Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль цитоскелета эритроидных клеток в регуляции их функций

На правах рукописи

РГ6 од

2 з !:;■}';

СТОРОЖОК СЕРГЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТОК В РЕГУЛЯЦИИ ИХ ФУНКЦИЙ

14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Челябинск - 1997

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии

Научный консультант

член-корреспондент РАМН, ЗАХАРОВ Ю.М.

академик РАЕН,

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты-.

доктор медицинских наук, профессор Гильмиярова Ф.Н. академик РАЕН;

доктор медицинских наук, профессор Ястребов А.П.

доктор медицинских наук, профессор Бргохин Г.В.

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский НИИ гематологии и переливания крови

Защита состоится "30" июня 1997 г. в "10" часов, на заседании диссертационного совета Д- 084.04.01. . в Челябинской государственной медицинской академии (454092, Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан " 27" мая 1997г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Кривохижина Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для оптимального обеспечения газотранспортной функции эритроциты млекопитающих приобрели в процессе эволюции ряд характерных морфологических особенностей. Отсутствие ядра, рибосом и митохондрий позволяет заполнить весь внутриклеточный объем гемоглобином и максимально увеличить количество молекул кислорода, транспортируемых одним эритроцитом. Процессы газообмена между кровью и тканями осуществляются в микроциркуля-торном русле во время прохождения эритроцитов через кровеносные капилляры. Средний диаметр эритроцитов (»7,55 мкм) вдвое превышает диаметр самых мелких капилляров (»3 мкм), поэтому при прохождении через кровеносные капилляры происходит сдвиговая деформация эритроцитов, при которой меняются линейные размеры и форма клеток, но остается постоянной площадь поверхности мембраны /Evans , Skalak, 1980/. Деформация эритроцитов осуществляется за счёт сил напряжения сдвига со стороны смещающихся слоев плазмы крови. После прекращения воздействия деформирующей силы эритроциты восстанавливают прежние размеры и форму за счет энергии, запасенной в процессе деформации, то есть им присущи свойства упругого твёрдого тела.

Таким образом, способность эритроцитов к деформации является непременным условием их прохождения через микроциркуляторное русло, а это во многом определяет выполнение кровью одной из основных её функций - газотранспортной.

Свойства мембран эритроцитов при деформациях, по аналогии с упругим твёрдым телом, определяются молекулярной организацией мембраны и физико-химическими свойствами образующих её молекул. Способность эритроцитов к деформации получила название деформа-бильность (deformability). Следует различать понятия деформабиль-ность эритроцита в целом и деформабильность мембраны эритроцита. Мембрана эритроцита также обладает свойствами упругого твёрдого тела Поведение мембраны эритроцита при действии деформирующей силы как упругого твёрдого тела определяется ее молекулярной орга-

низацией и физико-химическими свойствами структурных молекул. Мембрана эритроцита представляет из себя композитную структуру, основой которой служит липидный матрикс, формируемый молекулами фосфолипидов, который пронизывают молекулы интегральных белков (полосы 3 и гликофоринов). На цитоплазматической поверхности ли-пидного бислоя локализована прочная эластичная сеть, образуемая молекулами белков цитоскелета. Липидный бислой и белковая сеть цито-скелета вносят индивидуальный вклад в упругое поведение мембран эритроцитов при их деформациях /Waugh е.а., 1995/.

Особая роль в обеспечении упругих способностей при сдвиговой деформации и поддержании формы дискоцита приписывается белковому цитоскелету мембран эритроцитов, формирование которого должно быть завершено к моменту выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь/С.А. Сторожок, 1995/.

Роль цитоскелета в регуляции выхода молодых эритроцитов из костного мозга и селезенки в циркулирующую кровь мало исследована. По-прежнему в литературе большое значение при описании механизма выхода ретикулоцитов из костного мозга и селезенки придается "липкости" их мембран /Jandl, 1960; В.И Филимонов, Ю.М Захаров, 1974/. Во многом не исследована роль, которую играет эволюция вязко-эластических свойств мембран ретикулоцитов в процессах поступления молодых эритроцитов в кровь. Это связано с недостаточной разработанностью технических подходов для оценки в эксперименте вклада отдельных компонентов цитоскелета в обеспечение деформабильности ретикулоцитов- эритроцитов.

Подходы, исследующие количественные стороны эритроцитарного баланса, исходят лишь из скорости созревания ретикулоцитов периферической крови in vitro /E.H. Мосягина и соав., 1976/, и не учитывают взаимоотношений между процессами формирования цитоскелета этих клеток и их прохождением через стенки синусоидов костного мозга в кровь. В результате наши представления о влиянии эволюции формирования цитоскелета эритроидных клеток на кинетику последних остаются далеко неполными.

Исследования последних лет позволяют говорить о наличии регу-ляторного контроля за функциональным состоянием белкового цито-

скелета и, соответственно, способности эритроцитов к деформации /Bennett, 1990/. Особое внимание уделяется изучению генетических аномалий белков цитоскелета мембран эритроцитов, наличие которых ставится в причинную связь с повышенным разрушением эритроцитов и развитием анемии у человека /Palek, Sahr, 1992/.

Показана также роль дефектов цитоскелета эритроцитов в патогенезе гипертонической болезни, проявляющаяся в снижении дефор-мабильности эритроцитов вследствие увеличения кальмодулин зависимого связывания Са2+ с цитоскелетом /Bennett е.а., 1988; Gardner, Bennett, 1988/. Поэтому исследования молекулярной структуры белкового цитоскелета эритроцитов и особенностей его формирования на различных этапах дифференцирования эритроидных клеток, изучение взаимоотношений между белковым цитоскелетом и механизмами регуляции системы эритрона несомненно имеет важное теоретическое и прикладное значение.

Особо значимо при проведении исследований подобного рода объективно оценить способность эритроцитов к упругой деформации. Одним из методов, отвечающих этому требованию, является компьютерная эктацитометрля /Bessis е.а., 1981/. Использование эктацитомет-рии в клинической гематологической практике создало новые возможности для успешной дифференциальной диагностики анемий, вызванных нарушениями мембран или цитоскелета эритроцитов /Bessis е.а., 1981; Mohandas е.а., 1981; Kuypers е.а., 1990; Nash е.а., 1990; Johnson е.а., 1994; Johnson, Ravidranath, 1996; Baskurt, Meiselman, 1996/.

Однако, в настоящее время в России отсутствует отечественная серийная модель эктацитометра, что в значительной мере ограничивает возможность проведения российскими учёными исследований по изучению вязко-упругих свойств цитоскелета эритроцитов и их влияние на реологические свойства клеток крови. Поэтому разработка и создание отечественной модели эктацитометра с компьютерной обработкой полученной информации, отработка технологии эктацитометри-ческих исследований вязко-эластических свойств эритроцитов при физиологическом и стимулированном эритропоэзе, внедрение эктацито-метрии в практику научно-исследовательских и клинических лаборато-

рий России, безусловно является актуальной проблемой как для практической, так и теоретической медицины.

Цель работы: Выяснить роль белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток в регуляции системы эритрона в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

Задачи исследования:

1. Разработка и создание отечественной лабораторной установки для оценки деформабильности эритроцитов методом эктацитометрии. Написание и отладка программного обеспечения для компьютерной обработки результатов эктацитометрического анализа деформабильности эритроцитов. Отработка технологии проведения эктацитометрических исследований;

2. Исследовать деформабильность эритроцитов "молодой" и "старой" популяций эктацитометрическим методом в условиях нормального эритропоэза;

3. Исследовать деформабильность эритроцитов "молодой" и "старой" популяций эктацитометрическим методом в условиях напряжённого эритропоэза;

4. Разработать технологию специфической блокады белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток моноспецифическими кроличьими антителами к спектрину;

5. Исследовать изменения в системе красной крови в условиях длительной блокады белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток антителами к спектрину;

6. Исследовать способность системы эритрона отвечать на острую кровопотерю на фоне блокады белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток антителами к спектрину.

Научная новизна. Впервые показано, что деформабильность ре-тикулоцитов является фактором, определяющим момент их выхода из костного мозга в кровь. Способность ретикулоцитов к деформации зависит от степени завершенности формирования функционально полноценной структуры белкового цитоскелета.

Скорость выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь прямо-пропорционально зависит от их количества в костном мозге и значения константы выхода, величина которой определяется деформабильностью ретикулоцитов и размерами пор в стенках синусоидных капилляров костного мозга.

Изменения скорости выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь могут привести к нарушению эригроцигарного баланса при отсутствии изменений интенсивности продукции ретикулоцитов костным мозгом и интенсивности гемолиза эритроцитов.

Выход ретикулоцитов из костного мозга в кровь в условиях нормального эритропоэза регулируется механизмом, который обеспечивает селекцию ретикулоцитов по их способности к упругой деформации. В условиях напряженного эритропоэза возможна блокада этого механизма отбора ретикулоцитов. В результате в циркуляцию поступают рети-кулоциты ранней степени зрелости, в которых незавершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета, вследствие этого они обладают низкой деформабильностью.

Блокада белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток у крыс антителами к спектрину препятствует включению механизмов, обеспечивающих компенсаторные реакции системы красной крови в ответ на острую кровопотерю.

Впервые в России создана лабораторная установка, позволяющая исследовать деформабильность эритроцитов методом лазерной дифрак-тометрии (эктацитометрии) с непосредственным вводом информации в компьютер.

Создано оригинальное программное обеспечение для обработки результатов эктацитометрических исследований. Отработана технология эктацитометрических измерений.

Научно-практическая значимость работы. На основе результатов настоящей работы разработаны и научно обоснованы:

новые представления о механизмах выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь, о значимости процессов формирования цитоскелета эритроидных клеток на кинетику последних.;

математическая модель, описывающая скорость поступления рети-кулоцитов в кровеносное русло;

экспериментальная модель эффективной блокады белкового цито-скелета мембран эритроидных клеток с помощью липосом, загруженных антителами к спектрину;

лабораторная эктацитометрическая установка, которая может служить основой для создания серийного промышленного образца отечественной модели эктацитометра;

технология исследований деформабильности эритроцитов с помощью эктацитометра, которая может быть использована для разработки методических рекомендаций по исследованию реологических свойств крови методом эктацитометрии в практической гематологии

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Способность ретикулоцитов к деформации зависит от степени завершенности формирования функционально-полноценной структуры белкового цитоскелета;

2. Деформабильность ретикулоцитов является фактором, определяющим момент их выхода из костного мозга в кровь;

3. Снижение деформабильности эритроцитов молодой популяции в периферической крови через четыре часа после острой крово-потери обусловлено поступлением в циркуляцию из костного мозга ретикулоцитов ранней степени зрелости, в которых не завершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета;

4. В условиях напряженного эритропоэза возможна блокада механизма, который регулирует выход ретикулоцитов из костного мозга в кровь в условиях физиологического эритропоэза, селектируя их по способности к упругой деформации.;

5. Нарушения эритроцитарного баланса могут возникать вследствие изменения скорости выхода ретикулоцитов из костного мозга в

кровь при отсутствии изменений интенсивности продукции рети-кулоцитов костным мозгом и интенсивности гемолиза эритроцитов;

6. Компьютерная эктацитометрия является объективным методом исследования деформабильности эритроцитов, обеспечивающим высокую степень автоматизации измерений.

7. Внутрибрюшинное введение крысам липосом, загруженных антителами к спектрину, позволяет эффективно блокировать белковый цитоскелет мембран эритроидных клеток.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на пленуме правления научного общества гематологов и трансфузиологов "Проблемы регуляции гемопоэза в норме и патологии", г. Майкоп, 1989; на межрегиональном семинаре "Современные проблемы гематологии", Челябинск, 1989; на конференциях: "Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области", Тюмень, 1993; "Актуальные проблемы фармации", Тюмень, 1994; "Медицина и охрана здоровья", Тюмень, 1995, 1996; на Всероссийском симпозиуме "Кроветворение и физиологические функции иммунной системы организма" , Санкт-Петербург, 1995; на И Международном, симпозиуме "Патология эритрона и метаболизма железа", Рязань, 1995; на 1У Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1997.

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликована 21 печатная работа (1 монография, 7 статей, 13 тезисов докладов).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 235 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 58 рисунками. Библиографический указатель включает 352 работы отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на беспородных белых крысах-самцах, массой 180-200 гр (1500 особей) и 15 кроликах Калифорнийской породы. Животные содержались в условиях вивария на полноценной диете (овёс, овощи, минеральные добавки). Кровь для исследований обычно забиралась из надреза кончика хвоста крысы в гепаринизированные капилляры (фирма Radiometer Copenhagen, Дания). При этой процедуре крыса практически не испытывала стресса. В ряде экспериментов кровь требовалось забирать из сердца или яремной вены, в этом случае животное находилось под эфирным наркозом. Кровь стабилизировали 3% раствором цитрата натрия (0,1 мл раствора цитрата натрия на 1 мл крови). Острая кровопотеря, как фактор, стимулирующий эритропоэз, проводилась по стандартной методике. Кровь забиралась из яремной вены животного (2% от массы тела), находящегося под эфирным наркозом. Подсчёт количества эритроцитов, ретикулоцитов, цитометрию эритроцитов, расчёт таких показателей, как средний объём эритроцитов, сферический индекс, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах проводили по общепринятым методам и формулам /И. Тодоров, 1963; П.А. Коржуев, 1964; М.И. Стенко, 1975/. Гематокрит определяли с помощью гематокритной микроцентрифуги (АВ LARS LJUNGBERG & СО Stockholm, Швеция, 15 000g, 2').

Для выделения мембран эритроциты отмывали от плазмы повторным центрифугированием, а затем гемолизировали 40 объемами раствора-7 мМ NaCl, 5 мМ Трис 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрайтол, 0,01 % диизопро-пилфлюорофосфата (v/v) (рН 7,4) /Johnson, 1975, Gardner, Bennett, 1986/. Мембраны эритроцитов осаждали центрифугированием (20000 g, 40') и отделяли от гемоглобина используя метод гель- проникающей хроматографии на сефарозе 4В /Froman е.а., 1980/. Электрофорез белков мембран эритроцитов проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по методу Fairbanks е. а. /1971/. Белок в полиакриламидных гелях окрашивали кумасси ярко-синим R-250. В тех случаях, когда требовалось определить количественные соотношения между различными белками, использовали

метод экстракции красителя, который элюировали из гелей 25 % водным раствором пиридина. Количество экстрагированного из геля красителя было прямолропорционально содержанию белка. После завершения экстракции красителя измеряли оптическую плотность раствора при Л=605 нм /Fenner е.а., 1975/. Для количественного определения белка был использован метод связывания красителя (кумасси ярко-синий G 250) /Bradford, 1976; Spector, 1978/. Молекулы спектрина в малых концентрациях (ниже порога чувствительности электрофоретического метода анализа) в Тритон X-100 растворимой фракции мембран выявляли используя иммуноблотинг, который проводили по методу Burnette /1981/.

Спектрин из мембран эритроцитов экстрагировали раствором низкой ионной силы /Morrow, Marchesi, 1981/. Для получения антител к спектрину из эритроцитов крыс проводили иммунизацию кроликов в течение шести недель. Суммарно за весь цикл иммунизации каждому из кроликов вводили по 18 мг спектрина, чередуя способы введения: подкожно в передние и задние конечности, внутрибрюшинно и внутривенно /Л.А. Людоговская, 1968/. Антитела к спектрину крыс из плазмы крови иммунизированных кроликов выделяли используя аффинную хроматографию на сефарозе CL 6В. Для приготовления аффинного сорбента связывали молекулы спектрина с сефарозой CL 6В, активированной три-хлортриазином /Я. Туркова, 1980/. Липосомы, использовавшиеся для транспорта антител к спектрину в эритроидные клетки, были изготовлены нами из. соевого фосфатидилхолина и холестерина (Serva, Германия) в молярном соотношении (7:2) по методу Sessa и Weismann /1972/.

При проведении эктацитометрических исследований эритроциты суспензировали в 20% растворе Fikoll-400 /A.B. Белкин и соав., 1990/. Вязкость раствора Fikoll-400 оценивалась при помощи капиллярного стеклянного вискозиметра ВПЖ-1. Осмоляльность сред измеряли используя осмометр 1Ц-01.

Эритроциты различных возрастных популяций выделяли методом центрифугирования по Murphy /1973/. После центрифугировании крови (30' 40.000 g) эритроциты "молодой" популяции концентрировались в верхнем слое центрифужной пробирки, а "старые" клетки - в нижнем.

Для статистической обработки результатов исследований и их графического представления нами был использован программный пакет Statistica for Windows Release 4.3 Statsfort, Inc. 1993.

Конструктивные особенности эктацитометра, созданного в нашей лаборатории. Для исследования способности эритроцитов к деформациям использовали метод эктацитометрии. Эктацитометрия - метод, в основе которого лежит явление дифракции лучей гелий-неонового лазера на тонком слое эритроцитов, деформируемых потоком вязкой жидкости, что приводит к изменению дифракционной картины, по которым судят о де-формабильности эритроцитов (рис. 1, 2, 3) /Bessis, е.а., 1980; Groner, е.а., 1980 /.

Нами создана и апробирована эктацитометрическая установка для изучения реологических свойств эритроцитов в потоке, в качестве конструктивного прототипа которой мы использовали конструкцию прибора, представленную в работах /Bessis, е.а., 1980; Groner, е.а., 1980/.

Основанием установки служит массивная металлическая плита, установленная горизонтально. Привод наружного цилиндра обеспечивает серводвигатель (HSM 150, Чехословакия) и высокостабилизированный блок питания с кварцевой стабилизацией. Скорость вращения может меняться в пределах от 0 до 400 об/мин. и контролируется специальным электронным индикатором, датчиком которого служит оптронная пара. В качестве когерентного источника света используется гелий-неоновый лазер ЛНГ-208Б (мощность P=1.9xl0"3 Вт, длина волны Л=632.8 нм). Оба стакана выполнены из прозрачного для видимого света материала (оргстекло) и термостабилизированы. Термостабилизация внутреннего, покоящегося стакана, конструктивно была нами обеспечена пропуском внутри него змеевика. Для наружного стакана нами сконструирована специальная "рубашка" с отверстием для света и с очень малым зазором между этой "рубашкой" и вращающимся наружным стаканом. Наружный диаметр внутреннего цилиндра составляет 49 мм, внутренний диаметр наружного - 50 мм, так что ширина щели между стаканами равна 0,5 мм. Исследуемые эритроциты, суспензированные в растворе Ficoll-400, вносились в зазор между этими цилиндрами, где подвергались деформирующе-

му воздействию при вращении наружного стакана. Формула для расчёта

R Q N ч

скорости сдвига имеет следующий вид: у =-= (—)-(2л—), где Q. -

1 I 60

частота вращения, R - радиус вращающегося стакана, ] - зазор между стаканами, N - скорость вращения ( N/60 - число оборотов в минуту) при-

■ ,N

обретает вид: у = - = 314.16 • (—)

0.5 60

При фиксированных значениях радиусов внутреннего и наружного стаканов, скорость сдвига зависит только от скорости вращения наружного стакана, а при постоянном значении динамической вязкости т|, усилие сдвига х также определяется только скоростью вращения: т = у • Г|

В качестве регистрирующего устройства мы использовали твёрдотельную видеокамеру, видеосигнал с которой поступал на аналого-цифровой преобразователь, что обеспечивало непосредственный ввод информации в персональный компьютер IBM PC/AT (рис. 1).

Блок-схема эктацитометра.

лИ_ _ ПАЗЕР

Прозрачные

пг^

c!D

I I Видеокамера Преобразователь Компьютер

контрольный монитор

яип IBM PC/AT.

Рис 1.

Для количественной оценки выявляемого среднеклеточного удлинения при сдвиге используется эктацитометрический показатель, или индекс удлинения 1о=(А-В)/(А+В), где А и В - большая и малая полуоси дифракционного эллипса.

Степень вынуждающего воздействия оценивается по напряжению

(усилию) сдвига т = Г| • у; [Н/м2], где т) - динамическая вязкость суспензионной среды, [Пахе]; у - скорость сдвига, [1/с]. В свою очередь скорость сдвига зависит от скорости вращения наружного цилиндра N отно-

сительно покоящегося внутреннего- и соотношения их диаметров D и d:

, D N

Y = 2ж- .

' D-d

Действительное изображение дифракционной картины выводится на монитор компьютера (рис. 2.), программно анализируется и может быть записано в память машины вместе с интересующими нас параметрами, такими как значения радиусов и индекс деформабильности, как величина, определяемая особым отношением радиусов эллипса по формуле-Di= (А-В)/(А+В) и являющаяся функцией от усилия сдвига. Для сравнения изображения выводимого на монитор компьютера и реальной дифракционной картины, получаемой на нашей установке, на рис. 3 представлены фотографии, полученные контактным способом с фотопластинок, на которые проецировались лучи лазера, прошедшие через суспензию эритроцитов.

Рис. 2. Реальное изображение дифракционной картины, получаемое при прохождении луча от лазера через слой эритроцитов и выводимое на монитор. Справа-для покоящихся эритроцитов; слева-для эритроцитов в сдвиговом потоке.

Рис. 3. Фотографии дифракционных картин, полученных при прохождении луча лазера через суспензию эритроцитов. 1- для покоящихся эритроцитов; 2, 3- для эритроцитов в сдвиговом потоке.

В процессе исследования деформабильности эритроцитов с помощью эктацитометра регистрируют зависимость 1ц от г (рис. 4). Программа, позволяющая анализировать изображение, была написана на языке Turbo Pascal.

Рис.4. График зависимости индекса деформабильности от усилия сдвига, приложенного к эритроцитам.

Технология проведения эктанитометрических исследований Проба крови вносилась в 20% раствор Шсо11-400, (100 мкл цельной крови на 3 мл раствора) приготовленного на фосфатном буфере. В результате разбавления, концентрация эритроцитов составляла =г15*107 клеток/мл. Дальнейший контроль за концентрацией эритроцитов в растворе не носил принципиального характера, так как данный параметр определял лишь интенсивность дифракционной картины (по аналогии с дифракционной решёткой) и лимитировался чувствительностью видеокамеры. По количественным показателям индекса деформабильности Бь при различных усилиях сдвига, изменяющихся в диапазоне от 0 до 35 Н/м2 , используя компьютер, строилась эмпирическая кривая, иллюстрирующая функциональную связь между изменениями размеров, формы эритроцитов и приложенным к ним напряжением сдвига (рис. 4).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из значимости белкового цитоскелета для нормального функционирования эритроцитов в циркулирующей крови нами было сделано предположение, что завершение формирования структуры белкового цитоскелета, наряду с синтезом достаточного количества гемоглобина, является одним из основных критериев функциональной зрелости эритроцитов. Это предположение и было положено нами в основу рабочей гипотезы данной работы.

Основные положения гипотезы были сформулированы следующим образом:

1. В условиях нормального эритропоэза из костного мозга в кровь поступают ретикулоциты, в которых завершены процессы формирования функционально-полноценной структуры белкового цитоскелета;

2. Способность ретикулоцитов к деформации определяется степенью завершенности формирования структуры белкового цитоскелета;

3. Выход ретикулоцитов из костного мозга в кровь в условиях нормального эритропоэза регулируется механизмом, который обеспечивает селекцию ретикулоцитов по их способности к упругой деформации;

4. В условиях напряженного эритропоэза возможно значительное ограничение этого механизма отбора ретикулоцитов. В результате в циркуляцию из костного мозга поступают ретикулоциты ранней степени зрелости, в которых не завершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета, вследствие этого они обладают низкой деформа-бильностью.

Подтвердить или опровергнуть состоятельность этой гипотезы можно было только экспериментальным путем. Исходя из основных положений гипотезы формулировались и экспериментальные задачи настоящей работы. Прежде всего необходимо было выяснить действительно ли деформабильность ретикулоцитов зависит от их степени зре-

лости. Решить эту задачу можно было только, имея в своем распоряжении объективный метод оценки деформабильности эритроцитов.

Результаты анализа доступной нам литературы свидетельствуют о том, что метод эктацитометрии является в настоящее время одним из основных, используемых в ведущих зарубежных гематологических центрах для оценки деформабильности эритроцитов /Chasis, Mohandas, 1986; Chasis е.а., 1988; Reid е.а., 1987; Kuypers е.а., 1990; Nash е.а., 1990; Low е.а., 1991; Johnson е.а., 1994; Baskurt, Meiselman, 1996; Johnson, Ravidranath, 1996/.

Эктацитометрия по сравнению с другими методами имеет ряд преимуществ, к числу которых следует отнести:

1. Быстроту выполнения исследований (2-3 мин), что сводит к минимуму возможность изменений деформабильности эритроцитов вследствие их пребывания in vitro;

2. Высокая чувствительность метода, позволяющая выявить изменения деформабильности эритроцитов даже в том случае, если из всего пула клеток нарушения имеют не более 5 % эритроцитов;

3. Возможность полной автоматизации процесса оценки изменений дифракционной картины при деформации эритроцитов, что позволяет эффективно использовать вычислительную технику для обработки результатов исследований;

4. Модификации метода эктацитометрии позволяют наряду с исследованиями деформабильности эритроцитов, получить информацию о вязкости внутриклеточного содержимого, оценить механическую стабильность мембран и отношение площадь поверхности/объем эритроцитов /Clark е.а., 1983/.

Отсутствие эктацитометров в гематологических лабораториях России обусловлено тем, что выпуск этих приборов не освоен нашей отечественной промышленностью, а приобретение импортных приборов лимитируется их высокой стоимостью. Одним из обязательных этапов на пути разработки промышленного образца эктацитометра является создание лабораторной эктацитометрической установки и отработка технологии проведения экспериментов по оценке деформабильности

эритродитов методом лазерной дифрактометрии, что и являлось одной из задач настоящей работы.

Для оценки чувствительности созданного нами эктацитометра мы провели с его помощью исследование деформабильности эритроцитов, мембраны которых были модифицированы глютаровым альдегидом. В процессе инкубации эритроцитов в растворе, содержащем глютаровый альдегид, между молекулами мембранных белков возникают поперечные сшивки (основания Шиффа), в результате возрастает величина модуля поверхностного сдвига материала мембраны- ц /НеиэткуеЫ е.а., 1977/, что отрицательно сказывается на деформабильности эритроцитов. Исследование с помощью эктацитометра деформабильности эритроцитов после инкубации в среде, содержащей глютаровый альдегид в различной концентрации, позволило нам выявить снижение Б1 в сравнении с интактны-ми клетками (рис. 5). т

Рис. 5. Графики зависимости индекса деформабильности мембран эритроцитов крысы, обработанных раствором глютарового альдегида, различных концентраций, от приложенного к ним напряжений (т). 1-"норма"; 2- концентрация глютарового альдегида -0.01%; 3-концентрация глютарового альдегида -0.02%; 4- концентрация глютарового альдегида -0.03%.

В другой серии экспериментов в ячейку эктацитометра вносили взвесь эритроцитов, в которой у одного числа клеток мембраны оставались интактны, а у другой части эритроцитов мембраны были модифици-

рованы глютаровым альдегидом. Это достигали путем добавления к суспензии интактных эритроцитов определенного количества (в % отношении) взвеси клеток , которые предварительного инкубировали в растворе, содержащем 0,02 % глютарового альдегида. На рис. 6 представлены кривые зависимости Б1 от напряжения сдвига т для суспензий эритроцитов с различным процентным содержанием клеток, мембраны которых были модифицированы глютаровым альдегидом.

Рис. 6. Зависимость индекса деформабильности от относительного содержания в суспензии клеток, обработанных глютаровым альдегидом. 1- ин-тактные эритроциты; 2, 3, 4, 5 - 2.5%, 5%, 30% и 75% эритроцитов в исследуемом образце были модифицированы глютаровым альдегидом.

Анализ этих графиков свидетельствует о том, что чувствительность созданного нами эктацитометра позволяет достоверно выявить изменения способности эритроцитов к деформации если среди них относительное количество клеток, деформабильность которых отличается от интактных, превышает 5 %.

Деформабильность эритроцитов зависит от следующих основных факторов /Mohandas е.а., 1981/:

1. Эластических свойств мембран эритроцитов;

2. Размеров и формы клеток, соотношения площадь поверхности/объем;

3. Вязкости внутриклеточного содержимого.

Эктацитометрия позволяет оценить роль каждого из перечисленных выше факторов для конкретных случаев изменения деформабильности эритроцитов.

Деформабильность эритроцитов меняется при различных значениях осмоляльности суспензионной среды. Максимальную деформабильность эритроциты имеют в изоосмоляльной среде. С увеличением или уменьшением осмоляльности суспензионной среды деформабильность эритроцитов снижается. Низкая деформабильность в гиперосмоляльной среде является следствием увеличения концентрации гемоглобина и роста вязкости внутриклеточного содержимого в результате потери эритроцитами воды. В гипотоническом растворе, напротив, происходит поступление воды в эритроциты и, вследствие этого, - увеличение их сферичности и уменьшение величины отношения площади поверхности к объему, что также приводит к снижению деформабильности /Mohandas е.а., 1981/.

Метод регистрации зависимости индекса деформабильности эритроцитов от осмоляльности суспензионной среды, когда выполняется условие x=const, получил название- осмотическая градиентная эктацитометрия. График зависимости DI от осмоляльности суспензионного раствора называют профилем осмотической деформабильности (рис. 7). На профиле осмотической деформабильности эритроцитов выделяют: 1. DI тах и соответствующее ему значение осмоляльности среды;

2. DImjn в гипотонической области, и осмоляльность - Omin;

.3. Значение осмоляльности (О') в гипертонической области для которой DI=l/2 DI max.

Величина DI max уменьшается при снижении отношения площадь поверхности объем и увеличении величины модуля поверхностного сдвига мембран эритроцитов /Chasis е.а., 1988; Reinhart е.а., 1989/. Положение Dlmax на профиле осмотической деформабильности эритроцитов обычно соответствует изоосмоляльному значению среды, но может смещаться в гипотоническую область при увеличении концентрации гемоглобина, или -в гипертоническую область при снижении концентрации гемоглобина в эритроцитах.

А- В

Рис. 7. Профиль осмотической деформабильности эритроцитов интакт-

ных крыс.

Значение осмоляльности суспензионной среды (Om;n) при которой величина деформабильности эритроцитов минимальна (Dimin) также варьирует в зависимости от концентрации гемоглобина в эритроцитах. Минимальная величина деформабильности эритроцитов при Om;n обусловлена достижением эритроцитами максимального возможного объема, когда отношение площадь поверхности/объем имеет наименьшее значение, и при этой осмоляльности раствора гемолизируется до 50% клеток /Mohandas

е.а., 1981/. Увеличение деформабильности эритроцитов при снижении ос-моляльности суспензионной среды ниже величины Omin объясняют уменьшением объема клеток вследствие потери ионов и воды в результате увеличения проницаемости мембран /Clark е.а., 1983/.

Используя созданный нами эктацитометр мы провели измерения значений индекса деформабильности ID эритроцитов интактных крыс в зависимости от осмоляльности суспензионной среды при постоянной величине напряжения сдвига - 1=30 Н/м2. Профиль осмотической деформабильности эритроцитов интактных крыс, построенный по результатам этих экспериментов (рис. 7) подобен по форме профилю осмотической деформабильности эритроцитов человека /Clark е.а., 1983/.

Таким образом, созданная в нашей лаборатории модель эктацито-метра имела технические характеристики (чувствительность и воспроизводимость результатов измерений), достаточные для достоверного количественно измерения деформабильности эритроцитов.

Имея в своём распоряжении объективный и быстрый метод исследования способности эритроцитов к деформации мы могли провести эктацитометрическую оценку деформабильности эритроцитов молодой и старой популяций в условиях нормального и напряженного эритропо-эза после острой кровопотери.

Эритроциты, находящиеся в циркулирующей крови, отличаются по их времени пребывания в кровеносном русле (т.е. от момента выхода клеток из костного мозга в кровь). По крайней мере, в крови можно выделить популяцию молодых и старых эритроцитов, которые различаются не только по времени пребывания в циркуляции, но и по ряду морфологических и биохимических критериев /Piomelli, 1967; Cohen е.а., 1976; Seaman е.а., 1977/. Поскольку одной из задач настоящей работы являлось исследование деформабильности эритроцитов молодой и старой популяций, нам необходимо было обеспечить их эффективное разделение. Для этой цели мы использовали метод центрифугирования по

Murphy /1973/, в основе которого лежит разделение молодых и старых эритроцитов в поле центробежных сил вследствие различия плотности их внутриклеточного содержимого. Выделенные с помощью этого метода фракции молодых и старых эритроцитов достоверно различались относительным содержанием ретикулоцитов, концентрацией гемоглобина, диаметром и отношением площадь поверхности/объём, количественным соотношением между белками полос 4.1а и 4.1Ь цитоскелета и способностью связывать лектины (рис. 8, 9; табл. 1, 2, ). Это свидетельствовало об эффективности процесса разделения эритроцитов молодой и старой популяции.

Таблица 1

Результаты цитометрических исследований и концентрация гемоглобина в эритроцитах молодой и старой популяций до и после кровопотери (результаты для выборки п = 12).

Исследуемый образец эритроцитов Средний диаметр эритроцитов (0) М±т (мкм) Средняя площадь эритроцитов (S) М±т (мкм2) Сферический индекс М ±т Концентрац ия Hb M+m (г/л)

1 Клетки верхнего слоя до кровопотери 7.32+0.13 104.62±1.11 2.72+0.05 298±8

2 Клетки нижнего слоя до кровопотери *6.21±0.09 *75.22±0.65 "2.58+0.08 *316+5

3 Клетки верхнего слоя после кровопотери 7.9710.12 123.81+1.12 2.82+0.07 278+8

4 Клетки нижнего слоя после кровопотери *6.26+0.17 *76.99±1.24 *2.48+0.09 *32б±7

Р < 0.05 относительно данных для верхнего слоя.

Таблица 2.

Эффективность, связывания лектинов эритроцитами молодой и старой популяций, в % относительно нефракционированных эритроцитов

(М ± ш, п=15)_

Тип лектина Клетки нижнего слоя_Клетки верхнего слоя_

WGA 53.83 1.23 *112.56 2.02

Con А 43.49 1.48 *128.45 3.98

LCL_ 61.55 198_"108.78 1.78_

Р < 0.05 относительно клеток нижнего слоя

Сокращения: WGA- лектины зародышей пшеницы; LCL - лектины чечевицы, Con А - лектины конкавалина А

Рис. 8. Относительное количество ретикулоци-тов, выявленное в цельной крови и среди клеток верхнего и нижнего слоев, после центрифугирования по Murphy /1973/.

%о 300 Т

250 200 150100-, 500 4-

225,2 ±6.93

275,25112.15

54,41+«.es

до кровопогерн

цешнэя кровь кверхшйслой

8 №Ш*|Й СЛОЙ

после фоеоютери

Рис. 9. Количественное соотношение между белками 4.1а и 4.1Ь. 1- старые эритроциты. 2- эритроциты, нефракционированные по возрасту. 3 - эритроциты молодой популяции.

л +

tú

^ 0.8- ■

12 3

Исследуя с помощью эктацитометрической техники деформа-бильность эритроцитов молодой и старой популяций, выделенных из крови интактных крыс, мы выявили достоверно более низкую способность к деформации старых эритроцитов в отличие от молодых клеток. Достоверные отличия наблюдались и между профилями осмотической деформабильности молодых и старых эритроцитов (рис. 10, 11).

На профиле осмотической деформабильности эритроцитов старой популяции в отличие от профиля осмотической деформабильности для молодых клеток наблюдалось достоверное снижение величины ц)тах и смещение Щтах в гипотоническую область, а также уменьшение ширины интервала значений осмоляльности суспензионной среды От;п- О'.

Рис. 10. Графики зависимости индекса деформабильности от усилий сдвига, приложенных к эритроцитам различной степени зрелости: 1-"молодые" клетки; 2-"старые" эритроциты после острой кровопоте-ри; 3-"старые" эритроциты, полученные при физиологическом состоянии эритропоэза; 4-"молодые" клетки - после острой кровопотери. Точки на трафике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п=10).

Выявленные нами характерные отличия профиля осмотической деформабильности старых эритроцитов в отличие от молодых клеток были обусловлены увеличением концентрации гемоглобина в цитоплазме и уменьшением отношения площадь поверхности/объём. Действительно, для популяции старых клеток, в отличие от молодых эритроцитов, нами было выявлено достоверное увеличение концентрации гемо-

глобина и уменьшение отношения площадь поверхности/объём (табл. 1). Уменьшение величины 1с)шах для старых эритроцитов можно объяснить как снижением соотношения площадь поверхности/объем, так и изменениями вязко-эластических свойств материала мембраны. Действительно, при исследовании вязкоэластических свойств мембран при помощи микроаспирационной техники были выявлены более высокие значения модуля поверхностного сдвига для мембран старых эритроцитов в отличие от молодых клеток /ЬаСе11е, К1гкра1;пк, 1975/.

А-В

Рис. 11. Профили осмотической деформабильности для "молодой"-1 и "старой"-2 популяции клеток до кровопотери (фиксированное усилие сдвига 1=30 Н/м2 , r)=18,64xl0"3 Па-с, Т=310°К). Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п=10).

Гемопоэтические клетки костного мозга отделены от циркулирующей крови сосудистой стенкой. Постоянное поступление из костного мозга в циркуляцию зрелых клеток крови связано с наличием в костном мозге кровеносных капилляров синусоидного типа /Weiss, 1961; И.И. Новиков, 1968, A.B. Петров, В.Г. Свешников, 1979/. Результаты электронной микроскопии свидетельствуют, что выход зрелых клеток крови в циркуляцию из костного мозга происходит через стенки синусоидных капилляров /Э.Н. Баркова, 1979/

Электронномикроскопическое исследование структуры стенок сину-соидных капилляров костного мозга позволило выявить интересные закономерности взаимного расположения эндотелиальных клеток. Края соседних эндотелиоцитов могут накладываться друг на друга наподобие черепицы, а между телами клеток образуются щелевидные поры /ТауаББоИ, ЭЬакЫ, 1978/. Учитывая морфологические особенности синусоидных капилляров Tavassoli и ЭЬакЫ /1978/ предложили модель механизма выхода зрелых гемопоэтических клеток из костного мозга в циркулирующую кровь. Согласно этой модели гемопоэгические клетки, завершившие процесс дифференцирования, проникают в поры между эндотелиоцитами во время минимального кровенаполнения синусоидных капилляров. Переход клеток крови в просвет капилляров происходит в тот момент времени, когда увеличивается кровенаполнение синусоидных капилляров и возрастает плотность контактов между эндотелиальными клетками (рис 12).

Рис. 12. 1-увеличение размеров пор (П) в стенках синусоидных капилляров костного мозга при уменьшении их кровенаполнения. 2 уменьшение просвета пор в стенках синусоидных капилляров при увеличении их кровенаполнения /ТауаББоИ, БИакЫ, 1978/.

При критическом анализе этой модели механизма выхода зрелых клеток крови из костного мозга в циркуляторное русло возникают следующие вопросы:

1. Почему только зрелые гемопоэтические клетки способны выходить в просвет синусоидных капилляров ?

2. Какие силы обеспечивают пассаж клеток через поры в стенках капилляров ?

3. Почему перемещение клеток происходит только в одном направлении из миелоидной ткани в просвет капилляров ?

С учетом малых размеров пор между эндотелиальными клетками при проникновении в них ретикулоцитов последние должны подвергаться деформации. За счет каких сил осуществляется деформация мембран ретикулоцитов и их прохождение через эндотелиальные поры ? В стенках синусоидных капилляров нет сократительных элементов, мембраны ретикулоцитов с учетом современных представлений о их структуре также не способны к активному сокращению.

Необходимые для деформации мембран ретикулоцитов усилия сдвига могут возникать при смещении тел эндотелиальных клеток в тот момент времени, когда возрастает кровенаполнение синусоидных капилляров, что будет способствовать перемещению ретикулоцитов в просвет капилляра. Поскольку объем костного мозга, заключенного в костном канале, не будет меняться при увеличении кровенаполнения синусоидных капилляров, то окружающая миелоидная ткань, будет выполнять роль своеобразной опорной поверхности для ретикулоцитов, проходящих через стенку капилляра. При наличии усилия сдвига происходит своеобразное "нанизывание" поры в стенке капилляра на ретикулоцит (рис. 12).

В предлаегаемом нами гипотетическом механизме выхода ретикулоцитов из костного мозга в циркуляцию одним из лимитирующих факторов является деформабильность ретикулоцитов. Ретикулоциты, ранней степени зрелости в которых не завершены процессы формирования белкового цитоскелета и не обладающие достаточной деформацией, не смогут пройти через поры в стенке синусоидного капилляра. Вероятно, можно говорить о существовании своего рода механического фильтра, осуществляющего отбор ретикулоцитов, поступающих в циркулирующую кровь, по их способности к деформации. Не исключено, что имеется возможность изменения порога срабатывания этого фильтра, что позволяет регулировать интенсивность потока ретикулоцитов из костного мозга в кровь.

При достижении порами наибольшего размера (это будет определяться величиной наименьшего кровенаполнения капилляров, так как чем

меньше кровенаполнение, тем больше диаметр пор) через стенки синусо-идных капилляров костного мозга смогут проходить ретикулоциты ранней степени зрелости, имеющие низкую деформабильность.

Выдвигаемое нами предположение о том, что деформабильность ре-титикулоцитов является фактором, лимитирующим их выход из костного мозга в кровь, безусловно требовало экспериментальной проверки. С этой целью в нашей лаборатории было выполнено несколько серий экспериментов. При их планировании мы исходили из следующих соображений:

1. Если каким-то образом модифицировать механические свойства мембран ретикулоцитов, следствием чего будет снижение их деформабильно-сти, то при правильности нашего предположения, это будет препятствовать выходу ретикулоцитов из костного мозга в кровь.

2. Ретикулоциты, поступающие из костного мозга в кровоток в условиях нормального кроветворения, представлены в основном ретикулоцитамл IV, и, в меньшей степени, III степени зрелости /P.A. Дымшиц, Ю.М. Захаров, 1966/. Выход в циркулирующую кровь ретикулоцитов ранней степени зрелости (0, 1 и 2 классов зрелости) возможен в экстремальных ситуациях (например, после острой кровопотери). В случае истинности нашей гипотезы они должны иметь низкую деформабильность в отличии от ретикулоцитов, поступающих в циркуляцию в условиях нормального эри-тропоэза.

Исходя из этих предпосылок, одной из задач настоящего исследования являлось изучение деформабильности эритроцитов молодой и старой популяций в условиях стимулированного эритропоэза после острой кровопотери.

Увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови после острой кровопотери, обусловленное их выходом из костного мозга, или так называемый распределительный ретикулоцитоз, наблюдается уже через 4-6 часов после острой кровопотери. В циркуляцию поступают ретикулоциты 0, 1, 2 степени зрелости, которые при нормальном эритропоэзе завершают процесс созревания в костном мозге. Действительно, через четыре часа после острой кровопотери мы выявили достоверные изменения в ретикулоцитарной формуле - увеличение относительного количества менее зрелых форм ретикулоцитов (табл. 3).

Особо значимы результаты выполненных нами экспериментов по исследованию деформабильности молодых эритроцитов, выделенных из крови крыс через четыре часа после острой кровопотери. Нами было выявлено, что эти клетки имели достоверно более низкую деформа-бильность в отличие от молодых эритроцитов, полученных из крови ин-тактных крыс (рис. 10, 13). На наш взгляд это было обусловлено качественным изменением пула молодых эритроцитов вследствие появления в крови после кровопотери незрелых ретикулоцитов. При сравнении распределения ретикулоцитов по степени зрелости в клетках верхнего слоя после кровопотери, в отличие от интактных крыс, наблюдалось более высокое количество ретикулоцитов ранней степени зрелости, содержащих большое количество рибосомальных гранул (табл. 3). Наблюдалась достоверная отрицательная корреляция между величиной индекса деформабильности молодых эритроцитов через четыре часа после острой кровопотери и содержанием в исследуемом образце клеток ретикулоцитов первого и второго класса зрелости (рис 14).

А-В

Рис. 13. Профили осмотической деформабильности для "молодой" популяции эритроцитов; 1 - интактные крысы; 2- спустя четыре часа после острой кровопотери (фиксированное усилие сдвига т=30 Н/м2, Т1=18,64х10"3 Па-с, Т=310°К). Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п=10).

В эритроцитах молодой популяции, выделенных из крови спустя четыре часа после острой кровопотери, нами было выявлено наличие молекул спектрина, не связанных с мембраной, что свидетельствовало о том, что в циркуляции появились клетки, в которых не завершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета (рис 15).

ш

0.5

0.46 0.42 0.38 0.34 0.3 0.26

10

14

\ , N. 22 26 30

(ьш + т2), %

Рис. 14. Наличие отрицательной корреляции между величиной индекса деформабильности эритроцитов и относительным содержанием в пробе ретикулоцитов 1 и 2 классов зрелости (г= - 0.98; Р < 0.05; п=10).

Таблица 3.

Относительное распределение ретикулоцитов по степени зрелости сре-

Сроки исследования 1 класс 2 класс 3 класс 4 класс

До кровопотери 3.31±0.82 5.58+0.84 7.65±0.76 83.44±4.36

Через 4 часа после кровопотери »5.30+0.64 *8.51+0.83 *12.01+0.93 *74.16±3.29

* Р < 0,05 в сравнении с распределением до кровопотери.

Рис. 15. Электрофорез белков эритроцитов в полиакриламидном геле (А) с последующим блоттинг переносом на нитроцеллюлозную мембрану (В). А - 1, 2, 5- белки цитоскелета, несолюбилизированные Тритоном Х-100; 3, 4, 6 - белки эритроцитов, растворимые в буфере с Тритоном Х-100; 1, 3-белки эритроцитов, нефракционированных на популяцию молодых и старых, из крови интактных крыс; 2, 4- белки эритроцитов молодой популяции из крови интактных крыс; 5, 6 - белки эритроцитов молодой популяции, выделенные из крови крыс через четыре часа после острой кровопо-тери. Окраска полиакриламидных телей кумасси ярко синим К.-250. В. -иммуноблотинг белков на нитроцеллюлозной мембране. Номера блотов соответствуют номерам гелей (А). После завершения блотинг переноса нит-роцеллюлозные мембраны инкубировали в буфере, содержащем кроличьи антитела к спектрину из эритроцитов крыс (3 % бычий сывороточный альбумин; 20 мМ Трис; 500 мМ ИаС1; концентрация антител 0,1 мг/мл; рН 7,4). Для выявления молекул кроличьих антител, специфически связавшихся с нитроцеллюлозной мембраной в местах локализации молекул спектрина, использовали стафилококковый протеин А, коньюгированный с пероксидазой хрена

Таким образом, выявленная в наших экспериментах низкая способность к деформации молодых эритроцитов, выделенных из крови крыс через четыре часа после острой кровопотери, в сравнении с де-формабильностью молодых эритроцитов, выделенных из крови нормальных животных, была обусловлена появлением в циркуляторном русле незрелых ретикулоцитов.

Изменение количества эритроцитов в крови "dN" за некоторый дифференциально малый промежуток времени dt определяется их количеством, поступившим за это время в кровь из костного мозга pt (интенсивность эритропоэза), и убылью эритроцитов из циркуляции gt (интенсивность гемолиза) - dN/dt = pt - gt. Это уравнение впервые использовал Ponder /1944/ для математического описания условий эрит-роцитарного баланса.

Используя аналогичный подход опишем условия баланса количества ретикулоцитов в кроветворной ткани костного мозга. Изменения количества ретикулоцитов костного мозга "dN^" за интервал времени dt, определяются как интенсивностью их продукции (Ret)p, так и интенсивностью- выхода в кровь (Ret)e - dNj^/dt = {Ret)p - (Ret)e.

В условиях нормального эритропоэза при наличии нулевого эритроцитарного баланса (dN/dt=0, pt=gt) скорость продукции ретикулоцитов кроветворной тканью является величиной постоянной d(Ret)p/dt=0, количественно компенсирующей убыль ретикулоцитов из костного мозга в кровь. В результате количество ретикулоцитов костного мозга остается постоянным: dNn/dt=0.

Для этих условий количество ретикулоцитов dN^, поступающих в кровь из костного мозга за время dt, будет пропорционально длительности этого интервала времени и исходному количеству ретикулоцитов костного мозга: dN^ = kNpdt. Из этого простого дифференциального уравнения первого порядка следует, что в условиях нормального эритропоэза при наличии эритроцитарного равновесия скорость поступления ретикулоцитов из костного мозга в кровь пропорциональна величине константы выхода к и их количеству в костном мозге Nr в данный момент времени. Очевидно, что изменения величины константы выхода ретикулоцитов к могут привести к нарушению эритроцитарного баланса и при отсутствии изменений интенсивности эритропоэза или интенсивности гемолиза эритроцитов.

Вероятно, можно предполагать, что величина константы выхода ретикулоцитов к зависит как от их способности проникать через поры синусоидных капилляров костного мозга, так и от размеров пор. Допустим, что в условиях нормального эритропоэза максимальный диаметр

пор в стенках венозных синусов костного мозга является величиной относительно постоянной и значительно меньшей в сравнении с размерами эритроцитов. Тогда в этом случае фактором, определяющим величину константы выхода ретикулоцитов к из костного мозга в кровь, будет являться их деформабильность.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ре-тикулоциты ранней степени зрелости (1 и 2 класса), в которых незавершен процесс формирования функционально полноценной структуры белкового цитоскелета, обладают низкой способностью к деформации. Соответственно, константа выхода к для незрелых ретикулоцитов имеет небольшую величину и в результате скорость их поступления из костного мозга в кровь близка к нулю. Действительно, в условиях нормального эритропоэза в циркулирующей крови имеется незначительное количество ретикулоцитов 1 и 2 классов. Очевидно, что от скорости формирования в ретикулоцитах полноценной структуры белкового цитоскелета зависит их время пребывания в костном мозге, и в конечном итоге, это определяет интенсивность эритропоэза. Критически анализируя обоснованность этого предположения следует обратить внимание на то, что один из методов оценки интенсивности эритропоэза основан на определении скорости созревания ретикулоцитов in vitro /E.H. Мосяги-на и соав., 1976/. При этом подходе - о степени зрелости ретикулоцитов судят по количественному содержанию в их цитоплазме органелл, но не учитывают степень завершенности формирования белкового цитоскелета мембран ретикулоцитов.

Для экспериментальной проверки состоятельности основных положений нашей рабочей гипотезы весьма значимы были исследования, в процессе которых мы модифицировали механические свойства мембран эритроидных клеток. С этой целью мы использовали антитела к молекулам спектрина. Доставка антител на цитоплазматическую поверхность мембран клеток обеспечивалась с помощью липосомного транспорта. Вначале требовалось решить задачу по нахождению того количества антител к спектрину, вводимых крысам, которое бы обеспечивало эффективную блокаду белкового цитоскелета. Для выявления наличия блокады белко-

вого цитоскелета антителами к спектрину требовался объективный количественный критерий.

Одной из основных функций белкового цитоскелета эритроцитов является обеспечение их способности к упругой деформации. Нарушения нормального функционирования белкового цитоскелета приводят к снижению деформабильности эритроцитов. Таким образом, эктацитометриче-ский индекс деформабильности эритроцитов можно было использовать как объективный количественный критерий для оценки эффективности блокады белкового цитоскелета эритроидных клеток антителами к спектрину.

После внутрибрюшинного введения крысам липосом, загруженных антителами к спектрину, мы провели исследования деформабильности эритроцитов с помощью эктацитометра через различные интервалы времени от момента введения липосом. В том случае, если количество вводимых антител составляло не менее 1,5 мг на кг массы крыс, через тридцать минут после внутрибрюшинной инъекции препарата липосом наблюдалось снижение индекса деформабильности эритроцитов, которое нарастало с увеличением количества вводимых антител. Через четыре часа с момента введения крысам липосом, загруженных антителами к спектрину, эритроциты имели наименьшую деформабильность (рис.16). Таким образом, результаты этих экспериментов свидетельствовали о том, что минимальная доза кроличьих антител к спектрину из эритроцитов, которая при внут-рибрюшинном введении обеспечивала эффективную блокаду цитоскелета эритроцитов, составляла 1,5 мг белка антител на 1 кг массы крысы.

Требовалось также объективно подтвердить включение антител к спектрину в цитоплазму эритроидных клеток костного мозга крыс. С этой целью через шесть часов после ведения антител крыс забивали и готовили мазки - отпечатки костного мозга из бедренных костей. Для выявления включения в цитоплазму клеток костного мозга кроличьих антител к спектрину из эритроцитов крыс обрабатывали мазки костного мозга ослиными антителами к кроличьим иммуноглобулинам. Ослиные антитела имели флуоресцентную метку, они были коньюгированы с флуоресцеин изотиоцианатом. Затем препараты костного мозга крыс исследовали под люминесцентным микроскопом. В эритробластах различной степени зре-

лости через шесть часов после введения крысам препарата антител к спектрину наблюдалось люминесценция цитоплазмы (рис 17). Это свидетельствовало о наличии в цитоплазме эритробластов кроличьих антител к спектрину.

Рис. 16. Зависимость индекса деформабильности эритроцитов Б1 от напряжения сдвига х через 240 мин после введения антител к спектрину. К-контроль; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 для эритроцитов крыс, которым вводили антитела к спектрину в дозе 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 1.8, 2.0 и 2.5 мг на кг массы соответственно. Точки на графике соответствуют среднему значению для выборки из десяти животных (п=10).

Рис. 17. Флуоресценция цитоплазмы эритробластов костного мозга крыс, выделенного через шесть часов после внутрибрюшинного введения липо-сом, загруженных кроличьими антителами к спектрину , в дозе 1.5 мг на кг массы. Препараты костного мозга были обработаны ослиной антисывороткой к кроличьим иммуноглобулинам, коньюгированной с флюорес-цин изотиоцианатом(хЭО).

В одной из серий экспериментов нами было проведено изучение изменений в системе красной крови, обусловленных специфической блокадой белкового цитоскелета эритроидных клеток с помощью антител к спектрину.

Введение крысам антител к спектрину в течение десяти дней приводило к развитию гиперхромной анемии в начальные сроки эксперимента (до четвертого дня), а при более длительном введении антител анемия приобретала выраженный гипохромный характер. Грис.18. табл. 4)

380000 340000 300000 260000 220000 180000 140000 100000 60000

©

80

70

60

50

40

30

20

©

г .1 х"!...........

т

га

©¿.Да-г

5800000

'сЬ.

1231234 56789 10

Исход Введение антител

^уС атЭМ. Эеу. О ±ЗМ.Егг. • Меап уЛ ±зи. оет. ±ВЫ. Егг Меап

.^П! ±8М. й

^-МЩ Е а Меап

Дни опыта

Рис. 18. Изменения количества эритроцитов и ретикулоцитов в периферической крови крыс, обусловленные введением антител к спектрину. 1-эритроциты млн/мкл; 2- ретикулоциты %>', 3 - ретикулоциты тыс./мкл; I начало введения антител

Достоверное снижение относительного и абсолютного количества ре-тикулоцитов в периферической крови крыс после введения антител к спектрину, а также преобладание в составе ретикулоцитарной формулы клеток 3 и 4 класса, наряду с отсутствием ретикулоцитов 1 и 2 класса, свидетельствовало об ограничении выхода последних из костного мозга (табл. 5). Действительно, это вполне могло иметь место, поскольку снижение деформабильности ретикулоцитов, обусловленное специфической блокадой белкового цитоскелета, препятствовало их прохождению через поры в стенках синусоидных капилляров костного мозга, что являлось одной из причин увеличения количества ретикулоцитов костного мозга в первые четыре дня введения антител (рис. 19). Уменьшение содержания ретикулоцитов среди клеток костного мозга после четырех дней введения антител к спектрину могло являться следствием торможения процессов созревания эритробластов. Об этом свидетельствовало уменьшение величины индекса созревания эритроидных клеток костного мозга (рис 20).

68.2%

80.4%

*

91.6%

с

Рис. 19. Изменения относительного количества ретикулоцитов в костном мозге крыс в зависимости от длительности введения антител к спектрину. *Р < 0,05 относительно исходного уровня.

Таблица 4.

Изменения количества гемоглобина в единице объема крови, содержания гемоглобина в эритроцитах, площади

Сроки и Гемоглобин Количество гемоглобина в Площадь поверхности

сследования [гр/л] одном эритроците[х10 -12 гр] эритроцита (мкм2)

М ± т М ± т М ± ш

п=7 опыт контроль опыт контроль опыт контроль

До введения 162.70 0.72 164.51 0.50 30.86 0.51 31.21 0.53 86.46 4.29 81.71 5.04

антител

Введение

антител:

1 день "158.61 0.62 162.45 0.89 31.89 0.37 31.56 0.33 73.02 2.64 79.21 3.72

2 день '154.87 1.11 160.78 1.34 '32.34 0.36 31.03 0.46 '68.90 1.66 82.22 2.02

3 день '152.54 1.49 165.90 1.01 '32.65 0.48 31.88 0.38 "68.13 1.19 78.71 2.97

4 день "139.85 0.42 163.23 0.98 31.35 0.49 31.45 0.41 73.68 1.62 80.96 4.52

5 день '127.98 0.54 168.34 1.50 29.95 0.30 32.24 0.48 "66.08 1.82 83.74 2.30

6 день "120.06 0.82 165.76 1.80 '28.95 0.78 32.10 0.35 "67.64 1.74 81.71 1.77

7 день '115.54 0.91 162.78 1.56 29.36 0.71 31.55 0.43 "67.38 1.29 87.36 2.61

8 день '103.27 1.39 167.56 1.09 '27.30 0.70 32.29 0.29 "67.42 1.28 86.06 1.81

9 день '101.10 1.61 162.80 0.98 '27.94 0.85 31.31 0.35 '67.01 0.99 86.58 2.34

10 день '97.62 0.99 166.78 1.01 '27.45 0,73 31.89 0.24 "70.23 1.43 80.96 1.76

*Р < 0.05 относительно контроля

Контрольной группе животных вводили липосомы, загруженные неспецпфическимп кроличьими

иммуноглобулинами .

Таблица 5.

Относительное распределение ретикулоцитов периферической крови по степени зрелости в зависимости от длительности введения крысам антител к спектрину ( п = 10).

Сроки исследовани я

1 класс %, М ± т ОПЫТ контроль

2 класс %, М + гп опыт контроль

3 класс %, М ± ш опыт контроль

4 класс %, М ± ш опыт контроль

до введения антител

5.20 0.68 5.00 0.48

6.49 0.46 6.89 0.32

9.63 0.46 10.01 0.12 78.70 1.19 78.10 0.98

Введение антител:

1 день "2.87 0.59 5.30 0.34 5.01 0.42 5.98 0.76 10.44 0.43 9.67 0.34

2 день *2.27 0.14 5.62 0.56 "3.99 0.27 5.02 0.12 *8.82 0.15 9.56 0.23

3 день *1.87 0.27 5.01 0.98 *3.76 0.24 6.09 0.75 9.16 0.43 10.00 0.90

4 день 0.00 0.00 5.98 0.45 *2.67 0.26 6.34 0.32 9.04 0.43 9.89 0.12

5 день 0.00 0.00 4.23 0.67 *2.32 0.10 5.96 0.92 9.62 0.44 11.09 0.56

6 день 0.00 0.00 4.78 0.23 0.00 0.00 6.79 0.23 *8.08 0.22 10.02 0.48

7 день 0.00 0.00 5.23 0.14 0.00 0.00 6.12 0.79 *6.83 0.62 9.78 0.23

8 день 0.00 0.00 5.87 0.45 0.00 0.00 5.45 0.56 *5.97 0.96 10.56 0.45

9 день 0.00 0.00 4.89 0.76 0.00 0.00 6.99 0.12 *5.94 1.13 9.56 0.67

10 день 0.00 0.00 4.57 0.34 0.00 0.00 6.86 0.23 *3.95 0.68 10.04 0.56

81.68 "84.92 '85.20 "88.29 "88.15 '91.92 "92.47 "94.03 "94.06 "96.05

1.04 0.32 0.51 0.46 0.38 0.22 0.65 0.96 1.13 0.68

79.05 0.45 79.80 0.23 78.90 0.12 77.79 0.77 78.72 0.65 78.41 0.12 78.87 0.89 78.12 0.32 78.56 0.07 78.53 0.39

* Р < 0.05 относительно контроля. Контрольной группе животных вводили липосомы, загруженные неспецифическими кроличьими иммуноглобулинами .

Рис. 20. Величина индекса созревания эритроидных клеток костного мозга крыс, в зависимости от длительности введения антител к спектрину. К - контроль мнтактные крысы. *Р<0.05 относительно контроля.

Таким образом, в результате специфической блокады белкового ци-тоскелета эритроидных клеток антителами к спектрину в системе красной крови возникали выраженные нарушения, которые имели сложные механизмы. Ведущую роль среди них играли нарушения процессов дифференцирования эритроидных клеток, блокада выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь и снижение деформабильности эритроцитов.

В другой серии экспериментов с использованием антител к спектрину мы исследовали особенности ответной реакции системы красной крови на острую кровопотерю на фоне блокады цитоскелета мембран эритроидных клеток.

У животных контрольной группы, которым вводили липосомы, загруженные неспецифическими иммуноглобулинами, наблюдалась характерная реакция системы красной крови на острую кровопотерю. Через четыре часа после кровопотери наблюдалось увеличение относительного количества ретикулоцитов в периферической крови, а также прирост абсолютного и относительного количества ретикулоцитов в циркулирующей крови через 72-96 часов после кровопотери и изменения в составе рети-кулоцитарной формулы - увеличение относительного количества ретикулоцитов 1 и 2 класса (рис. 21, табл. 6).

5400000

5000000

4600000

4200000

3800000

Исходно

©

I iStd.De». □ 43М.Еп • Меап

©

2 4 24 48 72 9В 120

Часы после кровопотери

Рис. 21. Изменения количества эритроцитов и ретикулоцитов в периферической крови крыс в динамике после острой кровопотери . Контрольная группа животных, которым вводили неспецифические к спектрину иммуноглобулины. 1-эритроциты млн/мкл; 2- ретикулоциты %о; 3 ретикулоциты тыс./мкл; 4- момент кровопотери. Каждая точка на графике соответствует результатам для выборки, в которой п = 10.

Таблица 6.

Изменения количества гемоглобина в единице объема крови, содержания гемоглобина в эритроцитах, площади поверхности эритроцитов после острой кровопотери на фоне введения антител к спектрину.

(п = 10)

Сроки исследования Гемоглобин [гр/л] Количество гемоглобина в одном эритроците [хЮ~12 гр] Площадь поверхности эритроцита (мкм2)

п=7 опыт М ± П1 контроль опыт М + т контроль М ± т опыт контроль

До кровопотери 163.40 1.00 162.55 1.36 30.90 0.51 30.96 0.59 87.89 3.88 87.10 3.13

Кровопотеря 2 часа *120.49 1.70 ♦121.42 1.02 30.20 1.14 29.91 0.57 ♦72.88 2.35 84.25 2.17

4 часа * 110.45 0.76 ♦116.44 1.36 29.22 1.33 28.33 1.09 *70.52 3.98 ♦94.81 1.34

24 часа ♦108.84 1.13 ♦120.65 3.92 29.82 1.18 30.09 1.67 *70.06 2.97 87.62 1.10

48 часов * 104.71 0.81 ♦121.99 2.11 29.09 1.47 30.05 1.64 *69.36 1.48 86.84 2.21

72 часа *102.06 0.81 П49.15 1.05 ♦28.35 0.78 ♦33.14 0.56 82.73 2.15 *108.00 1.85

96 часов * 101.45 1.26 ♦148.89 1.34 "27.57 1.54 31.02 0.82 88.40 2.78 ♦115.08 1.48

120 часов *97.91 1.21 163.24 1.02 *27.43 1.20 32.45 1.18 ♦75.52 1.20 ♦115.67 1.27

* Р < 0.05 относительно исходного уровня до кровопотери. Контрольной группе животных вводили лшшсомы, загруженные неспецифическими кроличьими иммуноглобулинами.

При исследовании клеточного состава костного мозга контрольной группы крыс после острой кровопотери были выявлены характерные признаки активации эритропоэза, уменьшение величины лей-ко/эритробластического отношения, увеличение индекса созревания эрит-роидных клеток (рис. 24, 25). Наблюдались изменения и качественных характеристик эритроцитов - увеличение их диаметра, уменьшение индекса сферичности, увеличение содержания гемоглобина (табл. 7). Спустя 120 часов после кровопотери количество эритроцитов и гемоглобина в единице объема крови у животных контрольной группы достоверно не отличалось от исходного уровня.

У животных опытной группы ответная реакция на острую кровопо-терю на фоне блокады белкового цитоскелета эритроидных клеток антителами к спектрину имела совершенно иной характер (рис. 23, табл. 6, 7) Прежде всего, на что следует обратить особое внимание, то это отсутствие ретикулоцитарной реакции как в первые часы (4-6 часов), так и в более поздние сроки (72-96 часов) после острой кровопотери . Наряду с этим увеличивалось содержание ретикулоцитов в костном мозге (рис. 22).

% О

115

й

й

0 ¿4 4»

120 час

О 24 48 К 96 121 час

Рис. 22. Изменения относительного количества ретикулоцитов в костном мозге после острой кровопотери. 1- опытная группа животных, которым вводили антитела к спектрину. 2- контрольная группа животных, которым вводили липосомы, загруженные неспецифическими кроличьими иммуноглобулинами. По горизонтальной оси : 0- интактные крысы; 48, 72, 96, 120 время (час) от момента острой кровопотери. *Р < 0.05 относительно интактных крыс (п=7).

Таблица 7.

Относительное распределение ретикулоцитов периферической крови по степени зрелости в динамике после острой

_кровопотери на фоне введения антител к спектрину ( п — 10). _

Сроки 1 класс 2 класс 3 класс 4 класс

исследования %, М ± ш %, М + ш %, М + Ш %, М ± Ш

_контроль ОПЫТ_контроль_ОПЫТ_контроль_ОПЫТ_контроль_опыт

ДО 3.21 0.71 3.74 0.67 5.04 0.64 4.78 0.34 7.43 0.52 7.23 0.23 83.43 0.56 84.25 0.78

кровопотери *

После кровопотери:

4 часа *5.02 0.51 2.78 0.12 7.42 0.42 3.48 0.15 8.71 0.84 8.44 0.16 78.75 0.78 85.30 0.76

24 часа 2.20 0.13 2.01 0.18 3.69 0.27 4.01 0.17 7.1 0.25 9.55 0.21 86.19 0.59 4.43 0.67

48 часов *6.35 0.21 2.15 0.10 *18.51 0.71 3.04 0.14 *12.01 0.12 *15.48 63.13 0.82 79.33 0.45

72 часа *5.84 0.31 *1.43 0.10 7.51 0.25 2.01 0.21 *15.03 0.31 *18.78 71.62 0.87 77.78 0.64

96 часов *5.62 0.21 П.47 0.10 8.21 0.14 *1.18 0.12 *16.04 0.29 *12.94 70.13 0.98 84.41 0.82

120 часов *5.01 0.31 *1.40 0.10 8.94 0.17 П.21 0.13 »18.04 0.32 14.22 0.69 68.01 0.92 83.17 0.93

*Р < 0.05 относительно исходного уровня. Контрольной группе животных вводили липосомы, загруженные

неспецифическими кроличьими иммуноглобулинами.

Рис. 23. Изменения количества эритроцитов и ретикулоцитов в периферической крови крыс в динамике после острой кровопотери . Опытная группа животных, которым вводили специфические к спектрину иммуноглобулины. 1-эритроциты млн/мкл; 2- ретикулоциты %о; 3 - ретикулоциты тыс./мкл; >1* момент кровопотери. Каждая точка на графике соответствует результатам для выборки, в которой п = 10.

Возрастание относительного количества ретикулоцитов в периферической крови обычно регистрируемое через четыре - шесть часов после острой кровопотери обусловлено выбросом костномозгового резерва ретикулоцитов вследствие увеличения размеров пор в стенках синусоидных капилляров костного мозга в результате действия гормона эритропоэтина /Chamberlain е.а., 1975; Leblond е.а., 1975/. Возрастает скорость выхода в кровь и ретикулоцитов ранней степени зрелости, имеющих низкую деформабильность. В наших опытах блокада белкового цитоскелета антителами к спектрину несомненно приводила к снижению способности ретикулоцитов к деформации, что значительно снижало их скорость выхода из костного мозга в кровь, несмотря на увеличение размеров пор в стенках синусоидных капилляров. Вследствие этого не наблюдалось увеличения относительного количества ретикулоцитов через четыре часа после острой кровопотери.

Рис. 24. Изменения величины лейко/эритробластического отношения (Л/Э).1- опытная группа животных, которым вводили антитела к спектрину. 2- контрольная группа животных, которым вводили липосомы, загруженные неспецифическими кроличьими иммуноглобулинами. По горизонтальной оси : 0- интактные крысы; 48, 72, 96, 120 время (час) от момента острой кровопотери. *Р < 0.05 относительно интактных крыс (п=7).

В ответ на острую кровопотерю у животных опытной группы в отличие от контроля не наблюдалась выраженной активации эритропоэза. Это свидетельствовало о том, что введение антител к спектрину блокиру-

ет увеличение скорости процессов пролиферации и дифференцирования эритроидных клеток, что является обязательной реакцией системы эри-трона на острую кровопотерю. Следствием этого является невозможность восстановления эритроцитарного баланса и развитие гипорегенераторной, гипохромной анемии после острой кровопотери на фоне блокады белкового цитоскелета эритроидных клеток антителами к спектрину.

Гипохромный характер эритроцитов позволяет предполагать и торможение синтеза гемоглобина эритроидными клетками при блокаде их цитоскелета, "не снимаемое" эритропоэтическим стимулом после острой кровопотери.

0.42 04 0.38 0.36 0.34 0.32 0.3 0.28 0.26 0.24

48 72 90 120 час

0.6

0.55

0.5

0 45

0.4

0.35

0.3

0.25

П?

к 48 72 96 120 час

Рис. 25. Изменения величины индекса созревания эритроидных клеток костного мозга. 1 - опытная группа животных, которым вводили антитела к спектрину. 2- контрольная группа животных, которым вводили липосомы, загруженные неспецифическими кроличьими иммуноглобулинами. По горизонтальной оси: К- интактные крысы; 48, 72, 96, 120 время (час) от момента острой кровопотери. *Р < 0.05 относительно интактных крыс (п=7).

Результаты настоящей работы позволяют говорить о том, что завершение формирования в ретикулоцитах функционально полноценной структуры белкового цитоскелета является одним из критериев их функциональной зрелости. Момент выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь определяется их деформабильностью, которая должна быть доста-

к

точной для их прохождения через поры в стенках синусоидных капилляров. Вследствие этого в условиях нормального эритропоэза из костного мозга в кровь поступают ретикулоциты, имеющие высокую способность к деформации, и напротив, незрелые ретикулоциты, обладающие низкой деформабильностью^ не могут пройти через поры стенок синусоидных капилляров костного мозга. После острой кровопотери в результате действия эритропоэтина этот механизм отбора ретикулоцитов по степени зрелости блокируется, ,что позволяет выбросить в циркуляцию костномозговой резерв ретикулоцитов и обеспечить экстренное восполнение дефицита эритроцитов в крови.

Таким образом, от скорости созревания ретикулоцитов в костном мозге зависит время завершения формирования структуры белкового ци-тоскелета и момент выхода ретикулоцитов в кровь, что, в свою очередь, определяет состояние эритроцитарного баланса. Наши опыты подтверждают, что в понятие "скорость созревания ретикулоцитов" следует включить не только эволюцию (деградацию) синтезирующих белок молекул (полисом), митохондрий (то есть исчезновение из цитоплазмы клетки гранулофиламентозных субстанций), но и завершение процесса формирования белкового цитоскелета этих клеток. При аслнхронности этих процессов расчет эритроцитарного баланса, построенный лишь на скорости исчезновения гранулофиламентозной субстанции из цитоплазмы ретикулоцитов, исследуемых in vitro, должен учитывать это обстоятельство, в противном случае, возможны ошибки в расчетах суточного поступления эритроцитов в кровь из костного мозга.

ВЫВОДЫ

1. Деформабильность ретикулоцитов является фактором, определяющим момент их выхода из костного мозга в кровь. Способность ретикулоцитов к деформации и выходу из костного мозга в циркуляторное русло крови зависит от степени завершенности формирования функционально полноценной структуры белкового цитоскелета;

2. Из предложенной нами математической модели следует, что скорость поступления ретикулоцитов из костного мозга в кровь прямо пропор-

порционально зависит от количества ретикулоцитов в костном мозге и значения константы их выхода в циркулирующую кровь. Величина константы выхода ретикулоцитов определяется их деформабильностью и размерами пор в стенках синусоидных капилляров костного мозга;

3. Изменения скорости выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь могут привести к нарушению эритроцитарного баланса при отсутствии изменений интенсивности продукции ретикулоцитов костным мозгом и интенсивности гемолиза эритроцитов;

4. Эктацитометрия является объективным методом оценки способности эритроцитов к деформации. Преимуществами разработанной нами модели эктацитометра являются быстрота исследований деформа-бильности эритроцитов и их высокая степень автоматизации.

5. Эритроциты старой популяции, выделенные из крови нормальных крыс, имеют достоверно более низкую деформабильность в сравнении с молодыми эритроцитами. Снижение деформабильности эритроцитов при старении обусловлено уменьшением отношения площадь поверхности/объем, увеличением концентрации гемоглобина в цито-золе и изменениями механических свойств материала мембраны этих клеток;

6. Через четыре часа после острой кровопотери эритроциты молодой популяции обладают достоверно более низкой деформабильностью в сравнении с молодыми эритроцитами, выделенными из крови нормальных животных. Снижение деформабильности эритроцитов молодой популяции через четыре часа после острой кровопотери обусловлено поступлением в циркуляцию из костного мозга ретикулоцитов ранней степени зрелости, в которых не завершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета;

7. В условиях напряженного эритропоэза возможна блокада механизма, который регулирует выход ретикулоцитов из костного мозга в кровь в условиях физиологического эритропоэза, селектируя их по способности к упругой деформации. Это позволяет выбросить в циркуляцию костномозговой резерв ретикулоцитов и обеспечить экстренное восполнение дефицита эритроцитов в крови;

8. Внутрибрюшинное введение крысам липосом, загруженных антителами к спектрину, позволяет обеспечить эффективную блокаду белкового ци-тоскелета в эритроидных клетках. Изменения, которые возникают в системе красной крови в результате специфической блокады белкового цитоскелета эритроидных клеток антителами к спектрину, имеют сложные механизмы. Ведущую роль среди которых играют нарушения процессов дифференцирования эритроидных клеток, блокада выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь и снижение деформабильности эритроцитов;

9. Блокада белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток антителами к спектрину препятствует включению механизмов, обеспечивающих реализацию системой красной крови компенсаторных реакций в ответ на острую кровопотерю.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Целесообразным является включение в понятие "скорость созревания ретикулоцитов" не только скорость исчезновения из цитоплазмы этих клеток грануло-филаментозной субстанции, но и интенсивность процессов формирования их белкового цитоскелета. Последнее необходимо учитывать при расчетах эритроцитарного баланса, построенного на определении скорости созревания ретикулоцитов in vitro.

2. При расчетах эритроцитарного баланса следует принимать во внимание, что фактором лимитирующим скорость поступления ретикулоцитов из костного мозга в кровь является их способность к упругой деформации.

3. Для создания экспериментальной патофизиологической модели нарушений функций белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток рекомендуется использовать метод его блокады с помощью липосом, загруженных антителами к спектрину.

4. Для объективной количественной оценки деформабильности эритроцитов рекумендуется использовать метод компьютерной эктацитометрии

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зудин B.C., Баркова Э.Н., Петров A.B., Печников Л.А., Сторожок С.А. Комплексное исследование механизмов образования эритропоэтина и его утилизации клетками-мишенями. В сб.: материалов XIII съезда всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова. Алма-Ата, -1979. - с. 236.

2. Сторожок С.А., Левен П.И. Исследование вязко-эластических свойств мембраны эритроцита методом центрифугирования. В сб.: Методы массового обследования населения В Тюменском территориально-промышленном комплексе. Тюмень. - 1984. - С..157.

3. Сторожок С.А., Соловьев C.B. Изменение способности эритроцитов к деформации после возмущающего воздействия на систему красной крови. В сб.: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Тюмень. - 1988. - с. 86.

4. Белкин A.B.., Сторожок С.А., Катюхин Л.Н. Эктацитометрия-объективный метод оценки способности эритроцитов к деформации // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. -1991 - №1 - с. 133138.

5. Сторожок С.А., Соловьев C.B. Структурные и функциональные особенности цитоскелета мембраны эритроцита // Вопросы мед. химии. - 1992 - т. 38. - №2. - с. 14-17.

6. Сторожок С.А., Санников А.Г. Уровень АТФ в эритроцитах при механических деформациях и изменении осмоляльности среды. В сб.: трудов Уральского отделения РБО "Обмен веществ в норме и патологии", Тюмень. - 1992. - с. 95.

7. Сторожок С.А., Белкин А.В., Василевский В.В., Санников А.Г. Завершенность процессов самосборки цитоскелета эритроцитов как один из критериев их функциональной зрелости. В сб.: "Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области", Тюмень. - 1993. - т. 1. - с. 50-52.

8. Сторожок С.А., Санников А.Г. Характеристика состояния цитоскелета мембраны эритроцита как критерий его функциональной зрелости. В сб.: "Актуальные проблемы фармации". Тюмень - 1994. - с. 174-175.

9. Санников А.Г., Сторожок С.А., Жмуров В.А., Сенаторов Ю.Н. Роль вязко-эластических свойств эритроцитов в патогенезе различных видов артериальных гипертензий. В сб.: "Актуальные проблемы фармации". Тюмень - 1994. - с. 194-195.

10. Sannikov A.G., Storozhok S.A., Zhmurov V.A., Senatorov Yu.N. Rôle of visco-elastic properties of erythrocytes in pathogenesis of various kinds of arterial hypertension. In.: Materiais second international scientific practical conférence. - Nadym. - 1995. - P. 85.

11. Сторожок C.A., Санников А.Г., Белкин A.B. Роль мембранного цитоскелета в обеспечении стабильности и деформабильности эритроцитов. В сб.: тез. докл. 1 Междунар. симп. "Медицина и охрана здоровья". Тюмень. - 1995. - с. 50.

12. Сторожок С.А. Завершение процессов самосборки белкового цитоскелета определяет момент выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь. В сб.: Тез. докл. II Междунар. симпоз. "Патология эритрона и метаболизма железа": Рязань. - 1995 - с. 115-116.

13. Сторожок С.А., Санников А.Г., Белкин А.В. Зависимость стабильности и деформабильности мембран эритроцитов от межмолекулярных взаимо-дествий белков цитоскелета // "Научный вестник ТГУ, серия Биология" (ISBN 5-88081-033-Х, Тюмень).. - 1996. - т. 1. - с. 8-15.

14. Сторожок С.А., Санников А.Г., Василевский В.В. О молекулярных дефектах белков мембраны эритроцита и их последствиях // "Научный вестник ТГУ, серия Биология" (ISBN 5-88081-033-Х, Тюмень).. - 1996. -т. 1. - с. 16-24.

15. Сторожок С.А., Белкин А.В. Эктацитометрическая характеристика деформабильности эритроцитов молодой и старой популяций в условиях

нормального напряженного эритропоэза // "Научный вестник ТГУ, серия Биология" (ISBN 5-88081-033-Х, Тюмень).. - 1996. - т. 1. - с. 25-33.

16. Санников А.Г., Сторожок С.А., Бродер И.А. Кальций и деформационный стресс эритроцитов. В сб.: тез. докл. 2 Междунар. симп. "Медицина и охрана здоровья". Тюмень. - 1996. - с. 103-110.

17. Белкин A.B., Сторожок С.А., Санников А.Г. Перспективы эктацитомет-рии в гематологии. В сб.: тез. докл. 2 Междунар. симп. "Медицина и охрана здоровья". Тюмень. - 1996. - с. 86.

18. Белкин A.B., Сторожок С.А., Санников А.Г Причины низкой деформа-бильности ретикулоцитов после острой кровопотери. В сб.: тез. докл. 2 Междунар. симп. "Медицина и охрана здоровья". Тюмень. - 1996. - с. 75.

19. Сторожок С.А., Санников А.Г. Молекулярные дефекты белков мембраны эритроцита // Вопросы мед. химии. - 1996 - т. 42. - №2. - с.103-110.

20. Санников А.Г., Бродер И.А., Сторожок С.А. Влияние модификации экс-трацеллюлярной среды различными концентрациями СаС12 на механические свойства мембраны и метаболизм эритроцитов //"Научный вестник ТГУ, серия Биология" (ISBN 5-88081-046-1, Тюмень). - 1997. - т. 2. - с. 36-41.

21. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. - Тюмень, Изт-во Тюм. гос. Унив. 1997. - 169 с.

Подписано к печати 23 мая 1997 г.

Заказ №277. Тираж 150. Ксерокс Тюменской медицинской академии