Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патофизиологический анализ динамики и механизмов регуляции антенатального гемопоэза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правше рукописи

Кривохюшна Людмила Владимировна

ПАТОФКЗИОЛОШЬХЖКЙ АНАЛИЗ ДИНАМИКИ И МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ АНТЕНАТАШЮГО ПШЮЭЗА

14.00.15. - патофизиология

АЗТОРБКРАТ дисс-ертадан на соискание ученой степени доктора медипинеких наук.

Челябинск. 1993

ГОУЗг'А

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Челябинского медицинского института

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор медицинских наук, профессор Г.К.ПОПОВ

ОЯЩИАЛЕНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор, академик АЕН России, А.П.ЯСТРЕБОВ;

доктор медицинских наук, профессор, член корреспондент АН России В.А.ЧЕРЕШЕВ,-

доктор медицинских наук, профессор А.Г.ГИЗАТУЛЛИН.

ВЕДЩЕЕ УЧРЕВДЕНИЕ: . V

Российский гематологический научный центр (Москва)

Защита диссертации состоится " "_ 1993г.

в_часов на заседании специализированного ученого

совета Д.084.04.01 Челябинского государственного медицинского института. 454092, г.Челябиаск, ул.Воровского, 64.

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЧМИ.. • Автореферат разослан _"_ 1993г.

Ученый секретарь

Специализированного ученого совета, доктор медицинских наук, профессор

С.Н.ТШОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА' РАБОТН

Актуальность проблемы. Изучение основных закономерностей гемопоэза в условиях норш и патологии является одной из актуальных проблем теоретической и практической гоматологин. Центральное направление в современных экспериментальных гематологических исследованиях - изучение родоначальник кроветворных клеток, включая адаптационные возможности гемопоэза при экстремальных ситуациях, регуляции пролиферации и дифференцировки предшественниц, роли ¡ликроокрртения и клеточно-клегочгаис взаимодействий в данных процессах.

Следует отметить-, что з последние годы особое внимание уделяется двум аспектам этой проблемы - исследовании клеточно-кле-точных взаимодействий и роли биологически активных соединений в процессе функционирования кроветворной ткани. Эта направления являются приоритетны?.?:!, так как обосновываю? новые концепции регуляции кроветворения, этиология л патогенеза забатгозашй крозп, определяют новую тактику, технологии лэчеш.1 гематологических заболеваний (Юикоз В.Г. и др.,1978; Чзрткоз И.Л., Гурезт O.A., . IS84; Свярнопсжгй А.И. ,1987; Чипенс ГЛ1. и др., 1937; Гргаинко 3.1!. •и др.,ISS8; Ясгрзбоэ А.П. и др.,1588; Попов Г.К. и др., 1988, IS89; Блинов М.Н. и др., 1991; Гэйл, Е^тгуряня, 19ЭХ; Тзстз, IS9I). • ' -

"На 'настоящий день фундаментальная гематология располагает достаточно обширными данными по функционирования и регуляции кроветворения в норме и патологии, по щ>еимуществу» полученными во взрослом организме. Наименее изученным разделом гематологии является период антенатального кроветворения, особенно в ембрио-нальный и ранний плодовый период развития'организма. До настоящего времени не изучены причины поэтапной емзнн мзет кроветворения, вступления кроветворной стволовой клетки на тот или иной путь дифференцировки в зависимости от территориальной принадлежности. Так в желточном мешка, в основном, реализуется только эритроидное направление, хотя потенциально присутствует предшественницу всех линий дифференцировок ( Moore , netcaif Д9?0). Спорным остается вопрос происхождения стволовых кроветворных клеток, динамики их изменения в органах гемопоэза, первичных и вторичных. По одним данным стволовые кроватвЬрнка клетка имеет .келточно-меыковов происхождение, по другим - шггрззморяскальноз

( Moore," Eekcalf ,IS70.Weisaann et al. ,1978; Chen . Bail 1979; Dieterlen - Lievre et al. ,1976; Lassila et al. 1979; uartia et al. ,1980). В тоже время еще Максимов (1912) и Заварзин (1947) указывали, что родоначальные кроветворные клетки имеют мезенхимальное происхождение и локализуется во всех экстра- и ивтраэмбрионалышх тканях развивающегося организма.

Много нерешенных проблем связано с особенностям»! антенатального эритропоэза и его регуляции. Изучение эритропоэза наиболее часто проводится с периода печеночного кроветворения, а ранние этапы интра- и экстраэмбрионального эритропоэза являются неиме-нее изученными. Данные литературы позволяют предполагать, что регуляция "раннего" эритропоэза осуществляется по принципу аутокринной и паракринной регуляции ( Hiura , wilt ,1969;

wilt,1965,1967; Cole, Paul ,1966; salvatorelli et al.,1978, 1982; seaarut ,1979).

Антенатальный гемоаоэз, как экспериментальная модель, интересен тем, что при поэтапной колонизации кроветворных органов и дифференцировав клеток-предшдственниц дсишш быть, условия,- оп-< ределяпше пути их миграции, коимитации и терминальной дифферент цировки. Для антенатального геыопоэза в условиях ограниченных компенсаторных возможностей, характерна чрезвычайно тонкая и четкая согласованность работы регуляхорвшС механизмов. И период становления гемопоэза определяет судьбу кроветворения не только детскогс, но и взрослого организма. Это диктует необходимость сравнительного исследования для раскрытия новых сторон патогенеза нарушений деятельности костного йгазгэ во взрослом организма. Изучение закономерностей регуляции гемопоэза в антенатальный период развития необходимо не только дня формирования фундаментальнее представлений, но и для изыскания новых биологически активных веществ с цельв Коррекции нарушений системы крови.

Данная работа выполнена в соответствии республиканской проблемы "Гематология взрослых и детей" (14.00), по плану научно-исследовательских работ Челябинского медицинского института (Л государственной регистрации 01860004735).

■ Цель работа; В условиях эксперимента изучить основные закономерности и механизмы регуляции ранних этапов антенатального гемопоэза, роли.микроокружения в этих процессах, провести сравнительное исследование влияния антенатальных гемопоэзрегулнруи-

_щих фзкторов на кроветворение зародыша и ксеногенного взрослого организма при нормальной к измененной функции костного мозга.

Задачи исследования:

1. Исследовать морфофункционалыше свойства кроветворных клеток в антенатальный период развития организма.

2. Исследовать динамику и характер дифференцировки кроветворных клеток-предшестверниц в органах гемопоэза и периферической крови развивающегося организма.

' 3. Исследовать некоторые гуморальные механизмы регуляции антенатального гемопоэза, в частности, выяснить роль и механизмы межклеточных и межорганных взаимодействий кроветворных органов в различные периоды развития организма.

4. Из желточного мешка выделить гуморальные гемопоэзрегули-рупщие вещества.

5. Исследовать действие выделенных гуморальных факторов на эмбриональное кроветворение на уровне кроветворных предшественниц и пула дифференцированных клеток.

6. Исследовать влияние эмбриональных и плодовых клеток ге-мопоэтических органов на кроветворные клетки-предшественницы взрослого организма при нормальной и измененной функции костного мозга.

7. Выяснить специфичность и механизм действия выделенных: из келточного мешка, гемопоэзрегулирукшх веществ на кроветворные предшественницы и дифференцированные клетки взрослого оргзшзмз в норме и измененной функции костного ыозга.

Научная новизна. Впервые выполнено комплексное исследование антенатального гемопоэза и некоторых механизмов его регуляции. Проведено сравнительное исследование влияния антенатальных гемо-•поэ^егулируюших факторов на кроветворение ксеногенного взрослого организма при различных, функциональных состояниях костного мозга. , "

Впервые покззано, что для антенатального гемопоэза характерна чрезвычайно высокая интенсивность кроветворения. Это касается ддкакижи популяшгснной смэны эритроцитов•в крови и количества кроветворных кдеток-предшзственкиц в интра- и экстраэыбриональ-. ных кроветворных органах. Появление новых популяций, эритроцитов не означает обязательную смену'маета крозетзерекзя. Зригроцднне

клетки различиях клеточных популяций отличаются по биохимическим, морфологическим, ыорфоыетрическим и антигенным критериям. Наличие общих антигенов и экспериментальная модель- их определения предполагают единый источник всех эритроидных линий. Дока-■ зано одновременное образование примитивных эритроцитов в теле эмбриона и кедточном мешке в доциркуляторный период.

Желточный мешок выполняет кроветворную функцию больший период развития куриного зародыша. В нем синтезируются три популяции эритроидных клеток, поэтапно сменяющие друг друга. В желточном мешке, практически, представлены клетки-предшественницы всех линий диффервнцировки. Но в процессе формирования гемопоэ-тической функции келточного мешка наблюдается постепенная ком-митация кроветворных предшоствекниц и проявление потенциальных спосооносгей предаэстванниц зависит от срока развития зародашз и условий культивирования.

Кроветворение в печени начинается с появления в органе макрофагов и явлений фагоцитоза предшествующей популяции эритроцитов. Печень, в отличие.от желточного мешка, сразу с начала ее кроветворной функции содержит кроветворные клетки-предшественницы всех линий дифференцировки. Сопоставление динамики клеток-предоествекниц в желточном мешке, печена к крови позволяет прийти к выводу, что источником первой и второй популяции эритроцитов в желточном меше являются его собственные родоначальныз клетки, а источником третьей популяции эритроцитов, .наиболее вероятно, является печень.

Все антенатальные кроветворные органы синтезируют гемопоэз-регулирующие факторы, оказызашие влияние на пролиферацию" и диф-ферекцировку кроветворных клеток как куриного зародышз, так и взрослых мнией. Характер синтеза веществ зависит от срока развития зародыша. Действие факторов, оказывающих влияние'на пролиферацию клеток независимо" от условий культивирования, а действие факторов влияющих на клеточную днфференцировку зависимо от этого момента. Направленность количественных изменений колоние-кластеробразовакдя костномозговыми ыононуклеараыи мышей при гуморальных воздействиях клеток антенатальных кроветворных органов не зависит от функционального состояния костномозгового кроветворения, а интенсивность и характер качественных изменений зависимы от этого фактора.

Реакция клеток ксеногешюго "взрослого костного мозга" на

действие гуморальных антенатальных факторов подобна и отлична от реакции Детального костного мозга. Из 6-суточного куриного желточного мешка выделены среднемолекулярныэ пептидные Фракции, влияющие на пролиферацию и дифференцирозку кроветворных клеток. Действие их является возрастно- и видовонеспецифичшм. Активные фракции, как правило, проявляют однонаправленное действив как у куриных зародышей, так и взрослых мышей. Все активные фракции обладают доза-зависимым действием. Для одних фракций характерно самостоятельное действие, а для других - модулирующее. Одна из фракций обладает эритропоэзстимулирунцей способностью, а другая - ингибирует выход клеток л эритроиднуа дифференцировку.

Теоретическое значение шботы. Диссертационное исследование относится к фундаментальным. Полученные результаты содержат новые сведения о становлении кроветворной функции и некоторых механизмов его регуляции, особенно а ранний период развития организма. В частности, при отсутствии систем дистантного регулирования, все гелаопоэтические органы сштвзяругг? ■ ныв гамопоэзрегулирупяие факторы разкеобразного спектра дейст--вия. Это позволяет предполагать большое значение аутокрннных и паракринных механизмов регуляции антенатального гемопоэза. Из желточного мешка выделены регулирующие гемопоэз вещества, не обладающие возрастно- и видовоспецифичным действием, что может определять их прикладное значение. Их влияние эффективно проявляется не только при нормальной функции костного мозга, но и при различных нарушениях кроветворения. Использование различных экспериментальных моделей позволило выяснить механизмы их действия и сформулировать некоторые новые дополнительные представлен^.! о закономерностях выхода клеток в терминальную дифференцировку.

Практическое значение работы. Данная работа содержит новые данные о закономерностях функционирования кроветворной ткани, что тлеет большое значение для развития теоретической гематологии. Из желточного мешка выделены биологически активные соединения, влияшие на пролиферацию и дафференцирозну кроветворных клеток, что может определять дальнейшее исследование их прик-.ладного значения. В процессе выполнения работы разработаны оригинальные приемы культивирования кроветворных клеток з дифху-

зионных микрокамерах, что послужило основанием для выпуска методических рекомендаций. Изложенные в них методические приемы могут успешно применяться в гематологических научных и практических подразделениях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 3 Всесоюзном совещании по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1978), на I и 2 Всесоюзном съезде патофизиологов (Тбилиси,1982; Кишинев,1389), на I и 2 Всесоюзных съездах гематологов и трансфузиологов (Баку,1979; Львов,1985), на пленуме Всесоюзного общества гематологов и трансфузиологов (Рязань,1978), йа конференциях патофизиологов Урала (Уфа,1977; Свердловск,1978; Уфа,1982; Челябинск,1984; Пермь,1986; Ижевск, 1939; Челябинск,1391), на 2 съезде физиологов Уральского региона (Свердловск,1990).

Публикации.' По теме диссертации опубликовано 23 работ», список которых приведен в конца автореферата.

Структура и объе^ работы.' Диссертация изложена на ?55 страницах машинописи и состоит гг гзсДвнад, обзора литературы, описания использованных методов исследований, 2 глав с.изложением собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и' списка использованной литературы. Работа иллистрирована 79 таблицами,- 14 графиками, 4 рисунками.' Библиографический указатель включает 445 работ отечественных и зарубежных авторов. Список литературы изложен на 51 страницах.

' На защиту выйосятся следующие-г яожения.

1. Дня антенатального гемопоэза, в отличие от взрослого организма, характерна чрезвычайно высокая интенсивность кроветворения. Это касается динамики популяционной смени эритроцитов в крови и кроветворных клеток-предшественниц в гемопоэтических органах-

2. Все кроветворные органы развивающегося организма способны к синтезу собственных весеств, регулирующих интенсивность пролиферации и характер дифференцировки кроветворных клеток. Характер синтеза веществ зависит от срока развития зародыша. Реакция кроветворной ткани на действие антенатальных гемопоэзрегулкруотих факторов определяется не только наличием соответствующего вещест-

ва, но и условия?.«! реализации их действия и наличием чувствительных к ним клеток.

3. Гуморальные факторы, синтезируемые клетками антенатальных кроветворных органов, способны влиять на кроветворение взрослого ксеногенного организма при нормальной и измененной функции костного мозга. Направленность количественных изменений, вызванных антенатальными гемопоззрегулирувдими веществами, не зависит от функционального состояния костного мозга, а интенсивность и характер качествзгашх изменений зависимы от этого параметра,

МАТЕРИМЫ И МЕТОЛЫ ИССЛЕДОЙШИЯ

Эксперименты выполнены на 8350 куриных зародышах породы двухлинейный Крос-89, линии Бройлер 3 и 6; 950 мышах линии СБА, 15 курах, 10 кроликах.

- Закономерности и особенности регуляции антенатального гемопоэза изучали на куриных зародышах, т.к. он является наиболее удобной моделью для исследований формирования системы крови, особенно ранних этапов этого процесса. Это касается верификации точных сроков развития, исключено влияние организма матери на гемопоэз зародыша. Можно оценивать эффект действия различных веществ непосредственно на зародил, шнуя организм матеря. Лел-точный мешок куриного эмбриона большой массы, легко доступен для исследования, что позволяет исследовать его гемопоэзрегули-рущую функцию и выделить кз него вещества этого спектра действия. При поэтапном включении различных органов в кроветворение можно достаточно эффективно изучать межклеточные и межорганные взаимоотношения. Кроме того, данные.литературы"и собственные, межвидовые эксперименты в норме и при патологии кроветворения позволят говорить о наличии общих механизмов формирования системы крови. . .

- Куры являлись донорами сыворотки - интактной и эритропоэ-тичесйи активной. .

- Кролики были донорами иммунной сыворотки для определения .антигенного спектра эритроидных клеток различных клеточных популяций.

- Сравнительные аспекты регуляции антенатального л взрослого гемопоэза, специфичность и механизм действия антенатальных гемопоэзрегулирущих факторов,-исследовались на взрослых мышах при интактном и измененном кроветворении.

Б работе были использованы следующие методы исследования.

Гематологические методы. Морфологические и морфометрические исследования осуществлялись после окраски клеток по Папп&нгейму. Подсчет количества эритроцитов и ретикулоцитов осуществлялся по. общепринятым методом в камере Горяева и суиравитальном окрашивании бриллиант-хфезиловой синыо. Гемоглобин определялся по методу Драбкина. Вычислялось среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. Скорость созревания ретикулоцитов определялась по методу Е.Н.Мосягиной (1962). Опаска на гемоглобин тотальных препаратов желточного мешка производилась по методу Кларка. Зритробластаческие островки определялись по методу Ю.М.Захарова и сотр. (1984). Определяли эндогенные колонии в селезенке.

Цитохимические исследования клеток крови. Использовали методы, изложенные в руководствах - Пирс (1962), Лецкии Б.Б.(1973), Хейхоу, Кваглине (1983). Определяли активность пероксидазы, щелочной и кислой фссфатаэы, содержание гликогена, липидов, гемоглобина .

Методы культивирования кроветворных клеток в диффузионных камерах. Для культивирования клеток использовали диффузионные камеры оригинальной конструкции, выполненные полностью из мклли-пора или полихлорвиниловой трубки, одна сторона которой срезалась и наклеивался миллипор. Обьем таких камер был 23-25 мкл. Использовали камеры трех видов - однополостнуй, двухполостную и ээлобообразнув. Диффузионные камеры помешали ин ово, на хорион-аллантоисную мембрану, в брюшную полость мышей и в костномозговую полость кролика. Срок культивирования 7 суток. Культураль-ная среда - плазменный сгусток. Далее готовили мазки, окрашивали и подсчитывали число колоний и кластеров.

Биохимические методы исследования. Еелезо в жидких■средах развивающегося зародыша определяли методом атомно-абсорбцконного спектрофотометраеского -акализа. Вид' синте зируемого гемоглобина определяли методом диск-электрофореза. Белок определяли биурето-вым методом (Кочетов Г.А.,1980) с реактивом-Бенедикта. Активность синтетазы б -АЛК и количество 'АПК определяли по методы

АОИ. et al. (1974), ' цаияегсИ. Geniels (1956) в модификации сотрудников Института гигиены труда и проф.заболеваний (1982), который принят в качестве стандарта. Из желточного мешка зыделя-ли среднемолекулярные пептидные фракции методом ионообменной и . колоночной хроматографии.

Иммунологические методы. Использовали для получения сыворотки, содержащей антитела против 5-суточного желточного ыепка. Схема иммунизации изложена в руководстве Вязова (1967,1973). Далеее в перекрестных реакциях агглютинации исследовали тождество и различие антигенного спектра эритроидных клеток различной популяционной принадлежности.

Радиометрические методы. Данные методы использовали для оценки пролиферативной активности кроветворных клеток, с помощью включения меченого тимидина, и интенсивности синтеза гемоглобина", по включению меченого во втором положении глицина.

В работе били использованы следующие г.ксперимзнталыше модели. Острая кровопотеря, сублетальное облучение, острая ба-рокамернягипоксия плюс сублетальное облучение. Для усиления деятельности эритроидного ростка у мышей вызывали гемолитическую анемию введением фенилгидразина. Действие пептидных гемопо-эзрегулируших фракций оценивали ян виво у зародышей и взрослых мышей при нормальной и измененной функции костного мозга и ин витро. В последнем случае пептидные фракции добавлялись к взвеси клеток костного мозга мышей с активированным эритропоэзом а раз. личную инкубационную среду. Клзточно-клеточные взаимодействия оценивали по колоние-, кластеробразушей способности кроветворных клеток из различных гемопоэтяческих органов.

"Данные обрабатывали с использованием критериев достоверности по Стьюдонту, применялся' одно- и двухфакторный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ . I. Патофизиологический анализ динамики и" некоторых механизмов регуляции антенатального гемопоэза

1.1. Иорфофункционалтая характеристика клеток периферической крови зародышей в динамике развития

В настоящее время признано представление, что первичным органом кроветворегая у всех амниот является желточный мешок. И антенатальный гемопоэз, независимо от вида организма, начинается с производства в желточном мешке эритрондаых клеток. Наиболее вероятно, преимущественная продукция эритроцитов обусловлена необходимостью кислородного обеспечения развиваюсегося организма, когда простая диффузия газов уне недостаточна для удовлетворения ■ потребностей растущего'организма.

Так как птицы развиваются изолированно от организма матери,

то у них наиболее рано и мощно проявляется кроветворная функция желточного мешка. Как было установлено в наших экспериментальных исследованиях первые гемоглобинсодержащие клетки появляются в желточном мешке чрезвычайно рано, на 14-18 час развития куриного эмбриона. По своей морфологии от мало похожи на типичные эрит-роидные клетки. Скорее всего,их можно отнести к мезенхимальным элементам, ¿"цитоплазме которых гемоглобин сосредоточен в виде мелких гранул. По всей вероятности, это есть "блуждающие мезен-химальные клетки", участвующие в образовании кровяных островков (Заварзин,1947).прошедшие определенный путь биохимической диффе-ренцировки. На тотальных препаратах желточного мешка на 30-34 час развития уже четко видны эритроидные клетки, сосредоточенные в виде кровяных островков. Первичное кроветворение осуществляется интраваскулярно. Подобная закономерность является общебиоло-гичсской и проявляется у млекопитающих, в том числе и у человека ( сЬеп, Ези ,1979; Ке1етеп ,1980; АЛ-ег^Ьа*:, Eзterly 1983). В наших экспериментах очаги первичного кроветворения в доциркуляторный период были обнаружены, кроме келточногр мешка, в головной области эмбриона, в зоне сердца и в формирующихся крупных сосудах.

Одновременное образование примитивных эритроцитов в доциркуляторный период в желточном мешке и теле эмбриона доказывает, что. кроветворные предшественницы одновремейно закладываются как экстра-, так и интраэмбрионально, либо мигрируют в очень ранней стадии в.^сте с продвигавшем ыезенхимальных элементов. Предшест-венници примитивной популяции эритроцитов не имеют строгой тка--новой локализации'и, скорее всего, дифференцируются согласно своей генетической программы и.менее зависимы от условий микроокружения. Подобное ограничение зависимости от условий микроок-руиения можно наблюдать во взрослом организме при развития опухолевых порайешй кроветворной ткани. Процесс интраваскулярного кроветворения отражается на картине периферической 1фови. Так, " на 48-72 час развития эмбриона высок процент клеток в митозе, число которых уменылается с возрастом. В первые 5 суток в кроля саияаегся количество, недифференцированных клеток, в основном эритроядного ряда. Исчезают клетки подобные мезенхкмальным.Кроме эритроцитов в крови присутствуют клетки подобные макрофагам, малы:,! лимфоцитам. Среди последних встречаются клетки, в которых можно, наблюдать единичные гранулы гликогена при постановке цито-

химической реакции.

Следует отметить, что для эмбрионального гемопоэза, вне зависимости от вида, характерна быстрая смена эритроидных популяций в периферической крови. Так, у куриного зародыша в первой половине развития регистрируется появление в крови трех эритроидных популяций. Первая, примитивная, единственная в крови до 5-6 суток, далее появляется вторая популяция дефинитивных эритроцитов, затем с 11-12 суток - третья группа дефинитивных эритроцитов. Соответственно этим'процессам меняется и кривая Прайс-Джонса. С II суток кривая приобретает трехгсрбую форму, особенно хорошо выраженную на 15 сутки развития. Популяционную смену эритроцитов подтверждает и динамика изменений среднего содержания гемоглобина (ССЭ) а одном эритроците. Данный показатель снижается при появлении молодых эритроцитов в крови, а именно, на 7 и II сутки. Особенно резко ССЭ падает на II сутки, которое не может быть объяснено только появлением молодых эритроцитов. Подобный феномен мог зависеть от снижения интенсивности синтеза гемоглобина. Второе предположение нашло подтверждение в литературе. Так, Fantoni et al. (1976) отметили, что у мышей мезду 12-13 днями развития синтез гемоглобина снижается на 50/2 из-за наличия инактивированных полирибосом. И этот механизм важен в плане проявления различных фенотипов гемоглобина. Следовательно, для анализов результатов важно было исследовать интенсивность синтеза гемоглобина эритроидными клетками периферической крови в динамике развития зародыша. Для оценки этого процесса мы использовали меченый во втором положении глицин, который может включаться в гем и глс-бкковун часть молекулы. А синтез или инактивация гемоглобина. в эмбриональный период развитая может начинаться с гло-биновой части молекулы ( wilt ,1965,1967). Сравнивая включение глицина в эритроидные клетки различных популяций, можно прийти к заключению, что синтез гемоглобина наиболее интенсивен в примитивных эритроцитах. Появление молодых эритроцитов в крови приводит к достоверному увеличении включения глицина на 6 сутки, но на 11-12 сутки подобной закономерности не просматривается. И только на 13 сутки включение глицина начинает достоверно возрастать. То есть, имеется противоречие между появлением молодых эритроцитов и интенсивностью синтеза гемоглобина. Этот процесс мы склонны расценивать важным в_ плане пзреклшения механизмов гуморальной регуляции дафферендароэки. эритроидных кйехок. Этап-

ность смены эритроидных популяций подтверждается эволюцией ге-моглобинов. Наш данные подтверждает положение, что смена эрит-роидных популяций приводит к. появлению гемоглобина.нового типа.

Морфологические и цитохимические критерии позволяют четко отдифференцировать примитивные эритроциты от дефинитивных. А именно, они различаются по размерам, интенсивности реакции на гемоглобин и пероксидазной активности, которая обусловлеш псев-допероксидазшми свойствами гемоглобина. Гораздо сложнее было выявить различия между дефинитивными эритроцитами 2 и 3 генерации. С этой целью мы иммунизировали кроликов 5-суточным желточным мешком куриного зародыша. Предварительно тщательно отмывали его от свободных эритроцитов. В данный период, как будет показано ниже, в нем интенсивно синтезируются дефинитивные эритроциты 2 популяции. И далее с помощью перекрестных реакций агглютинации и истощения иммунной сыворотки соответствующими эритроцитами показали, что все эритроидные клетки содержат общие антигены, а также антиген, присутствующий на эритроцитах взрослых кур. Кроме того, имеются антигенные различия между примитивными и дефинитивными эритроцитами, а также между дефинитивными эритроцитами, поступающими в кровь на 6 и II сутки. Таким образом, в крови зародышей кур £ первой половине развития наблюдается попу-ляционная смена эритроидных клеток, различающихся по морфологическим, биохимическим, антигенным критериям. Наличие общих антигенов на всех эритроидных клетках предполагает единую предшественницу для примитивных, дефинитивных и "взрослых" эритроцитов.

1.2. Динамика гемопоэза в кроветворных органах куриного зародыша

Для установления мест синтеза дефинитивных эритроцитов и порядка вступления кроветворных органов в функцию мы провели их гистологический анализ и морфологический анализ мазков-отпечатков желточного мешка, печени, селезенки,- костного мозга. Определяли .активность синтетазы -АПК .и количества -АЛК в желточном мешке, что позволяло судить об активности начальных этапов синтеза тема. На тотальных препаратах желточного мешка исследовали появление и распределение геыоглобинсодержапшх клеток со 2-х по 7-е сутки включительно. Определяли эритройластические островки в кроветворных органах.

При гь'дслениз эритройласгетескис ос~ровксв из печени нами бы-

ло установлено, что первыми кроветворными клетками в этом органе являются'макрофаги и на 7 сутки развития интенсивно выражен процесс эритрофагоцитоза примитивных эритроцитов. Типичных эрит-робластических островков в печени мы не обнаружили, но,начиная с 7,5-8 суток разлития,в печени присутствуют грубые клеточные скопления, состоящие из множества ранних эритроидных элементов и макрофагов. Количественные соотношения между этими клетками могут быть самые разнообразные. Число подобных образований на 7,5-8 сутки колеблется от 350 до 800 на всю печень. На 14-е сутки их количество резко уменьшается и перед вылуплекием в печени они не обнаруживаются. Первые очаги кроветворения на гистологических препаратах печени отчетливо видны на 9 сутки. Таким образом, кроветворение в печени начинается позже появления в крови второй популяции эритроцитов. На 10-11 сутки появляются кроветворные клетки в "селезенке, на 12-13 суткя - в костном мозге. Первыми клетками, появляющимися в органах гемопоэза являются макрофаги и эритроидные клетки. Зритрсбластических островков в селезенке мы не обнаружили, в костном мозга на 19-20 сутг.;; «оз-.но видеть образования подобные эритробластическим островкам» ко .в очень ограниченном количестве. То есть, и у птиц проявляется общебиологическая закономерность' связи эратроидннх клеток с макрофагами,.ко со своими особенностями.

"Проведенные исследования позволили прийти к заключения, что производство эритроцитов второй генерации должно осуществляться в желточном мешке. Прямым доказательством этого положения'являются эксперименты с окраской на гемоглобин тотальных препаратов желточного мешка. Действительно, на 40-45-й часы развития в желточном мешке регистрируется вторая-волна гемопоэза. В паренхиме жзлточкэго мешка экстравазально появляются бензидшшозитив-ные клетки. Процесс нарастает во времени и скопления клеток образуют мощные муфты вокруг сосудов. В 1972 году Га¿газ высказал предположение, что предшественники дефинитивной линии эритроцитов могут присутствовать в мезодерме желточного мешка, развиваясь как секвестрированная попушзш, независимая от эмбриональной циркуляция. Доказательством значительного участия желточного мешка в кроветворении являются данные по изменению в нем активности £ -АЛК-сантетазы, количества б -АЛК и содержания железа в- подзародышевой жидкости-(график I). Сопоставление этих процессов показало, что повышение активности синтетазы АПК

ГРАФИК. X. Динамика изменения б-АЛКсинтетазы и б-АЛК в желточном мешке и содержания железа ь подзародышсвой жидкости

* - различия достоверны

во всех случаях на 24 часа опережает возрастание АЛК. Содержа--ние железа в подзародниевой жидкости минимально на фоне максимальной активности синтетазы АЛК. Изменение активности синтетазы АЛК и железа на 24 часа опережает появление молодых форменных элементов в крови. Так, активность синтетазы АЛК возрастает на 5 и 10 сутки, а молодые эритроидные клетки дефинитивных популяций выходят в кровь на 6 и П-е сутки. То есть, в желточном мешке синтезируются три популяции эритроидных меток. Сохранение кроветворной функции желточного мешка при начале функционирования интраэмбриональных кроветворных органов, по всей вероятности, обеспечивает стабильность гемопоэза в условиях ограниченной адаптации и необходимую массу клеток. По мере нарастания интенсивности интраэмбрионального гемопоэза кроветворение в желточном мешке редуцируется. Следует отмстить, что для желточномешко-вого гемопоэза характерна определенная клеточная гетерогенность. В желточном мешке на самых ранних стадиях развития присутствуют макрофаги, лимфоцитоподобные элементы и недифференцированные гранулоциты.

1.3. Кроветворные клетки-предиественницы в

гемопоэтических органах куриного зародыша

Исследование представительства кроветворных клеток-предшественниц в органах гемопоэза и периферической крови показало, что их количественный и качественный состав подвержен значительным изменениям в дтатке развития организма (график 2).

В желточном мешке со 2 по 10-е сутки развития регистрируется два подъема КОЕ, КЛОЕ - на" 4 и 10-е сутки. Подъем предшественниц на 24 часа опережает нарастание активности синтеза гема. Таким образом в желточном мешке первоначально увеличивается количество кроветворных предшественниц, а затем активируются процессы терминальной дифференцировки, в частности, клеток эритроидного ряда. При сопоставлении динамики КОЕ, КЛОЕ в желточном мешке к крови интересен факт, что на 4-е сутки увеличивается их количество в желточном мешке, на 5-е сутки они достоверно возрастают в крови. Наоборот, на 9-е сутки увеличиваются в крови, а затем на 10-е сутки возрастают в желточном мешке. Таким образом, возрастание предшественниц в крови на 5 сутки■обусловлено их миграцией из желточного мешка, а увеличение на 9 сутки - миграцией из печени, в которой КОЕ,КЛОЕ на 9 сутки возрастают" более чем в 4 раза.Эти данные позволяют прийти к заключению,- что сийтез ?то-

ГРАФИК 2. Динамика колоние-кластеробразующей способное ти кроветворных клеток в гемопоэтических орга

Ш-КОБ+ЮЮЕ..

- КЛОЕ * ' различия ESCtaaspnu

gas -КОЕ

рой популяции эритроцитов в желточном мешке осуществляется из его собственных кроветворных предшественниц, а синтез третьей популяции - из предшественниц печеночного происхождения. В тоже время можно допустить, что желточный мешок использует свои собственные родоначальные клетки, и именно поэтому на 9 сутки в нем первоначально достоверно увеличиваются КОЕ, а затем на 10 сутки возрастает и КЛОЕ.

Количество предшественниц в костном мозге и селезенке изменяется к концу антенатального развития. В костном мозге КОЕ, КЛОЕ снижаются более чем в 3 раза на 19 сутки, в селезенке снижаются на 18 сутки с восстановлением их числа на 19 сутки развития.

В процессе формирования гемопоэтлческой функции желточного мешка идет постепенная коммутация клеток-предшественниц. На 2-2,5 сутки развития предшественницы из желточного мешка в диффузионных камерах ин ово дифференцируются в макрофагальные и недифференцированные колонии и кластеры. На 4 сутки развития уже образуются эритроидныз колонии и бурстн. На 6 сутки развития способность образовывать колонии эритроидного типа сохраняется, но бурсты отсутствуют. Кроме того, предшественницы аз 6-суточного желточного мешка в тех же условиях культивирования образуют гранулоцитарные колонии .и кластеры. Следует отметить, что желточный мешок и на 4 сутки содержит предшественницы гра-нулоцитарного ряда дифференцирсвки, но для проявления их потенциальных возможностей нужны специальные условия культивирования. А именно, культивирование в бршной полости мшей и ностно-.мозговой полости кролика приводило' к образованию колоний этого типа, но в "тих случаях не наблюдалось образование колоний эритроидного типа. Появление КОВ-Э и БОЕ-Э вновь отмечается в желточном мешке на 10 сутки развития. Таким образом, для появления определенных клеточных линий важна как эволюция клеток, так и наличие специальных условий микроокружания. Желточнсмешковые и печеночные КОЕ-Э и Б0Е-3 в отличав от фатальной селезенка и костного мозга не нуждаются в специальных гуморальных индукторах и условия ин ово достаточны для их дифференшровки. Родоначальные клетки из печени на 7 сутки развития пс своему потенциалу идентичны таковым из 6-суточного желточного мешка. Культивирование клеток фетальной селезенки и костного мозга показало, что предшественницы аз этих органов очень чувствительны к условиям микроокружения и для стабильности количественного и за-

чественного состава нужны гуморальные индукторы. Процесс образования колоний и кластеров становился более стабильным, когда в качестве индукторов брали клетки зародышевой печени.

1.4. Темопоэзрегулирувдая функция клеток антенатальных кроветворных органов

При поэтапном вступлении кроветворных органов в функцию и отсутствия специальных дистантных систем регуляции, антенатальный гемопоэз, особенно его ранние этапы, должен определяться механизмами аутокринной или паракринной регуляции. И все кроветворные органы должны синтезировать свои собственные коротко-ранговые гемопоэ-зрегулирувдиа факторы. Для выяснения наличия подобных механизмов мы использовали метод сокультивирования клеток из разных кроветворных источников. Культивировали клетки в специальных биполостных диффузионных микрокамврах ин ово. Клетки индукторы мы брали в концентрации в 4 раза большей, чем клетки эффекторы. Данный прием был использован вследствии того, что возможно взаимное влияние культивируемых клеток. И для того, чтобы превалировало действие клеток-индукторов, мы брали . их в большей концентрации. Для исследования использовали всю клеточную массу кроветворного, органа, т.к. неизвестно какие клетки участвуют в формировании соответствующего индукторного воздействия, возможно в этом процессе и совокупное действие разных клеток. Клетки как индукторы мы брали а начале формирования ге-мопоэти-еской функции органа, а клетки как эффекторы - когда кроветворных клеток в органе достаточное количество. Для желточного мешка и печени это был сдан срок. Клетка желточного мешка в качестве эедекторов и индукторов брали на 4-е сутки развития, начало синтеза дефинитивных эритроцитов. Клетки печени брали на 1С-е сутки развития. Клетки селезенки и костного мозга в качестве индукторов брали на 13-е сутки, а в качестве эффекторов - на 16-е сутки развития.

Проведенные исследования позволили прийти к заключению, что клетки начинающих функционировать кроветворных органов ингибнру-ют колоние-кластеробразование предшествующая кроветворных органов (рис. I). Гак, печень и селезенка интабкрута клетки желточного мешка, селезенка и костный мозг пнгибпрует клетки печени. В то-ке время, клетки печени одновременно обладали двойным действием. Они ингабировали колоше- кластеробпазозапио предшественницами из желточного мешка-и стимулировали предшественницы из

Рис. I. Взаимодействие антенатальных кроветворных органов

+ - активация • — - ингибиция 0. - нет эффекта

КОС, КЛОС - колоние-кластерообразующая способность

селезенки и костного мозга. Особая реакция на действие гемойо-ззрегулирупцих факторов, наиболее вероятно, зависима от .чувствительности клеток к воздействиям. Интересно, что клетки 4-су-точного желточного мешка, ингибируя пролиферацию клеток-предшественниц, способствовали эритроидной Дифференцировкс и прекращали образование гранулоцитарных колоний и кластеров. Преимущественный выход клегок-эффекторов в эритроидную дифференцкров-ку и ингибиция гранулоцитарной дифференцирошш может зависеть ог нескольких моментов. С одной стороны, ограшчение пролиферации клеток-предшественниц может увеличивать активность терминальной диф£оренцировки. С другой стороны, в желточном мешке могут продуцироваться одновременно эритропоэтинподобный фактор и гранулоцитарный ингибитор. Либо достаточно синтеза одного из этих веществ. Синтез эритропоэтинподобного фактора приведет к селекции клеток эритроидного ряда, а наличие ингибитора грану-лсцитов тоже создаст преимущества для синтеза клеток эритроидного ряда. Клетки печени также способствовали образованию эрит-роидных колоний предшественницами из печени и селезенки , но .одновременно .активируя пролиферацию КОЕ и КДОЕ.

Учитывая тот момент, что интенсивность пролиферации и характер дифференцировки определяются не только синтезом соответствующих веществ, но и наличием чувствительных к ним клеток, >ш взяли более стабильную систему - мононуклеары, выделенные из костного мозга взрослых мышей. Более того, мы ставили задачу выяснения возможности действия зародышевых гуморальных факторов на ксено-генные кроветворные клетки взрослых особей. Это определяло и прикладное значение исследований. Донорами мононуклеаров были интакгные ыыш, а также со стимулированным фенилгидразином эрит-ропоэзом. В последнем случае мы старались приблизить гемопоэз взрослого организма к антенатальному, при котором функция любого кроветворного органа начинается с производства эритроидных клеток. Кроме того, учитывая значение микроокружения, мы культивировали клеточные системы в . двух условиях, ин ово и в бршной полости сингенных мышей.

Первое, что обращает внимание, это количественная независимость колонне- кластеробразования от функционального состояния костного мозга. "Интактннй" и "активированный" костный мозг ин ово и в бршной полости образовывали одинаковое число колоний и кластеров. Но процессы колонне- кластеробразование были зависимы от условий зультавжровашш. Условия ин ово способствовали возрас-

.танию числа больших колоний по сравнению с культивированием в бршной полости. Это и определило преимущественное использова-Ш!е условий ин ово. Лишь в отдельных случаях для подтверждения полученных данных мы использовали культивирование в брюшной полости мышей.

Исследование влияния меток желточного мешка на колоние-кластеробразующую способность (КОС, КЛОС) костномозгошх моно-нуклеаров позволило сделать вывод, что в желточном мешке в динамике развития продуцируются различные гуморальные видовонес-псг.нфическис гемопоэзрегулиругощие факторы. На 2 и А сутки в нем синтезируются ингибиторы КОС, КЛОС (рис. 2 ). Клетки 2-суточно-го желточного мешка ингибируют образование всех типов колоний, кроме макрофагалышх. Клетки 4-суточного желточного мошка синтезируют эритролозтинподобный фактор, но по-прежнему ингибируют образование гранулоцитарных колоний и кластеров. Подобный эффект вполне объясним, т.к. в это время в желточном мешке идет популяциошшя смена эритроцитов и основные клеточные элементы -эритроциты и макрофаги. Поэтому короткоранговие механизмы должны способствовать синтезу клеток эритрокдной линии и ограничивать дофферепцировку остальных направлений. Одновременное сочетание синтеза ингибитора пролиферации КОЕ, КТОЕ и эритропоэтин-подобного фактора должно способствовать оптимальному выходу, меток в терминальную диффереяцировцу. Клетки 6-суточного желтбч-ного мешка стимулируют КОС, КЛОС, способствуют образованию эрит-роидшлс колоний и не препятствуют дафференцировке клеток по гра-нулоцитарному ряду. Следует отметить, что способность к образованию эритроидных колоний проявляется только при культивировании ин ово. !.£1кроокружение брюшной полости, даже при паличии индуктора эритроидной дифференцировки, не позв.оляет клеткам выйти в этот процесс.

Подобная динамика измеиений синтеза короткорангових регуляторов в желточном мешке является вполне закономерной. Со 2-х по 4-е сутки в желточндм мешке начинается синтез дефинитивных эритроцитов и процессы регуляции должны способствовать их накоплению. Лалее, когда на 6 сутки в желточном мешке наблюдается интенсивное производство дефинитивных эритроцитов, когда в ней появляются предшественницы гранулоцитарной линии дифференцировки и, по данным литературы, он становится местом образования, гранул'оци-тов ( згепЪегв ,1975) изменяется и синтез гемопоэзрогулдрув-щях веществ.

Рис. 2.

Влияние клеток желточного мешка не колонне-кластерообразующуто способность клеток костного мозга мышей.

Культивирование {novo

интактный костный мозг

нгибиция

муляция кос, клос

2 сут желточный мешок

4 сут желточный мешок

6 сут желточный мешок

Культивирование в брюшной полости

I

8

КОС - колониеобразукицая способность КЛОС - кластеробразующая способность

Мононуклеары как "интактного? так и "активированного" костного мозга дают однотипную реакцию в ответ на действие клеток желточного мешка, но интенсивность реакции зависит от функционального состояния костного мозга. Мононуклеары от мышей с активированным эритропоэзом сильнее реагируют на гуморальные факторы желточного мешка. Эффект воздействия желточного мешка на количественные параметры КОС, КЕ0С независим от условий и сохраняется при культивировании клеточных систем в брюшной полости мышей.

Клетки всех остальных органов гемопоэза при их сокультивировали с костномозговыми мононуклеарами ингибировали КОС и КЛОС (рис. 3 ). ЗДфект был выражен на"интактномпи "активированном" костном мозге. Следует отметить, что реакция "взрослого" костного мозга была отличной от фетального костного мозга. Так, фетальная печень и селезенка активировали КОС, КЛОС клеток фетального костного мозга. Одинаковой и независимой от вида и возраста была реакция кроветворных клеток на эритропоэтинподоб-ный фактор. Так, клетки "взрослого" и "фетального" костного мозга образовывали эритроидные колонии при их сокультивировании с . клетками печени и селезенки. Более чувствительны к подобным воздействиям были мононуклеары от мышей с активированным эритропоэзом. . ■

•Таким образом для антенатального гемопоэза характерна весьма сложная система регуляторных взаимоотношений. Результат этих взаимоотношений зависим не только от синтеза соответствующих регулирующих факторов, но и от наличия чувствительных к ним клеток и условий реализации их действия. Сочетание синтеза в одном кроветворном органе стимуляторов и ингибиторов КОС, КЛОС, а также npoii3Lодство веществ, влияниях на определенные дифференци-ровки кроветворных клеток, определяют динамику и последовательность включения в функцию кроветворных органов, способствуют на-коплегспэ в органе клеток-предшественниц и определяют их выход в нужную на дашшл момент развития дифференцировяу.

1.5. Некоторые аспекты регуляции пролиферации и дифЬеренцирозка кроветворных клеток в антенатальный период развития организма .

Антенатальный эритропоэз имеет свою специфику речктагя на эрнтропоэтин. Мы ужа указывали, что образование эржгропдных колоний и бурст предшественницами из желточного мешка а печени не

Рис. 3.

Влияние клеток антенатальных кроветворных органов на колоние-кластерообразуюшуо способность клеток костного мозга мышей.

КОС - колониеобразующая способность КЛОС • кластеробразующая способность КОЛМ - колонии малые Культивирование in ovo .

требует экзогенного эритропоэтина и условия ин ово достаточны •для дифференцировки. Предшественницы из селезенки и костного глозга для образовагащ эритроидних колоний ужо нуждаются в соответствующих индукторах.

Мы выяснили, что эритроидные клртки зародыша в процессе его развития проявляют разную чувствительность к эритропоэтлну. Этот вывод основывался на следующих экспериментах, для оценки чувствительности мы использовали экзогенный эритропоэтин С, который добавляли к зригроидаым клеткам крови. Ответную реакцию оценивали по изменению интенсивности включения меченого во втором положении глицина в эритроидные элементы. Результаты показали, что только эритроидные клетки от И-12-суточного зародыша отвечают усилением усвоения глицина под влиявшем экзогенного эритропоэтина. Таким образом, чувствительными к эритропоэтину оказались эритроциты третьей популяции. Следует отметить, что в этот временной период для них характерно низкое содсркаше гемоглобина и слабый синтез гемоглобина. Эритроидные клетки-до II суток и после 12 суток вообщо не чувствительны к эритропоэтину. Нечувствительность к оритропоэтину до II суток макет определяться тем, что в это время в крови циркулируют эритроциты, имевшие желточномешковое происхождение. А эритроидные клетки из интраэмбриональных источников уже зависимы от действия эритропоэтина. И, вполне вероятно,что 11-12 сутки важны в плане переключения механизмов регуляции эритропоэза. Далее эритроидные клетки вновь теряют чувствительность к эритропоэтину. Это можно объяснить тем, что в крови, на 13-16 сутки присутствуют достаточно зрелые клетки, либо синтез гема в них максимален и не может быть усилен эрятропоэтином.

Таким образом,, результаты исследований показывают, что ранние этапы кроветворения развивающегося организма регулируются иными отличными от взрослого организма механизмами.

Процесс детерминации и дифференцировки клеток в эмбриональный период развития определяется мор^ргенетмческими тканевыми взаимодействиями. Это короткодисТантнне взаимодействия, -включап-сие прямые контакты или взаимодействия молекул во внеклеточном матриксе (Михайлов, 1984 Д988; Чипенс и др. ,1987). Отсюда вполне вероятно, что среднеиолекулярные пептидные соедансгагя могут иметь большое значение при данных взаимодействиях. Они могут являться своеобразными "морфогенами". Поэтому мы попытались из

желточного мешка на 6 сутки развития выделить средне моле куляр-ные пептидные соединения и исследовать механизм их действия.

Ионообменная и гольхроматография на сефадексе 6-15 позволили выделить шесть срвднемолекулярных пептидных фракций из желточного мешка. Далее мы исследовали действие пептидных фракций на пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток. Пептидные фракции 1,3,4,5 в дозе 12 мкг белка на I мл культуралыюй среды шсгибировали пролиферацию кроветворных клеток. Выраженным ингибирукхцим действием обладала фракция 3, тормозящая образование малых колоний и кластеров клетками из 2,5-суточного желточного мешка. Фракции 1,4,5 снижали образование малых колоний, не влияя на образование кластеров (график 3 ). Таким образом, уровень воздействия фракций 3,4,5 - клетка-предшественница с ограниченной пролиферативной активностью.

Пептидные фракции определенным образом влияли на начальные этапы синтеза гема ин виво и ин витро. Действующая суммарная доза была 20 мкг белка при введении в инкубируемое яйцо, фракции вводили дважды на 4,5 сутки инкубации. Действие фракций было различно (график 3 ). Фракция I ингибировала активность синтета-зы С'-АЛК в желточном мешке и тем самым приводила к снижению С'-АЛК. Фракция 2 ингибировала не только синтетазу АЛК, но и последующие этапн синтеза гема, т.к. количество АЛК возрастало. Фракция 3, не влияя на активность синтетазы АЛК, приводила к повышению АЛК, вероятнее всего через икгибицию последующих этапов синтеза гема. Ее ингибиторный эффект относительно синтетазы АЛК не проявлялся и ин витро в различных концентрациях. Для фракции 2 ингибиторный эффект был подтвержден ин витро. Фракция 5 ингибировала активность синтетазы АЛК только ин витро, ин виво данный эффект отсутствовал. Фракция 4 активировала синтетазу АЛК и способствовала увеличению АПК в желточном мешке. Итак, фракция I лнгибирует, а фракция 4 активирует эритроидную дифференцировку. Фракции 2 и 3 проявляют ингибиторный эффект, но их действие можно рассматривать- с двух позиций. Вполне справедливо, что снижение активности определенных этапов синтеза гема может быть причиной' задержки созревания зритроидных клеток и уменьшения их количества. С другой стороны, накопление АЛК в клетке мозет являться -своеобразным синхронизатором выхода клеток в дифференцировку и как результат - одномоментное увеличение популяций эритроцитов.

ГРАФИК 3. Влияние пептидных фракций из желточного мешка

8,

8 «

3

0

1

о

5

а

Э"

на колоние-класгерообразование кроветворными клетками желточного мешка

-большие колонии

- малые колонии

- кластеры

- колонии + кластеры

я

< .60-а.

59

I 40'

»5 30-V 2.

Ц« 20

10 о

на активность б-АЛК синтетазы и количество б-АЛК в желточном мешке

б-АЛК сиктетаза

" :Л - б-АЛК

де-

кокт роль фр-1 ■ фр. 2 фр. 3 фр. 4 фр. 5

* - различия достоверны

2. Механизм влияния антенатальных регуляторов гемопоэза на кроветворение ксеногенного взрослого организма

2,1,- Влияние среднемолекулярных пептидных фракций, выделенных из 6-суточного желточного машка, на гемопозз взрослого интактного организма

Следующий этап исследований заключался в выяснении возможности влияния пептидных фракций из желточного мошка на кроветворение ксеногенного взрослого организма в норме и патологии, их видовой, возрастной специфичности, а тагосе механизма и уровня воздействия..

В первой серш: экспериментов пептидные фракции вводили дважды литактнш мышам линии СБА. а суммарной дозе 50 мет белка на мышь. Результаты оценивали по изменению числа ретикулоцитов в крови на 4-сутки после первого введения. Было получено, что фракции 2,3,5 приводили к увеличению, а фракция 4 к сниже1шю числа -ретикулоцитов в крови (график 4 ). Полученный эффект мог быть следствием изменения функции костного мозга, либо скорости созревания ретикулоцитов. Проверка последнего предположения показала,- что фракция 4 увеличивает, а фракция 5 снижает скорость созревания ретикулоцитов. Подобный эффект действия этих фракций отмечен и на эмбриональном гемопоэзе. Так, фракция 4 ускоряла первые этапы синтеза гема, а фракция 5 ингабнровйла синтетазу АПК,-правда,в условиях ия внтро. Механизм воздействия фракций 2 к 3 должен быть иной, т.к. они не влияют 1ю скорость созревания ретикулоцитов. Мы уже указывала, что результат действия фракций у э(..Лриона - накопление АЛК и,что данный механизм можно рассматривать как 'синхронизирующий выход глоток в дифферешзтров-ку. Вполне вероятно, данная закономерность проявляется и во взрослом организме..Возрастание числа ретикулоцитов в кревн мы-есй есть последействие фракций, приводшцее к одномоментному, ■ массивному выходу клеток в эритроидную дифференцировку. Кроме того .(данные изложены-ниже) фракции 2 и 3 ингибируют пролнфера-тивкуа активность кроветворных клеток взрослых милей. Вероятно, ограничение пролифератпвной активности может способствовать выхода- ¡иеток в терминальную дифференцировку. Далее необходимо было зачскить имеется ли зависимость между вводимой дозой а изменением числа ретнхулоцитов. Испытуемые дозы были от 10 до 100 мкг "ка мышь. Колкчестзо 'градаций доз было от 3 дс 5. При внешнем анализа полученною материала биле трудно сделать определи нше

ГРАФИК. 4. Изменение числа ретикулоцитов и

скорости их созревиння у интактных мышей при введении фракций из желточного мешка

100-

я о

5 80 -

60 -

404

20-

Ш фракция 5

- различия достоверны

выводы, т.к. строгой зависимости между дозой и результатом получено не было, т.е. с увеличением, дозы результативный признак параллельно увеличивается или.уменьшается. Поэтому следовало установить имеется ли вообще зависимость между дозой и ответом, измерить силу влияния, достоверность, выявить существенность различий и определить оптимальную дозу. Разрешить эти проблемы позволил однофакторный дисперсионный комплекс, в котором исследуемым фактором была доза. Фракции 2,3,4 и 5 обладают доза—зависимым действием. Фракции I и 6 подобным свойством не обладали. Оптимальная доза - 50 мкг на гллаь.

2.2. Влияние среднеыодекулярных пептидных фракций, выделенных из 6-суточного желточного мешка, на гемопоэз взрослого организма при измененном кроветворении

Эффект действия биологически активных веществ в условиях целого организма определяется множеством параметров, в частности, чувствительностью клеток к воздействиям, наличием ингибиторов, иными условиями реализации их действия. И результативный признак влияния активных соединений может быть различен в норме и патологии. Поэтому мы испытали действие пептидных фракций на двух моделях нарушения щюветворения у мышей. Использовали сублетальное облучение и двойное воздействие; острую барокаморную гипоксию <0,4 атм., 12 часов) плюс сублетальное облучение в дозе 6 Гр. фракции вводили через-24 часа и на 4 сутки после облучения. Суммарная доза вводимых фракций была- 50 мкг на мышь. Двойное воздействие было выбрано потому, что предварительной.гипоксией запускается механизм регуляции эритропоэза. Эффект действия фракций оценивали по изменению числа ретикулоцитов, гемоглобина, образованию макроскопичесзшх эндогенных колоний в селезенке. Данные обрабатывали с использованием ¡факториального анализа.

Следует отметить, что показатели гемоглобина при введении фракций не отличались от контроля во всех экспериментальных сериях. При облучении лишь.фракция 4 приводила к увеличению ретикулоцитов в крови. В данном случае явно проявилось ее свойство активации синтеза, тема. Число колоний в селезенке при введении фракций не' отличалось от контроля. При дзойном воздействии - гипоксия + облучение - результат влияния фракций был иной, фракции 2,3,5 снижали число ретикулоцитов в крови. В тоже время фракции" 2 и 3 увеличивали число колоний в-селезенке. Известно, что основная масса макроскопических колоний з селезенке на 8 сутки - эрпт-

роидная. Следовательно, можно предположить, что в данном случае проявляется' синхронизирующий эффект фракций. Фракции 2 и 3, задерживая на определенной стадии дифференшровку эритрондных клеток, будут способствовать их накоплению в колонии и замедлять выход на периферию. Весьма интересно, что при действии фракций 2,3 формируются обратные взаимоотношения между терминальной диф-ферэнцировкой и пролиферативной активностью. Необходимо учитывать, что ответ клеток на биологически активные соединения зависим от чувствительности, от соотношения между разными клеточными популяциями, от соотношения между зрелыми и незрелыми представителями в пределах одной клеточной линии, от уровня повреждения и условий реализация действия. И именно поэтому у фракции 4 при облучении проявился ее стимулирующий эффект в отношении эритро-идной дифференцировки. Ингибкторное яе действие фракций 2.3,5 становится значимым при гипоксии плис облучение. Могно предположить, что пептидные фракции, выделенные из желточного мешка, могут выполнять корригирующую функцию в соотношении активности пролиферации и дифференцировня клеток-предшественниц, способствуя .оптимальности функционирования системы з целом.

2.3. Значение условий для реализации действия пептидных фракций, вы деленных из 6-суточного желточного мешка

Из-предшествующа результатов вполне очевидно, что конечный эффект влияния фракций зависим от множества взаимодействующих ' факторов. Поэтому было необходимо в прямых экспериментах Исследовать влияние пептидных фракций па пролиферацию и даффзренщровку центрального звена гемопоэза и определить значение условий в конечном эффекте действия фракций."Для решения поставленных: задач мы и с еле товали влияние фракций на клетки костного мозга мышей ин витро в различных инкубационных средах. Костный мозг брали от мышей с фенилгидразиновой анемией. Использование этой модели определялось двумя моментами: С одной стороны, мы старались приблизить гемопоэз взрослого организма к антенатальному, для которого характерна кервоначально преимущественная пролиферация и дафференцировка клеток эритроидного ряда. С другой стороны, пептидные фракции влияют на центральное и периферическое звено эритрона. Клетки костного мозга от мышей получали на фоне рети-кулопитарного криза, когда в крови, примерно,'100% ретикулопитоз. Использовали три инкубационных среда; среду Хэнкса, жнтактную ■ сыворотку и сыворотку от мыза а с фвнилгидразмновоЗ анемией.. Нги-

териями влияния фракций на пролиферацию и дифференцировку било изменений включения меченого тимидина и глицина в клетки костного мозга ври 2-часовой инкубации. Концентрация клеток костного мозга.была 5,25.Ю6 т/т. В пробу вносили 2 мккюри %-тими-дина или I мккюри глицина 2^0, 10 мет белка испытуемых фракций. Общий объем пробы был 1 мл. Результаты выражали в Беккерелях/ 10° клеток. Интенсивность включения тимидина в контрольных сериях была выше в среде Хэнкса, чем в сыворотках. Включение в сыворотках было одинаково. В интактной сыворотке фракции 1-5 проявляли шггибиторный эффект, который снимался при инкубации клеток в сыворотке от мышей с активированным эритропоэзом. Лишь фракция 4 проявляла ингибиторное действие во всех инкубационных средах. Обработка полученных данных с помощью критерия Стыоден-та для понимания результатов дала очень немного. Тогда для оценки был применен двухфакторный анализ, позволяющий выяснить значение условий инкубации, пептидной фракции, их суммарное и сочетаиное действие, достоверность и силу влияния каждого фактора Индивидуальный анализ всех факториалышх комплексов-позволил дать характеристику действия каждой фракции. Так, для фракции I характерно не самостоятельное действие, а модулирущее. В различных условиях она может усиливать значение последних и даже метать направленность результативного признака. Она усиливает действие интактной сыворотки, а в сыворотке* от мышей с фенилгид-разиновой аномией приводит к повышению включения тимидина в клетки костного мозга. Вполне вероятно, фракция I, воздействуя на клетки, повышает их чувствительность к биологически активным" соединениям. Действие фракции 2 проявляется только в сыворотках. Ее пнзгиблторный эффект независим от вида сыворотки. Действие фракции 3 подобно действию фракции I, Для фракции 4 характерен ингибиторнш! эффект полностью независимый от условий реализации ее действия. Но интенсивность иагкбкцки зависима от вида сыворотки. В сыворотке от мышей с активированным эритропоэзом ингн-биция включения тимидина менее выражена. Это позволяет думать о конкурентных взаимоотношениях между активным веществом сыворотки и фракцией. Действие .фракция 5 подобно действию фракции 4, но проявляется только в енворотках. Свойство пептидных фракций ингибировать пролиферацию проявилось и на уровне образования колоний и кластеров. Мононуклеарн костного мозга мышей с фенилгид-разииовой анемией культивировали з диффузионных камерах. Культу-ральная среда - плазмзшшй сгусток в добавлением пептидных Фрак-

ций в дозе 15 мкг белка на I шг хсультуралыгой среды. Плазма-бра-"лась от интактных мышей. Диффузионные камеры помещали в брюшную полость сикгенных реципиентов. Срок культивирования ? суток. Было получено, что фракции 2,3,4 достоверно иягябировали колонке-класгеробразование. Наиболее значительный эффект проявляли фракции 3 и 4. Качественный состав колоний изменялся при внесении в среду фракции 3. Образование гранулоцитарных колоний и кластеров полностью прекращалось.

Эксперименты по исследованию действия пептидных фракций на дифференцирозду показали, что глицин 2С^, в отличие от тимидина, в контрольных сериях более интенсивно включался в клетки костного мозга при инкубации в сыворотках. Достоверных различий включетя в зависимости от вида сыворотки не было. Фракции 1,2,5 ингибиро-вали включение глицина во всех инкубационных средах. Лишь франция 5 не проявляла это свойство в среде Хэнкса. Результативный признак был полностью зависим от действия активных фракций. Таким образом, ингиблторный аффект 1,2 и 5 фракций проявлялся и на эрятроидных клетках взрослого организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Совокупность проведенных исследований позволяет заключить, что период формирования системы гемопоэза характеризуется высокой напряженностью процессов и особы?,и механизмами регуляши. Основная роль в регуляции пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток, особенно на ранних этапах развития организма, принадлежит короткорэнговш регуляторам и, вероятнее всего, осуществляется согласно аутокрияной и паракринной 'регуляции. Вследствие высокой интенсивности и скорости изменений, антенатальный гемо-поэз удобная экспериментальная модель реакции кроветворения на меняющиеся условия- существования организма в норме и при воспроизведении патологических состояний. Имеются 'общие механизмы реакции системы крови, независимые от вида и возраста организма. Вполне вероятно, закономерности антенатального гемопоэза могут иметь место и во возрослом организме рри патологии системы крови, в частности, лрй патологической гиперфункции костного мозга. И именно при патологии системы' врови на первое место по значимости могут выдвигаться короткорэнговш механизмы регуляции пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток. Выделение антенатальных гемопоэзрегулирущих факторов и исследование, механизмов их действия весьма перспективно для разработки новых методов коррекции нарушений костномозгового кроветворения.

ЕЫВОДУ

1. Антенатальны! период формирования гемопоэтической системы характеризуется высокой интенсивностью кроветворения *и позволяет проследить динамику представительства родоначальных кро-ветворшх клеток, популяционную смену эритроидных элементов, различающихся по биохимическим, морфологическим, морфометричес-ким, антигенным критериям и чувствительностью к гуморальным регуляторам, Вследствие столь напряженных процессов и скорости их изменений, антенатальный гемопоэз-удобная экспериментальная модель для изучения реакции кроветворения на меняющиеся условия существования организма в норме и при воспроизведении патологических состояний.

2. При формировании системы кроветворения осуществляется одновременная закладка кроветворных клеток-предшественниц экстра- и интраэмбрионально а, именно поэтому, в доциркулятордай период синтез примитивных эритроцитов представлен не только в желточном мешке, но и теле эмбриона. Характер антигенного спектра эритроцитов различных популяций и экспериментальный подход их определения предполагают единую предшественницу как для при-лштивных, так для дефинитивных л "взрослых" эритроцитов.

3. Динамика количественных изменений кроветворных предшественниц в органах гемопоэза является следствием синхронного их выхода в дифференцировку и миграции в .кровь, что соответствует принципу "клональной сукцессии". Популяционнзя смена эритроидных элементов в крови не означает обязательную смену места кроветворения. Последовательная колонизация гемопозтических органов сопровождается расширением спектра дафференцировок кроветворных клеток-предшественниц.

4. В процессе формирования гемопоэтической функции желточного мешка идет постепенная'коммитация кроветворных цредшествен-.ниц и изменение'условий микроокрукения. Проявление потенциальных способностей предшественниц из желточного-мелиса зависит от срока развития и условий культивирования. Интраэмбриональные кроветворные органы с момента начала их фикции содержат предшественницы всех линий дифференцировок. Предшественницы из селезенки и костного мозга более чувствительны к условиям микроокружения, чем метки желточного мешка и печени.

5. Антенатальный гемопоэз независимо от локализации начинается с появления в органе макрофагалышх и эритроидных клеток. Общеозологическая закономерность существования эритробластичес-

ких островков имеет место и у птиц, но со своими особенностями. В желточном'мешка и селезенке эритробластяческих островков обнаружено не било. В печет, в период разгара ее гемопоэтичес-кой функции, определяются клеточные скопления, состоящие из макрофагов и эритроидвых клеток. Количественные соотношения глея- -ду этими форменными элементами могут быть различными, что не соответствует классическому описанию эритробластических остроз-ков. В костном мозга в конце развития эритробластическке островки .определяются, но их представительство невелико.

6. Антенатальные кроветворные органы синтезируют локально регулирующие гемопоэз факторы, определяющие характер диффорен-. цировки и интенсивность пролиферации кроветворных клеток-предшественниц. В начинающих функционировать кроветворных органах вырабатываются вещества, иигабмрупше пролиферации KOS, ЮГОВ аз предшествующих крейотворянх органов. Кроме того, может осуществляться одновременны" идя поэтапный синтез ингибиторов к стимуляторов пролиферации и дафференцировки КОЗ, КЯ02. Особенность действия короткоракговых регуляторов дкФФереh^j-obк;. завхгеи-

. мость их влияния от условий куяьтивировзшя. Прэлпфзратившэ .эффекты менее йодвгргены.таким влияниям. •

7. Действие антенатальных короткоранговых регуляторов га-мопоэза является возрастно- и видовонеспёцифичшм. Направленность количественных изменений при индуктивных воздействиях антенатальных гемопоэзрегулирузадих факторов не зависит от.функционального состояния ксеногенного "взрослого" костного мозга, а интенсивность и характер качественных изменений зависимы от этого, параметра. Ответ клеток ксеногенного "взрослого" костного ■мозга а сингенного "детального" костного мозга при действия антенатальных -■•емопоззрегулируших факторов имеет общие и специфические реакции.

8. Из 6-суточного желточного мешеа куриного зародыша выделено 5 среднемояекулярных пептидных'фракций, оказывающих влияние на пролиферацию и дифферекцировку кроветворных клеток-предазст-венниц. Действие их является возрастно- и видовонеспецифичным. Активные фракции, как правило, проявляют однонаправленность действия на нроветзорныё клетки зародыша и взрослых ксеяогенных особей. Действие фракций подчиняется захсноаерностяи "доза-

.эффект".

9. Пептидные фракции контролируют интенсивность пролиферации и характер дифферэкцирозки. В отношении влияния на зролифэ-

рацию их можно разделить на ингибиторы и модуляторы, а в отношении влияния на дифференцировку - на стимуляторы, ингибиторы и синхронизаторы эритроидной дафференцировки. Одна из фракций ин-гибирует гранулоцитарную линию дафференцировки.

10. Конечный эффект влияния среднемолекулярных пептидных фракций ин витро неравнозначен их влиянию на уровне целого организма, а также имеется особенность реагирования на них кроветворной ткани в норме и патологии.

11. Выявлены общие механизмы реакции системы крови, независимые от вида и возраста организма, в ответ на действие антенатальных геыопоэзрегулируюпих факторов. Это создает перспективу использования корогкоранговых антенатальных регуляторов во взрослом ксеногенноы организме с целью дальнейшего изучения общих закономерностей гемопоэза и изыскания новых методов коррекции нарушений функции кроветворной системы.

СШСОХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТИЛЕ ЛИССЕРТАШИ

1. Особенности регуляции первичного кроветворения у эмбрионов птиц // Регуляция вегетативных и соматических функций в организме человека а животных: Тез. к конф. - Уфа, 1977. - 4.1.-C.I08-I09 (соавг.: Камилова АД.).

2. /Формирование систем лимфо- и миеяопоэза в эмбриональный

и плодовый период развития кур // Факторы .естественного иммунитета- при различных физиол.состояниях // Тез.докя. ЗУ науч.конф.-Челябинск, 1978,- С.15-16 (соавт. Шамгунов А.Н.).

3. ¡/Ьрфофункционалвная характеристика первичного кроветворения у эмбрионов птиц // Механизмы регуляции в системе крови: -Тез. докл. Всесок^н.ронф,- Красноярск,1978,-4.2.-С.61-62 (соавт. Попов Г.К.).

4. Некоторые особенности кроветворения в эмбриональный и плодовый период развития организма // 1-2 Всесоюзн. съезд гематологов и трансфузиологов,- М.,1979.- С.146 (соавт.:Попов Г.К., Дашкевич Т.А., Пермнтина М.И.),

5. Особенности эри-тропоэза на ранних этапах развития куриного зародыша // Система кроветворения развивающегося организма в норме и патологии:Сб.науч.тр.- Челябинск,I979.-C.20-29.

5. Синтез гема и становление гуморальной регуляции этого процесса в эритроцитах куриного зародыша.- Там же, С.29-34.

7. Изменение спектра среднемолекулярных пептидных соединений в процессе диф$еренцкровки-эмбриональных эритроидных клеток //

.Патофизиология экстремальных состояний: Тез.дога.конф.патофизиологов Урала.- Уфа, 1982.-С. 108-109 (соавт.: Попов Т.К.", Лифынц Р.И., Ефименко Г.П.).

8. Особенности эритроидной дифферсздировхл-в эмбрионалышй

и плодовый период развития организма // Повреждения и регулятор-низ процессы организма: Тез.докл.3-го Всесоюзн,съезда патофизиологов.- М.,1982.-0.190-191 (соавт.: Лифниц Р.И., ЗДименко Г.П., Крупицкая Л.И., Иамгунов.А.Н.).

9. Техника клонирования кроветворных клеток-предшественников в костномозговой, перитонеальной полостях и курином эмбрионе с помощью капиллярных диффузионных камер // Гематология и грапсфу-зиология.-1985.-& 10.-С.55-57 (соавт.: Попов Г.К., Шахов З.П., Суслова Т.А.).

10. Кинетика гемопозза и характеристика клеток предшественников желточного мешка зародышей кур // Тез.докл.2-го Всесоюзн. съезда гематологов и траксфузиояогов.-Львов,1985.- С.165.

11. Биохимическая и функциональная характеристика пептидных компонентов желточного мешка // Патологическая физиология экстремальных состояний.Патофизиад.аспекты гематологии и иммунологии: Тез.докл.конф.патофизиологов Урала,- Пермь,1986.- С.98-99 (соавт. : Попов Г.К.).

12. Метод исследования кроветворных клеток-предшественников в антенатальный период развития птиц // Кроветворные клетки-предаественники з механизмах повреждения и компенсации системы крови при действии на организм экстремальных факторов: тез.докл. симп.- Челябинск,1986.-С.36-37 (соавт.: Теплова С.Н.).

13. Эмбриональны!! эритропозз и некоторые механизмы его регуляции // Научно-технический прогресс в службе крови страны: Сб. науч.тр.пленума Всесоэз.об-тва гематологов и .трансфузиологов.-Рязань,1987.-0.I08-III (соавт,: Попов Г.К.).

14'. Нзлточный мешок и его кроветворная функция // Сб-.науч. тр.каф.патологической 'физиологии.-Челябинск, 1988.- С. II-I8.

15. РеакцЕя кроветворной ткани на*введение веществ, выделенных из желточного мешка // Мат. 17 Всесоюзн.съезда патофизиологов.- Кишинев-^.,1989.- Т.З.- С. 1233..

16. КолСяие-кластеробразутзя способность.кроветворных клеток эмбриона // Патология дыхания, крови и регулирующих функций организма и принципы коррекютнарушений: Тез.докд-ЙШ науС.конф. патофизиологов Урала.- Ижевск,1989.» С.45-47. .

17. Образование гранулоцитарно-макрофагальных колоний при различных функциональных состояниях костного мозга в условиях культивирования // Секторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиол. и патол, состояниях: Тез.докл.Х науч.конф.-Челябинск, 1990,- С.76.

18. Временные п функциональные параметры кроветворения в онтогенезе // Приобретенные аммунодефицитныэ состояния в клинике к эксперименте: Сб. на уч.тр.- Челябинск,1990.-С.63-67.

19. Гуморальная гемопоэзрегулзрующая функция эмбриональных кроветворных органов // Физиологические механизмы адаптации человека и животных: Тез.докл. II съезда физиол.Уральского региона.- Свердловск,2590,- С.17.

20. Изменение колоние-кластеробразующей способности мононук-леаров костного мозга при сокультивирояании с клетками желточного мешка // Систешше и клеточные механизмы адаптации организма к действию повреждаших факторов: Гез.докл.конф.патофизиологов Урала.- Челябинск, 1391.- С.4Э-51.

21. Эффект гуморальйого воздействия клеток кроветворных органов куриного зародыша на колониеобразущую способность клеток костного мозга мышей в норме и при активированном эритропоэзе// Патофизиология ж экспериментальная терапия. -1991. -&3. -С. 33-40.

22. Колоше- и кластеробразутаия способность костного мозга мышей в зависимости от его функционального состояния и условий культивирования // Патофизиология и экспериментальная терапия.-1991.- £ 5.- С.26-27.

23. Действие клеток кроветворных: органов эмбрионов кур на К0Едк-КЛ0Едк мышей // Архив'анатомии, гистологии и эмбриологии (Принято к печати и будет опубликовано, начиная с 5 4 - 1991).