышенную восприимчивость к Fas-опосредованной смерти (Katsikis P.D.,1995, McCloskey T.W., 1998). В мононуклеарных клетках (содержащих моноциты) периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов повышен FasL (Silvertris F., 1998), а также уровень растворимого FasL, который коррелирует с содержанием РНК ВИЧ-1 (Hosaka N.,1998). Эти данные заставляет предположить, что экспрессия Fas-рецептора и Fas-лиганда могут быть важны для некоторых форм ВИЧ-индуцированной клеточной смерти.

Тем не менее, экспрессия Fas рецептора является не единственным признаком, определяющим подверженность клеток апоптозу. Например, у больных ВИЧ-инфекцией также установлена выраженная экспрессия Fas-рецептора на поверхности С08+Т-Лф, что является следствием их активации. Между тем на ранних стадиях заболевания С08+Т-лимфоциты устойчивы к апоптотической гибели. Механизмы устойчивости СТ>8+Т-Лф к апоптозу остаются до конца не изученными.

Литературные данные свидетельствуют о том, что Т-Лф ВИЧ-инфицированных пациентов в большей степени подвергаются спонтанному апоптозу, чем Лф доноров (Katsikis P.D., 1995). Более того, активация С04+Т-Лф ВИЧ инфицированных пациентов ex vivo (с помощью различных стимулов) постоянно усиливает апоптоз в отличие от клеток неинфицированных людей (Ledru' Е., 1998). Этот феномен, названный индуцированная активацией смерть клеток (activation-induced cell death (AICD)), происходит только в предварительно активированных клетках (Brunner Т., 1995) и может представлять собой модель для изучения последствий антигенной стимуляции in vitro (Yang Y., 1995). Покоящиеся Т-Лф периферической крови доноров после стимуляции через TCR

подвергаются пролиферации, секретируют цитокины (Nau G.J., 1988), и проявляют склонность к гибели по механизму Fas-опосредованного апоптоза (Alderson M.R., 1995).

Одним из потенциальных факторов, индуцирующих апоптоз Лф при различных патологических состояниях, в том числе, при ВИЧ-инфекции, может являться микровезикуляция. Данное предположение основано на данных, демонстрирующих повышенное количество микровезикул при программированной клеточной гибели различных типов клеток. Установлено, что микровезикулы (MB) являются фрагментами клеточных мембран, отделяемых от клеточной поверхности при активации и апоптозе (Martin S.J., 1995; Freyssinet J-M., 2003). Возможность индукции апоптоза Лф микровезикулами, содержащими вирусные частицы, привлекает внимание многих исследователей (Aupeix К., 1997; Bess J.W., 1997). Показано, что MB, содержащие на своей поверхности FasL, способны вызывать апоптоз различных клеток-мишеней (Jodo S., 2001; Andreola G.,

2002), Тем не менее, некоторые авторы ставят под сомнение возможность индукции апоптоза растворимыми формами FasL (Suda T., 1997). Кроме того, установлена возможность переноса микровезикулами тромбоцитарного и мегакариоцитрного происхождения хемокиновых рецепторов CXCR4 на поверхность негативных по данным рецепторам клеток. Этот факт может обуславливать их восприимчивость к инфицированию СХСЯ4-тропным штаммом ВИЧ-1 (Rozmyslowicz Т.,

2003).

Известно, что применение современных антиретровирусных препаратов способно подавлять репликацию ВИЧ-1, а также влиять на процессы апоптоза Лф в лимфоидной ткани и периферическом русле. Тем не менее, воздействие препаратов на резервуары ВИЧ-1 и индукцию апоптоза латентно инфицированных клеток существенно ограничено и неэффективно. Следовательно, понимание механизмов регуляции апоптоза может явиться предпосылкой для создания новых и перспективных методов терапии ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита.

Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором были поставлены следующие цели и задачи.

Цель исследования:

Изучение механизмов апоптоза лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией и их взаимосвязи с процессами активации лимфоцитов и репликации ВИЧ-1.

Задачи исследования:

1. Изучить последовательность и взаимосвязь событий спонтанного, индуцированного и активационного апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

2. Изучить экспрессию Fas-рецептора и его лиганда на поверхности лимфоцитов периферической крови, а также зависимость их экспрессии от функционального состояния лимфоцитов.

3. Исследовать механизмы Fas-индуцированного апоптоза лимфоцитов доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

4. Изучить влияние процессов активации лимфоцитов на восприимчивость к действию апоптогенных стимулов.

5. Исследовать роль митохондрий, а также некоторых митохондриальных белков (в частности, Вс1-2), в процессах спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.

6. Изучить взаимосвязь репликации ВИЧ-1 и апоптоза различных популяций лимфоцитов периферической крови и лимфоидных линий

7 Изучить роль процессов микровезикуляции в патогенезе ВИЧ-инфекции.

Научная новизна.

Впервые получены данные, иллюстрирующие зависимость активационного статуса Лф больных ВИЧ-инфекцией и их повышенной восприимчивости к апоптозу. Показано, что повторная активация лимфоцитов, одновременно экспрессируюших активационные маркеры (CD38, HLA-DR, CD26) снижает их чувствительность к действию апоптогенных стимулов (ФГА, энти-Fas-MKAT). Впервые выявлена повышенная чувствительность к Fas-индуцированному апоптозу у лимфоцитов с гиперэкспрессией Fas-рецептора. Показано, что при ВИЧ-инфекции имеется повышенная чувствительность лимфоцитов периферической крови к апоптогенному действию глюкокортикоидов. В то же время, только С08+Т-лимфоциты являются резистентными к ФГА-индуцированному апоптозу. При инфицировании in vitro культуры лимфоцитов наблюдается резкое снижение количества неинфицированных С04+Т-лимфоцитов (но не CD8+ Т-лимфоцитов) вследствие их гибели по механизму апоптоза. Впервые установлено, что инфицированные in vitro лимфоциты являются резистентными к апоптозу. Репликация ВИЧ-1 сопровождается подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов и массовой гибелью неинфицированных CD4+ Т-лимфоцитов по механизму апоптоза. Установлено повышение образования микровезикул тромбоцитарного происхождения у больных ВИЧ-инфекцией, коррелирующее с активацией Т-лимфоцитов периферической крови.

Научно-практическая значимость.

Совершенствование диагностики ВИЧ-инфекции, проведение адекватной терапии невозможно без глубоких знаний о патогенезе и механизмах формирования иммунодефицитного состояния при данном заболевании. Полученные данные о механизмах гибели лимфоцитов при ВИЧ-инфекции открывают путь к поиску новых подходов к лечению данного заболевания. Модель оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов может быть использована как в комплексном исследовании процессов ПКГ и функциональной активности клеток, участвующих в патогенезе вирусных заболеваний с нарушениями апоптоза, так и для направленного поиска средств фармакологического контроля.

Результаты проведенного исследования могут быть использованы патофизиологами, иммунологами, инфекционистами в научной, практической и учебной работе. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лимфоциты периферической крови больных ВИЧ-инфекцией подвержены апоптотической гибели, что обусловлено их повышенной активацией.

2. Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных ВИЧ-инфекцией различаются по чувствительности к апоптогенным стимулам. Наиболее резистентной популяцией лимфоцитов к активационному и Fas-индуцированному апоптозу является С08+Т-лимфоциты. Развитие устойчивости CD8+T-лимфоцитов к апоптозу зависит от их функционального состояния, выявляемого по экспрессии активационных маркеров.

3. Интенсивность репликации ВИЧ-1 in vitro обусловлена подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов. Повышенная гибель неинфицированных лимфоцитов по типу апоптоза находится в прямой зависимости от репликации ВИЧ-1.

Внедрение результатов исследования.

Разработанные в исследованиях методы исследования активационного апоптоза лимфоцитов периферической крови используются в комплексном иммунологическом исследовании больных ВИЧ-инфекцией в лаборатории иммунологии Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ Министерства здравоохранения Республики Татарстан. Материалы диссертации используются в преподавании раздела "Патогенез иммунодефицита при ВИЧ-инфекции" на кафедре инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на 4, 5, 6, 7, 8 -ой Всероссийских конференциях по аллергологии и клинической

иммунологам "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004); на 10, 11-ом Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2000, Москва, 2001); 7, 8-ой Всероссийских школах молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2000, 2001); 5-ой научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2001); 4-ом Конгрессе РААКИ "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2001); 12-ой Конференции ученых КГУ "Нуклеазы микроорганизмов" (Казань, 2001); 11-ой Международном Конгрессе "Европейского респираторного общества" (Берлин, 2001); 1,3-ей научно-практической конференции с международным участием "Проточная цитофлуорометрия и ее использование в практической медицине" (Санкт-Петербург, 2001, 2004); XVII Менделеевском съезде но общей и прикладной химии (Казань, 2003); Юб.конференции, посвящ. 10-летию основания Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.Шмидта-Б.Кудряшова (Москва, 2003), 3-м Российском конгрессе по патофизиологии "Дизрегуляторная патология органов и систем" (Москва, 2004), Всероссийском семинаре "Проблемы определения субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц методом проточной цитометрии" (Смоленск, 2004); 2-й Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2005); заседании предметно-проблемной комиссии КГМУ по патофизиологии и аллергологии (Казань, 2005).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 38 работ, из них 8 в центральной печати.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, глав результатов исследования, заключения, выводов, Списка цитируемой литературы. Объем диссертации 252 страницы машинописного текста, содержит 52 рисунка, 4 таблицы. Список литературы включает 32 отечественных и 313 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе был использован материал, полученный от 129 больных ВИЧ-инфекцией, находящихся на стадиях заболевания ПА- IV.

Объектом изучения служили лимфоциты (Лф) периферической крови 120 доноров и 129 больного ВИЧ-инфекцией. Возраст обследованных лиц - от 17 до 46 лет, 98 женщин и 151 мужчина.

Диагноз ВИЧ-инфекции подтверждался при наличии антител к вирусспецифическим белкам в иммуноблоте "New Lav-Blot 1" фирмы "Sanofi Diagnostics Pasteur".

Проводилось общеклиническое и лабораторное обследование, включавшее в себя общий анализ крови с лейкоформулой, общий анализ мочи, ФПП, серологические и вирусологические анализы.

Клетки выделялись из периферической крови в несколько этапов. Проводился забор крови внутривенной пункцией иглой № 2 в объеме 15-25 мл. Кровь смешивали в соотношении 20:1 с 2,7% раствором ЭДТА, используемого в качестве антикоагулянта. Для выявления MB проводили забор крови на гепарине или цитрате натрия.

Лф выделяли центрифугированием на градиенте плотности Фиколл-Пака ("Sigma"), при 700g в течение 25 минут при комнатной температуре. Мононуклеары, полученные с интерфазы, дважды отмывали раствором Хенкса, не содержащим ионы Са2+ и Mg2+. Чистота выделения клеток варьировала от 85 до 96%.

Жизнеспособность клеток оценивали по исключению красителя трипанового синего, а также методом окрашивания пропидием йодидом с последующей оценкой методом проточной цитофлуорометрии.

Клетки культивировали в среде RPMI 1640 ("Flow") с добавлением L-глутамина, HEPES, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и антибиотиков в С02-инкубаторе (5% СОг) ("Jouan") в течение 1-6 суток.

Клетки инкубировали с дексаметазоном (Дн) ("Sigma"), ионофором Са2+ А23187 ("Sigma"), фитогеммаглютинином (ФГА) ("Serva"), олигомицином ("Sigma"), моноюхональными антителами (мкАТ) анти-СОЗ ("Ortho"), мкАТ aHTH-Fas ("PharMingen").

Исследование апоптоза Лф проводилось методом проточной цитофлуориметрии на приборах Facscan и FacsCalibur ("Becton Dickinson") с использованием нескольких методов, включая определение фрагментации ДНК по выявлению гиподиплоидного пика при окраске PI, выявление экспрессии фосфатидилсерина на поверхности Лф флуоресцентной меткой мероцианин 540 (МС540) и аннексином V, измерение митохондриального потенциала клеток по интенсивности флуоресценции CMX-Ros и DiOC6, определение экспрессии Fas-рецептора (CD95) и Fas-лиганда (CD95L), определение антиапоптотического белка Вс1-2. В каждом случае на каждый вариант опыта анализировалось не менее 10000 клеток.

1. Определение фрагментации ДНК

Фрагментацию ДНК определяли по наличие гиподиплоидного пика, характерного для апоптоза, оцениваемого с помощью флуорохрома пропидия йодида (PI) ("Sigma") (Nicoletti I., 1991).

2. Оценка изменений клеточной мембраны.

Изменение клеточной мембраны определялось по наличию экспрессии фосфатидилсерина(ФС), выявляемого при окрашивании Лф с помощью флуорохрома мероцианина 540 (МС540) и аннексина V, меченого FITC (AnnV-FITC). Регистрацию результатов проводили на первом детекторе флуоресценции FL1 для AnnV-FITC и втором детекторе FL2- для МС540.

3. Измерение величины митохондриального потенциала (АЧ'щ).

Динамику изменения величины АЧ'щ выявлялась с использованием флуорохромов дигексилокарбоцианина йодид (DiOC6 ) ("Sigma") и хлорометил-Х-розамина (CMX-Ros) ("Molecular Probes"). Снижение интенсивности флуоресценции данных флуорохромов соответствует снижению величины ДТт.

Регистрацию результатов проводили на первом детекторе флуоресценции FL1 для DiOC6 и на третьем детекторе флуоресценции FL3 для CMXRos. Различная область эмиссии ЕЙОСб и CMX-Ros позволяла проводить одновременное окрашивание клеток этими флуорохромами.

В качестве контроля уровня флюоресценции флуорохромов, используемых для оценки величины ДЧ'щ, применялся специфический индуктор, снижающий величину Д^Рт - хлорофенилгидразон карбонила цианид (ш - С1ССР) ("Sigma") в дозах 50-150 мМ.

4. Определение экспрессии Fas-рецептора (CD95) и Fas -лиганда (CD

95L)

Выявление Fas-рецептора проводили с использованием мкАТ CD95, меченных фикоэритрином (PE) ("PharMingen") и FITC ("Сорбент"). Оценку уровня экспрессии FasL проводили в непрямой реакции флуоресценции с использованием мкАТ, меченых биотином. На втором этапе клетки дополнительно окрашивали стрептавидин-фикоэритрином. Учет результатов проводили на втором детекторе FL2.

Для исключения неспецифической флуоресценции проводили постановку реакции с отрицательным изотопическим контролем (использовали иммуноглобулины мыши того же изотипа, мечеными аналогичным флюорохромом).

5. Определение внутриклеточной экспрессии белка Вс1-2 Определение внутриклеточной экспрессии Вс1-2 проводилось с предварительной пермеабилизацией Лф. Клетки обрабатывали пермеабилизирующим раствором (FACS Permeabilizing solution) ("Becton Dickinson"), при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Далее клетки отмывали дважды раствором CellWash ("Becton Dickinson"), содержащим азид натрия, и инкубировали с мкАТ к Вс1-2, меченными фикоэритрином (РЕ) ("PharMingen") в течение 40 минут при 4°С. После окраски клетки дважды отмывали раствором CellWash. Оценку результатов проводили на втором детекторе FL2.

Для исключения неспецифической флуоресценции проводили постановку реакции с отрицательным изотопическим контролем (использовали иммуноглобулины мыши того же изотипа, мечеными аналогичным флуорохромом).

6. Определение фенотипа Лф периферической крови

Содержание CD3+, CD4+, CD8+, CD16+/56+, ОТ19+-Лф определяли в реакции прямой иммунофлуоресценции с использованием мкАТ к соответствующим антигенам, меченых 4 видами флуорохромов - FITC, РЕ, PerCP, APC ("BD"USA). Для этого клетки инкубировали с мкАТ к CD, мечеными флуорохромами (20 мин. при 4° С). Активационный фенотип Лф определяли с применением мкАТ к CD25, HLA-DR, CD38, CD26 антигенам.

Различная область эмиссии используемых в ходе исследования флуорохромов позволила произвести различные комбинации окрашивания клеток, что, в свою очередь, позволило проводить как одновременную оценку различных маркеров апоптоза, так и их динамику на различных клеточных популяциях Лф. При оценке уровня одновременной экспрессии внутриклеточных антигенов (Вс1-2) на различных популяциях Лф окрашивание мкАТ к поверхностным АГ производили перед пермиабилизацией клеток. Также, в первую очередь, проводили окрашивание клеток флуорохромами, используемыми для оценки величины ДЧРт. Окрашивание клеток с мкАТ к различным поверхностным АГ (например, CD4 и CD95) проводилось одновременно.

Выявление микровезикул (MB) проводили по маркерному ферменту 5'-нуклеотидазе по методу Зубаирова Д.М., Андрушко И.А., 1987 и методом проточной цитофлуориметрии (Abrams C.S., 1990).

Для исследования MB методом проточной цитометрии проводили забор венозной крови в вакуумные пробирки с цитратом натрия. Плазму получали центрифугированием крови при 1500 g в течение 15 мин. Пробы плазмы анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Регистрация прямого малоуглового (FSC) и бокового светорассеивания (SSC) в логарифмическом режиме позволила нам дискриминировать микровезикулы в отдельной зоне.

Спонтанную и стимулированную активацию тромбоцитов оценивали по экспрессии адгезионной молекулы CD62P после окрашивания моноклональными антителами PE-CD62P (Pharmingen, San Diego, Calif.). Стимуляцию тромбоцитов проводили 2x10"4 M АДФ.

В качестве источника ВИЧ-1 использовали штамм NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA), геном которого был представлен в виде 2 плазмид (р83-2 и р83-10), содержащих соответственно 5'- и 3'- последовательности генома ВИЧ-1.

Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с применением пакетов прикладных программ "Excell " и "Statgraphics Plus". Достоверность различий полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента. Корреляционный анализ полученных результатов проводили с применением методов Пирсона (параметрический) или Спирмена (непараметрический).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Спонтанный апоптоз лимфоцитов доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

На основании исследований апоптоза лимфоцитов периферической крови, проведенных с применением различных методических подходов (определение фрагментации ДНК по окраске пропидиумом йодидом, определение митохондриального потенциала и экспрессии ФС), нами получены данные, свидетельствующие о существенных различиях спонтанного апоптоза Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

Результаты проведенного нами исследования показали, что у больных ВИЧ-инфекцией 13,5±3,8% свежевыделенных Лф (ex vivo) имеют сниженный A4V Этот маркер апоптоза Лф больных ВИЧ-инфекцией достоверно превышал аналогичный показатель, регистрируемый у Лф доноров (р<0,05). В то же время признаки фрагментации ДНК и экспрессии ФС на поверхности Лф исследуемых групп отсутствовали. Эти данные, на наш взгляд, представляются логичными, так как появление молекул ФС на поверхности апоптотирующих клеток является предпосылкой для их элиминации клетками РЭС in vivo. Следовательно, определение в периферической крови клеток, экспрессирующих молекулы ФС, и тем более имеющих фрагментацию ДНК (поздняя стадия апоптоза), представляется маловероятным. Сниженный ДТт Лф периферической крови больных ВИЧ-инфекцией отражает их повышенную склонность к развитию спонтанного апоптоза. Кроме того, этот факт может свидетельствовать о повышенной чувствительности Лф к различным воздействиям, в том числе, апоптогенного характера.

Результаты проведенных исследований показали, что при культивировании Лф периферической крови доноров и больных ВИЧ-инфекцией наблюдается гибель клеток. Исследование маркеров апоптоза выявило, что часть клеток погибала по типу апоптоза. Определение ДЧ'щ Лф показало, что снижение величины ДЧ^ Лф доноров происходит после 48 часов инкубации, тогда как у больных ВИЧ-инфекцией на 48 часов содержание ДЧ^^-лимфоцитов было достоверно выше (р<0,001) и составило более 30%.

Фрагментацию ДНК Лф регистрировали в течение 96 часов инкубации в среде по появлению гиподиплоидного пика. Количество гиподиплоидных клеток у Лф доноров через 48, 72 и 96 часов инкубации

составило 8,1±2,6%; 15,5±5,9%; 21,3±6,9%. В то же время у Лф больных ВИЧ-инфекцией данный показатель был существенно выше и составил 16,5±3,8%; 22,1±5,3%; 39,7±9,1% соответственно. При культивировании Лф процессы спонтанной фрагментации ДНК среди Лф больных ВИЧ были значительно более выражены по сравнению с Лф доноров. Различие в исследуемом показателе обнаруживается после 48 часов инкубации, при дальнейшей инкубации клеток различие в данном показателе было более существенным. Полученные данные свидетельствуют о том, что у Лф больных ВИЧ при инкубации в среде с течением времени фрагментация ДНК происходит в большей степени по сравнению с Лф доноров.

Таким образом, результаты исследования маркеров апоптоза Лф при ВИЧ-инфекции показали наличие у больных ВИЧ-инфекцией повышение процессов спонтанной гибели клеток по типу апоптоза, определяемых по снижению митондриального потенциала, появлению ФС на поверхности клеток и фрагментации ДНК.

Спонтанный апоптоз субпопуляций Т-лимфоцитов

Исследование спонтанного апоптоза субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-Лф проводили трехцветным окрашиванием Лф по снижению Д*Рга клеток.

При анализе А*Рт субпопуляций Т-Лф, оцениваемого по интенсивности флуоресценции DiOCe Лф ex vivo, было выявлено снижение величины ATm в большей степени среди CD8+ по сравнению с CD4+ Т-Лф как у доноров, так и у больных ВИЧ-инфекцией. Содержание у доноров СП8+/Д¥ш|<т составило 12,2±1,4%, a CD4+/AvFm,0W - 7,1±2,1%. Для больных ВИЧ-инфекцией показатели составили 19,3±4,2% и 12,1±3,1%, соответственно.

Инкубация Лф в RPMI приводила к снижению ДТП1 Т-Лф. Полученные ранее данные о повышенном содержании Лф с А^т^-у больных ВИЧ-инфекцией при их инкубации в среде с дефицитом ростовых факторов подтвердились и при анализе ДТт субпопуляций Т-Лф. Так, к 48 часам инкубации клеток содержание CD8¡/AvFmlow составило 51,6%, CD4+/AlFmlow - 41,7% у больных ВИЧ-инфекцией, а у доноров 32,3% и 14,2%, соответственно. Дальнейшая инкубация клеток приводила к еще более высокой разнице в содержании субпопуляций Т-Лф с низким A^F,,, в группе больных ВИЧ и доноров. Анализ полученных данных показал, что у доноров снижение AvFm Т-Лф остается преобладающим среди СЭ8+Т-Лф при инкубации клеток, тогда как при ВИЧ-инфекции было выявлено значительное снижение АТп, как среди и CD4+, так и среди С08+Т-Лф.

Таким образом, можно утверждать, что при ВИЧ-инфекции обе субпопуляции Т-Лф подвержены спонтанному апоптозу в одинаковой степени.

Исследование спонтанного апоптоза среди лимфоцитов с различным активационным статусом.

Для определения взаимосвязи между активацией Лф и подверженности их спонтанному апоптозу мы провели исследование активационного статуса клеток у больных ВИЧ-инфекцией в группах с различным уровнем апоптоза Лф.

Исследования показали наличие повышенной экспрессии СОЗ 8 и НЬД-ЭИ антигенов на Лф больных ВИЧ-инфекцией. У части больных ВИЧ-инфекцией повышена одновременно экспрессия СОЗ 8 и НЬА-ОЯ антигенов на СБ8+Лф. Содержание С03+/С08+/С038+/Н1>А-011+Лф составило 67±10,2% у больных ВИЧ-инфекцией, что достоверно выше, чем в группе здоровых лиц (р<0,001).

По мере прогрессирования заболевания на фоне снижения СБ4+Лф наблюдается увеличение доли С04+/НЬА-0Я+Лф без изменения количества С04+/С03 8+Лф. По мере дальнейшего снижения СЕ)4+Лф увеличивается доля С04+/С038+/НЬА-011+Лф.

В группе больных ВИЧ-инфекцией с содержанием СБ4+Лф ниже 30% уровень С04+/С038+Лф достоверно не отличался (р>0,05) и составил 54,1 ±16,0% при 55,0±10,5% в группе с содержанием С04+Лф выше 30%, тогда как содержание С04+/НЬА-0Л+Лф достоверно увеличилось и составило 19,4±6,5% и 8,1 ±4,1%, соответственно.

Анализ активационного фенотипа периферических Лф у больных ВИЧ-инфекцией в группах с различным уровнем спонтанного апоптоза показал существенные отличия по уровню экспрессии активационных маркеров НЬА4Ж, СОЗ 8. Так, в группе больных ВИЧ-инфекцией с повышенным уровнем спонтанного апоптоза Лф содержание активированных Т-Лф (СОЗ +/НЬ А-011+) составило 39,2±5,1%. В то же время в группе больных с низкими значениями спонтанного апоптоза аналогичный показатель составил 25,1 ±7,0% (р<0,01). Исследование экспрессии другого активационного маркера СОЗ 8 выявило наличие достоверно повышенного содержания СЕ)3+/С038+ Лф лишь в группе больных с повышенным уровнем спонтанного апоптоза Лф. В группе больных ВИЧ-инфекцией с высокой степенью активации и С04+ и С08+Лф при инкубации клеток наблюдалось высокое содержание Лф с пониженным ДЧ'щ по сравнению с группой больных с повышенной активацией только С08+субпопуляции. Содержание ЛЧ/т'°"'-Лф к 48 часам наблюдения составило в группе с высокой активацией клеток 28,1+4,3%, тогда как в сравниваемой группе - 19,8±4,1% (р<0,01). Различие в содержании клеток с низким ДЧ^ к 72 часам наблюдения в сравниваемых группах увеличилось более чем в 2 раза.

Проведенный анализ показал наличие прямой корреляционной связи между степенью активации Т-Лф, определяемой по экспрессии НЬА-ОЛ и С038 антигенов, и уровнем их спонтанного апоптоза (г=0,845; р<0,001).

Исследование других маркеров апоптоза также показало наличие достоверно повышенного содержания апоптотических Лф в группе больных с одновременно активированными субпопуляциями Т-Лф. При определении содержания Лф, экспрессирующих ФС на поверхности клетки, было установлено, что содержание ФС+Лф в группе больных ВИЧ-инфекцией с повышенной активацией Лф достоверно выше (р<0,01) и составило 23,7±4,8% при 13,3±5,1% в сравниваемой группе к 48 часам наблюдения. Повышенное содержание Лф с фрагментацией ДНК выявлялось у больных с одновременно активированными субпопуляциями Т-Лф и составило 11,0+4,7% к 48 часам, 16,3±5,8% к 72 часам культивирования клеток.

Определена прямая корреляционная связь между экспрессией активационных маркеров CD38, HLA-DR и антигена CD95 на субпопуляциях CD4+ и С08+Лф. При высокой экспрессии CD38 и HLA-DR антигенов на С04+Лф отмечается и увеличение экспрессии CD95. Так, у больных ВИЧ-инфекцией при содержании CD3 +/CD4+/CD3 8+Лф на уровне 65,6±6,8% и CD3+/CD4+/HLA-DR^ - 15,6±3,1% уровень СБЗ+/С04+/С095+Лф составил 52,2±5,9%, тогда как в группе больных ВИЧ-инфекцией с низкой активацией СОЗ+ЛЛМ+Лф экспрессия CD95 антигена была достоверно ниже (р<0,05) и составила 41,2±5,2%.

Таким образом, выявлена зависимость между активацией Лф и их чувствительностью к спонтанному апоптозу in vitro. Появление в периферической крови больных ВИЧ-инфекцией Лф с одновременной экспрессией активационных маркеров CD38 и HLA-DR на С04+Т-Лф является неблагоприятным прогностическим признаком, свидетельствующим о повышенной готовности клеток к апоптозу.

2. Изучение механизмов индуцированного апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.

Процессы апоптоза могут быть реализованы через специфические рецепторы. Эти рецепторы относятся к суперсемейству рецепторов ФНО (фактора некроза опухоли) и/или ФРН (фактора роста нервов). К этому семейству относятся широко известный Fas-рецептор (CD95), два рецептора для ФНО, рецептор для ФРН, а также CD27, CD30, CD40 и другие. Одна из функций данных рецепторов состоит в индукции апоптоза.

Данные литературы по уровню экспрессии Fas-рецепторэ на лимфоцитах при ВИЧ-инфекции многочисленны, но, тем не менее, противоречивы. С одной стороны, выявлено повышение уровня экспрессии Fas-рецептора на поверхности активированных Лф (Crispe N., 1995). С другой стороны, не обнаружено зависимости между выживаемостью Лф и уровнем экспрессии Fas-рецептора в присутствии цитокинов (Fauci N., 1994).

Анализ экспрессии Рав-рецептора на различных популяциях Лф.

Исследования уровня экспрессии Баз-рецептора (СБ95) на свежевыделенных Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией показали, что экспрессия данного антигена в общей популяции Лф доноров составила 44,8±14,5%, а среди Лф больных ВИЧ 63,4±10,8%. Количество С095+-клеток среди свежевыделенных СЭ4+-Лф доноров составило 30,4±1,5%, тогда как при ВИЧ-инфекции - 55,8±5,7% (р<0.001). Количество СБ95+-Лф среди С08+-Лф составило 35,7±6,7% и 67,9+9,4% у доноров и больных ВИЧ-инфекцией, соответственно (р<0.001) (Рис.1).

CD4 CD95 CD4/CD95 CD8 CD8/CD95

D Доноры ■ ВИЧ-инфиц CD4>30% Ш ВИЧ-инфиц CD4<30% Рис.1 Экспрессия CD95 антигена на основных популяциях и субпопуляциях Лф доноров, больных ВИЧ-инфекцией с уровнем CD4+ Т-лф ниже и выше 30%. ***- р<0,001, **- р<0,01 по сравнению с донорами, ### - р<0,001, ## - р<0,01 между группами ВИЧ-инфицированных

Кроме того, было выявлено, что популяция С08+-Лф является неоднородной по уровню экспрессии данного маркера. Данную популяцию Лф можно разделить на Лф с высоким уровнем экспрессии CD8 (CD8h,gh-Лф) и с низким уровнем экспрессии CD8 (СО8|0М,-Лф). Анализ уровня экспрессии CD95 на вышеуказанных субпопуляциях С08-Лф выявил закономерность, характерную и при аналогичных исследованиях у больных атопической бронхиальной астмой (Бойчук C.B., 2002). CD8low-Лф практически все экспрессировали на своей поверхности CD95 (84,6+6,6%), в то время как уровень экспрессии данного антигена на поверхности СОв^-Лф был существенно ниже и составил 42,4 ± 8,8 % (р<0.001) (Рис.2). Этот факт свидетельствует о гетерогенности С08+-Лф.

чг

о-а

16.07.008

о.

о

о

о

10° 101 Ю2 103 Ю4 СР95Р1ТС

Рис.2 Экспрессия Баз-рецептора на С08ы*ь- и СО8|0и,-Лф

Обнаружено, что СП16+-Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией не экспрессируют Раз-рецептор (более 90% СБ16+-Лф были негативны по СЕ>95). Количество Га5+-клеток среди С020+-Лф (зрелые В-Лф) доноров и больных ВИЧ-инфекцией составило 47,6+8,4% и 49,9±8,1%, соответственно.

Таким образом, полученные данные показали усиление экспрессии Раз-рецептора на клеточной поверхности Лф периферической крови больных ВИЧ-инфекцией, что свидетельствует о повышенной готовности Лф (СИ4+ и СБ8+) к запуску апоптоза, опосредованного Раз-рецептором.

Существует связь между количеством СБ4+Т-Лф и экспрессией молекулы апоптоза на субпопуляциях лимфоцитов: чем ниже содержание С04+клеток, тем выше содержание СЭ95+Лф, и выше экспрессия С095 на С08+Т-Лф. В группе больных ВИЧ с содержанием С04+Т-Лф менее 30% - выше содержание СБ4+ и С08+Т-Лф, экспрессирующих С095, тогда как в группе больных ВИЧ с содержанием С04+Т-Лф более 30% отмечается повышенное содержание СП8+/СШ5+Лф (р<0,001) и тенденция к увеличению С04+/СЕ>95+Лф. При этом относительное содержание С08+Т-Лф в этой группе больных не отличается от показателя здоровых лиц. Выявлено, что по мере уменьшения СБ4+Т-Лф увеличивается экспрессия на них СЕ>95 антигена. Содержание С04+/СЮ95+Лф в этой группе больных (Н1У2) составило 57,6±19,0% (Рис.1).

В группе больных ВИЧ-инфекцией с низким содержанием С04+Т-Лф отмечается увеличенное содержание С08+/СШ5+Лф и их содержание составляет 69,4±9,4%.

Таким образом, снижение СБ4+Лф при ВИЧ сопровождается увеличением содержания СИ95+Лф. Экспрессия Рая-рецептора значительно увеличивается на СБ8+Лф (р<0,001). При одинаковом содержании СБ8+Лф экспрессия Рав-рецептора была повышена у больных ВИЧ-инфекцией по сравнению с донорами (р<0,05).

Fas-индуцированный апоптоз лимфоцитов доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

Инкубация Лф периферической крови доноров с aHTH-Fas-мкАТ (1 мкг/мл) в течение 72 часов не индуцирует достоверного снижения величины ДТ,,,, Лф по сравнению с контролем.

Количество ФС+-Лф после их инкубации с анти-Fas-MKAT ( в течение 72 часов) существенно не увеличивалось у Лф доноров (Рис.3). Определение фрагментации ДНК клеток доноров также не выявило достоверного различия в содержании Лф с гиподиплоидным пиком по сравнению с контролем (Рис.4). Количество гиподиплоидных клеток у Лф доноров через 48, 72 и 96 часов инкубации с гнти-Fas-MKAT составило 9,5±3,9%; 20,1 ±7,3%; 24,1±9,4%. Данный показатель для Лф инкубированных без энти-Fas-MKAT (контроль) существенно не отличался и составил 8,1±2,6%; 15,5±5,9%; 21,3±6,9%, соответственно. Таким образом, исследования Fas-индуцированного апоптоза Лф показали, что неактивированные Лф доноров являются нечувствительными к Fas-индуцированному апоптозу.

Исследование индуцированного апоптоза анти-Fas-MKAT у больных ВИЧ-инфекцией выявило повышенное содержание Лф с низким А^т начиная с 48 часов инкубации клеток по сравнению с контролем (р<0,01). В группе больных отвечающих снижением Д*?,,, Лф на Fas-индуцированный апоптоз регистрировалось увеличение экспрессии ФС на поверхности клеток, выявляемое по повышению интенсивности флуоресценции МС540. Содержание МС540+ составило 34,3±7,6% в данной группе больных при 25,3±5,8% в контроле (без анти-Fas-MKAT). Инкубация Лф больных ВИЧ-инфекцией индуцировала появление значительного количества клеток с гиподиплоидной ДНК (Рис.4Г)

г

3 О

О

10" 10' 10' 10" 10ч MCS40

10" 10' 10' 10" 10п МС540

48 ч I

. -7-j о -J1— ■ ------ ------- СО

I j Jhl

10" 10' 10' 10" 10^ МС540

10" 10' 10' 10' 10

МС540 МСИО

'"mcW"

А Б В Г

Рис.3 Экспрессия ФС на Лф доноров (А,Б) и больных ВИЧ-инфекцией (В,Г) к 48 часам наблюдения при Рая-индуцированном апоптозе. А, В - контроль; Б, Г - с анти-Рав-мкАТ

48ч 1

72 ч

_82L

M1

wwft улгтъп ^rTTTV

Presidium Iodide Propidium lodtd« Propidtum Iodide

Propidlmn Iodide

96 ч

РгаркИип МмЬ Ргарккяп 1о<Ме

А Б В Г

Рис.4 Фрагментация ДНК Лф доноров (А,Б) и больных ВИЧ-инфекцией (В,Г) к 96 часам наблюдения при Рав-индуцированном апопточе. А, В - контроль; Б, Г - с анти-Раз-мкАТ

Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что несмотря на достаточно высокий уровень экспрессии Рав-рецептора на поверхности Лф доноров, клетки не отвечают повышением Рав-индуцированного апоптоза после воздействия анти-Раз-мкАТ, тогда как у больных ВИЧ-инфекцией наблюдался повышенный Рав-индуцированный апоптоз Лф.

Для индукции апоптоза через СП95/Ра,ч-АРО-1 имеет значение и количество этих рецепторов, экспрессированных на поверхности клетки. При невысоком содержании рецепторов на поверхности клетки их взаимодействие с соответствующим лигандом не позволяет эффективно провести сигнал в клетку. Как видно из данных цитофлуорограмм по оценке экспрессии СЕ>95 антигена, интенсивность флуоресценции по флуорохрому ИТС, использованного для метки С095, существенно различалась между донорами и больными ВИЧ-инфекцией (Рис.5). Была выявлена достоверная разница в интенсивности экспрессии антигена у Лф больных ВИЧ-инфекцией (Рис.5). Показатель МИФ (медиана ~ интенсивности флуоресценции) составил 438,9±78,1 и 267,2±64,1 ед. при ВИЧ-инфекции и у доноров, соответственно.

10* CD95FÍTC

Рис.5 Распределение С095+лимфоцитов по интенсивности флуоресценции у донора (А) и больных ВИЧ-инфекцией (Б, В). М1 - маркер С095-позитивых клеток.

Исследование Fas-индуцировэнного апоптоза Лф в группах с разным уровнем экспрессии Fas-рецептора у больных ВИЧ-инфекцией показало наличие достоверной разницы в содержании Лф с маркерами апоптоза в сравниваемых группах больных начиная с 48 часов инкубации Лф с анти-Fas-мкАТ. Так, количество ФС+Лф на 48 часов инкубации было достоверно выше (р<0,05) и составило 39,5+6,8% в группе больных с высокой экспрессией рецептора при 29,1 ±5,1% в сравниваемой группе.

Таким образом, полученные данные показывают, что позитивные по CD95 антигену Лф больных ВИЧ-инфекцией различаются по плотности рецептора на поверхности клетки и чувствительности к Fas-индуцированному апоптозу.

Дексаметазон-индуцированный апоптоз Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией

Возможность индукции апоптоза зрелых Лф глюкокортикоидами (ГК) является предметом многочисленных дискуссий. Однако достаточно много исследований, показавших, что определенные субпопуляции зрелых Т-Лф (NK-клетки, цитотоксические Лф, Т-хелперы) подвергаются апоптозу под влиянием ГК (Zubiaga М., 1992, Migliorati G., 1994, Spinozzi F., 1995, Melis А, 1997). В противоположность этому считается, что В-Лф резистентны к действию ГК. Однако и в этом вопросе нет однозначной точки зрения. Считается, что чувствительность Лф к ГК зависит от многих факторов, включая степень зрелости клеток (Alnemry Е., 1992, Merino R., 1994) и нарушение выработки клетками цитокинов (например, ИЛ-2) под влиянием ГК (Helmerg А., 1995).

Результаты проведенных исследований показали, что инкубация Лф с дексаметазоном (Дн) дозозависимо приводила к снижению величины

ДЧКт как у Лф доноров, так и у больных ВИЧ-инфекцией. Исследование Дн-индуцированного апоптоза Лф выявило, что снижение Ч'щ Лф у больных ВИЧ-инфекцией было достоверно выше, чем у Лф доноров (р<0,05).

Определение фрагментации ДНК Лф показало наличие повышенного содержания клеток с гиподиплоидной ДНК доноров и больных ВИЧ-инфекцией. Однако Дн в большей степени индуцировал апоптоз Лф у больных ВИЧ-инфекцией. Так, количество Лф с фрагментацией ДНК составило у доноров через 48, 72 и 96 часов инкубации 10,1±4,0%; 29,1 ±8,4%; 33,2±11,4%, тогда как показатели у больных ВИЧ-инфекцией достоверно превышали (р<0,05) и составили 18,3±6,8%; 35,5±11,3%; 41,4±13,9%.

Таким образом, была выявлена повышенная чувствительность Лф больных ВИЧ-инфекцией к глюкокортикоид-индуцированному апоптозу.

3. Активация и апоптоз лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.

Антигены и митогены, являющиеся активаторами клеток, при определенных условиях индуцируют апоптоз (Ярилин, A.A., 1996, Rüssel J., 1991). Например, было показано, что инкубация лимфоцитов доноров с фитогемагглютинином (ФГА) приводила к образованию части гиподиплоидных клеток, обнаруживаемых после окраски PI с помощью проточной цитометрии (Никонова М.Ф., 1996).

Более того, поликлональная активация лимфоцитов, достигаемая их инкубацией с ФГА, приводит к существенному повышению чувствительности клеток к действию апоптогенных факторов (в частности, анти-Fas-AT) (Sloand Е., 1997; Ярилин А., 2000), а также развитию апоптоза при повторной активации клеток.

Учитывая тесную связь между процессами активации и апоптоза представляло интерес изучение различных механизмов активации Лф и их взаимосвязи с процессами апоптоза Лф больных ВИЧ-инфекцией.

В результате проведенных экспериментов было показано, что инкубация Лф с мкАТ-анти-СОЗ (0.25 - 1 мкг/мл) вызывает их время- и дозозависимую активацию, что выражается в появлении специфических маркеров данного процесса (например, увеличение количества С025+-Лф).

Активация Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией анти-СОЗ мкАТ приводила к изменению фенотипа клеток, проявляющемуся в увеличении содержания Лф с экспрессией маркеров активации, включая рецептор Fas(CD95) (табл.1). Активация Лф сопровождалась достоверным увеличением содержания позитивных по CD95 антигену клеток как в целом среди Лф, так и в субпопуляциях Т-Лф. Увеличение экспрессии CD95 антигена наблюдалось как у доноров, так и больных ВИЧ-инфекцией. Также было показано, что большинство С025+-Лф как доноров, так и больных ВИЧ-инфекцией после активации мкАТ-анти-СОЗ

экспрессировали на своей поверхности Fas-рецептор.

Таблица 1

Влияние TCR-активации Лф периферической крови на экспрессию CD95/APO-1 на CD4+ и СР8+Т-лимфоцитах доноров и больных ВИЧ-инфекцией_

CD95 лф % Доноры Больные ВИЧ-инфекцией

ex vivo RPMI Ahth-CD3 ex vivo RPMI Ahth-CD3

CD95 лф 44,8±7,5 42,5±8,1 63,2±12,5* 58,1±11,5Л 56,3±17,5Л 74,8±16,8*

CD4/CD95 30,4±1,5 34,1 ±4,5 61,2+11,9* 47,5±9,6Л 46,8±12,5Д 60,9±21,2*

CD8/CD95 33,2±9,5 32,7+10,5 64,8±7,5* 57,6±19,7Л 55,3±22,6Л 76,2±20,4*

* - р< 0,05 ** - р< 0,01 достоверность по сравнению с RPMI л - р< 0,05 достоверность по сравнению с донорами

Экспрессия CD95/APO-1 на CD4+ и CD8+ Т-Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией анализированных методом проточной цитометрии. Анализ проведен ex vivo и спустя 48 часов после инкубации Лф в RPMI или в присутствии иммобилизированных анти-СОЗ мкАТ. Данные репрезентативны для 26 больных ВИЧ-инфекцией и 24 доноров.

Было проведено изучение влияния активации Лф с помощью мкАТ-анти-СОЗ (0.25-1,5 мкг/мл) на изменение величины Л4?™, уровень экспрессии ФС и белка Вс1-2, обладающего антиапоптогенной активностью.

Количество A4Jmlow-KneTOK после инкубации Лф доноров с мкАТ-анти-СОЗ (1,5 мкг/мл) в течение 72 часов составило 21,8±7,1% (контроль 19,4±4,6%). Аналогичная процедура с Лф больных ВИЧ-инфекцией приводила к существенным изменениям количества АЧ^'^-клеток. Количество ДЧ^^-клеток у больных ВИЧ-инфекцией составило 41,б±6,4% (контроль 28,4±4,0%) (р<0,01).

Количество ФС+-клеток после инкубации Лф доноров с мкАТ-анти-CD3 (1,5 мкг/мл) в течение аналогичного периода составляло 19,2+5,8% (контроль 15,8+4,2%). У Лф больных ВИЧ-инфекцией эти показатели составили 39,4±8,6% и 25,3±4,9%, соответственно (р<0,01).

Уровень экспрессии бежа Вс1-2 Лф доноров после их культивирования в течение 72 часов с мкАТ-анти-СОЗ (1,5 мкг/мл) также изменялся незначительно. У Лф доноров количество Вс1-2+-клеток составило 63,4±9,8% (контроль 67,7±4,4% ). В отличие от доноров у Лф больных ВИЧ-инфекцией было отмечено снижение содержания Вс1-2+ Лф до 37,0±7,8% (в контроле - 54,2± 7,8%) (р<0,01).

Таким образом, было показано, что активация Лф с мкАТ-анти-СОЗ у больных ВИЧ-инфекцией в отличие от доноров индуцирует апоптоз, о чем свидетельствует достоверное увеличение содержания Лф с маркерами

апоптоза. При этом только Лф больных ВИЧ-инфекцией реагировали снижением внутриклеточной экспрессии антиапоптозного белка Вс1-2.

Митоген(ФГА)-индуцированный апоптоз Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией,

Активация Лф и ее взаимосвязь с апопотозом была также изучена на модели активации клеток с помощью ФГА (1(У-20 мкг/мл).

Инкубация Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией с ФГА приводила к активации Лф, оцениваемой как по увеличению экспрессии раннего активационного маркера С069 (через 24 часа) и количества С025+-лимфоцитов (на 3-4 сутки инкубации), так и по развитию реакции бластгрансформации Лф.

Изучение маркеров апоптоза ФГА-активированных Лф показало, что у доноров и больных ВИЧ-инфекцией инкубация Лф с ФГА (10-20 мкг/мл) дозо- и времязависимо индуцирует фрагментацию ДНК, определяемой по наличию гиподиплоидного пика. Количество гиподиплоидных клеток начинает достоверно увеличиваться через 72 часа при инкубации Лф с 20 мкг/мл ФГА. Применение ФГА в дозе 10 мкг/мл приводило к значимому увеличению клеток с "фрагментированной" ДНК только спустя 120 часов инкубации.

Количество клеток с гиподиплоидной ДНК в ответ на стимуляцию Лф ФГА (20 мкг/мл) у больных ВИЧ-инфекцией было достоверно выше по сравнению с донорами. Через 72 часа инкубации данные показатели составили 27,2±4,6% и 17,8+6,8%, соответственно (р<0.05). На следующие сутки инкубации клеток больных ВИЧ-инфекцией и доноров с ФГА различие в количестве "гиподиплоидных" клеток было еще более выраженным и составило 34,9+6,8% и 22,4+4,4%, соответственно (р<0.01).

Сравнительный анализ других маркеров апоптоза Лф доноров и больных ВИЧ-инфекцией в ответ на их стимуляцию ФГА показал, что количество ФС+-клеток и АЧ^^-клеток у Лф больных ВИЧ-инфекцией было достоверно выше по сравнению с донорами. Количество АЧ^'0*-клеток у больных ВИЧ-инфекцией составило 44,6±7,4%, у донорами 16,2±4,2% через 48 часов стимуляции лимфоцитов ФГА (р<0.001).

Спустя 48 часов инкубации Лф с ФГА количество ДЧ'т1<"¥ФС+-клеток у больных ВИЧ-инфекцией составило 38,9±9,1%, а у Лф доноров - 15,1 ±4,8%. К 72 часам инкубации Лф с ФГА различие между больными и донорами составило 65,2±10,1% и 27,5+7,3%, соответственно (р<0.001).

Таким образом, активация Лф периферической крови с помощью ФГА индуцирует апоптоз Лф, наиболее выраженный у больных ВИЧ-инфекцией.

Также было выявлено, что среди больных ВИЧ-инфекцией существует группа пациентов, у которых отсутствовала способность Лф отвечать апоптозом на стимуляцию ФГА. В ответ на действие ФГА у

данной группы больных содержание клеток с фрагментированной ДНК было достоверно ниже, чем у доноров и основной группы больных и составило 49,1+3,3% (на 9 сутки культивирования). Анализ причин выявленного феномена выявил значительное повышение абсолютных и относительных количеств СТ)8+Т-Лф в периферической крови данных пациентов. Механизм развития устойчивости С08+Т-Лф к ФГА-индуцированному апоптозу может быть обусловлен выявленной нами гиперэкспрессией антиапоптозного белка Вс1-2 на данной субпопуляции Т-Лф. В частности было выявлено, что уровень экспрессии белка Вс1-2 на CD4+ и CD8+ Лф у больных ВИЧ-инфекцией составил 37,017,8% и 54,2+ 7,8%, соответственно (р<0,01).

Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать, что субпопуляции Т-Лф при одинаковой чувствительности к спонтанному апоптозу отличаются в индуцированном апоптозе. CD8+T-Лф устойчивы к ФГА-индуцированному апоптозу.

4. Микровезикулы в патогенезе ВИЧ-инфекции.

Определение микровезикул (MB), по мнению некоторых авторов, можно использовать в качестве маркеров активации или повреждения клеток (Fadok V.A., 1992; Martin S.J., 1995; Freyssinet J-M., 2003; Hügel В., 2005). Учитывая факт образования MB при апоптозе и активации клеток, было логичным исследовать их содержание в крови больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от фунционального состояния Лф периферической крови, степени спонтанного и индуцированного апоптоза.

Исследования, проведенные нами по определению MB по маркеру 5'- нуклеотидазе, показали наличие повышенного уровня активности фермента у больных ВИЧ-инфекцией по сравнению со здоровыми лицами. Проявление 5'-нуклеотидазной активности плазмы или сыворотки крови свидетельствует о наличии мембранных фрагментов, включая MB (Зубаиров Д.М., 1987). Было показано, что уровень активности фермента у больных ВИЧ-инфекцией со стадиями заболевания 11Б и IIB составил 137,6+18,1 нмоль/л, тогда как у здоровых лиц - 99,29+10,7 нмоль/л (р<0,001).

Определение содержания MB методом проточной цитофлуориметрии также показало повышение содержания MB у больных ВИЧ-инфекцией по сравнению со здоровыми лицами. У больных ВИЧ-инфекцией содержание MB составило 12023,11378,4 в мкл плазмы и достоверно отличалось от показателя в группе доноров, составившего 5243,6+256,7 частиц в мкл (р<0,01).

Для выявления возможного источника образования MB на следующем этапе исследования было проведено определение специфичности MB по антигенным маркерам (CD3, CD4, CD8, CD13, CD14, CD41, CD42b, CD45, CD61, CD62P).

Наши исследования показали, что при высоком спонтанном апоптозе Лф периферической крови больных ВИЧ-инфекцией, в свежевыделенной плазме крови не определялись МВ позитивные по CD3, CD4, CD8 антигенам. Подверженность к повышенному спонтанному апопотозу Лф in vitro не сопровождалась in vivo появлением в периферической крови МВ лимфоцитарного происхождения (МВ были негативны по CD45, CD3, CD4, CD8 антигенам). Однако отмечалась корреляция между содержанием МВ в плазме крови и степенью активации Лф. У больных ВИЧ-инфекцией с высоким содержанием в крови МВ были выявлены повышенные уровни CD4+ и CD8+ Т-Лф, экспрессирующих молекулы активации CD38, HLA-DR. Так, в группе больных ВИЧ-инфекцией с содержанием МВ 15450,2±301,3 в мкл уровень активированных Т-Лф составил 44,3±5,4%, тогда как в группе больных с низким содержанием МВ (6330,5±311,5 в мкл) уровень активированных Т-Лф составил достоверно низкие показатели (р<0,01) (24,7±7,9%). Проведенный анализ на наличие антигенов HLA-DR и CD38 в составе МВ плазмы крови показал негативность микрочастиц по данным маркерам.

У 37% больных ВИЧ-инфекцией были выявлены МВ с тромбоцитарными антигенами GPIba и GPIIb (Рис.6).

Рис 6 СП42Ь и С041-позитивные МВ у доноров (верхний ряд) и больных ВИЧ-инфекцией (нижний ряд).

Исследование специфичности МВ, проведенные с применением мкАТ А2А9 к вРШа, показали позитивность как тромбоцитов до 90%, так и микровезикул до 51% по тромбоцитарному маркеру.

Определение маркера СО 13, специфичного для гранулоцитов и моноцитов, показало наличие в плазме крови доноров и больных ВИЧ-инфекцией МВ позитивных СО 13 антигену. При этом относительное содержание С013+МВ при ВИЧ-инфекции составило 38,31±3.22%, тогда как у здоровых лиц - 23,41 ±2,85% (р<0,01).

Для определения соотношения доли МВ моноцитарного и гранулоцитарного происхождения мы провели окрашивание моноклональными антителами к С014 антигену. Данный маркер является специфичным в отношении моноцитов и не экспрессируется на других клетках крови (БсЫовтапп Б., 1995). Наши исследования показали негативность микровезикул по СОН антигену у доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

Учитывая данные об экспрессии эидотелиальными клетками антигена С062Р, нельзя исключить зндотелиальное происхождение части МВ. Проведенное двухцветное окрашивание по С061 и С062Р антигенам показало, что у 51,3% больных ВИЧ-инфекцией 66,6±12,5% МВ были позитивны по обеим маркерам. Данный факт свидетельствует о тромбоцитарной принадлежности выявленной части МВ у данной группы больных ВИЧ-инфекцией. Активация тромбоцитов т укго АДФ приводит к увеличению двойных позитивных по С061 и С062Р маркерам МВ.

Таким образом, проведенные исследования показали преобладание у больных ВИЧ-инфекцией МВ специфичных по тромбоцитарным и гранулоцитарным маркерам (С062Р; С061; С041; С042Ь и С013).

Высокие уровни МВ коррелировали с содержанием НЬА-ОК+Лф у ВИЧ-инфицированных пациентов (г=0,890; р<0,001). Исследование иммунной системы показало наличие высоких уровней НЬАЛЖ+Лф и ЦИК. При этом степень повышения содержания НЬА-ОЯ+Лф зависела от стадии заболевания. Так при 1ГБ стадии ВИЧ-инфекции содержание НЬА-ОЯ+лимфоцитов составило 516,6±56,5 в мкл, а при ПВ стадии - 624,3±64,3, тогда как у здоровых лиц - 226,1±18,6 (р<0,001).

Учитывая преобладание в циркуляции МВ с тромбоцитарными маркерами, было проведено исследование функционального состояния тромбоцитов у больных ВИЧ-инфекцией. Определение активации тромбоцитов в свежевыделенной плазме, определяемой по экспрессии мембранной формы антигена С062Р методом проточной цитофлуориметрии, показало наличие не более 5% С062Р+ тромбоцитов у здоровых лиц. При активации тромбоцитов и секреции гранул С062Р антиген экспрессируется на поверхности активированных тромбоцитов фепЬе^Р.Е., 1985).

У больных ВИЧ-инфекцией было обнаружено повышенное содержание тромбоцитов позитивных по CD62P антигену, свидетельствующее об активации клеток.

Анализ взаимосвязи между содержанием MB в периферической крови доноров и уровнем спонтанного и индуцированного апоптоза Лф in vitro не выявил корреляционной связи между изучаемыми явлениями.

Таким образом, при ВИЧ-инфекции было отмечено усиление процессов микровезикуляции с преобладанием тромбоцитарных микровезикул в периферической крови, сопровождающееся активацией иммунной системы (повышенное содержание HLA-DR+ и СБ38+Лф) и тромбоцитарного звена.

5. Некоторые механизмы репликации ВИЧ-1: роль процессов активации и апоптоза лимфоцитов и клеточных линий.

Для изучения влияния репликации ВИЧ-1 на процессы апоптотической гибели Лф было проведено исследование апоптоза С04+Т-Лф, инфицированных ВИЧ-1 in vitro, и взаимосвязи с уровнем репликации вируса.

Установлено, что пик репликации ВИЧ-1 в культуре ФГА-активированных Лф наблюдался на 5-6 сутки после инфицирования и коррелировал с количеством ВИЧ-инфицированных клеток. В контроле (неактивированные Лф) репликация ВИЧ-1, определяемая аналогичными методами, не регистрировалась.

В дальшейшем было проведено изучение основных закономерностей и механизмов апоптоза ВИЧ-инфицированных и неинфицированных Лф, а также возможной взаимосвязи между уровнем апоптоза инфицированных Лф и репликацией ВИЧ-1 in vitro.

Было установлено, что наиболее ранним признаком апоптоза Лф при их инфицировании ВИЧ-1 in vitro являлось снижение величины митохондриального потенциала (ДЧ'т), регистрируемое на 5 сутки культивирования. Экспрессия фосфатидилсерина на поверхности Лф регистрировалась на 6 сутки культивирования и находилась в обратной зависимости от величины ДТт. Самым поздним признаком апоптоза Лф являлась фрагментация ДНК (9 сутки культивирования).

Сравнительный анализ различных маркеров апоптоза между ВИЧ-инфицированными Лф, выявляемыми по внутриклеточной экспрессии p24gag белка ВИЧ-1, и неинфицированными Лф выявил существенные различия между этими популяциями Лф.

Например, количество клеток со сниженным Д*Рт было существенно выше среди неинфицированной популяции Лф на 5 сутки культивирования (Рис.7 А) (23,4±3,1% при 2,4±0,12% среди инфицированных клеток, р<0,001)и сохранялось на протяжении всего периода культивирования Лф.

Аналогичная тенденция была отмечена и при исследовании уровня экспрессии фосфатидилсерина на поверхности инфицированных и неинфицированных Лф (Рис.7Б). Исследование динамики фрагментации ДНК, являющейся, как известно, одним из конечных признаков апоптоза Лф, подтвердило выявленную закономерность, свидетельствующую о повышенном уровне апоптоза у неинфицированных Лф по сравнению с инфицированной популяцией Лф.

p2«M=ITC Р21-РЕ

А Б

Рис. 7. Величина ДУт (А) и экспрессия ФС (Б) на поверхности инфицированных (р24+) и неинфицированных лимфоцитов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при инфицировании in vitro культуры преактивированных Лф неинфицированные Лф являются наиболее подверженными апоптозу, в то время как у инфицированной популяции Лф имеется существенное ослабление в реализации программы апоптоза.

Выявленный феномен устойчивости ВИЧ-инфицированных клеток к апоптозу был подтвержден в последующих исследованиях на других экспериментальных моделях. Инфицирование ВИЧ-1 клеточной линии СЕМх174 дозозависимо индуцировало апоптоз преимущественно у неинфицированной популяции клеток. В то же время у инфицированных (p24gag+) клеток была выявлена устойчивость к гибели по механизму апоптоза. Данная закономерность была выявлена при изучении различных маркеров апоптоза: а) ДЧ^'0*; б) экспрессии ФС; в) фрагментации ДНК.

Сравнительный анализ апоптоза инфицированных и неинфицированных клеток был проведен с использованием клеточной линии CEM-GFP, позволявшей определять инфицирование клеток по изменению интенсивности флуоресценции GFP белка, и, следовательно, не требовавшей пермеабилизации для определения внутриклеточного содержания p24gag белка ВИЧ-1.

Было показано, что количество ЛЧ^^-клеток у инфицированной (ОРР-позитивнон) популяции клеток (правый нижний квадрат Рис.8А) было существенно ниже по сравнению с неинфицированной (ОРР-негативной) популяцией данной клеточной линии (левый нижний квадрат Рис.8А) (1,79±0,22% и 22,8±3,7%, соответственно). Аналогичная закономерность была выявлена и при изучении экспрессии ФС на поверхности инфицированных (правый верхний квадрат Рис.8Б) и неинфицированных клеток (левый верхний квадрат Рис.8Б).

69% ■-^¿ьд I»-".

19,8% 0,2%

юи

10*

GFP

У-

- «¡{\atiy 0,1%

82,9% К" ■ U /

10

10"

10

to*

10' GFP

10

10"

Рис.8 Динамика изменения ДЧ'т (А) и экспрессии ФС (Б) у инфицированных (GFP+) и неинфицированных (GFP-) CEM-GFP на 5 сутки культивирования.

Таким образом, инфицирование клеток ВИЧ-1 делает их устойчивыми к гибели по механизму апоптоза, что, безусловно, является важнейшим фактором, обеспечивающим создание резервуаров ВИЧ-1 и его длительной персистенции. В то же время наблюдается массовая гибель неинфицированных клеток по механизму апоптоза. Полученный факт коррелирует с данными многочисленных исследователей, иллюстрирующих значительное снижение количества СБ4+Лф в периферической крови на фоне чрезвычайно низкого (<0,1 %) количества ВИЧ-инфицированных Лф (Embertson J., 1993).

Изучение динамики количества С04+-Лф в культуре ФГА-активированных Лф при их последующем инфицировании ВИЧ-1 подтверждает данную точку зрения. Было выявлено лишь незначительное снижение количества С04+-Лф в культуре неинфицированных (но ФГА-активированных) Лф (Рис.9А и Б). В то же время инфицирование in vitro культуры ФГА-активированных Лф индуцировало значительное снижение количества СБ4+-Лф (Рис.9 В и Г). Важно отметить, что в аналогичных экспериментальных условиях не наблюдалось снижения количества

4.03.015

шт- 1%

'flH^S'

■ « » ■ * *

- : 7V "■■ "С?' ' 4% I I 11ия| ' 11 roum-1 1 nun

10

10'

10' CD4FITC

10'

10^

ta s

û

4.03.016

0.5%

Яр;

■ V ,U»t

■ . 1 '

: - -т I .IIIII1, ■;' 2.5% .-1ЧГЯЧ_ 1 ■ "'«'г; >

10"

10'

CMFITC

10"

10^

В Г

Рис.9 Содержание CD4+ и CD8+ Лф на 8 сутки (А,Б,В) и 10 сутки (Г) культивирования. А- контроль; Б - ФГА В,Г - инфицирование ФГА-активированных клеток.

Учитывая низкий уровень виремии на протяжении длительного периода времени (даже в отсутствии антиретровирусной терапии) у группы пациентов, инфицированных ВИЧ-1, имеющих делецию гена Nef (Kestler, H., 1991; Huang Y., 1995; Kirchhoff, F., 1995; Learmont, J. ,. 1999), представляло интерес изучение роли данного белка ВИЧ-1 в механизмах вирусной репликации и апоптоза Лф.

Для исследования роли Nef белка в процессах репликации ВИЧ-1 были проведены эксперименты с использованием штамма NL4-3 (Nef+) и его рекомбинантного производного, содержащего делецию гена nef (Nef-). Уровни репликации Nef+ и Nef- в культуре ФГА-активированных Лф

периферической крови был примерно одинаковым, однако скорость репликации Nef+ была выше по сравнению с Nef- (Рис.10).

4 5 6 7 9 11 13 Дни культивирования

-Nef+ -Nef-

Рис. 10. Репликация Nef+ и Nef- в ФГА-активированных лимфоцитах

Аналогичная динамика репликации и отсутствие различий в уровне репликации Nef+ и Nef- наблюдались также при инфицировании клеток линии СЕМх174.

В то же время при внесении (на 5-й день) ФГА в культуру предварительно инфицированных Лф уровни репликации Nef+ и Nef-существенно различалась. Более того, в отдельных экспериментах, уровень репликации Nef- был ниже фоновых значений. Количество p24gag-позитивных клеток в культуре Лф, инфицированных Nef- также было существенно ниже по сравнению с культурой, инфицированной Nefh

На основании полученных данных, иллюстрирующих существенные различия в репликации Nef+ и Nef-, было выдвинуто предположение о влиянии данного белка ВИЧ-1 на апоптоз инфицированных Лф. Действительно, Nef-опосредованное подавление программы апоптоза ВИЧ-инфицированных Лф могло стать причиной усиленной репликации ВИЧ-1.

Д ля изучения роли белка Nef в регуляции апоптоза инфицированных и неинфицированных клеток были использованы следующие аналогичные подходы: 1) инфицирование ФГА-активированных Лф с помощью Nef- и оценка апоптоза на фоне процедуры пермеабилизации, необходимой для выявления инфицированной популяции клеток; 2) проведение аналогичных мероприятий с использованием клеточной линии СЕМх174; 3) оценка апоптоза с использованием клеточной линии CEM-GFP, не требующей пермеабилизации для выявления популяции инфицированных клеток.

Результаты проведенных исследований показали, что во всех экспериментальных моделях количество клеток с признаками апоптоза

было существенно ниже в инфицированной популяции клеток (нижний правый квадрат Рис.11 А,Б и верхний правый квадрат Рис.11 В,Г) по сравнению с неинфицированными клетками (нижний левый квадрат Рис.11 А,Б и верхний левый квадрат Рис. 11 В,Г).

2.03.035

2.03.036

о « ! •о

=6 а.

t 78%, 8.5%

jŒfflçtyjjjç ï : ! 1-34' "i«1 '"""i, i ' 0.5% "■"lo 1 '

10'

p21-FITC А

2.03.051

ai ^ с с -í

! 17% i%

'-•f

f&â* Л- -

■ 4w

10 10'

р24-РЕ В

10° 10ч

«

■о

■5

а

2% ■ ■ •

'Г*.'

» * •

i 7% - - ! 1 1ТТП, I-pJ 0% lililí' r-rilllll|n 1 i-.....1

10

10' 10' 10' P24-FITC

Б

2.03.056

10ч

14% 0.5%

V ' '

- , . .......... ..........."14

10и 10' 10¿ 10J 10ч р24-РЕ

Г

Рис 11 Выраженность апоптоза лимфоцитов инфицированных эквивалентными дозами Nef+ (А,В) и Nef- (Б,Г) на 9 день культивирования.

Отсутствие влияния белка Nef на апоптоз инфицированных клеток было выявлено и на клеточных линиях CEMxl 74 и CEM-GFP.

Полученные данные показывают возможность индукции апоптоза неинфицированных клеток белком Nef, высвобождающимся во внеклеточное пространство, что подтверждается работами других исследователей (James С.О., 2004).

Таким образом, репликация ВИЧ-1 сопровождается подавлением программы апоптоза инфицированных клеток, что создает условия для создания резервуаров ВИЧ-1 и его персистенции. В то же время ослабление программы апоптоза инфицированных клеток в исследованных нами экспериментальных моделях не связано с белком Nef. Тем не менее, данный белок ВИЧ-1 играет важную роль в индукции апоптоза неинфицированных CD4+-JLj>, что приводит к быстрому снижению их количества, являющегося, как известно, одним из основных признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Исследования по изучению внутриклеточных механизмов регуляции спонтанного и индуцированного апоптоза Лф периферической крови к доноров и больных ВИЧ-инфекцией показали, что в патогенезе ВИЧ-

инфекции апоптотические процессы занимают центральное место, обуславливая развитие различных иммунологических нарушений.

ВЫВОДЫ.

1. При ВИЧ-инфекции выявлено усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови, зависящего от степени активации лимфоцитов и экспрессии Fas-рецептора.

2. Повышение уровня экспрессии Fas-рецептора на различных популяциях лимфоцитов при ВИЧ-инфекции коррелирует со степенью тяжести заболевания и определяет повышенную чувствительность лимфоцитов к спонтанному и Fas-индуцированному апоптозу.

3. Повышенная чувствительность лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией к Fas-индуцированному апоптозу не требут (в отличие от лимфоцитов доноров) предварительной активации клеток и обусловлена повышенным уровнем активации клеток ex vivo (CD4+ и CD8+T-лимфоцитов).

4. Гетерогенность популяций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией по уровню экспрессии Fas-рецептора обуславливает их различную восприимчивость к Fas-индуцированному апоптозу.

5. Лимфоциты периферической крови больных ВИЧ-инфекцией по сравнению с лимфоцитами доноров более подвержены активационному апоптозу, сопровождающемуся снижением уровня экспрессии белка Вс1-2 и повышением уровня Fas-рецептора.

6. Митоген(ФГА)-индуцированная активация лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией и доноров индуцирует апоптоз. Лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией более подвержены данной разновидности активационного апоптоза. С04+Т-лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией (в отличие от лимфоцитов доноров) являются наиболее

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА j С. Петербург i О» тл —.

восприимчивой популяцией клеток к митоген-индуцированному апоптозу.

7. С08+Т-лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией являются резистентными к ФГА-индуцированному апоптозу. Устойчивость данной популяции клеток обусловлена их активацией ex vivo, определяемой по уровню экспрессии некоторых активационных маркеров (CD38, HLA-DR, CD26).

8. CD4+ Т-лимфоциты, в отличие от CD8+ Т-лимфоцитов, подвергаются гибели по механизму апоптоза в культуре клеток, инфицированных in vitro ВИЧ-1.

9. Инфицирование in vitro лимфоцитов сопровождается массовой гибелью неинфицированных С04+Т-лимфоцитов по механизму апоптоза и подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов, коррелирующим с уровнем репликации ВИЧ-1 .

10. При ВИЧ-инфекции наблюдается повышение образования микровезикул тромбоцитарного происхождения, коррелирующее со степенью активации Т-лимфоцитов периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модели индукции и оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови могут быть использованы в качестве комплексного анализа предполагаемых нарушений регуляции апоптоза и его механизмов.

2. Методы индукции и оценки апоптоза, использованные в настоящей работе, могут быть применены в качестве тест-систем для оценки эффективности терапии ВИЧ-инфекцией.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Фирсов О.В., Слабнов Ю.Д., Мустафин И.Г. Сравнительная характеристика показателей иммунограммы больных туберкулезом легких и здоровых доноров //Казанский мед. журнал - 1996. - № 2. -С.98-102.

2. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Апоптоз: характеристика, методы выявления и его роль в патогенезе атопических заболеваний //Казанский мед. журнал. - 2000, № 3. -С.217-222.

3. Коксин В.П., Мустафин И.Г., Бадриева Л.И., Ткачева Н.В., Хаертынова И.М., Рязанова Г.А., Романенко О.М. Мониторинг некоторых иммунохимииеских показателей на различных стадиях ВИЧ-инфекции //Мат. III съезда' иммун. и аллерг. СНГ (Сочи, Россия-16-20 сентября 2000). - Аллергология и иммунология. - 2000. -T.1,N2.-С.88-89.

4. Хаертынова И.М., Бадриева Л.И, Баширова Д.К., Коксин В.П., Мустафин И.Г., Рязанова Г.А., Замятина Э.А., Курмашева Е.В., Романенко О.М. Мониторинг активности анти-ВИЧ AT к белкам генов gag, pol и env ВИЧ при антиретровирусной терапии ВИЧ-больных //Сб. тез. VI - Росс.-итальянской конференции "Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика", 14-16/Х11-2000 г.. - Санкт-Петербург. - С.274.

5. Коксин В.П., Хаертынова И.М., Бадриева Л.И., Рязанова Г.А., Баширова Д.К., Мустафин И.Г., Килина Л.Н., Романенко О.М. Спектр анти-ВИЧ AT циркулирующих иммунных комплексов сывороток крови при различных клинических статусах ВИЧ-больных //Сб. тез. VI Российской-итальянской конференции "Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика", 14-16/Х11-2000 г.. - Санкт-Петербург. - С. 115-116.

6. Бойчук C.B., Миннебаев М.М., Мустафин И.Г. Ключевая роль митохондрий в апоптозе лимфоцитов //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - № 12 - С.644-647.

7. Бойчук C.B., Мустафин И.Г. Изучение роли ионов кальция в процессах апоптоза лимфоцитов //Тез. докладов VIII Всероссийской школы молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии". -Казань, 2001.-С.24.

8. Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Изучение апоптоза при атопической бронхиальной астме //Тез. докл. 10 Национального Конгресса по болезням органов дыхания. - Санкт-Петербург, 2000. -С.76.

9. Бойчук C.B., Мустафин И .Г., Фассахов P.C. Изучение механизмов апоптоза лимфоцитов периферической крови больных атопической бронхиальной астмой //Аллергология. - 2001, № 1. - С.3-9.

10.Boichuk S.V., Mustafin I.G., Fassahov R.S. Mechanisms of spontaneous and glucocorticoid(GC)-induced lymphocyte apoptosis in atopic bronchial asthma // Europ. Respir. J., 2001. - Vol. 18, suppl. 33,266s. - P. 1801.

11.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Изучение механизмов апоптоза лимфоцитов периферической крови больных атопической бронхиальной астмой //Аллергология. - 2001. - № 1. - С.3-9.

12.Бойчук C.B., Мустафин И.Г. Fas-рецептор и его роль при атопических заболеваниях //Иммунология. - 2001. - № 3 - С.24-29.

13.Килина Л.Н., Хамзина Р.В., Мустафин И.Г., Зубаиров Д.М., Коксин В.П. Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение микровезикуляции при ВИЧ-инфекции //Труды Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии" - Москва. -2002.-С. 116-117.

14.Мустафин И.Г., Коксин В.П., Бойчук C.B., Фассахов P.C., Зубаиров Д.М., Хамзина Р.В. Патогенетическое значение микровезикуляции при ВИЧ-инфекции //Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сб. трудов. - Т.2. — Москва. -2002.-С.346.

15.Мустафин И.Г., Бойчук C.B., Хамзина Р.В., Романенко О.М. Изучение апоптоза лимфоцитов периферической крови при ВИЧ-инфекции //VI Всероссийский научный форум с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге". — Санкт-Петербург. - 2002. - С.246.

16.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Спонтанный и глюкокортикоид-индуцированный апоптоз лимфоцитов при атопической бронхиальной астме: роль митохондрий и CD95 (АРО-1) //Аллергология. - 2002, № 1. - С. 13-20.

17.Мустафин И.Г., Бойчук C.B. Использование метода проточной цитометрии для оценки апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме //Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях (стр. 112-122). - Под ред. М.П. Потапнева. - Минск: ГУ РНМБ, 2002 - 138 с.

18.Рязанова Г.А., Коксин В.П., Мустафин И.Г., Хаертынова И.М., Замятина Э.А., Романенко О.М. Выявление скрытых анти-ВИЧ антител в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови при ВИЧ-инфекции //III съезд биохимического общества. Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002. - С.211.

19.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Механизмы глюкокортикоид-индуцированного апоптоза лимфоцитов при

атопической бронхиальной астме //Казанский мед. журнал. - 2002. -N 3. - С.182-185.

20.Boichuk S.V., Mustafm I.G., Fassahov R.S. Mechanisms of Fas- and glucocorticoid (GC)-mediated lymphocyte apoptosis in atopic bronchial asthma //Abst. of 5th Annual Congress of Turkish Thoracic Society, Antalya, Turkey, 2002. - Abstract book, № 479. - P. 124.

21.Boichuk S.V., Mustafin I.G., Fassahov R.S. Fas-expression on peripheral blood lymphocyte and its function in atopic bronchial asthma Abst. of XXI Congress of European Academy of Allergology and Clinical Immunology, Naples, Italy, 2002. - Abstract book, № 45. - P.22.

22.Boichuk S.V., Mustafm I.G.,. Fassahov R.S, Tereshenko D.V. The mechanisms of glucocorticoid(GC)-induced lymphocyte apoptosis in atopic bronchial asthma (ABA) //Europ. Resp. J. - 2002. - Vol. 20. -Suppl. 38. - p.29s. - P.305.

23.Boichuk S.V., Mustafin I.G., Fassahov R.S.. T cell resistance to Fasmediated apoptosis during atopic bronchial asthma (ABA). Europ. Resp. J., 2002. - Vol. 20. - Suppl. 38. - p.29-30s. - P.307.

24.Мустафин И.Г., Коксин В.П., Бойчук C.B., Хамзина Р.В., Миннебаев М.М. Апоптоз лимфоцитов периферической крови при ВИЧ-инфекции //Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов - Санкт-Петербург. - 2003 - С. 263-264.

25.Мустафин И.Г., Коксин В.П., Рязанова Г.А., Хаертынова И.М., Килина J1.H. Изучение активности антител к нативной ДНК (НДНК) в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных в процессе развития инфекции. //Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов - Санкт-Петербург. - 2003 - С. 264.

26.Мустафин И.Г., Зубаиров Д.М., Романенко О.М., Фазылов В.Х., Коксин В.П., Хамзина Р.В., Долгополова А.В. Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение микровезикуляции при ВИЧ-инфекции. Этап 2001г. Исследование процессов микровезикуляции при ВИЧ-инфекции //Академия наук Республики Татарстан. Конкурс проектов 2001. - Фундаментальные науки. - Казань: Изд-во "Фэн".-2003.-С.246.

27.3убаиров Д.М., Хамзина Р.В., Мустафин И.Г., Коксин В.П. Методы обнаружения микровезикуляции при ВИЧ-инфекции //Юбилейная конференция, посвященная 10-летию основания Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А. Шмидта- Б. Кудряшова, Москва, 22-24 апреля 2003. -С.42.

28.Мустафин И.Г. Энзиматический и иммунохимический методы выявления микровезикул //XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - Казань. - 2003. - С.281.

29.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Механизмы дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме //Пульмонология. - 2003. - № 3. -С.10-15.

30.Boichuk S.V., Mustafin I.G., Fassahov R.S, Tereshenko D.V. Spontaneous, Fas- and glucocorticoid(GC)-mediated lymphocyte apoptosis in atopic bronchial asthma(ABA): mechanisms, role in pathogenesis and therapy //Abstr. 13th Annual Congress of European Respiratoiy Society, Vienna, Austria, 2003. - P.267.

31.Бойчук C.B. Яушев М.Ф., Мустафин И.Г. Изучение механизмов апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных инфильтративным туберкулезом легких //Проблемы туберкулеза. -2003. - №6 - С.36-39

32.3убаирова Л.Д., Андрушко И.А., Свинтенок Г.Ю., Мустафин И.Г., Зубаиров Д-М. Клеточные микровезикулы в динамике экспериментальной эндотоксинемии //Третий Российский конгресс по патофизиологии - "Дизрегуляторная патология органов и систем". - Москва, 2004. - С.112.

33.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Миннебаев М.М. Спонтанный, Fas- и глюкокортикоид-индуцированный апоптоз лимфоцитов при атопических заболеваниях //2-ая международная конференция "Патофизиология и современная медицина". - Москва, 2004. - С.62-66.

34.Бойчук C.B., Мустафин И.Г., Миннебаев М.М., Романенко О.М. Роль эндотелиальных клеток в репликации ВИЧ-1 //VIII Всероссийский научный форум с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" - Санкт-Петербург. - 2004. - С. 99.

35.Мустафин И.Г., Бойчук C.B., Миннебаев М.М., Романенко О.М. Сравнительный анализ репликации ВИЧ-1: роль различных типов антиген-презентирующих клеток. //VIII Всероссийский научный форум с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" - Санкт-Петербург. - 2004. - С.240.

36.Бойчук C.B., Мустафин И.Г. Роль эндотелиальных клеток и ВИЧ-1 белка Nef в патогенезе ВИЧ-инфекции: новые механизмы репликации ВИЧ-1 //Мед. иммунология. - 2004. - Т.6., № 6 - С. 499506.

37.3убаирова Л.Д., Мустафин И.Г., Андрушко И.А., Свинтенок Г.Ю., Зубаиров Д.М. Функции и диагностическое значение микровезикул в крови //2-ая Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии". -Москва, 2005. - Р.109-110.

38.Мустафин И.Г., Зубаиров Д.М., Романенко О.М., Фазылов В.Х., Коксин В.П., Хамзина Р.В., Долгополова A.B. Патофизиологическое

и клинико-диагностическое значение микровезикуляции при ВИЧ-инфекции. Этап 2002г. Исследование патофизиологической и клинико-диагностической значимости микровезикуляции при ВИЧ-инфекции //Академия наук Республики. Татарстан. Конкурс проектов 2002. - Фундаментальные и прикладные науки. - Казань: Изд-во "Фэн". - 2004. - С. 252-253.

Корректура автора

Подписано в печать .07.05 г. Заказ № 446

Тираж 100 экз. _

Формат 60x84 1/16

Печать ШБО

Бумага тип № 1 усл.-печ. л. Д5

Печатно-множительный отдел КГАСУ 420043, Казань, Зеленая,!

№17 5 4 2

РНБ Русский фонд

2006-4 18175

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Многочисленные исследования, посвященные процессу програмированной клеточной гибели (апоптозу), показали важную роль апоптоза в физиологических и патологических процессах организма (Kerr J.F.R., 1972; Ярилин А.А., 1997; Jacobson M.D., 1997). Апоптозу принадлежит ведущая роль в поддержании гомеостаза организма. В наиболее общей форме назначение апоптоза состоит в поддержании постоянства численности клеток, их соотношения и удалении генетически дефектных клеток (Ярилин А.А., 1998).

Вместе с тем следует выделить и патологическую роль апоптоза, проявляющуюся нарушениями механизмов регуляции процессов программируемой клеточной гибели (ПКГ), что может быть одним из главных звеньев патогенеза различных заболеваний. В частности, повышенная активация ПКГ является одним из звеньев нейродегенеративных (LaFerla F.M., 1995) и миелодиспластических заболеваний, ишемических повреждений различных органов (Saikumar Р., 1998) и других патологических состояний. Напротив, ингибирование процессов ПКГ наблюдается при опухолевых процессах (Levine A .J., 1994; Frassantino М.А., 1998), аутоиммунных (Kaneko Н., 1996; Никонова М.Ф., 1997). Данное положение можно отнести и к ряду вирусных заболеваний, сопровождающихся нарушениями регуляции клеточной гибели. При этом отмечается как повышение апоптоза (цитомегаловирусная инфекция), так и его ингибирование (вирус герпеса, бакуловирус, вирус Эпстайн-Барр) (Jerome K.R., 1998; Yang Y.L., 2000; Benetti L., 2004).

Патогенез ВИЧ-инфекции у человека остается во многом неясным. Прямому цитопатическому действию ВИЧ подвержено абсолютное меньшинство клеток, большая часть их гибнет вследствие аномальных межклеточных взаимодействий в иммунной системе, опосредованных антигенами ВИЧ-1 (Badley A.D., 2000).

Ведущим звеном патогенеза ВИЧ-инфекции является развитие вторичного иммунодефицита вследствие развития дисфункции и уменьшения количества СБ4+Т-лимфоцитов (Fauci A.S., 1988; Levy J.А., 1993; Mellors J., 1996; Badley A.D., 2000). Кроме того, СБ4+Т-лимфоциты не являются единственной мишенью для ВИЧ. Вирус способен проникать в макрофаги, гистиоциты, дендритные клетки, составляющие периферическое микроокружение Т-лимфоцитов.

Несмотря на то, что выявлено несколько причин уменьшения числа СБ4+Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции, ведущим фактором, обуславливающим снижение абсолютного числа СБ4+Т-лимфоцитов, безусловно, является их гибель по механизму апоптоза (Gougeon M.-L., 1993; Badley A.D., 2000). Многочисленные механизмы, вносящие свой вклад в ВИЧ-ассоциированный апоптоз лимфоцитов, включают хроническую иммунологическую активацию; gp 120/160-связывание CD4-рецептора; усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, В-клетками и CDB+T-клетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов или вирусных белков, убивающих неинфицированные CD4+T-клетки. Прямое инфицирование вирусом клеток-мишеней, приводящее к апоптозу, остается дискуссионым на сегодняшний день.

Базируясь на традиционных представлениях о том, что одним их характерных признаков патогенеза ВИЧ-инфекции является тенденция к прогрессированию заболевания, характеризующаяся нарастанием виремии и неуклонным снижением абсолютного числа СВ4+Т-лимфоцитов (Wei X., 1995; O'Brien W.A., 1996; Mellors J., 1997), представляет интерес изучение взаимосвязи вышеуказанных процессов. Данные литературы, иллюстрирующие зависимость между вирусной нагрузкой и апоптозом иммунокомпетентных клеток, противоречивы. В частности, ряд исследователей не обнаружил связи между этими процессами (Meyaard L., 1992; Muro-Cacho С., 1995). Механизмы апоптоза инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных СБ4+-лимфоцитов, также остаются до настоящего времени дискуссионными. С одной стороны, логичными выглядят результаты исследований, иллюстрирующих ослабление программы апоптоза в инфицированных ВИЧ-1 СБ4+лимфоцитах и клеточных линиях, что в свою очередь, является необходимым фактором, обеспечивающим создание резервуаров для репликации ВИЧ-1 и предпосылок для усиления репликации вируса (Antoni В., 1995; Rapaport Е., 1998). С другой стороны, имеются также многочисленные данные об усилении гибели СБ4+-лимфоцитов, а также различных клеточных линий, инфицированных ВИЧ-1 (Noraz N., 1997; Herbein G., 1998; Gandhi R., 1998). Данное противоречие может быть лишь отчасти объяснено различиями в используемых для инфицирования лабораторных штаммах ВИЧ-1 (Rapaport Е., 1998). В то же время, анализ активности различных структурных, регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ-1 доказывает правомочность существования двух, противоположных друг другу, точек зрения. Лишь в одном авторы всех проведенных исследований единодушны: подавляющее число клеток, погибающих по механизму апоптоза, составляют ВИЧ-1-неинфицированные клетки. Тем не менее, также имеются данные о том, гибель ВИЧ-инфицированных, а также неинфицированных клеток, а также CD4+ клеточных линий, может протекать по каспаз-независимому пути, т.е. по типу некроза (Bolton L., 2002).

В связи с этим, представляет интерес исследование механизмов апоптоза С04+-лимфоцитов, инфицированных ВИЧ-1 in vitro, и их взаимосвязи с уровнем репликации ВИЧ-1.

Регуляция апоптоза - сложный и многосторонний процесс. Факторы, регулирующие процессы ПКГ многочисленны и разнообразны. Выделяют регуляторы апоптоза экзогенного и эндогенного происхождения. Среди эндогенных регуляторов апоптоза особое внимание уделяется митохондриям. На ведущую роль митохондрий в регуляции апоптотических процессов при ВИЧ-инфекции указывают многочисленные работы (Badley А., 2003; Phenix В., 2002; Roggero R., 2001). Механизмы митохондрий-зависимого апоптоза лимфоцитов крови при ВИЧ-инфекции разнообразны - в результате действия вирусных белков (Vpr) непосредственно на митохондрии, сигнализации через клеточные рецепторы (CXCR4, CD95).

Наличие на клеточной поверхности Fas-рецептора (CD95, АРО-1), определяющего способность клеток к восприятию апоптогенных стимулов и приводящих к гибели клетки по механизму апоптоза, признается рядом исследователей ведущим механизмом апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции. Т-клетки ВИЧ-инфицированных пациентов проявляют как увеличенную экспрессию рецептора Fas, так и повышенную восприимчивость к Fas-опосредованной смерти (Katsikis P.D.,1995, McCloskey T.W., 1998). В мононуклеарных клетках (содержащих моноциты) периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов повышен FasL (Silvertris F., 1998), а также уровень растворимого FasL, который коррелирует с содержанием РНК ВИЧ-1 (Hosaka N.,1998). Продемонстрированное увеличение экспрессии Fas, восприимчивости к Fas и экспрессии Fas лиганда заставляет предположить, что эти молекулы могут быть важны для некоторых форм ВИЧ-индуцированной клеточной смерти.

Тем не менее, экспрессия Fas рецептора является не единственным признаком, определяющим подверженность клеток апоптозу. Например, у больных ВИЧ-инфекцией также установлена выраженная экспрессия Fas-рецептора на поверхности CD8+ Т-лимфоцитов, что является следствием их активации. Тем не менее, на ранних стадиях заболевания CD8+ Тлимфоциты устойчивы к апоптотической гибели. Механизмы устойчивости CD8+ Т-лимфоцитов к апоптозу остаются до конца не изученными.

Литературные данные свидетельствуют о том, что Т-лимфоциты (Лф) ВИЧ-инфицированных пациентов в большей степени подвергаются спонтанному апоптозу, чем Лф доноров (Katsikis P.D., 1995). Более того, активация CD4+ Т-Лф ВИЧ инфицированных пациентов ex vivo (с помощью различных стимулов) постоянно усиливает апоптоз в отличие от клеток неинфицированных людей (Ledru Е., 1998). Этот феномен, названный индуцированная активацией смерть клеток (activation-induced cell death (AICD)), происходит только в предварительно активированных клетках (Brunner Т., 1995) и может представлять собой модель для изучения последствий антигенной стимуляции in vitro (Yang Y., 1995). Покоящиеся Т-Лф периферической крови доноров после стимуляции через TCR подвергаются пролиферации, секретируют цитокины (Nau G.J., 1988), и проявляют склонность к гибели по механизму Fas-опосредованного апоптоза (Alderson M.R., 1995).

СБ8+Т-Лф пациентов с ВИЧ-инфекцией в большей степени активированы, чем такие же клетки ВИЧ-неинфицированных людей (Gougeon M.L., 1996), что указывает на повышенную подверженность апоптозу CD8+ и СБ4+Т-Лф вследствие повторного воздействия еще одного активационного стимула или апоптоз-индуцирующего лиганда (например, макрофаг-ассоциированного FasL (Badley A.D., 1997)). Более того, CD8 Т-Лф после активации начинают экспрессировать CD4 рецептор, и, таким образом, становятся восприимчивыми к непосредственному инфицированию вирусом (Yang L.P., 1998). Кроме того, следует ожидать, что повышенная экспрессия С04-антигена на СБ8+Т-Лф обуславливает их готовность к апоптозу вследствие перекрестного связывания gpl20 с CD4. Несмотря на существование нескольких возможных путей, отвественных за апоптоз СБ8+Т-Лф у ВИЧ-инфицированных пациентов, наиболее вероятным механизмом апоптоза С08+Т-Лф является их хроническая антигенная стимуляция. Роль прямого инфицирования СБ8+Т-Лф в индукции апоптоза остается дискуссионной.

Одним из потенциальных факторов, индуцирующих апоптоз Лф при различных патологических состаяниях, в том числе, при ВИЧ-инфекции, может являться микровезикуляция. Данное предположение основано на данных, демонстрирующих повышенное количество микровезикул при программированной клеточной гибели различных типов клеток. Установлено, что микровезикулы (MB) являются фрагментами клеточных мембран, отделяемых от клеточной поверхности при активации и апоптозе (Freyssinet J-M., 2003; Martin S.J., 1995). Перемещение фосфатидилсерина на поверхность клеточной мембраны в результате ремоделирования клеточной мембраны является одним из ранних признаков апоптоза. Возможность индукции апоптоза Лф микровезикулами, содержащими вирусные частицы, привлекает внимание многих исследователей (Aupeix К., 1997; Bess J.W., 1997). Кроме того показано, что MB, содержащие на своей поверхности FasL, способны вызывать апоптоз различных клеток-мишеней (Jodo S., 2001; Andreola G., 2002). Тем не менее, некоторые авторы ставят под сомнение возможность индукции апоптоза растворимыми формами FasL (Suda Т., 1997). Однако, можно предположить, что концентрирование FasL на микровезикулах способно обеспечить проведение достаточного по интенсивности Fas-опосредованного апоптоз-индуцирующего сигнала. Кроме того, установлена возможность переноса микровезикулами тромбоцитарного и мегакариоцитрного происхождения хемокиновых рецепторов CXCR4 на поверхность негативных по данным рецепторам клеток. Этот факт может обуславливать их восприимчивость к инфицированию СХСК4-тропным штаммом ВИЧ-1 (Rozmyslowicz Т., 2003).

Известно, что применение современных антиретровирусных препаратов способно подавлять репликацию ВИЧ-1 и также влиять на процессы апоптоза Лф в лимфоидной ткани и периферическом русле. Тем не менее, воздействие препаратов на резервуары ВИЧ-1 и индукцию апоптоза латентно инфицированных клеток существенно ограничено и неэффективно. Следовательно, понимание механизмов регуляции апоптоза может явиться предпосылкой для создания новых и перспективных методов терапии ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита.

Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором были поставлены следующие цели и задачи.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучение механизмов апоптоза лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией и их взаимосвязи с процессами активации лимфоцитов и репликации ВИЧ-1.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Изучить последовательность и взаимосвязь событий спонтанного, индуцированного и активационного апоптоза лимфоцитов периферической крови доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

2. Изучить экспрессию Fas-рецептора и его лиганда на поверхности лимфоцитов периферической крови, а также зависимость их экспрессии от функционального состояния лимфоцитов.

3. Изучить механизмы Fas-индуцированного апоптоза лимфоцитов доноров и больных ВИЧ-инфекцией.

4. Изучить влияние процессов активации лимфоцитов на восприимчивость к действию апоптогенных стимулов.

5. Исследовать роль митохондрий, а также некоторых митохондриальных белков (в частности, Вс1-2) в процессах спонтанного и индуцированного апоптоза Лф при ВИЧ-инфекции.

6. Изучить взаимосвязи репликации ВИЧ-1 и апоптоза различных популяций лимфоцитов периферической крови и лимфоидных линий

7. Изучить роль процессов микровезикуляции в патогенезе ВИЧ-инфекции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые получены данные, иллюстрирующие зависимость активационного статуса лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией и их повышенной восприимчивости к апоптозу. Показано, что повторная активация лимфоцитов, одновременно экспрессирующих активационные маркеры (CD38, HLA-DR, CD26) снижает их чувствительность к действию апоптогенных стимулов (ФГА, aHTH-Fas-мкАТ). Впервые выявлена повышенная чувствительность к Fas-индуцированному апоптозу у лимфоцитов с гиперэкспрессией Fas-рецептора. Показано, что при ВИЧ-инфекции имеется повышенная чувствительность лимфоцитов периферической крови к апоптогенному действию глюкокортикоидов. В то же время, только СБ8+Т-лимфоциты являются резистентными к ФГА-индуцированному апоптозу. При инфицировании in vitro культуры лимфоцитов наблюдается резкое снижение количества неинфицированных С04+Т-лимфоцитов (но не СБ8+Т-лимфоцитов) вследствие их гибели по механизму апоптоза. Впервые установлено, что инфицированные in vitro лимфоциты являются резистентными к апоптозу. Репликация ВИЧ-1 сопровождается подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов и массовой гибелью неинфицированных С04+Т-лимфоцитов по механизму апоптоза. Установлено повышение образования микровезикул тромбоцитарного происхождения у больных ВИЧ-инфекцией, коррелирующее с активацией Т-лимфоцитов периферической крови.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Совершенствование диагностики ВИЧ-инфекции, проведение адекватной терапии невозможно без глубоких знаний о патогенезе и механизмах формирования иммунодефицитного состояния при данном заболевании. Полученные данные о механизмах гибели лимфоцитов при ВИЧ-инфекции открывают путь к поиску новых подходов к лечению данного заболевания. Модель оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов может быть использована как в комплексном исследовании процессов ПКГ и функциональной активности клеток, участвующих в патогенезе вирусных заболеваний с нарушениями апоптоза, так и для направленного поиска средств фармакологического контроля.

Результаты проведенного исследования могут быть использованы патофизиологами, иммунологами, инфекционистами в научной, практической и учебной работе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Лимфоциты периферической крови больных ВИЧ-инфекцией подвержены апоптотической гибели, что обусловлено их повышенной активацией.

2. Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных ВИЧ-инфекцией различаются по чувствительности к апоптогенным стимулам. Наиболее резистентной популяцией лимфоцитов к активационному и Fas-индуцированному апоптозу является СБ8+Т-лимфоциты. Развитие устойчивости CD8+T-лимфоцитов к апоптозу зависит от их функционального состояния, выявляемого по экспрессии активационных маркеров.

3. Интенсивность репликации ВИЧ-1 in vitro обусловлена подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов. Повышенная гибель неинфицированных лимфоцитов по типу апоптоза находится в прямой зависимости от репликации ВИЧ-1.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения и результаты работы доложены на 4, 5, 6, 7, 8 -ой Всероссийских конференциях по аллергологии и клинической иммунологии "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004); на 10, 11-ом Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2000, Москва, 2001); 7, 8-ой Всероссийских школах молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2000, 2001); 5-ой научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2001); 4-ом Конгрессе РААКИ "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2001); 12-ой Конференции ученых КГУ "Нуклеазы микроорганизмов" (Казань, 2001); 11-ой Международном Конгрессе "Европейского респираторного общества" (Берлин, 2001); 1,3-ей научно-практической конференции с международным участием "Проточная цитофлуорометрия и ее использование в практической медицине" (Санкт-Петербург, 2001, 2004); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); Юб.конференции, посвящ. 10-летию основания Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.Шмидта-Б.Кудряшова (Москва, 2003), 3-м Российском конгрессе по патофизиологии "Дизрегуляторная патология органов и систем" (Москва, 2004); Всероссийском семинаре "Проблемы определения субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц методом проточной цитометрии" (Смоленск, 2004); 2-ой Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2005); заседании предметно-проблемной комиссии КГМУ по патофизиологии и аллергологии (Казань, 2005).

ВЫВОДЫ

1. При ВИЧ-инфекции выявлено усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови, зависящего от степени активации лимфоцитов и экспрессии Fas-рецептора.

2. Повышение уровня экспрессии Fas-рецептора на различных популяциях лимфоцитов при ВИЧ-инфекции коррелирует со степенью тяжести заболевания и определяет повышенную чувствительность лимфоцитов к спонтанному и Fas-индуцированному апоптозу.

3. Повышенная чувствительность лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией к Fas-индуцированному апоптозу не требут (в отличие от лимфоцитов доноров) предварительной активации клеток и обусловлена повышенным уровнем активации клеток ex vivo (CD4+ и С08+Т-лимфоцитов).

4. Гетерогенность популяций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией по уровню экспрессии Fas-рецептора обуславливает их различную восприимчивость к Fas-индуцированному апоптозу.

5. Лимфоциты периферической крови больных ВИЧ-инфекцией по сравнению с лимфоцитами доноров более подвержены активационному апоптозу, сопровождающемуся снижением уровня экспрессии белка Вс1~2 и повышением уровня Fas-рецептора.

6. Митоген(ФГА)-индуцированная активация лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией и доноров индуцирует апоптоз. Лф больных ВИЧ-инфекцией более подверженны данной разновидности активационного апоптоза. СБ4+лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией (в отличие от лимфоцитов доноров) являются наиболее восприимчивой популяцией лимфоцитов к митоген-индуцированному апоптозу.

7. С08+Т-лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией являются резистентными к ФГА-индуцированному апоптозу. Устойчивость данной популяции клеток обусловлена их активацией ex vivo, определяемой по уровню экспрессии некоторых активационных маркеров (CD38, HLA-DR, CD26).

8. С04+Т-лимфоциты, в отличие от СВ8+Т-лимфоцитов, подвергаются гибели по механизму апоптоза в культуре клеток, инфицированных in vitro ВИЧ-1.

9. Инфицирование in vitro лимфоцитов сопровождается массовой гибелью неинфицированных С04+Т-лимфоцигов по механизму апоптоза и подавлением программы апоптоза инфицированных лимфоцитов, коррелирующим с уровнем репликации ВИЧ-1.

10.При ВИЧ-инфекции наблюдается повышение образования микровезикул тромбоцитарного происхождения, коррелирующее со степенью активации Т-лимфоцитов периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модели индукции и оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови могут быть использованы в качестве комплексного анализа предполагаемых нарушений регуляции апоптоза и его механизмов.

2. Методы индукции и оценки апоптоза, использованные в настоящей работе, могут быть применены в качестве тест-систем для оценки эффективности терапии ВИЧ-инфекцией.