Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Коррекция анемического синдрома при миелоингибирующих воздействиях

На правах рукописи

Удут Елена Владимировна

КОРРЕКЦИЯ АНЕМИЧЕСКОГО СИНДРОМА ПРИ МИЕЛОИНГИБИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск - 2008

003177764

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Гальдберг Евгений Данилович

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ

доктор медицинских наук, профессор, член-корр РАМН

доктор медицинских наук

Дыгай Александр Михайлович

Венгеровский Александр Исаакович

Кушлинский Николай Евгеньевич Масная Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится " " ^■¿^/»¿к.^с 2008 г в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031 01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г Томск, пр Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан " /£ " декабря 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Амосова Е Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные данные, касающиеся распространенности заболеваний, сопровождающихся угнетением кроветворения, в частности, эритропоэза, показывают, что анемии являются одним из основных проявлений различных патологических процессов [Алмазов В.А и др., 1981; Гав-рилов О.К и др., 1987; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М, Жданов BJB, 2002; Миловано-ва JIЮ., Николаев АЮ., Козлова Т А. и др., 2004, Ермоленко В М., Филатова Н.Н, 2004, Евтушенко И Д. и др., 2006]. В терапии анемического синдрома актуальным является как лечение ведущей нозологии, поскольку анемии, как правило, вторичны и обычно представляют собой проявление основного заболевания, так и своевременная коррекция нарушений, возникших в системе эритрона [Сабуров X С., Хамдамова Ф К., 1990; Моршакова Е.Ф., Дмитриев AJB, Борисова И П, 1997; Милованова JIЮ., Николаев А.Ю , Козлова Т А и др., 2004, Ермоленко В.М., Филатова Н Н, 2004; Евтушенко И Д. и др, 2006] Многочисленными исследованиями установлено, что изменения в системе крови, возникающие при действии различных болезнетворных факторов, во многом однотипны и заключаются в последовательной активации отдельных звеньев единого каскадного механизма регуляции кроветворения. Поэтому, несмотря на большое разнообразие причин, лежащих в основе развития анемий, адекватные патогенетически оправданные методы их фармакологической коррекции могут быть разработаны лишь на основе детального изучения общих механизмов управления гемопоэзом [Гершанович М А, 1982, Переводчикова Н.И, 1996; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В В., 1998, Воробьев А И., 2002].

Существующая теория регуляции кроветворения свидетельствует о наличии в организме единой, сложноорганизованной, взаимосвязанной системы управления гемопоэзом [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Гольдберг В.Е и др., 1996, Гольдберг Е.Д, Дыгай А М., Жданов В В , 1999, Гольдберг Е.Д, Дыгай AM., Жданов В.В., Хлусов И.А., 1999, Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В В и др., 2001] Ее основными компонентами являются центральные нейроэн-докринные механизмы, элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения, осуществляющие локальный контроль за процессами кроветворения, и цитоки-ны - активные вещества, секретируемые клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток. Учитывая вышесказанное, фармакологическая коррекция нарушений, возникающих в системе крови, вероятно, может осуществляться путем модуляции центральных механизмов регуляции ге-мопоэза, функций элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и применения заместительной терапии препаратами, аналогичными естественным регуляторам кроветворения

Существует ряд биологически активных веществ, которые, модулируя функции центральной нервной системы, способны изменять и функционирование аппарата системы крови, приводя к развитию позитивной динамики со стороны показателей периферического звена эритрона [Абрамова Е.В., Дыгай А.М., Гольдберг В.Е. и др, 1991, Гольдберг В Е, Абрамова ЕЯ, 1991; Гольдберг Е.Д,

Дыгай А.М., Гольдберг В.Е идо, 1997, Гольдберг Е Д., Дыгай AM, Ждан® B.B, 1998, Гольдберг Е.Д, Дыгай А.М., Жданов В.В. и др., 1999; Дыгай AM., Гольдберг В.Е., Родионченко A.A. и др., 2000; Goldberg ED., Dygai AM., Aga-fonov V.I et aL, 1994]. Перспективным также является создание препаратов на основе гликозаминогликанов. Данные вещества, являясь составной частью экс-трацеллюлярного матрикса, клеточной мембраны, влияют на процессы пролиферации кроветворных клеток, регулируют продукцию цитокинов, то есть могут опосредованно (путем активации гемопоэзиндуцирующего микроокружения) стимулировать процессы репарации подавленного гемопоэза. Создание гемостимуляторов на основе цитокинов продемонстрировано многочисленными работами иностранных и отечественных авторов [Волкова М.А, Ширин АД, 1997, Масычева В.И., Гольдберг Е Д., Дыгай А.М. и до,2006; Moore MA, Welte К, Gabnlove J. et aL, 1987, Vose JM, Armitage J0,1995; Мосте MA, 2002; Glaspy JA, 2003].

Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные, позволяющие дать патогенетическое обоснование применения различных препаратов в терапии нарушений эритрона, возникающих при отдельных нозологиях. Это обусловлено как отсутствием соответствующих данных, касающихся механизмов их действия, так и недостаточной изученностью патогенеза развивающихся анемических синдромов С указанных позиций удобными моделями для вскрытия закономерностей и механизмов функционирования кроветворной ткани при анемическом синдроме и разработки патогенетически обоснованных методов терапии являются цитостатические миелосупрессии, вызванные различными по механизмам действия антибластомными средствами, так как одним из наиболее тяжелых осложнений токсической миелодепрессии является развитие анемического синдрома различной степени выраженности

Изучение механизмов действия стимуляторов эритропоэза на моделях миелосупрессии, вызванных повреждающими агентами (цитостатиками), влияющими на отдельные структуры гемопоэзиндуцирующего микроокружения, позволит дать патогенетическое обоснование подходов к дифференцированному применению гемостимуляторов в лечении анемического синдрома и разработать целенаправленные методы терапии отдельными препаратами в клинической практике.

Цель исследования. Вскрыть механизмы регуляции эритропоэза при мие-лоингибирующих воздействиях Разработать патогенетически обоснованные методы коррекции гемостимуляторами анемического синдрома на моделях ци-тостатических миелосупрессий.

Задачи исследования

1 Изучить механизмы развития цитостатических миелосупрессий, вызванных введением циклофосфана, 5-фгорурацила, адриамицина и карбоплатина

2 В сравнительном аспекте оценить эффективность действия гемостимуляторов (рекормон, таблетарованный эритропоэтин, препарат сверхмалых доз антител к эршропоэшну - поэтам, экстракт шлемника байкальского, байкалин,

]Я-ацетилнейраминовая кислота) на эритропоэз на моделях цитостатических ге-модепрессий, вызванных введением циклофосфана и 5-фторурацила

3 Вскрыть специфические для каждого из гемостимуляторов механизмы участия элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения в восстановлении эритрона при моделировании цитостатических миелосупрессий.

4. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекций нарушений в системе эритрона в условиях повреждения кроветворной ткани противоопухолевыми препаратами

Положения, выносимые на защиту

1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами эритроидного ростка кроветворения при введении рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, Ы-ацетилнейраминовой кислоты, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина является избирательная чувствительность прекурсоров эритропоэза и клеточных элементов ГИМ к действию цитостатиков и гемостимуляторов.

2. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений эритрона является рекормон и 14-ацетилнейраминовая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция эритропоэза наблюдается под влиянием рекормона и препаратов экстракта шлемника байкальского При моделировании миелосулрессии адриамицином и карбоплатином рекормон более эффективен в сроки развития депрессии эритроидного ростка, поэтам - в период его активной регенерации.

3. В основе регуляторного действия рекормона и таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на костномозговой эритропэз в условиях цитостатических миелосупрессий лежит стимуляция пролифератив-ной активности и интенсивности дифференцировки эритроидных клеток-предшественников, поэтама — увеличение уровня гуморальных регуляторов эритропоэза (в том числе, сывороточного эритропоэтина). Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани Ы-ацетилнейраминовой кислотой и препаратами шлемника байкальского при назначении циклофосфана вызвано формированием гемопоэтических островков эритроидного и смешанного типа, в случае применения 5-фторурацила — возрастанием концентрации гемопоэтических факторов роста в экстрацеллюлярном матриксе

4 Стимуляция периферических альфа-адренергических структур стро-мальных элементов ГИМ восстанавливает подавленную циклофосфаном фидерную активность адгезирующих клеток в отношении эритроидных прекурсоров и значительно усиливает ее в присутствии эритропоэтина (рекормон).

5 Рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, 1Ч-ацетилнейраминовая кислота, экстракт шлемника байкальского и его биофлавоноид бай калин оказывают умеренное стимулирующее влияние на гранулоцитарный росток кроветворения в условиях введения цикло-

фосфана и 5-фторурацила В основе действия препаратов лежит увеличение функциональной активности клеточных элементов ГИМ.

Научная новизна. Впервые выявлена многофакторная природа, лежащая в основе развития длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения цитостатических препаратов с различными механизмами действия (алкшшрующий агент, антиметаболит) Основной причиной падения содержания эритрокариоцитов в системе крови у мышей при введении циклофос-фана выступает подавление функциональной активности пула коммитирован-ных предшественников кроветворения и, в меньшей степени, нарушение межклеточных взаимодействий и выработки гуморальных регуляторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения. При этом развитие анемии на фоне увеличения числа эритроидных гемопоэтических островков свидетельствует в пользу функциональной несостоятельности образованных de novo клеточных комплексов.

Развитие гемодепрессии при назначении 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и, в меньшей степени, с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирукждами клетками гемопоэзиндуцирующего микроокружения

В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из стимуляторов эритропоэза (рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского, флаво ноид бай калин, N-ацетилнейраминовая кислота) механизмов участия клеток кроветворного микроокружения в регуляции эритрона при его восстановлении При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемостимулято-ров. Мишенью для рекормона и таблетированной формы эритропоэтина являются прекурсоры эритропоэза. N-ацетилнейраминовая кислота оказывает преимущественное влияние на формирование эритроидных клеточных комплексов С модуляцией активности дистантных структур (эритропоэтическая активность сыворотки крови) связано стимулирующее действие на эритропоэз экстракта шлемника байкальского и поэтама

Впервые показано, что в условиях моделирования гипопластических состояний циклофосфаном гемостнмуляторы в большей степени активируют процессы регенерации эритропоэза, чем при назначении 5-фторурацила, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и нарушениями функций системы дальноранговой регуляции эритропоэза, вызванными антиметаболитом.

Патогенетически обоснована эффективность применения N-ацетил-нераминовой кислоты и рекормона при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом, рекормона и препаратов шлемника байкальского -в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита, рекормона и поэтама - при лечении анемий, вызванных введением карбоплатина и адриамицина

Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции анемий, вызванных противоопухолевыми агентами Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию создания новых гемостимуляторов для лечения анемий различного генеза.

Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).

В настоящее время разрешен к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации препарат на основе сверхмалых доз антител к эритропоэтину - поэтам (выпускается НПФ «Мате-риа Медика Холдинг», Москва), препарат шлемника байкальского в таблетках (НПЦ натуральных продуктов "Даника", Харьков, Украина; ООО "Амрита", Киев, Украина).

По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина и препарата М-ацетилнейраминовой кислоты для получения разрешения на клинические исследования в качестве гемостимуляторов. Получены патенты. (1Ш) №2001100123 от 03 января 2001 г, (1Ш) №2003116260 от 02 июня 2003 г

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2000, 2001, 2003), на Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2001, 2002), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002,2005,2007), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006, 2007), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на Ш Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 15 — в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 412 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения Работа иллюстрирована 21 рисунком и 119 таблицами (таблицы 96-119 размещены в приложении) Библиографический указатель включает 647 источников, из них 249 отечественных и 398 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1634 мышах-самцах линии CBA/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев массой 18-20 г Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биологического моделирования Института фармакологии ТЕЩ СО РАМН (сертификат имеется).

Циклофосфан ("Биохимик", Саранск), 5-фторурацил (Украина, химфар-мобъединение «Дарница»), адриамицин (Апджон С.п А, Италия) и карбопла-тин (Ebewe, Австрия) вводили внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе (МПД), составившей по результатам пробит-анализа соответственно 250 мг/кг, 228 мг/кг, 6 мг/кг и 100 мг/кг. После введения цитостатика мыши опытных групп получали подкожные инъекции препарата ЭП Recormon («Hoffmann-La Roche Ltd.», Швейцария), суммарная доза - 50 ЕД на мышь, таб-летированную форму рекомбинантного человеческого ЭП, разработанную НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os 1 раз в день в течение 5 суток, начиная со дня введения цитостатика, содержание действующего вещества 10 ЕД на мышь (суммарная доза - 50 ЕД на мышь); оригинальный препарат сверхмалых доз антител к ЭП — поэтам, созданный НПФ «Материа Медика Холдинг» (Москва) совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os ежедневно по 0,2 мл/мышь в течение 10 суток, начиная со дня введения цитостатика; экстракт шлемника байкальского жидкий, разработанный ГНЦЛС (Харьков, Украина), совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os в течение 9 суток ежедневно в дозе 1 мл/кг, начиная за 48 часов до введения цитостатика Стандартизацию экстракта шлемника проводили по флавоноиду байкалину, содержание которого в сухом экстракте составляло 37,20 %. Биофлавоноид байкалин, выделенный из корней и корневищ шлемника байкальского (ГНЦЛС, Харьков, Украина) вводили per os в течение 9 суток ежедневно в дозе 15 мгЛсг, начиная за 48 часов до введения цитостатика. N-ацетилнейраминовую кислоту («Sigma», США) использовали внутривенно, трехкратно на 3, 4, 5-е сутки после введения цитостатика в дозе 50 мг/кг (суммарная доза - 150 мг/кг). Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных. Мышей забивали на 3,4,5, 6,7,8,9,10,12,14,15 и 16-е сутки после введения цитостатика методом дислокации шейных позвонков

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми методами [Гольдберг Е Д, Дыгай А.М, Шахов В П, 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания эритроидных и гранулоцито-макрофагальных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза производили с помощью метода "клеточного самоубийст-

ва" путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава Эритропоэтическую (ЭПА) и коло-ниестимулирукяцую (КСА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроид-ных и гранулоцито-макрофагальных колоний (на 10s миелокариоцитов) [Гольд-берг Е.Д, Дыгай А.М, Шахов В.П., 1992]. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови определяли методом ИФА, с помощью набора фирмы «Sangui Bio Tech, Inc » согласно методическим указателям производителя Изучение прямого действия препаратов природного происхождения на эффективность клонирования in vitro КОЕ-Э из костного мозга интактных мышей и после применения цитостатика осуществляли в метилцеллюлозной культуре ткани. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента [Урбах В.Ю, 1975] При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий Уилкоксона-Манна-Уиши [Урбах В.Ю, 1975, Гублер Е.В, 1978] Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ. Влияние цитостатического воздействия либо препаратов (факторов) на изменения признака исследовали с помощью факторного анализа по критерию Фишера Использовали также линейный пошаговый дискриминантный анализ Фишера [Лакин Г.Ф, 1990; Мендрина Г И. и др., 2004]. Оценка влияний препаратов на динамику костномозгового эритро-поэза проводилась с помощью разности интегральных показателей [Гольдберг Е Д, Дыгай А М, Хлусов И А, 1997]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования производилась оценка регенераторных возможностей кроветворной ткани экспериментальных животных при введении цитостатических агентов.

Однократное введение циклофосфана (ЦФ) вызывало выраженное угнетение всех ростков гемопоэза, о чем свидетельствовало уменьшение числа незрелых (1-4-е сутки) и зрелых (1-5-е сутки) форм нешрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов (1-12-е сутки) в костном мозге. Депрессия костномозгового кроветворения сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания зрелых элементов изучаемых ростков в периферической крови. В частности, на протяжении длительного периода имело место развитие нейтро-фильной лейкопении (1-5-е сутки) и ретикулоцитопении (1-8-е сутки).

Вместе с тем, на 4-е сутки после инъекции алкилирующего агента отмечалось восстановление содержания незрелых форм нейтрофилов в костномозговой ткани, а уже на 5-е сутки развивалась гиперплазия гранулоцитарного ростка кроветворения. Увеличение числа полиморфноядерных гранулоцитов в периферической крови имело место на 8-12-е сутки опыта В свою очередь, реге-

\

нерация эритропоэза значительно задерживалась, о чем свидетельствовала нормализация содержания эритрокариоцитов в костном мозге только на 12-е сутки исследования и увеличение числа ретикулоцитов с 10-х суток.

У мышей, получавших 5-фторурацил (5-ФУ), была обнаружена более глубокая и продолжительная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Так, фторпиримидиновый антиметаболит приводил к статистически достоверному падению количества нейтрофильных гранулоци-тов и эритрокариоцитов на 1-14-е сутки опыта, причем на 3-8-е сутки эксперимента отмечалось наименьшее содержание всех изучаемых форм миелокарио-цитов, вплоть до полного исчезновения на препаратах костного мозга эритрокариоцитов. Вслед за периодом депрессии наблюдалось постепенное увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов в костном мозге животных. Однако восстановление процессов в кроветворной ткани до исходных значений регистрировалось только на 16-е сутки.

Отражением состояния костномозгового гемопоэза являлась картина периферической крови. Так, уже на 1-е сутки после введения 5-ФУ наблюдалось значительное снижение числа нейтрофильных лейкоцитов, вплоть до полного их исчезновения на гемограммах на 4-8-е сутки В указанные сроки на мазках крови были представлены преимущественно лимфоциты. Рост уровня нейтрофильных лейкоцитов регистрировался на 10, 12 и 16-е сутки наблюдения К окончанию эксперимента (16-е сутки) содержание нейтрофилов превосходило исходные значения на 47,50 % На 1-12-е сутки после введения антиметаболита обнаруживалось развитие выраженной ретикулоцитопении в периферической крови. Однако к 14-м суткам содержание ретикулоцитов нормализовалось, а на 16-е сутки число ретикулоцитов более чем в 2 раза превосходило исходный уровень.

Изучение колониеобразующей способности костного мозга мышей, перенесших цитостатические воздействия, позволило выявить ряд закономерностей. Так, в условиях введения циклофосфана отмечалось резкое снижение содержания эритроидных прекурсоров в костном мозге на протяжении всего периода наблюдения. Вместе с тем, угнетение гранулоцитарно-макрофагального коло-ниеобразования было выявлено на 3, 4-е сутки исследования К 5-м суткам опыта интенсивность роста КОЕ-ГМ в метилцеллюлозной среде нормализовалась и в дальнейшем не отличалась от таковой в интактном контроле. При моделировании гемодепрессии 5-ФУ динамика содержания клеток-предшественников в костном мозге (как и при назначении алкилирующего агента) носила волнообразный характер непродолжительное уменьшение числа эритроидных (1-5-е сутки) и грануломоноцитарных (1-6-е сутки) прекурсоров сменялось возрастанием их числа (14-16-е и 8-10-е сутки соответственно).

Итак, однократное введение цитостатиков в МПД вызывает развитие продолжительной гипоплазии костного мозга, лейкопению и ретикулоцитопению в периферической крови у мышей линии СВА/СаЬас. Нарушения в системе крови в случае использования фторпиримидинового антиметаболита более выражены, чем при назначении алкилирующего агента. Примечательно, что активация процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков при мо-

делировании гемодепрессии ЦФ наступает значительно раньше, чем при введении 5-ФУ (табл. 1). Дополнительной характеристикой использованных модельных ситуаций выступает выявленная нами большая чувствительность эритрона к действию хдатостатиков по сравнению с клетками белой крови.

Таблица 1

Сроки ингибиции и регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения при введении цитостатиков__

Цитостатики Эритроидный росток Гранулоцита рный росток

Ингибиция Регенерация Ингибиция Регенерация

Циклофосфан 1-8-е сутки 10-12-е сутки 1-5-е сутки 6-12-е сутки

5-фторурацил 1-14-е сутки 16-е сутки 1-14-е сутки 16-е сутки

Была проведена серия экспериментов, в которой изучалась пролифератив-ная активность и интенсивность дифференцировки кроветворных прекурсоров и локальные механизмы их контроля при гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана или 5-фторурацила.

Как и предполагалось, уже на 1-е сутки после введения циклофосфана регистрировалось снижение темпов деления и скорости созревания эритроидных прекурсоров, которое сохранялось на протяжении всего периода исследования Падение числа ДНК-синтезирующих КОЕ-ГМ обнаруживалось на 1-8-е сутки опыта. В то же время, интенсивность дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных предшественников изменялась волнообразно. Так, если индекс созревания грануломоноцитарных клеток на 1-4-е и 10-12-е сутки исследования статистически достоверно снижался, то на 5, 6-е сутки значение показателя, напротив, существенно возрастало.

Анализ результатов исследования митотической активности прекурсоров гемопоэза после назначения 5-фторурацила позволил установить, что в условиях данной модели существенно снижалась доля КОЕ-ГМ в Б-фазе митотическо-го цикла во все сроки эксперимента. В противоположность этому, темпы деления эритроидных предшественников возрастали (4, 5, 14-16-е сутки) Со стороны интенсивности дифференцировки эритроидных и грануломоноцитарных клеток отмечались как периоды увеличения (1-3-и и 1-4, 10-е сутки соответственно), так и уменьшения величины показателя (8-10, 14-16-е и 6-8, 10-е сутки соответственно)

Рассматриваемые процессы в отделе коммутированных клеток-предшественников кроветворения сопровождались значительными нарушениями в структурно-функциональной организации костного мозга. Под влиянием алкилирующего агента нарушение формирования клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом имело место на 1-2-е сутки опыта, а фиб-робластоидных гемопоэтических островков - на 1-4-е сутки В последующем наблюдалась стимуляция образования ассоциаций клеточных элементов (более интенсивная - макрофагположительных ГО) Анализ цитограмм позволил установить, что динамика содержания эритроидных ГО в целом повторяла таковую клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом Как и в случае с фибробластными ассоциациями, дефицит смешанных и гранулоцитар-ных гемопоэтических островков в костном мозге сменялся увеличением их

числа. Вместе с тем, у мышей после введения фторпиримидинового антиметаболита обнаруживалось падение содержания всех типов гемопоэтических островков в костномозговой ткани на протяжении большей части эксперимента.

При изучении роли гуморальных регуляторов в локальном контроле процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток установлено, что ЦФ уменьшал концентрацию эритропоэтической активности в суперна-тантах адгезирукицих (5, 6-е сутки) и неадгезирующих (3-12-е сутки) клеток ГИМ и сыворотке крови (6-8, 12-е сутки). В свою очередь, продукция колоние-стимулирующей активности нуклеарами прилипающей (6-8-е сутки) и непри-липающей (10-е сутки) фракций ГИМ и уровень сывороточных факторов (3, 512-е сутки) возрастали При назначении 5-ФУ характер секреции ЭПА клетками кроветворного микроокружения и сдвиги уровней сывороточных гемопоэтических факторов роста отличались от вышеописанного. В частности, после снижения ЭПА в биологических средах на 1-5-е сутки опыта отмечался ее рост в более поздние сроки Вместе с тем, выработка КСА прилипающими (8-е сутки) и неприлипающими (3, 10-е сутки) миелокариоцитами значительно превосходила исходные значения, но способность сыворотки периферической крови стимулировать грануломоноцитарное колониеобразование, напротив, падала.

Совокупность выявленных феноменов указывает на многофазсгорную природу длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила, которая складывается из повреждения структурно-функциональной целостности костного мозга, нарушения продукции ЭПА и КСА и угнетения деления и созревания эритроидных и грануломо-ноцитарных прекурсоров. Постцитостатическая регенерация гемопоэза обусловлена восстановлением функций ГИМ и коммитированных предшественников кроветворения.

Данные корреляционного и факторного анализов показали, что основной причиной снижения содержания эритрокариоцитов и нейтрофильных грануло-цитов в системе крови у мышей линии СВА/СаЬас при введении циклофосфана выступает снижение функциональной активности пула коммитированных предшественников кроветворения, а только потом — нарушение межклеточных взаимодействий (образование очагов гранулоцитарного кроветворения) и низкий уровень гемопоэтинов и цитокинов в биологических жидкостях.

Развитие гемодепрессии вследствие назначения 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и лимфо-идных механизмов, во вторую очередь - с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирую-щими клетками ГИМ (рис. 1).

Дальнейшим шагом в нашем исследовании явилось проведение экспериментов, направленных на сравнительное изучение гемостимулирующей активности препарата рекомбинантного человеческого эритропоэтина (эпоитин-6) -рекормона, таблегированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, оригинального препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину по-этама, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина, >1-аце-тилнейраминовой кислоты в условиях цитостатических гемодепрессий. Основ-

Циклофосфан

ЭПА а

ЭПАс

5-фгпорурацш

ДэПАд Н ЭПЛ и^ I ЭДЛс^

Гемопоэтические островки

| (мф) (лф)

Эритроидные прекурсоры

3

Эритрокариоциты

I Гемопоэтические островки

Эритроидные прекурсоры

Эритрокариоциты

3

КСА а КСАк КСА с

©

Гемопоэтические островки

Грануломоноцитарные прекурсоры

1 КСАн КСА с

I Гемопоэтические Ц островки

Нейгрофяльные гранулоциты

Грануломоноцитарн прекурсоры

Нейтрофил ыше гранулоциты

Рис. 1. Структура отношений показателей костномозгового кроветворения мышей линии СВА/СаЬас при введении циклофосфана и 5-фторурацила на основе данных корреляционного и факторного анализов. Сплошная линия обозначает положительные взаимодействия между системами, пунктирная линия - отрицательные связи. Толстые линии - высокая активность систем и "жесткость" взаимодействий, тонкие линии - низкая активность.

акцент был сделан на эритроидный росток кроветворения.

Введение рекормона животным приводило к ускорению процессов восстановления эритропоэза, подавленного цитостатиками, по сравнению с мышами контрольной группы, получавшими растворитель Причем в условиях введения циклофосфана увеличение содержания эритрокариоцитов в костном мозге под действием препарата эритропоэтина регистрировалось на 4-е сутки опыта, нормализовалось к 10-м суткам, а уже на 12-е сутки значение показателя существенно превышало исходный уровень (на 128 %) При назначении 5-фторурацила количество эритроидных элементов возрастало позднее - с 6-х суток исследования, и статистически достоверно превосходило уровень интакт-ных животных только на 16-е сутки Активация костномозгового эритропоэза сопровождалась накоплением ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови после введения ЦФ соответственно на 4-12-е и 6-10-е сутки исследования, а в случае использования 5-ФУ - соответственно на 8,14-е и 4-е сутки.

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировала процессы восстановления эритроидного ростка кроветворения при цитостатической болезни Так, препарат значительно увеличивал число эритроидных клеток в костном мозге в условиях введения циклофосфана на 4, 5, 8-12-е сутки опыта Прирост ретикулоцитов в периферической крови отмечался на 5, 6-е сутки исследования, а эритроцитов — на 8-е сутки При моделировании гемодепрессии 5-фторурацилом таблетированная форма эритропоэтина была менее эффективна. Об этом свидетельствовало повышение содержания эритрокариоцитов в костномозговой ткани лишь на 8,12,14-е сутки после введения цитостатика. При этом уровень содержания ретикулоцитов в крови превосходил таковой у мышей, получавших только цитостатик, на 8-е сутки (на 46 %).

При назначении мышам алкилирующего агента поэтам стимулировал регенерацию в эритроидном компартменте кроветворения на 5, 8,10,12-е сутки исследования. В указанные сроки содержание эритрокариоцитов в костном мозге превосходило таковое у контрольных животных в 2,4-10,7 раза, а количество ретикулоцитов — на 13-32 % В свою очередь, поэтам у мышей, получавших предварительно 5-фторурацил, способствовал накоплению эритроидных ядро-содержащих клеток в кроветворной ткани только на 12-е сутки опыта и не оказывал существенного влияния на динамику содержания ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови

Влияние экстракта шлемника байкальского и его флавоноида байкапина на процессы восстановления эритроидного ростка, подавленного алкилирующим агентом, в целом оказалось однотипным. Так, уже с 4-х суток опыта количество эритрокариоцитов в костном мозге животных, получавших данные модификаторы биологических реакций, превышало обнаруженное в контрольной группе, достигая уровня интактных животных на 8-е сутки при введении экстракта, и на 4-е сутки - в случае назначения байкалина. Изменения содержания ретикулоцитов в периферической крови соответствовали описанным выше Причем, под действием экстракта шлемника байкальского накопление клеток происходило более интенсивно, о чем свидетельствовало развитие более выраженного рети-кулоцитоза.

При курсовом введении растительного экстракта резкое увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови мышей (с 5-фторурацилом) обнаруживалось раньше - на 12-е сутки эксперимента, а не на 14-е сутки, как в группе животных, получавших только цитоста-тик В то же время, под влиянием байкалина сдвиги в кроветворной ткани не носили статистически достоверный характер. Однако на 8-е сутки после назначения антиметаболита регистрировался значительный прирост ретикулоцитов, а на 4-е сутки - эритроцитов.

Результаты экспериментальных исследований позволили прийти к выводу о том, что 1М-ацетилнейраминовая кислота обладала способностью в значительной степени стимулировать процессы регенерации эритропоэза при цито-статической болезни, вызванной ЦФ. Так, препарат уже на 4-е сутки опыта нормализовал содержание эритрокариоцитов в костном мозге животных, а в последующем — на 5-е сутки, и вплоть до окончания исследования уровень нуклеаров превосходил исходный В указанные сроки выявлена и нормализация числа ретикулоцитов в периферической крови В свою очередь, динамика содержания эритроцитов в крови изменялась волнообразно и на 5, 8-е сутки исследования их содержание в опыте оказалось достоверно выше, чем у мышей контрольной группы

При введении >1-ацетилнейраминовой кислоты интенсивность прироста эритроидных клеток в системе крови мышей, подвергнутых воздействию 5-фторурацила, значительно уступала таковой в случае использования алкили-рующего агента Действительно, в рассматриваемой ситуации отмечалось статистически достоверное увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге (4-8, 12, 14-е сутки) Однако нормализация их количества происходила только к 16-м суткам, как и в контрольной группе, а гиперплазия и вовсе не обнаруживалась. Отражением стимуляции М-ацетилнейраминовой кислотой костномозгового эритропоэза являлось более раннее, чем в контроле, восстановление содержания ретикулоцитов и развитие ретикулоцитоза в периферической крови

Приведенные выше результаты собственных экспериментальных исследований позволяют сделать заключение о том, что рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского и №-ацетилнейраминовая кислота стимулируют подавленный цитостатиками костномозговой эритропоэз.

При этом существует избирательность действия гемостимуляторов в различные сроки после назначения противоопухолевых средств. В частности, при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом наиболее эффективными с точки зрения нивелирования нарушений в эритроне (1-12-е сутки) являются И-ацетилнейраминовая кислота и рекормон (табл. 2). Байкалин, растительный экстракт, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина и поэтам замыкают ряд Эффективность гемостимуляторов в сроки регенерации эритроидного ростка кроветворения (с 14-х суток), выглядела следующим образом, рекормон > ]Ч-ацетилнейраминовая кислота > таблети-рованный эритропоэтин > байкалин > экстракт шлемника байкальского > поэтам.

В условиях однократного введения фторшримидинового антиметаболита лекарственные средства по способности увеличивать содержание эритрокариоцитов в костном мозге в период развития депрессии эритрона расположились в ином порядке, рекормон > препараты шлемника > 1М-ацетшшейраминовая кислота > поэтам > таблетированный эритропоэтин (табл 2) Значительная активация процессов регенерации отмечалась также под влиянием рекормона и препаратов шлемника байкальского Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, сиаловая кислота и поэтам оказывали менее выраженное стимулирующее действие

Таблица 2

Эффективность действия гемостимуляторов на эритропоэз в условиях цитостатиче-скои болезни____________

Гемостимуляторы Циклофосфан 5-фто1 >урадил

ингибиция регенерация ингибиция регенерация

Рекормон 4 5 5 5

Таблетированный эритропоэтин 2 3 1 3

Поэтам 1 1 2 1

Препараты шлемника 3 2 4 4

М-ацетилнейраадиновая кислота 5 4 3 2

Примечание Цифры отображают увеличение препаратами числа эритрокариоцитов в костном мозге, где 1 - минимальный эффект, 5 — максимальный

Косвенным подтверждением справедливости высказанных предположений явились результаты факторного анализа Так, при обработке данных экспериментов, направленных на изучение влияния гемостимуляторов на содержание эритрокариоцитов в костном мозге при цитостатических миелосупрессиях, методом главных компонент установлено, что в условиях однократного введения циклофосфана высокие значения факторных нагрузок характерны для рекормона (1 фактор; к=0,988) и Ы-ацетилнейраминовой кислоты (1 фактор; к=0,947) (табл. 3) Указанные факторные нагрузки превосходят выявленные в группах с экстрактом шлемника байкальского, таблетированной формой рекормона и по-этамом. При гипоплазии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, наибольший вклад в структуру первой компоненты вносят рекормон (1 фактор, к=0,948) и экстракт шлемника байкальского (1 фактор; к=0,933)

Таблица 3

Факторные нагрузки для данных, полученных при изучении влияния гемостимуляторов на содержание эритрокариоцитов в костном мозге в условиях цитостатических миелосупрессий, после применения метода главных компонент и вращения нормаль-

Гемостимуляторы Циклофосфан 5-фторурацил

Фактор 1 Фактор 2 Фактор 1 Фактор 2

Рекормон 0,987600 0,092257 0,947643 -0,217413

Таблетированный эритропоэтин 0,015503 0,987498 -0,35009 -6,987103

Поэтам 0,549186 0,790460 0,865736 0,093283

Экстракт шлемника байкальского 0,528003 0,558981 0,932810 0,024238

Ы-ацети лнейраминов ая кислота 0,947196 0,281228 0,864869 0,321747

Общая дисперсия 2,453166 2,000041 3,266883 1,134451

Доля общей дисперсии 0,490633 0,400008 0,653377 0,226890

Примечание Курсивом обозначены коэффициенты кррреляции переменных, прошедших редукцию данных

Как уже неоднократно подчеркивалось выше, все изучаемые нами препараты стимулируют процессы регенерации костномозгового эритропоэза у мышей линии СВА/СаЬас при цитостатических воздействиях. Вместе с тем, интенсивность восстановления эритрона в каждом конкретном случае различна По нашему мнению, причиной этого выступает избирательная чувствительность процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров и элементов системы локальной регуляции кроветворения к лекарственным средствам. Для подтверждения выдвинутой гипотезы проведена серия экспериментов, которая была посвящена изучению локальных механизмов регулятор-ного влияния рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, экстракта шлемника байкальского и КГ-ацетил-нейраминовой кислоты на пул коммитированных предшественников эритропоэза и ГИМ на моделях различных цитостатических миелосупрессий

В ходе проведенных экспериментов нами выявлено, что рекормон в значительной степени увеличивал функциональную активность прекурсоров эритропоэза уже на 3-й сутки опыта после назначения циклофосфана, что приводило к статистически достоверному возрастанию темпов деления (3-8-е сутки) и созревания (5-е сутки) прекурсоров эршропоэза выше исходного. При этом имело место ускорение образования макрофагпозитивных (3-5, 8-12-е сутки) и эритроидных (4-12-е сутки) гемопоэтических островков, обнаруживалось возрастание уровней ЭПА в супернатантах от прилипающих (3-12-е сутки) и неприлипающих (4-12-е сутки) миелокариоцитов и в сыворотке периферической крови (4-12-е сутки).

В рассматриваемой модельной ситуации таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировала пролиферативную активность эритроидных предшественников на 3, 5-е сутки опыта, а интенсивность их дифференцировки - на 3-6-е сутки. В более поздние сроки, напротив, происходило угнетение деления (6, 8-е сутки) и созревания (10-е сутки) клеток При исследовании структурно-функциональной организации костного мозга было установлено, что препарат усиливал формирование макрофагположитель-ных (3-5, 12-е сутки) и эритроидных (6, 10-е сутки) клеточных комплексов, существенно стимулировал рост секреторной активности адгезирующих (5, 6, 8, 12-е сутки) и неадгезирующих (4, 5, 8-е сутки) клеток ГИМ. Таблетированный эритропоэтин увеличивал уровень ЭПА в сыворотке крови.

Увеличение активности процессов в отделе эритроидных клеток-предшественников под влиянием поэтама приводило к нормализации темпов деления и созревания прекурсоров на 5, 6,8-е сутки после назначения ЦФ. Вместе с тем, на 12-е сутки исследования значение соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э становилось достоверно ниже такового в интактном контроле Одновременно с увеличением числа предшественников в опытной группе регистрировалась значительная стимуляция формирования в костном мозге новых ассоциаций с мак-рофагальной клеткой (5, 8, 10, 12-е сутки) и гемопоэтических островков эрит-роидного типа (5, 6, 8, 10, 12-е сутки). Анализ уровней ЭПА в биологических средах позволил сделать вывод о том, что поэтам оказывал стимулирующее влияние на продукцию активности прилипающими миелокариоцитами, сывороткой крови и, в меньшей степени, клетками неадгезирующей фракции ГИМ.

При изучении локальных механизмов гемостимулирукяцих эффектов экстракта шлемника байкальского было установлено, что его введение приводит к накоплению коммитированных предшественников эритропоэза в кроветворной ткани животных с циклофосфаном на 4-12-е сутки опыта Практически в те же сроки наблюдалась активация процессов пролиферации (3-6-е сутки) и диффе-ренцировки (3, 5, 6, 12-е сутки) прекурсоров Стимулирующее влияние растительного экстракта распространялось и на ГИМ, о чем, в частности, свидетельствовало усиление образования макрофагпозитивных ГО (3-5, 10-12-е сутки) и клеточных комплексов эритроидного типа (4, 6, 10-е сутки) Наряду с этим, препарат вызывал повышение уровня ЭПА как в супернатантах от адгезирую-щих (3, 4, 6, 8, 12-е сутки) и неадгезирующих (4-6, 12-е сутки) миелокариоци-тов, так и в сыворотке крови (3,4, 6, 8, 12-е сутки).

Введение К-ацетилнейраминовой кислоты мышам, получавшим предварительно алкилирующий агент, приводило к повышению темпов деления (4, 5-е сутки) и скорости созревания (6, 12-е сутки) КОЕ-Э, благодаря чему содержание предшественников эритропоэза (4-6, 8-е сутки) в костном мозге увеличивалось Сиаловая кислота в значительной степени способствовала образованию дополнительных очагов эритроидного кроветворения (5-12-е сутки). Стимулирующее действие препарат оказывал и на секрецию ЭПА прилипающими (8-е сутки) и неприлипающими (6-е сутки) клетками костного мозга. Вместе с тем, следует отметить, что на 4, 10, 12-е сутки исследования интенсивность продукции факторов роста КОЕ-Э неприлипающими нуклеарами ГИМ уступала таковой в контрольной группе (без гемостимулятора) Сдвиги со стороны уровня активности в сыворотке крови под влиянием 1Ч-ацетилнейраминовой кислоты были незначительны

В условиях моделирования цитостатической болезни 5-фторурацилом (препаратом более токсичным, чем циклофосфан) изменения со стороны пула коммитированных предшественников эритропоэза и кроветворного микроокружения под влиянием стимуляторов эритрона носили иной характер. Так, под влиянием рекормона статистически достоверное увеличение выхода КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде отмечалось только в период активной регенерации кроветворной ткани (14-е сутки). Вместе с тем, рост темпов деления эритроид-ных предшественников обнаруживался в сроки ингибиции эритрона (5-8-е сутки), а интенсивность дифференцировки клеток - практически на протяжении всего периода наблюдения (3, 4, 6, 12-16-е сутки). Применение рекомбинантного эритропоэтина приводило и к ускоренному формированию макрофагпозитивных клеточных комплексов (3-5, 8, 12-16-е сутки) и накоплению числа эритро-идных ГО (3-14-е сутки). Причем в указанные сроки наблюдалось и значительное возрастание уровня ЭПА в супернатантах от адгезирующих клеток ГИМ и в сыворотке крови. В свою очередь, после подъема секреторной активности не-прилипающих нуклеаров на 6-е сутки исследования отмечалось снижение величины данного показателя на 8-10-е сутки.

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина вызывала неоднозначные сдвиги со стороны функциональной активности пула прекурсоров эритропоэза мышей после введения 5-ФУ. В частности, первона-

чально препарат усугублял ингибицию образования КОЕ-Э (3-8-е сутки) и снижал темпы деления предшественников (4-6-е сутки), но в значительной степени стимулировал скорость дифференцировки клеток (4-6-е сутки) В дальнейшем активность пролиферации прекурсоров, напротив, существенно превосходила наблюдаемую в контрольной группе (10-14-е сутки), а интенсивность их созревания падала (8, 14, 16-е сутки). Препарат способствовал восстановлению функций кроветворного микроокружения, о чем свидетельствовало активное формирование эритроидных гемопоэтических островков и резкое возрастание продукции ЭПА адгезирующими миелокариоцитами на протяжении всего периода исследования. В то же время, имело место повышение активности гуморальных факторов сыворотки крови (3-5, 8, 10,14, 16-е сутки) Обращал на себя внимание тот факт, что после кратковременной стимуляции продукции факторов роста неприлипающими клетками костного мозга на 4-е сутки после назначения 5-ФУ регистрировалось падение уровня показателя ниже контрольного на 8,10-е сутки.

Назначение поэтама сопровождалось продолжительным угнетением роста КОЕ-Э в метияцеллюлозной среде (3, 4, 12, 16-е сутки) и процессов пролиферации (4-6, 14, 16-е сутки) и дифференцировки (5, 14, 16-е сутки) прекурсоров эритропоэза в костном мозге животных в условиях введения антиметаболита. Следствием ингибиции функциональной активности предшественников выступало усугубление депрессии эритрона в указанные сроки Между тем, на 10-е сутки опыта отмечался рост числа КОЕ-Э, находящихся в 8-фазе митотическо-го цикла, а на 12-е сутки - величины соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э. Это приводило к восстановлению содержания эритрокариоцитов в костном мозге на 12-е сутки эксперимента. Неоднозначное действие препарат оказывал и на 1фОве-творное микроокружение. В частности, на ряду с периодами стимуляции организации дополнительных очагов кроветворения (5, 12-е сутки) и секреции ци-токинов прилипающими нуклеарами (4,5,8-е сутки), в определенные сроки регистрировалась иншбиция процессов формирования клеточных комплексов эритроидного типа (10-е сутки), продукции ЭПА адгезирующими (12,14-е сутки) и неадгезирующими (8, 12-16-е сутки) миелокариоцитами Волнообразно изменялся уровень сывороточных факторов роста. После увеличения ЭПА на 4-е сутки опыта регистрировалось падение величины показателя на 5-е сутки, которое вновь возрастало на 14-16-е сутки

Экстракт шлемника байкальского нормализовал колониеобразующую способность костного мозга и функциональную активность эритроидных предшественников на 3-й сутки после введения 5-ФУ Однако в дальнейшем сдвиги со стороны изучаемых процессов были не столь однозначны. В частности, на 1216-е сутки эксперимента содержание предшественников в силу угнетения их пролиферативной активности значительно уступало таковому в контрольной группе Этому предшествовало снижение скорости созревания эритроидных клеток на 8, 10-е сутки. Вместе с тем, на 6,12-16-е сутки опыта величина соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э, напротив, резко возрастала Неоднозначно действие растительного экстракта и на ГИМ. Препарат нарушал образование эритроидных ГО. В свою очередь, на уровень ЭПА в биологических средах шлемник

байкальский оказывал модулирующее влияние, в сроки ингибиции эритроидно-го ростка имело место увеличение ЭПА в супернатантах от костномозговых нуклеаров и и в сыворотке крови. В поздние сроки препарат увеличивал преимущественно ЭПА неадгезирующих миелокариоцитов костного мозга.

В условиях назначения Ы-ацетилнейраминовой кислоты стимуляции роста КОЕ-Э (6, 8-е сутки) в метилцеллюлозной среде предшествовало увеличение интенсивности дифференцировки прекурсоров эритропоэза (4, 6-е сутки) в костном мозге мышей на фоне введения антиметаболита. Однако позднее темпы деления (14-е сутки) и скорость созревания (14, 16-е сутки) эритроид-ных предшественников падали до уровня интактного контроля. Со стороны динамики содержания клеточных комплексов в костномозговой ткани отмечалась обратная закономерность. Первоначальное (6-10-е сутки) угнетение формирования эритроидных ГО сменялось на усиление формирования дополнительных очагов кроветворения в более поздние сроки (12, 14-е сутки). Сиаловая кислота неоднозначно изменяла и уровень ЭПА в биологических средах Так, если секреторная активность адгезирующих клеток ГИМ возрастала, то уровень гемопоэтических факторов роста в супернатантах неприли-пающих миелокариоцитов (8-е сутки) и в сыворотке крови (6, 10-14-е сутки) значительно уступал контрольным значениям

Таким образом, стимуляция рекормоном, таблетированной формой реком-бинантного человеческого эритропоэтина, поэтамом, экстрактом шлемника байкальского и Ы-ацетилнейраминовой кислотой подавленного цитостатиками эритроидного реетка кроветворения обусловлена восстановлением (и/или активацией) процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров и функций ГИМ При этом прослеживается различный уровень изменений величин показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемоетимуляторов.

Используя некоторые многомерные методы статистической обработки результатов экспериментов, мы попытались ответить на вопрос, в чем заключается причина различной эффективности исследуемых в работе лекарственных средств в отношении эритроидного ростка кроветворения при щиосгашческих воздействиях.

Прежде всего, наше внимание было обращено на препараты, созданные на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина (рекормон, таблетиро-ванная форма эритропоэтина), являющегося, с одной стороны, гормоном, поскольку выделяется в кровь и транспортируется к клеткам-мишеням, а с другой стороны, его с полным правом можно отнести к группе веществ, объединяемых понятием «цитокины»

При проведении анализа собственных экспериментальных данных с помощью метода главных компонент установлено, что основной причиной ускорения рекормоном восстановления эритрона при цитостатической гемодепрессии выступала активация процессов в отделе эритроидных предшественников, о чем свидетельствовала большая доля изменчивости дисперсии компонент, в структуру которой входит пролиферация и дифференцировка прекурсоров (рис. 2). Увеличение функциональной активности ГИМ отодвигалось на второй план.

Причем если в условиях введения циклофосфана рекормон оказывал влияние на формирование эритроидных ГО и уровень ЭПА в биологических средах, то в случае использования 5-фторурацила — только на продукцию активностей мие-локариоцитами

Рис 2 Влияние рекормона на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эршропоэза мышей линии СВА/СаЬас в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов)

Структура корреляционных взаимоотношений между показателями эри-трона при использовании рекормона в условиях цитостатических воздействий однотипна На фоне существующих коррелятов прослеживалась организация дополнительных причинно-следственных связей между кроветворным микроокружением (содержание ГО, уровень ЭПА в биологических средах) и процессами пролиферации и дифференцировки прекурсоров эритропоэза.

При курсовом введении таблетированной формы эритропоэтина (как и в случае использования рекормона) высокие темпы деления и созревания эритроидных предшественников выступали в качестве основной причины, определяющей ускоренное восстановление содержания эритрокариоцитов в костном мозге мышей при цитостатических воздействиях (рис 3) Вместе с тем, при назначении циклофосфана прослеживались сдвиги общей дисперсии таких характеристик ГИМ, как клеточные комплексы эритроидного типа и продукция ЭПА клетками костного мозга В случае назначения 5-фторурацила снижалась величина дисперсии уровня гемопоэтических факторов роста в супернатантах мие-локариоцитов и сыворотке крови (рис 3)

Циклофосфан 5-фторурацш

Рис 3 Влияние таблетированной формы эритропоэтина на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии СВА/СаЬас в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов)

Под влиянием таблетированной формы эритропоэтина структура корреляционных взаимоотношений параметров эритропоэза при цитостатических воздействиях оставалась практически без изменений (рис. 3). Исключение составили корреляции, возникающие между формированием дополнительных очагов кроветворения и продукцией активностей клетками костного мозга при введении ЦФ, и взаимосвязь прекурсоров и секреторной активности прилипающих (г=0,742; р=0,014) и неприлипающих (г=0,827, р=0,003) миелокариоцитов в случае назначения 5-ФУ

Выявленная избирательность действия препаратов на основе рекомбинант-ного человеческого эритропоэтина была ожидаемой Вместе с тем, при стимуляции деления и созревания эритроидных клеток и одновременной задержке восстановления структурно-функциональной целостности костного мозга существует опасность повреждения «глубокого» резерва эритропоэза в условиях применения 5-ФУ - истощение пула клеток-предшественников и развитие различных рецидивов, на что и указывает увеличение числа коррелятов в опыте

При рассмотрении факторных нагрузок переменных эритропоэза в условиях последовательного введения поэтама и циклофосфана было обнаружено, что лекарственное средство вызывало наибольшие изменения дисперсии со стороны переменных, характеризующих восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга и увеличение уровня ЭПА в биологических средах (рис 4). В условиях гемодепрессии, вызванной введением 5-фторурацила, наибольшие сдвиги под влиянием препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину были свойственны продукции ЭПА адгезирующими нуклеарами и сывороткой крови (рис. 4). В то же время следует отметать, что в обеих патологических ситуациях величина дисперсии компонент, представленных содержанием коммитированных клеток-предшественников и их функциональной активностью, оставалась практически неизменной

Циклофосфан 5-фторурацил

ЭПА,

ЭНАн

ЭПАс

ЭГО Прекурсоры

Рис 4 Влияние поэтама на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии СВА/СаЛ-ас в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов) По данным корреляционного анализа, в условиях введения циклофосфана поэтам разрушал корреляты между показателями эритропоэза, наблюдаемые в контрольной группе (рис 4) Количество связей практически не отличалось от такового в интактном контроле. Однако в случае применения 5-фторурацила была обнаружена высокая степень координации между увеличением темпов деления предшественников и секреторной активности прилипающих клеток

(г=0,644; р=0,045), а также ростом скорости созревания и продукцией ЭПА не-прилипающими миелокариоцитами (г=0,786; р=0,007). Объяснение полученным феноменам, с нашей точки зрения, находится в более токсичном действии на организм антиметаболита, чем алкилирующего агента Именно различная чувствительность кроветворной ткани к цитостатикам и определила различные темпы восстановления функций отдельных элементов ГИМ (более высокие при назначении ЦФ, чем 5-ФУ), что, в свою очередь, нашло свое отражение в картине корреляционных взаимоотношений показателей эритрона. В силу этого синхронизация ряда процессов в системе локальной регуляции под влиянием поэтама свидетельствовала о незавершенности регенерации подавленного 5-ФУ эригропоэза.

Как и при назначении поэтама, стимуляция экстрактом шлемника байкальского процессов регенерации, в первую очередь, была связана с увеличением уровня ЭПА в биологических средах (рис. 5). Причем при моделировании ге-модепрессии циклофосфаном формирование клеточных комплексов эритроид-ного типа и ГО с центрально расположенным макрофагом и функциональная активность эритроидных прекурсоров во многом способствовали восстановлению клеточности костного мозга Однако величина их изменчивости уступала сдвигам дисперсии компоненты, в состав которой входит продукция ЭПА неад-гезирующими нуклеарами.

В условиях введения 5-фторурацила регуляторное влияние растительного экстракта на эритрон через изменение активности процессов пролиферации и дифференцировки коммитированных предшественников также отодвигалась на второй план. Как видно из представленных величин дисперсии, стимулирующее действие препарат оказывал на кроветворное микроокружение (в том числе, и на ЭПА сыворотки крови), что свидетельствовало в пользу значения дистантных механизмов в реализации регуляторных влияний экстракта шлемника байкальского на эритропоэз На это указывали вновь возникшие корреляты между показателями гуморальной составляющей системы локальной регуляции в обеих моделях цитостатической болезни (рис. 5). Отражением синхронной стимуляции роста КОЕ-Э и формирования эритроидных ГО выступала прямая корреляция между показателями (г=0,861, р=0,006).

Рис 5 Влияние экстракта шлемника байкальского на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эригропоэза мышей линии СВА/СаЬас в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов)

Интересные результаты получены при факторном анализе данных эксперимента по влиянию И-ацетилнейраминовой кислоты на систему локальной регуляции эритропоэза в условиях цитостатических гемодепрессий. В частности, при назначении циклофосфана и сиаловой кислоты наибольшие изменения дисперсии выявлены со стороны компонент, в состав которых входят переменные, характеризующие функциональную активность адгезирующих клеток кроветворного микроокружения — содержание клеточных комплексов эритро-идного типа, интенсивность продукции ЭПА клетками адгезирующей фракции ГИМ (рис. 6) Изменчивость предшественников и уровней гуморальных факторов в кондиционных средах неприлипающих нуклеаров и сыворотке крови отодвигалась на второй план. Появление отрицательной корреляции между двумя противоположными процессами - усилением формирования ГО с центрально расположенным макрофагом и ингибицией митотической активности КОЕ-Э, выступало дополнительным доказательством зависимости увеличения числа эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови, в первую очередь, от восстановления "М-ацетилнейраминовой кислотой структурно-функциональной целостности костного мозга мышей, перенесших введение ЦФ (рис. 6).

В условиях коррекции сиаловой кислотой нарушений в системе крови, вызванных 5-фторурацилом, также прослеживался преимущественный вклад секреторной активности прилипающих клеток ГИМ в стимуляцию процессов регенерации эритрона. При этом высока изменчивость дисперсии компонент, в состав которых входят пролиферативная активность и интенсивность диффе-ренцировки эритроидных предшественников (рис. 6). Корреляционная картина усложнялась появлением дополнительных связей между делящимися предшественниками и уровнем ЭПА в супернатантах адгезирующих миелокариоцитов (рис. 6).

Циклофосфан 5-фторурацил

Рис. 6 Влияние И-ацетилнейраминовой кислоты на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эршропоэза мышей линии СВА/СаЬас в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов)

Итак, есть все основания для заключения о том, что избирательная чувствительность коммитированных предшественников и элементов ГИМ к гемо-стимуляторам диктуют различные темпы и характер восстановления клеточно-сти эритроидного ростка при цитостатических воздействиях (табл 4) Так, мишенью для рекормона, таблетированной формы эритропоэтина и, в меньшей

степени, сиаловой кислоты являлись прекурсоры В свою очередь, Ы-ацетилнейраминовая кислота оказывает преимущественное влияние на формирование эритроидных клеточных комплексов. С модуляцией активности гуморальных регуляторов кроветворения связано стимулирующее действие экстракта шлемника байкальского и поэтама (табл 4)

Таблица 4

Избирательная чувствительность механизмов регуляции эритропоэза к гемостимуля-торам при цитостатических воздействиях (по результатам многомерного анализа собственных экспериментальных исследований и данным литературы)

Гемостимуяяторы Мишень {или реакция)

Рекормон Эритроидные прекурсоры

Таблегированная форма эритропоэтина Эритроидные прекурсоры

Поэтам Гуморальные регуляторы кроветворения

Экстракт шлемника байкальского Гуморальные регуляторы кроветворения

Ы-ацетилнейраминовая кислота Клетки кроветворного микроокружения

Выявленное нами преимущество фармакологических эффектов лекарственных средств в условиях введения циклофосфана над таковыми при назначении 5-фторурацила главным образом связано с более токсичным действием антиметаболита на систему крови.

Сопоставляя результаты собственных исследований об особенностях механизмов повреждающего влияния циклофосфана и 5-фторурацила на эритрон и данные об индивидуальной чувствительности элементов локальной регуляции к действию гемостимуляторов, можно допустить, что на модели миелосупрессии, вызванной алкилирукмцим агентом, препараты, обладающие способностью активировать процессы в отделе эритроидных предшественников, будут наиболее эффективны. В свою очередь, антиметаболит требует применения лекарственных средств с преимущественным стимулирующим влиянием на кроветворное мтсроокружение Действительно, приведенные в табл 5 интегральные показатели костномозгового эритропоэза подтверждают нашу гипотезу.

Как видно, механизмы действия противоопухолевых препаратов на кроветворную ткань во многом регламентируют применение гемостимуляторов. Но с нашей точки зрения наиболее перспективным является комплексная фармакологическая коррекция нарушений эритропоэза, вызванных цитостатиками при проведении противоопухолевой химиотерапии. Правомочность такого подхода подтвердилась результатами собственных экспериментов и данными литературы

Прежде всего хотелось остановиться на возможности активирующего действия гемостимуляторов на кроветворные клетки или на различные элементы системы локальной регуляции эритропоэза Неизбежность истощения коммутированных прекурсоров, ГИМ и, как следствие, развития осложнений цитоста-тической болезни при введении рекормона, таблетированной формы эритропо-этина (5-фторурацил, в меньшей степени, циклофосфан) и И-ацетилнейрамино-

вой кислоты (5-фторурацил) заставляет отказаться от монотерапии. Более перспективным для лечения цитостатических анемий, с нашей точки зрения, является комплексное воздействие на кроветворную ткань: одновременное восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга и активности предшественников

Таблица 5

Влияние гемостимуляторов на величину интегральных показателей эритроноэза мышей линии СВА/Са1ас при цитостатических воздействиях (% от цитостатического контроля)______

Циклофосфан 5-фторурацил

Гемостимуляторы Ингибиция Регенерация Ингибиция Регенерация

Эритроидные прекурсоры

Рекормон 329 246 116 115

Таблетированная форма эритропоэтина 270 221 61 118

Продукция ЭПА прилипающими миелокариоцитами

197 294 97 118

Поэтам Продукция ЭПА неприлипающими миелокариоцитами

128 55 71 49

Уровень ЭПА в сыворотке крови

124 88 107 245

Эритро-гранулоцитарный ГО

Экстракт шлемника 85 93 115 435

байкальского Эритроидный ГО

160 237 102 97

Эритро-гранулоцитарный ГО

Н-ацетилнейраминовая 287 249 263 756

кислота Эритроидный ГО

265 354 I 146 I 82

Результаты опытов показали, что в метилцеллюлозной среде № ацетилнейраминовая кислота (50 мкг/мл) значительно увеличивала способность прилипающих клеток связывать обработанные рекормоном (0,5 Ед/мл) эритро-идные предшественники Интенсивность роста КОЕ-Э в опыте превосходила таковую в контрольных группах (без препаратов) на 50 %. Преинкубация адге-зирующих миелокариоцитов с циклофосфаном (20 мкг/мл) приводила к существенному угнетению фидерной активности макрофагов в отношении ивтакт-ных эритроидных прекурсоров. Обработка Ы-ацетилнейраминовой кислотой или экстрактом шлемника байкальского (50 мкг/мл) подвергнутых цитостати-ческому воздействию прилипающих клеток ГИМ, а коммитированных предшественников эритропоэза - рекормоном препятствовала ингибиции эритроидно-го колониеобразования. Причем наиболее выраженный эффект отмечался в случае добавления в культуру костного мозга сиаловой кислоты.

В целом, результаты представленных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что возможны разнообразные подходы фармакологиче-

ской коррекции нарушений эритропоэза, вызванных цитостатиками при проведении противоопухолевой химиотерапии. Мы постарались проиллюстрировать это настоящей схемой (рис 7). Следует выделить еще два направления лечебных воздействий, позволяющих минимизировать патогенное влияние цитоста-тиков. Первое из них - терапевтические мероприятия, направленные на повышение "неврозоустойчивости" (резистентности к психоэмоциональному стрессу) больных Согласно современным представлениям, состояние ВНС во многом является определяющим в развитии соматической патологии. Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что при назначении цикловой полихимиотерапии при раке легкого имеет место проградиентное, сообразно проведенным курсам лечения* снижение числа пациентов с сохранной реактивностью и формирующееся преобладание лиц с "симпатико-" и "гиперсимапатикотонией" [Рыжаков В.М., 1998} Безусловно, данное обстоятельство усугубляет состояние системы крови при злокачественном новообразовании в условиях химиотера-певтической "агрессии". Однако превентивное назначение и включение в схему противоопухолевой химиотерапии скутекса (сухой экстракт шлемника байкальского в таблетках) приводит к физиологически оправданной модуляции тонуса и реактивности ВНС не только повышая число пациентов с исходной "нормо-тонией" и сохранной реактивностью, но и поддерживая на должном уровне представительство лиц с данными характеристиками Это является решающим фактором в стимуляции процессов регенерации костномозгового эритро- и гра-нуломоноцитопоэза, закономерным следствием чего является возрастание числа ретикулоцитов и лейкоцитов в периферической крови.

Второй подход связан с нивелированием уже наступивших в результате цитостатических воздействий нарушений дистантных механизмов регуляции системы крови. К настоящему времени предложены методы лечения цитостатических миелоеупрессий с помощью фармакологических модуляторов активности симпатического отдела ВНС [Гольдберг Е Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А., 1997] Эффективность применения симпатолитика, нейролептика и антисерото-нинового препарата резко возрастала в случае дополнительного применения рекомбинантных форм цитокинов (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин) [Минакова М.Ю., Скурихин Е.Г., Першина О В, 2007]. Продемонстрировано, что комбинация лекарственных средств регламентируется типом цитостатического воздействия. В частности, более быстрое восстановление подавленного циклофосфаном гранулоцитопоэза имело место при назначении резерпина и Г-КСФ. Фармакологическое вмешательство в процессы регенерации эритропоэза при назначении 5-фторурацила должно включать препараты, с одной стороны, угнетающие активность серотонинергических структур мозга - ципрогептадин, с другой стороны, стимулирующие эритроидные предшественники - рекормон.

В наших экспериментах установлено, что стимуляция т vitro серотонинергических или /?-адренергических структур на предварительно обработанных циклофосфаном макрофагах и (или) на интактных коммитированных кроветворных предшественниках восстанавливала до уровня интактного контроля способность прилипающих элементов к связыванию эритроидных прекурсоров

Нейроэндокринная # система

XI

Повышение неврозоустойчивости, снижение тонуса ВНС (препараты шлемника байкальского), и активация процессов в отделе прекурсоров эритропоэза (препараты на основе рекомоинантного эритропоэтина)

Восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга (Я-ацетилнейраминовая кислота, моноамины периферического действия) и увеличение темпов деления и созревания прекурсоров эритропоэза (препараты на основе рекомбинантного эритропоэтина)

Модуляция активности центральных нейроэндокринных структур регуляции эритропоэза (симпатотттк, нейролептик, антисеротониновый препарат) и активация прекурсоров эритропоэза (препараты на основе рекомоинантного эритропоэтина)

и дифференцировки прекурсоров эритропоэза (препараты на основе рекомоинантного эритропоэтина) и стимуляция продукции эндогенного эритропоэтина (поэтам) ¡ш

Рис 7 Подходы к фармакологической коррекции нарушений костномозгового эритропоэза При щпостатических воздействиях (на основе данных литературы и результатов собственны: экспериментальных исследований)

Вполне вероятно, что "точечное" воздействие моноаминами на эритроидные клетки и клетки кроветворного микроокружения способно позитивно влиять на состояние системы крови при цитостатической болезни. Однако технически исполнить подобный маневр в условиях целостного организма весьма затруднительно Возникает опасность фармакологического вмешательства в функции не только периферического звена регуляции кроветворения, но и дополнительной активации механизмов, контролирующих стрессорную реакцию, стимуляция которой чревата усилением повреждающего воздействия цитостатических препаратов [Гольдберг Е Д, Дыгай А.М, Хлусов И. А. и др., 1993].

В заключение этого раздела исследования мы попытались ответить на вопрос о правомерности предложенных нами подходов фармакологической коррекции нарушений в эритроне при патологии, вызванной введением цитостати-ков с отличным от циклофосфана и 5-фторурацила механизмом действия Для моделирования гипопластического состояния кроветворной ткани использовался противоопухолевый препарат карбоплатин, обладающий помимо цитостати-ческого эффекта выраженным нефротоксическим действием, и адриамицин, прямой повреждающий эффект которого в отношении мембран клеток и митохондрий связан с липофильностыо антрациклинов [Тетерина В И., Пичугина Т В, Колмогорова JI А. и др, 1980; Гольдберг Е Д, Новицкий В В., 1986, Пере-водчикова НИ, 1993, Lohrmann HP., Schreml W., 1982, Del Bino G., Darzynkiewicz Z, 1991, Masunaga H., Takáhira R., Sawai Т., 1991]

Проведенные эксперименты позволили установить, что введение в МПД карбоплатина или адриамицина вызывало существенное падение содержания эритрокариоцитов (3-5, 7, 9-12-е и 3, 4-е сутки соответственно) и эритроидных предшественников (7-е и 4, 5, 6, 15-е сутки соответственно) в костном мозге. Однако цитостатики не только ингибировали рост КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде Так, на 3, 4, 6, 8, 9, 12, 15-е сутки после назначения карбоплатина отмечалась стимуляция эритроидного колониеобразования. В случае адриамицина увеличение показателя регистрировалось на 3, 7, 9, 10-е сутки. Одновременно со сдвигами в костном мозге имело место развитие ретикулоцитопении и эрит-роцитопении, уменьшение количества гематокрита и гемоглобина в периферической крови. Наиболее выраженные нарушения в крови наблюдались в условиях введения карбоплатина.

Несколько неожиданным было длительное усиление выхода КОЕ-Э в культуре костного мозга мышей с карбоплатином Детальный анализ функциональной активности прекурсоров эритропоэза позволил выявить, что этому феномену сопутствовало увеличение содержания эритроидных прекурсоров в S-фазе митотического цикла на 3-6, 9-е сутки исследования На 7, 12, 15-е сутки опыта величина показателя, напротив, падала В то же время, скорость созревания коммитированных предшественников в зрелые эритроидные клетки снижалась на протяжении всех сроков исследования

Результаты серии экспериментов по изучению состояния ГИМ в условиях введения цитостатиков показали, что карбоплатин способствовал увеличению продукции ЭПА прилипающими нуклеарами костного мозга (4,15-е сутки) и не изменял секреторную активность неадгезируюхцих миелокариоцитов. В то же

время, при назначении адриамицина уровень факторов роста в кондиционных средах клеток кроветворного микроокружения не превышал таковой в интакт-ном контроле.

Использование иммуноферментного анализа позволило выявить статистически достоверное снижение концентрации ЭП в сыворотке крови животных с карбоплатином до 0,21+0,02 ти/мл при 1,24+0,05 тО/мл в интактном контроле на 3-й сутки опыта. Начиная с 4-х суток после введения цитостатика, отмечалось поступательное увеличение уровня гемопоэтина, достигшее своих максимальных значений на 12-е сутки (35,82+0,23 ти/мл). Динамика содержания эртропоэтина в крови в условиях введения адриамицина в целом соответствовала описанной выше

Представленные результаты исследований указывают на зависимость развивающейся депрессии эритропоэза при назначении карбоплатина и адриамицина от угнетения и/или дискоординации процессов пролиферации и диффе-ренцировки коммитированных предшественников эритропоэза, а также нарушения секреторной активности клеток прилипающей фракции ГИМ и уменьшения концентрации эндогенного сывороточного эритропоэтина. В силу этого, предположительно, рекормон и поэтам будут наиболее предпочтительными в ряду исследованных гемосгимуляторов при лечении анемий, вызванных введением карбоплатина и адриамицина.

В ходе экспериментов было показано, что введение исследуемых стимуляторов эритропоэза существенно изменяло характер восстановления эритрона, подавленного карбоплатином. Так, в обеих опытных группах число ретикуло-цитов в периферической крови значительно превосходило таковое в цитостати-ческом контроле Причем величина данного показателя была повышена на протяжении практически всего эксперимента. Примечательно, что в случае применения рекормона максимальное увеличение поступления ретикулоцитов в кровь выявлено на 5-е сутки опыта (до 1004 % от исходного уровня), при использовании поэтама - на 12-е сутки (до 392 %). Препараты способствовали и возрастанию количества эритроцитов, гематокрита и гемоглобина (в большей степени - рекормон). В противоположность этому, на 9, 10 и 12-е сутки эксперимента при введении эритропоэтина и на 9-е сутки при назначении поэтама отмечалось статистически достоверное падение уровня эритроцитов, гематокрита и гемоглобина

Описанная в группах с гемостимуляторами картина периферической крови явилась отражением увеличения количества эритрокариоцитов в костном мозге: при курсовом введении рекормона - на 3-5,7,12-е сутки опыта, а поэтама -на 4, 5, 12-е сутки Сопоставление значений показателя в опытных группах позволило обнаружить, что если в начальные сроки наблюдения более эффективным оказывался рекормон (3-5-е сутки), то препарат сверхмалых доз антител к ЭП - в более поздний период (6,8,15-е сутки). Любопытно отметить, что на 15-е сутки после введения карбоплатина рекормон, в противоположность поэтаму, снижал число эритрокариоцитов до 59,2 % от контроля

Культуральные исследования фармакологического действия препаратов на эритропоэз доказали зависимость описанных реакций системы крови от увели-

чтения содержания эритроидных предшественников в кроветворной ткани: на 3, 7, 8-е сутки опыта - при использовании рекормона и на 4, 8, 15-е сутки - при введении поэтама Однако кроме увеличения роста КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде рекомбинантный эритропоэтин снижал величину показателя ниже контрольных значений на 6, 9, 12, 15-е сутки (наиболее выражено на 15-е сутки -до 53,3 %).

Исследование функциональной активности коммитированных предшественников эритропоэза выявило разнонаправленные изменения темпов деления и скорости созревания КОЕ-Э в обеих опытных группах. Так, если при введении рекормона первоначальное увеличение (3, 4-е сутки) пула активно проли-ферирующих прекурсоров сменялось на последующее снижение величины показателя (5, 6, 9, 12, 15-е сутки), то лечение поэтамом приводило к повышению числа КОЕ-Э, находящихся в S-фазе митотического цикла, практически во все сроки наблюдения Следует отметить, что на 3, 4-е сутки опыта пролифератив-ная активность эритроидных клеток в группе с поэтамом была существенно ниже, чем в случае назначения рекомбинантного эритропоэтина Интенсивность дифференцировки эритроидных предшественников повышалась под действием обоих исследуемых препаратов преимущественно в ранние сроки исследования С 7-х суток исследования регистрировалось падение величины соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э.

Как было продемонстрировано на моделях цитостатической болезни, вызванной введением циклофосфана или 5-фторурацила, регуляторное влияние рекормона и поэтама во многом осуществляется посредством гуморальных эри-тропоэтических факторов. У животных, получавших карбоплатин, гемостиму-ляторы отменяли угнетение цитостатиком продукции почками эритропоэтина на 3-е сутки эксперимента Статистически достоверное увеличение концентрации сывороточного ЭП регистрировалось и в более поздние сроки исследования: при назначении рекормона на 3-7, 9,10, 12-е сутки, а в случае использования поэтама - на 3, 5-7, 9, 10-е сутки При этом закономерным было значительно более выраженное увеличение данного параметра в группе мышей, получавших препарат рекомбинантного эритропоэтина (до 10772 % на 5-е сутки от контрольных значений), в связи с детекцией в сыворотке вводимой извне субстанции [Синюхин В Н и др, 1997]. В противоположность этому, на 15-е сутки эксперимента в обеих опытных группах наблюдалось статистически достоверное падение уровня ЭП в сыворотке крови по сравнению с цитостатическим контролем (более существенное у животных с рекормоном). Данное обстоятельство, вероятно, явилось следствием усиления нефротоксического действия карбоплатина в результате дополнительного «напряжения» под влиянием препаратов интерстициальных почечных клеток, закономерно приводящего к усугублению их повреждения и ускорению декомпенсации эритропоэтин-продуцирующего аппарата

Гемосшмуляторы ускоряли процессы восстановления подавленного ад-риамицином эритропоэза Так, если рекормон увеличивал содержание эритро-кариоцитов в костном мозге на 4-6, 8-10,12-е сутки опыта, то при введении поэтама накопление нуклеаров имело место на 6, 9, 12-е сутки Как и при назна-

чении карбоплатина, в рассматриваемой модели цитостатической патологии рекомбинантный эритропоэтии вызывал более выраженное повышение величины показателя в начальные сроки исследования (3-6, 8, 10-е сутки), а препарат сверхмалых доз антител к эритропоэтину - в более поздние сроки (12, 15-е сутки) Причем к 15-м суткам исследования число эритрокариоцитов в кроветворной ткани в опыте с поэтамом на 34 % превосходило таковое в группе с ре-кормоном

Курсовое введение стимуляторов эритропоэза вызывало статистически достоверное возрастание колоний эритроидного типа в метилцеллюлозной среде: рекомбинантный эритропоэтин - на 4-10,15-е сутки опыта, поэтам - на 4, 10, 12,15-е сутки При этом сравнительный анализ влияния препаратов на динамику роста КОЕ-Э на протяжении всего периода исследования позволил выявить более интенсивное увеличение числа эритроидных предшественников в костном мозге рекормоиом на 3-8-е сутки исследования, а поэтамом - на 9, Щ 12-е сутки.

Закономерным следствием ускорения регенерации костномозгового кроветворения рекормоиом и поэтамом являлось возрастание числа ретикулоцитов (3-15-е и 7-9-е сутки соответственно) и эритроцитов (3,5,7-9-е и 5,10,12,15-е сутки соответственно) в периферической крови Изменение динамики содержания клеточных элементов в крови в опытных группах сопровождалось значительным увеличением количества гематокрита и гемоглобина (более выражено рекормоиом)

В заключительной серии экспериментов нами изучалось влияние лекарственных средств на уровень эритропоэтина в сыворотке крови у мышей с адриа-мицином. Так, уровень ЭП в крови опытных животных с рекормоиом существенно превышал таковой в контрольной группе на протяжении большей части периода наблюдений Наибольшие значения показателя регистрировались на 3-и сутки (458 ти/мл) и 4-е сутки (311 тШмл) после цистостатического воздействия. Примечательно, что на 15-е сутки опыта регистрировалось снижение количества ЭП в опыте

Использование поэтама также приводило к повышению содержания эндогенного эритропоэтина в сыворотке крови мышей с адриамицином, начиная с самых ранних сроков исследования. Наиболее выраженный подъем показателя был выявлен на 10-12-е сутки, как и в группе животных, которым вводили растворитель. При этом содержание эндогенного ЭП в крови опытных животных вдвое превосходило таковое в цитостатическом контроле. Этот факт свидетельствует о потенцирующем влиянии поэтама на продукцию почечного эритропоэтина в условиях гипопластической анемии, вызванной введением адриамицина

На основании проанализированных данных можно сделать следующие выводы. Во-первых, применение рекормона и поэтама действительно правомочно для коррекции нарушений в эритроне при моделировании цитостатической ге-модепрессии карбоплатином и адриамицином. Во-вторых, нами был подтвержден ранее выдвинутый тезис о возможности негативных последствий монотерапии анемий, развивающихся вследствие применения цитостатиков Например, препарат рекомбинантного эритропоэтина в условиях цитостатического воздействия (5-фторурацил, карбоплатин, адриамицин) приводит к поврежде-

нию «глубокого» резерва эритропоэза, заключающемуся в истощении пула клеток-предшественников. Причем при назначении карбоплатина состояние усугубляется нефротоксическим действием цитостатика. В-третьих, есть некоторое преимущество применения поэтама над рекормоном в терапии гипопластиче-ских анемий, вызванных цитостатиками, состоящее в том, что использование сверхмалых доз антител к ЭП не вызывает истощения пула эритроидных прекурсоров В-четвертых, если эритропоэзстимулирующее действие рекормона проявляется в ранние сроки после назначения цитостатиков и кратковременно, то при назначении поэтама активация эритрона развивается позднее и более продолжительно.

Сопоставляя имеющиеся факты об особенностях механизмов действия рекормона и поэтама, мы пришли к заключению, что перспективным является совместное применение гемостимуляторов в терапии постцитостатической анемии Описанный подход, с одной стороны, позволит снизить негативные явления экзогенного эритропоэтина в силу сокращения продолжительности введения препаратов на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина. С другой стороны, немаловажным для организма в условиях цитостатического воздействия является близкое к физиологическому восстановление поэтамом функций нейроэндокринной системы и поступление в кровь эндогенного ЭП

Однако изученные стимуляторы эритропоэза способны изменять характер и темпы регенерации и гранулоцитарного ростка кроветворения в условиях ци-тостатических воздействий Так, на модели миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана, установлено, что рекормон восстанавливал число незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов (4-е сутки) в костном мозге и нейтро-фильных лейкоцитов в периферической крови (5-е сутки) Эффект препарата был связан со стимуляцией процессов пролиферации (3-й сутки) и дифферен-цировки (4, 12-е сутки) грануломоноцитарных клеток-предшественников и образования макрофагнегативных (4-6, 12-е сутки) и гранулоцитарных (3-5-е сутки) ГО, продукции КСА прилипающими (4,6-е сутки) и неприлипающими (8-е сутки) миелокариоцитами. Увеличение содержание незрелых (3, 6-8, 12-14-е сутки) и зрелых (12-14-е сутки) нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтиче-ской ткани и сегментоядерных нейтрофилов в крови (14-е сутки) имело место и при назначении 5-фторурацила Вместе с тем, в этой модельной ситуации сдвиги со стороны пула прекурсоров грануломоноцитопоэза не столь однозначны, как при использовании алкилирующего агента С одной стороны, инъекционный препарат рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировал рост КОЕ-ГМ в метилцеллюлозной среде (3-6-е сутки), с другой стороны -снижал интенсивность колониеобразования (8, 10, 14, 16-е сутки) Пролифера-тивная активность гранулоцитарно-макрофагальных предшественников падала, а интенсивность их созревания, напротив, возрастала (4-16-е сутки) При этом рекормон ускорял формирование макрофагнегативных клеточных комплексов (4-8, 12-е сутки) и гранулоцитарных ГО (4-5, 12, 16-е сутки) в костном мозге, восстанавливал уровень КСА в супернатантах от адгезирующих (6-е сутки) и неадгезирующих (8, 14-е сутки) клеток ГИМ, и в сыворотке крови (3, 5, 8-12, 16-е сутки)

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина также увеличивала скорость регенерации гранулоцитопоэза при назначении ЦФ, на что указывало повышенное содержание палочкоядерных гранулоцитов в периферической крови по сравнению с цитостатическим кошролем на 12-е сутки опыта. Стимуляции грануломоноцитопоэза предшествовало восстановление структурно-функциональной организации костного мозга (3-8-е сутки), рост концентрации гемопоэтических факторов роста в кондиционных средах прилипающих (4-е сутки) и неприлипающих (8-е сутки) миелокариоцитов и в сыворотке 1фови (8-е сутки) Вместе с тем, под воздействием препарата активация пролиферации (3-й сутки) прекурсоров сменялась на ее угнетение (10-12-е сутки) Со стороны индекса созревания выявлена обратная закономерность уменьшение показателя имело место на 5-8-е сутки опыта, а увеличение - 10-е сутки. В основе ускоренного восстановления клеточности гранулоцитарного ростка таблетированным эритропоэтином при назначении 5-ФУ лежало повышение темпов деления (3-5, 8-12-е сутки) и скорости созревания предшественников грануломоноцитопоэза (3, 8-10-е сутки). Одновременно возрастала продукция КС А адгезирующими (4, 6-е сутки) и неадгезирующими (8, 12-е сут) миелокариоцитами В противоположность этому, препарат еще более нарушал образование клеточных комплексов гранулоцитарного типа (3, 6,10-е сутки).

Показано, что введение поэтама на фоне цитостатической миелосупрессии, вызванной применением ЦФ, приводило к кратковременному увеличению числа незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге (4-е сутки). При этом в опытной группе рост пролиферативной активности (с 4-х суток) и интенсивности дифференцировки (с 6-х суток) гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров опережал таковой в цитостатическом контроле Лекарственное средство способствовало формированию клеточных ассоциаций с центрально расположенным фибробластом (4, 6, 12-е сутки) и смешанных ГО (3-5, 8-10-е сутки) в костном мозге, оказывало стимулирующее влияние на продукцию КСА неприлипающими миелокариоцитами (4-5, 8-е сутки) Несколько иной характер стимуляции гранулоцитопоэза поэтамом отмечался в условиях использования 5-ФУ. Так, резкое увеличение содержания нейтрофильных клеток в костном мозге и периферической крови отмечалось к концу эксперимента (12-14-е сутки). Этому предшествовало возрастание содержания грануломоноцитарных прекурсоров (4-6-е сутки) в гемопоэтической ткани в силу значительной стимуляции темпов их деления (3, 8,10-е сутки). Возникающая в указанные сроки задержка созревания гранулоцитарных клеток нивелировалась организацией дополнительных очагов гранулоцитарного и смешанного кроветворения Важнейшим эффектом препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину являлось увеличение уровня сывороточного КСА (4-6, 8, 12-е сутки) и продукции факторов роста прилипающими (3, 6, 14-е сутки) и неприлипающими (14-е сутки) клетками кроветворного микроокружения.

Применение экстракта шлемника байкальского на фоне цитостатических миелодепрессий способствовало стимуляции процессов гранулоцитопоэза Однако увеличение клеточности гранулоцитарного ростка в условиях введения ЦФ имело место на 3, 5,10-е сутки эксперимента, при назначении 5-ФУ - на 3-

8, 12, 14-е сутки. Изучение механизмов действия растительного экстракта на гранулоцитопоэз выявило ряд межмодельных различий. При назначении ЦФ введению препарата сопутствовало накопление гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в кроветворной ткани (с 6-х суток) и увеличение их функциональной активности (с 4-х суток) Одновременно наблюдалось усиление образование фибробластных (6-е сутки) и гранулоцитарных (3, 8-10-е сутки) ГО, а также повышение уровня КС А в супернатантах от неадгези-рующих миелокариоцитов (4-5-е сутки) и сыворотке периферической крови (5-е сутки) При моделировании гемодепрессии 5-ФУ растительный экстракт оказывал модулирующее действие на пул прекурсоров грануломоноцитопоэза в сроки ингибиции пролиферации и дифференцировки регистрировалось увеличение темпов деления и созревания, в случае стимуляции процессов — снижение их активности В этих условиях отмечалось угнетение формирования гемопоэти-ческих островков и снижение концентрации сывороточной КСА В свою очередь, продукция активностей прилипающими (4-е сутки) и неприлипакнцими (6-16-е сутки) клетками кроветворного микроокружения возрастала

Стимуляция >1-ацетилнейраминовой кислотой костномозгового грануло-цитопоэза (4-12-е сутки) и развитие нейтрофильного лейкоцитоза в крови (с 6-х суток) в условиях цитостатической болезни, вызванной инъекцией алкилирую-щего агента, являлось следствием повышения функциональной активности прекурсоров грануломоноцитопоэза и прилипающих клеток ГИМ (образование ГО смешанного типа, секреция КСА). Уровень колониестимулирукяцей активности в сыворотке крови в опыте оказался статистически достоверно ниже по сравнению с цитостатическим контролем (5-8-е сутки). Эффект препарата на 48-е сутки после введения 5-фторурацила был связан с увеличением пролифера-тивной активности и интенсивности дифференцировки грануломоноцитарных прекурсоров и концентрации КСА в кондиционных средах клеток неадгези-рующей фракции кроветворного микроокружения и в сыворотке крови На 1214-е сутки опыта активация процессов регенерации находилась в прямой зависимости от межклеточных контактов и всплеска секреторной активности неприлипающих миелокариоцитов

В целом, результаты представленных исследований свидетельствуют о том, что рекормон, таблетированный эритропоэтин, поэтам, экстракт шлемника байкальского и №-ацетилнейраминовая кислота стимулируют подавленный цик-лофосфаном и 5-фторурацилом гранулоцитарный росток кроветворения. При этом гемостимуляторы действуют на белую кровь в основном опосредованно -через изменения активности ГИМ Следует отметить, что эффективность лекарственных средств в отношении эритропоэза несопоставимо выше, чем в отношении гранулоцитопоэза

В совокупности вышеприведенные данные легли в основу предложенных нами схем регуяяторного влияния стимуляторов эритропоэза на кроветворную ткань при цитостатических воздействиях (рис. 8, 9).

Как было отмечено выше, рекормон и таблетированная форма эритропо-этина являются аналогом эндогенного эритропоэтина. Действие ЭП осуществляется благодаря специфическим рецепторам, локализованным на плазматичес-

РЕКОРМОН

ТАБЛЕТИРОВАННАЯ ФОРМА

ЭРИТЮПОЭТИНА

Нейро- эндокринная система

Костный

ЭКСТРАКТ Клеточные

ШЛЕМНИКА мембраны БАЙКАЛЬСКОГО

БАЙКАЛИН

1

И-АЦЕТИЛНЕИРАМИНОВАЯ; КИСЛОТА

Периферическая кровь

Рис. 8. Механизмы действия стимуляторов эритропоэза при гемодепрессии, вызванной введением алкилирующего агента (циклофосфан). Широкие стрелки - активирующее действие препаратов

ЭКСТРАКТ

ШЛЕМНИКА

БАЙКАЛЬСКОГО

БАЙКАЛИН

Клеточные мембраны

л

РЕКОРМОН

ТАБЛЕТИТОВАННАЯ ФОРМА

ЭРИТРОПОЭТИНА

Нейро - эндокринная система

Периферическая кровь

Рис. 9. Механизмы действия стимуляторов эритропоэза при гемодепрессии,

вызванной введением фторпиримидинового антиметаболита (5-фгорурацил). Широкие стрелки - активирующее действие препаратов

Ы-АЦЕТИЛНЕЙРАМИНОВАЯ КИСЛОТА

Костный

кой мембране эритропоэтинчувствительных клеток. БОЕ-Э, КОЕ-Э, проэрит-робластах и базофильных эритробластах [Павлов А.Д., 1997, Эппггейн О.И., Штарк М Б., Дыгай А.М, Гольдберг Е.Д и др., 2005]. В условиях введения ал-килирующего агента применение в больших дозах препаратов на основе реком-бинантного человеческого ЭП приводит к закономерно быстрому преходящему накоплению числа КОЕ-Э в гемопоэтической ткани, вызванному повышением интенсивности пролиферации и созревания эритроидных прекурсоров Одновременно повышается также содержание эритробластов в костном мозге и ре-тикулоцитов в периферической крови Однако указанные лекарственные средства способны стимулировать не только процессы в отделе коммутированных предшественников, но и увеличивают функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов Об этом свидетельствуют как экспериментальные исследования с использованием лекарственных средств in vivo (формирование эритроидных ГО, продукция ЭПА), так и увеличение рекормоном т vitro фидерной активности обработанных цикло-фосфаном макрофагов в отношении интактных эритроидных прекурсоров. Причем, по нашим данным, при стимуляции периферических серотонинергических и у?-адренергических структур эритропоэтин вызывает существенное ускорение формирования ассоциаций эритроидного типа.

Антитела к эритропоэтину в сверхмалых дозах стимулируют подавленный алкилирующим агентом костномозговой гемопоэз, увеличивая одновременно содержание ретикулоцитов и нейтрофилов в периферической крови (рис. 8) В основе активации регенерации эритроидного ростка кроветворения поэтамом лежит ускорение пролиферации и дифференцировки эритроидных клеток-предшественников вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения

Гемостимулирующий эффект экстракта шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовой кислоты в условиях введения циклофосфана связан с опережающим восстановлением структурно-функциональной целостности костного мозга (рис 8). Однако в основе усиленного роста гемопоэтических островков в кроветворной ткани при введении модификаторов биологических реакций и сиаловой кислоты в условиях применения алкшгарующего агента лежат различные механизмы. С мембраностабилизирукяцим эффектом препаратов шлемника байкальского связаны оптимизация функций ЦНС (в том числе, системы дальноранговой регуляции кроветворения) и снижение повреждающего действия цитостатика на кроветворную ткань [Saya A., Scalese М., Lanza М et al., 1995; Arora A., Nair M.G., Strasburg G M., 1998]

В свою очередь, N-ацетилнейраминовая кислота, в основном на уровне костномозговой ткани, способствует восстановлению межклеточных взаимодействий, обеспечению высокой концентрации гемопоэтических ростовых факторов (ЭПА) в экстрацеллюлярном матриксе ГИМ, а также активации митозов коммитированных предшественников эритропоэза (рис. 8).

Выраженность эффектов гемостимуляторов на модели цитостатической болезни, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более

глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов кроветворного микроокружения (рис. 9)

ВЫВОДЫ

1 Особенности механизмов развития анемического синдрома в условиях цистостатических гемодепрессий обусловлены неодинаковой чувствительностью коммитированных клеток-предшественников эритропоэза и элементов кроветворного микроокружения к действию миелосупрессирующих препаратов. В основе развития депрессии эритроидного ростка кроветворения при введении циклофосфана лежит угнетение функциональной активности прекурсоров эритропоэза и межклеточных взаимодействий, 5-фторурацил вызывает нарушение формирования гемопоэтических островков эритроидного и смешанного типа и снижение продукции эршропоэтической активности адгезирующими миелокариоцитами. Карбоплатин и адриамицин снижают секреторную активность клеточных элементов ГИМ в сочетании с уменьшением концентрации эритропоэтина в сыворотке крови и ингибицией деления и созревания эритро-идных предшественников.

2 Рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, №ацетшшейраминовая кислота, экстракт шлемника байкальского и его биофлавоноид байкалин стимулируют подавленный цитостати-ками эритроидный росток кроветворения. При моделировании цитостатической болезни алкилирукнцим агентом наиболее эффективными средствами являются М-ацетилнейраминовая кислота и рекормон, в условиях введения фторпирими-динового антиметаболита - рекормон и препараты шлемника байкальского.

3. В основе ускорения рекормоном процессов регенерации эритроидного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях лежит активация деления и созревания коммитированных предшественников эритропоэза, при этом наблюдается увеличение функциональной активности гемопоэзиндуци-рующего микроокружения (формирование эритроидных гемопоэтических островков, рост уровня гемопоэтических ростовых факторов) при введении циклофосфана и возрастание продукции ЭПА миелокариощгтами при применении 5-фторурацила

4 При курсовом введении таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина высокие темпы деления и созревания эритроидных прекурсоров и секреторная активность клеток кроветворного микроокружения выступают основными механизмами, определяющими ускоренное восстановление содержания эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови после назначения алкилирующего агента или фторпирими-динового антиметаболита.

5 Стимулирующий эффект поэтама при гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана, во многом обусловлен восстановлением структурно-функциональной целостности костного мозга и увеличением уровня ЭПА в кондиционных средах костного мозга и сыворотке крови. В то же время, поэтам при введении 5-фторурацила активирует эритропоэз преимущественно за счет

увеличения уровня эритропоэтической активности во фракции адгезирующих нуклеаров и сыворотки крови.

6 Стимуляция экстрактом шлемника байкальского процессов регенерации эритроидного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях связана с увеличением функциональной активности клеточных элементов ГИМ: при применении алкилирующего агента формируются гемопоэтические островки, преимущественно, эритроидного типа, в случае использования антиметаболита возрастает уровень гемопоэтических ростовых факторов в супернатантах мие-локариоцитов.

7 При моделировании гемодепрессии циклофосфаном основной мишенью для N-ацетшшейраминовой кислоты выступают адгезирующие клетки кроветворного микроокружения (увеличивается содержание клеточных комплексов эритроидного типа и уровень эритропоэтической активности) В условиях введения 5-фторурацила наблюдается стимуляция пролиферативной активности эритроидных колониеобразуюхцих единиц за счет возрастания уровня ЭПА в экстрацеллюлярном матриксе костномозговой ткани.

В. При миелосупрессии, вызванной карбоплашном или адриамицином, эритропоэзстимулирующее действие рекормона проявляется в сроки ингиби-ции эритроидного ростка, под влиянием поэтама активация эритрона развивается позднее (в период регенерации) и является более продолжительной

9. Преинкубация адгезирующих миелокариоцитов с N-ацетилнейрамино-вой кислотой, экстрактом шлемника байкальского или рекормоном существенно увеличивает фидерную активность макрофагов, подвергнутых прямому воздействию циклофосфана, в отношении интактных и обработанных эритропо-этином in vitro коммитированных предшественников эритропоэза. При этом более выраженный эффект отмечается в случае добавления в культуру костного мозга N-ацетилнейраминовой кислоты и рекормона

10 Активация p-адренорецепторов (изадрин) или серотонинергических структур (серотонин) in vitro на адгезирующих клетках костного мозга восстанавливает нарушенную циклофосфаном способность стромальных элементов к связыванию интактных эритроидных прекурсоров В этих условиях интенсивность эритроидного колониеобразования в случае предварительной обработки неадгезирующей фракции миелокариоцитов рекормоном значительно превосходит исходный уровень

11 Характер восстановления клеточиости эритроидного ростка кроветворения в условиях цитостатических воздействий обусловлен избирательной чувствительностью процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных предшественников и клеточных элементов ГИМ к токсическому действию цитостатических препаратов и гемосгимуляторам.

12 Выраженное стимулирующее влияние рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, N-ацетилнейраминовой кислоты и экстракта шлемника байкальского на эршроидный росток кроветворения сопровождается активацией восстановления грануяоци-тарного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях Реализация гемостимулирукяцей активности препаратов заключается в стимуляции функ-

циональной активности клеток гемопоэзиндуцирующего микроокружения (формирование гемопоэтических островков, секреция КСА).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Методические документы МЗ РФ

1. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств — 2002. — № 1 — С 29-32 (соавт Ды-гай А.М, Жданов В.В , Гольдберг В.Е. и др.)

Публикации

2 Влияние рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и пантогематогена на гемопоэз в условиях цитостатической миелосу-прессии // Актуальные вопросы экспериментальной морфологии- - Томск, 1999 - С 10-12 (соавт Гольдберг Е Д., Дыгай А М, Жданов В.В. и др.)

3 Механизмы стимуляции миелопоэза при цитостатических миелодепресси-ях пантогематогеном и гранулоцитарным колониестимулирующим фактором // Бюлл. эксперим. биологии и медицины — 2000. - Т. 130 - № 11. — С 512-515 (совт Гольдберг Е.Д, Дыгай А.М., Гурьянцева Л А и др.).

4. Миелотоксичность цитостатического препарата растительного происхождения - этопозида // Проблемы эксперим. и клин, фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2000. - С 48

5 Новые подходы в создании гемостимуляторов для клинической практики // Тез докл. VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 10-14 апреля 2000. - С. 494 (соавт. Гольдберг Е Д., Дыгай А.М, Жданов В.В. и др.).

6. Новые препараты — стимуляторы грануломоноцитопоэза // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности (Материалы международной научной конференции). - Томск; 27-29 июня 2000. - С. 148-150 (соавт. Жданов В В., Симанина ЕВ, Поженько Н.С и др)

7. The compared investigation of hemopoiesis stimulatmg activity of pantoge-matogen (PG) and recombinant granulocyte-colony stimulatmg factor // Abstr. of the Iй International Symposium on Antler Science and Product Technology, Banf£ Canada, 2000 - P.42 (with Dygai A.M, Guijantseva L.A, Zhdanov V.V., Pozhen ko N.S, Simanma E V., Suslov NI, Goldberg V.E., Shebahn A.I, Frolov N А, Goldberg ED)

8. Механизмы регенерации гемопоэза при миелосупрессии, вызванной введением этопозида // Актуальные проблемы эксперим. и клин, фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2001. - С. 162-164.

9. Миелотоксичность цитостатического препарата растительного происхождения - этопозида // Эксперим и клин фармакол. - 2001 -Т 64 -№5. -С. 3133 (соавт. Дыгай А.М, Жданов В В., Ткаченко С Б и др.).

10. Новые лекарственные формы рекомбинантных цнтокинов для лечения анемий и лейкопений различного генеза // Тез. докл. УШ Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2-6 апреля 2001. - С 295 (соавт Гольдберг Е Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др.).

11. Роль гемопоэзивдуцирующего микроокружения в регенерации гемопоэза при миелосупрессии, вызванной этопозидом // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины (Материалы молодежной научной конференции СО РАМН) -Новосибирск, 2001 -С. 38-39.

12 Роль гемоноэтических ростовых факторов в регенерации кроветворения при миелосупрессии, вызванной введением этопозида // Бюлл эксперим. биологии и медицины. - 2001.-Т. 131 -№5. - С 512-516 (соавт Жданов В В, Гурь-янцева Л. А, Дыгай А.М. и др.)

13. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции кроветворения на модели цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2001 -Т. 132.-№ 8.-С. 156-160 (соавт. Жданов В.В, Гурьянцева Л.А, Данилец МГ идо).

14. Влияние этопозида на структурно-функциональную организацию костного мозга // Эксперим. и клин фармакол. - 2002. - Т. 65 - № 6 - С. 151-152 (соавт Дыгай А.М., Жданов В.В., Симанина Е В. и др )

15. Механизмы гемостимулирующего действия гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора // Актуальные проблемы фармакологии (Тез. докл. научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета). -Барнаул, 2003. - С. 12 (соавт. Гольдберг Е Д., Дыгай А.М, Жданов В В. и др.)

16. Механизмы эритропоэзстимулирующего действия препарата поэтам // Тез. докл X Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 7-11 апреля 2003.—С. 607 (соавт Жданов В.В., Симанина Е.В., Гурьянцева Л.А. и ДР-)

17. Поэтам модулирует эритропоэтическую активность сыворотки крови II Тез. докл X Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2003. - С. 605 (соавт Дугина Ю Л., Жданов В В, Симанина Е.В. и др.).

18. Роль гуморальных факторов в регуляции эритропоэза при цитостатической миелосупрессии // Бюлл эксперим. биологии и медицины. - 2003. - Т. 135. - № 6. - С. 642-646 (соавт. Дыгай А М, Жданов В В , Симанина Е.В. и др.).

19. Экспериментальное исследование поэтама — нового препарата для лечения анемий И Материалы третьей международной конференции "Клинические исследования лекарственных средств", Москва, 2003 -С. 131-133 (соавт. Дугина ЮЛ, Жданов В.В, Симанина Е В и др.)

20. Гемопоэтическая активность сверхмалых доз антител к эритропоэтину // Актуальные проблемы фармакологии (Материалы конференции). - Томск: Изд-во ТГУ, 2004.—С. 58-60 (соавт. Жданов ВВ, Гурьянцева ЛА, Симанина ЕВ и др ).

21. Влияние Г-КСФ на кинетику клеток-предшественников гранулоцитопоэза // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологич. и клинич. аспекты (Материалы Всероссийской конференции) - Новосибирск, 2004. - С. 21-22 (соавт. Жданов В В , Гольдберг В Е., Симанина Е В. и др.).

22 Механизмы эритропоэзстимулирующего действия экстракта шлемника байкальского// Эксперим. и клин, фармакол. - 2004 - Т. 32. - № 5. - С. 156-160 (соавт. Жданов В В., Гурьянцева Л А., Минакова М Ю. и др.). 23. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на кинетику гемопоэтических предшественников регенерирующего костного мозга И Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2005. - № 1 - С 56-59 (соавт Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М, Жданов В В. и др ).

24 Функционирование стволовых кроветворных клеток в условиях цитоста-тической миелосупрессии и при применении гемостимуляторов // Клеточные технологии в биологии и медицине -2005 -№4 -С. 230-233 (соавт. Жданов В.В., Гурьянцева Л А., Хричкова Т Ю и др)

25. Механизмы действия стимуляторов гранулоцитопоэза в условиях цитоста-тической миелосупрессии // Эксперим и клин, фармакол. - 2006 - Т. 69. - № 2.

- С. 44-47 (соавт. Гурьянцева Л. А., Жданов В.В , Симанина Е.В. и др.).

26 Механизма действия стимуляторов эритропоэза в условиях цитостатиче-ской миелосупрессии Н Вестник Уральской Медицинской Академии Наук. -Екатеринбург, 2006 - № 3-2(15) - С 44-45

27. Специфическая активность препарата сверхмалых доз антител к эритропо-этину (поэтам) в сравнении с рекомбинантным эритропоэтином // Бюлл эксперим. биологии и медицины - 2006. -Т 144 - № 9. - С. 289-294 (соавт. Дыгай А.М., Жданов В.В, Симанина Е.В. и др.)

28. Влияние гемостимуляторов на пул прекурсоров эритропоэза при миелрсу-прессии, вызванной 5-фторурацилом Н Актуальные проблемы эксперим и клин фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых) - Томск, 2007 -С. 86-87.

29. Механизмы действия различных препаратов эритропоэтина в условиях ци-тостатической миелосупрессии//Бюлл СО РАМН -2007 - № 1(123) -С. 2629 (соавт Жданов В.В, Гурьянцева Л.А, Симанина Е В. и др.).

30 Механизмы регуляции кроветворения при моделировании цитостатиче-ской миелосупрессии карбоплатином // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.

- 2007.—Т 143.5 -С 515-518 (соавт Гольдберг Е Д., Дыгай А.М , Жданов В.В. и др)

31 Роль серотонинергической системы в регуляции эритропоэза при цитоста-тических миелосупрессиях // Бюлл эксперим. биологии и медицины. - 2007 -Приложение 1 -С 8691. (соавторы Минакова MJO, СкурихинЕГ, Прешина ОБ.).

32 Сравнительный анализ результатов стимуляции эритропоэза при почечной анемии препаратом сверхмалых доз антител к эритропоэтину и рекормоном // Бюлл эксперим. биологии и медицины - 2007 - Т. 143. - № 6 - С 641-644 (соавт. Эпштейн О И, Дыгай А М., Жданов В.В. и др.).

33 Создание экспериментальных моделей и изучение на их основе регенераторных возможностей стволовых клеток // Бюлл эксперим. биологии и медицины. - 2007. - Приложение № 1 - С. 5-13 (соавт Гольдберг Е Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др.).

34. Фармакологическая регуляция стволовых клеток // Психофармакология и биологическая наркология -2007 —Т. 7.-С. 1662-1663 (соавт ГоладбергБ.Д., Дыгай А.М., Жданов В В. и др )

35. Фармакологическая стимуляция регенераторных возможностей стволовых клеток II Создание новых лекарственных препаратов- Материалы конференции - Томск. Изд-во Том. ун-та, 2007 - С. 5-7 (соавт Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др )

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БОЕ-Э - бурстобразующая единица эршроидная ВНС - вегетативная нервная система ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение ГО — гемопоэтический островок

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ДЕК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЕД - единица действующего вещества

ИД - интенсивность дифференцировки

КСАд - колониестимулирующая активность (в супернатантах адгезирую-

щих миелокариоцитов) КСА„ - колониестимулирующая активность (в супернатантах неадгези-

рующих миелокариоцитов) КСАс — колониестимулирующая активность (в сыворотке крови) КлОЕ-ГМ - кластерообразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная КлОЕ-Э - кластерообразующая единица эритроидная КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная ЛФ - лимфоциты

МЦД - максимально переносимая доза МФ - макрофаги

ЦНС — центральная нервная система ЦФ - циклофосфан

ЭП - эритропоэтин

ЭПАд - эритропоэтическая активность (в супернатантах адгезирующих миелокариоцитов)

ЭПА„ - эритропоэтическая активность (в супернатантах неадгезирующих

миелокариоцитов) ЭПАс — эритропоэтическая активность (в сыворотке крови) 5-ФУ - 5-фторурацил

Подписано к печати 07 12.2007 г. Тираж 100 зкз. Кол-во стр. 44 Заказ № 76-07. Бумага офсетная. Формат А5. Печать RISO. Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбХ» Лицензия Серия ПД № 12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул Усова 7, ком. 046. тел. (3822) 56-44-54