Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Роль цитогенетических и молекулярных исследований в диагностике и терапии миелоидных неоплазий

УДК 616.155.392.8-08:616-071:616-076.5

Мартынкевич Ирина Степановна

РОЛЬ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ МИЕЛОИДНЫХ НЕОПЛАЗИЙ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2011

3 • идр 2077

4841773

Диссертация выполнена в Федеральном Государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства РФ.

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, профессор,

доктор медицинских наук К. М. Абдулкадыров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Борис Владимирович

доктор биологических наук, профессор Воробцова Ирина Евгеньевна

доктор медицинских наук Куцев Сергей Иванович

Ведущая организация: Государственное учреждение «Гематологический

научный центр» РАМН

Защита состоится ^ЦСЬрТЦ 2011 года в часов

на заседании специализированного Совета Д 084.19.01 при ФГУ «Российский

НИИ гематологии и трансфузиологии» по адресу:

191024, г. Санкт-Петербург

ул. 2-я Советская, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии».

Автореферат разослан «__» марта 2011г.

Ученый секретарь специализированного Совета

д.м.н. Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В основе развития гемобластозов лежат генетические изменения в клетке -предшественнице гемопоэза, приводящие к торможению дифференцировки кроветворной клетки, нарушению механизмов регуляции клеточного цикла и неконтролируемой пролиферации клеток. Все потомки такой клетки-предшественницы несут одни и те же генетические изменения, иногда приобретая и новые в процессе опухолевой прогрессии.

Генетические изменения при заболеваниях системы крови обычно представлены мутациями хромосомного типа (транслокациями, инверсиями, делениями, наличием дополнительных хромосом и другими) и могут быть выявлены методами стандартной цитогенетики и молекулярной генетики. В последние годы было показано, что генетические изменения (тандемные повторы и мутации генов р53, NPM1, FLT3, Ras) можно обнаружить только с помощью молекулярно-биологических методов [Mrozek К., 2007, Czibere А., 2009].

Хромосомные и/или молекулярно-генетические перестройки, играя важную роль в патогенезе гематологических неоплазий, определяют биологические свойства лейкозных клеток и, соответственно, морфологические, иммунологические и клинические особенности заболевания. Большинство наиболее распространенных хромосомных перестроек имеют самостоятельное прогностическое значение, как при миелоидных, так и при лимфоидных вариантах опухолевых заболеваний. Кроме того, данные цитогенетических и молекулярно-биологических исследований при ряде заболеваний системы крови являются одним из главных критериев при выборе адекватной терапии.

Генетическая диагностика опухолевых заболеваний системы крови в настоящее время является одним из основных методов, определяющих прогностические и диагностические особенности заболевания. Высокоспецифичные хромосомные аберрации изучены достаточно хорошо, однако вариабельность течения и прогрессии заболевания неоднородны у больных в пределах одинаковых цитогенетических нарушений. В то же время, согласно сообщениям различных авторов, информационная ценность мутаций ряда генов остается неопределенной [Thiede С., 2006; Falini В., 2005].

Вместе с тем изменение тактики терапевтических режимов при опухолевых заболеваниях кроветворной системы и введение в практику новых препаратов направленного действия («таргетной» терапии), мишенью для которых являются химерные гены (BCR/ABL, PML/RARa), привели к повышению роли молекулярно-генетических исследований. В связи с этим становится актуальной необходимость разработки алгоритма генетической диагностики гемобластозов, который позволит получить наиболее полную картину заболевания. Следовательно, алгоритм диагностики поможет адекватно верифицировать вариант заболевания, определить прогностические особенности генетических маркеров и тем самым выбрать рациональную

терапию, что, в свою очередь, позволит получать у больных длительную безрецидивную выживаемость.

Цель исследования

Определить значимость и место цитогенетических и молекулярных аберраций в верификации форм, оценке прогностических особенностей течения и в алгоритме генетической диагностики миелоидных неоплазий.

Задачи исследования:

1. Разработать алгоритм генетической диагностики больных различными вариантами миелоидных неоплазий.

2. Оценить прогностическую значимость дополнительных клональных хромосомных аберраций у пациентов с хроническим миелолейкозом на различных этапах целенаправленной терапии.

3. Выявить механизмы и природу происхождения клональной эволюции у больных хроническим миелолейкозом, получающих ингибиторы тирозинкиназ.

4. Определить частоту встречаемости мутации V617F в гене JAK2 и прогностические особенности течения заболевания в зависимости от типа цитогенетических аберраций у пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями.

5. Исследовать прогностическую значимость кариотипа с учетом возраста больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами, обнаруженными в дебюте заболевания.

6. Изучить влияние на прогноз мутаций генов NPM1, FLT3 у пациентов с миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами.

Новизна результатов исследования

В настоящем исследовании впервые:

- разработан алгоритм генетической диагностики различных вариантов миелоидных неоплазий;

- установлено, что клональная хромосомная эволюция, обнаруженная на различных этапах терапии в Ph-положительных клетках, достоверно ухудшает прогноз заболевания у пациентов с хроническим миелолейкозом, в то время как дополнительные клональные хромосомные аберрации в Ph-отрицательных клетках являются статистически значимыми только для бессобытийной выживаемости больных;

- проведен ретроспективный FISH анализ клеток костного мозга пациентов с XMJ1, получающих целенаправленную терапию, с выявленными дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-отрицательных клетках, позволивший определить природу происхождения клональной эволюции;

- определены новые данные о прогностическом потенциале мутаций NPM1 и FLT3 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми

миелобластными лейкозами, свидетельствующие о благоприятном (NPM1) или агрессивном (FLT3) течении этих процессов;

- выявлена частота встречаемости и распределение между вариантами заболевания мутации V617F в гене JAK2 у пациентов с Ph-отри дательным и хроническими миелопролиферативными заболеваниями Северо-Западного региона РФ;

- показана необходимость проведения параллельного цитогенетического и молекулярно-генетического исследований у больных Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями с целью обнаружения прогностически значимых хромосомных аберраций.

Практическая значимость

- Разработанный алгоритм генетической диагностики миелоидных неоплазий помогает адекватно верифицировать их различные варианты и прогности ческие особенности.

- Обнаруженные комплексные нарушения кариотипа, аберрации 5 и 7 хромосом, перестройки 17 хромосомы являются неблагоприятными аномалиями кариотипа и позволяют прогнозировать агрессивное течение миелоидных неоплазий и раннее развитие рецидива.

- Наличие мутаций генов NPMJ и FLT3 у больных миелодпспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами свидетельствует о благоприятном или агрессивном течении заболеваний.

- Высокая частота встречаемости мутации V617F в гене JAK2 у пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями убедительно доказывает целесообразность включения данного маркера в алгоритм диагностики заболевания.

- Обнаружение дополнительных хромосомных аберраций у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ, позволяет верифицировать терапию заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный алгоритм генетической диагностики позволяет эффективно верифицировать формы заболевания и проводить адекватную терапию пациентов с миелоидными неоплазиями.

2. Возраст и кариотип являются самостоятельными прогностическими маркерами у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами.

3. Детекция мутаций генов NPM1, FLT3 у пациентов с миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами способствует определению прогностических особенностей заболевания.

4. Клональная эволюция в Ph-положительных клетках у больных хроническим миелолейкозом, обнаруженная до и на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ, является прогностически неблагоприятным

фактором. В то время как дополнительные клональные хромосомные аберрации, выявляемые в Ph-отрицательных клетках, значимы только для бессобытийной выживаемости пациентов.

5. Мутация V617F в гене JAK2 является высокоспецифичным маркером Ph-отрицательных хронических миелопролиферативных заболеваний, и включение данного теста в алгоритм диагностики делает распознавание этих заболеваний более достоверным.

Апробация работы

Полученные результаты докладывались на:

3 Всероссийском съезде гематологов, Санкт-Петербург, 1996; 6 конференции молодых ученых «Вопросы клинической и трансфузионной медицины», Киров, 1999; научно-практической конференции «Гематологический диагноз в лаборатории», Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию института, "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", Санкт-Петербург, 2002 г.; Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", Санкт-Петербург, 2004 г.; European Human genetics Conference, Praga, 2005; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы клинической гематологии", Москва, 2005 г.; Международной конференции «Молекулярно-генетические аспекты современной терапии гемобластозов», Кисловодск, 2006; Международной конференции «Современная терапия ХМЛ», Киев, 2008; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2008 г.; IV съезде медицинских генетиков Украины с международным участием, г. Львов, 2009; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербург, 2009 г.; VI симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 2009 г.; Международной конференции «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2009 г.; American Society of Hematology, 2009; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербург, 2010 г.; 15,h Congress of the European Hematology Association, Barcelona, Spain, 2010; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010 г.; VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010 г.; V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в гематологии», Новосибирск, 18-19 ноября 2010 г.; American Society ofHematology, Orlando, USA, 2010.

Внедрение в практику здравоохранения

Результаты исследования широко используются в диагностике и оценке прогноза заболевания у больных гематологическими неоплазиями, находящихся на лечении в ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. Павлова, ФГУ «Федеральный центр сердца, крови, эндокринологии» им. Алмазова, Городской больнице № 15, Городской больнице № ] 7, Детской городской больнице № 1, Ленинградской клинической областной больнице, в ряде областных клинических больниц Северо-Западного региона Российской Федерации. Полученные данные используются при чтении лекций и проведении семинаров на кафедре медицинской генетики в Медицинской академии последипломного образования. Полученные результаты исследования легли в основу изданных 3 методических рекомендаций для врачей-гематологов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 56 научных работ, из них 20 - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук. Издано 3 Пособия для врачей, 1 медицинская технология.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 241 странице и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 70 рисунками, 23 таблицами. Список литературы включает 212 источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Цитогенетические и молекулярно-генетические исследования проводились у больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ), РЬ-отрицательньши хроническими миелопролиферативными заболеваниями (Р1г(-)ХМШ), миелодиспластическим синдромом (МДС) и острыми миелобластными

лейкозами (ОМЛ), находившихся на лечении в гематологических клиниках г. Санкт-Петербурга: ФГУ "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии"; Городской больнице № 15; Городской больнице № 17; Санкт-Петербургском государственном медицинском университете; ФГУ "Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии"; Ленинградской областной больнице; Областных клинических больницах Северо-Западного региона РФ.

Всего в данном исследовании проанализированы результаты генетических и морфологических исследований у 1188 больных в дебюте заболевания и на разных стадиях его развития за период с 1991 по 2010 г.

Диагнозы верифицировались по результатам комплексного обследования, включающего морфологические, гистологические, цитохимические, иммунологические, цитогенетические и молекулярно-генетические методы. Для определения кариотипа у больных были исследованы не менее 20 метафаз в дебюте заболевания и 30-50 метафаз на этапах мониторинга минимальной резидуальной болезни (МРБ).

В исследование включены 488 больных ХМЛ, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) (терапию 1-й линии - иматиниб - 400 пациентов, терапию 2-й линии - нилотиниб и дазатиниб - 88 больных) с 2003 года. Возраст пациентов варьировал от 17 до 85 лет (медиана 50 лет). В начале исследования в хронической фазе (ХФ) были 456 (93,4%) больных, в фазе акселерации (ФА) или бластном кризе (БК) - 32 (6,6%) пациента. Исследуемую группу составили 270 (55%) мужчин и 218 (45%) женщин. У всех больных в дебюте заболевания выполнялось цитогенетическое исследование клеток костного мозга и была обнаружена Р1г-хромосома либо, в случае нормального кариотипа, при помощи молекулярных методов исследования определялся химерный ВСКУАВЬ ген, что позволило подтвердить диагноз ХМЛ. Из 488 пациентов 184 (37,7%) в дебюте терапии ИТК были предлечены препаратами группы интерферона-а, гидреа, малыми дозами цитозара, миелосана. Согласно рекомендациям Европейской организации Ьеике1ша№1 [Вассагаш М., 2009] цитогенетическое исследование клеток костного мозга у больных ХМЛ мы проводили до начала терапии иматинибом и, далее, каждые 3—6 месяцев на фоне терапии до достижения полного цитогенетического ответа (ПЦГО). После достижения стабильного ПЦГО - 1 раз в 12 месяцев.

В зависимости от наличия дополнительных к РЬ-хромосоме клональных аберраций все исследуемые больные ХМЛ были разделены на 5 групп. Первую группу составили 366 (75%) из 488 пациентов, у которых при цитогенетических исследованиях на различных этапах терапии ИТК обнаруживалась только РЬ-хромосома как единственная аномалия кариотипа. Во вторую группу вошли 17 (3,5%) из 488 исследуемых больных, у которых в дебюте заболевания при цитогенетическом анализе клеток костного мозга определялись вариантные транслокации г(9;22). Третью группу составили 39 (8%) пациентов с дополнительными к РЬ-хромосоме клональными хромосомными аберрациями -клональной эволюцией (КЭ), которая обнаруживалась до начала терапии ИТК. В четвертую группу включены также 39 (8%) из 488 пациентов, у которых КЭ

появилась на различных этапах терапии ИТК в Ph-положительных клетках. В пятую группу вошли 27 (5,5%) из 488 больных, у которых при мониторинге терапии ИТК в Ph-отрицательных клетках обнаруживались клональные хромосомные аномалии (КХА).

С целью определения влияния КЭ на прогноз заболевания и выживаемость больных XMJ1, получающих ИТК, у пациентов данных групп проводился сравнительный анализ сроков общей и безрецидивной выживаемости, вероятности достижения большого цитогенетического ответа (БЦГО) к 6 месяцам и полного цитогенетического ответа (ПЦГО) к 12 месяцам терапии.

С диагнозом ХМПЗ в исследование вошли 307 больных, находившихся иа обследовании в гематологических отделениях г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области с 2007 по 2010 год. Возраст пациентов варьировал от 38 до 67 лет (медиана 52 года). Из 307 больных у 67 (21,8%) установлен диагноз истинная полицитемия (ИП), у 56 (18,2%) пациентов - диагноз эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ), у 44 (14,3%) больных — хронический идиопатический миелофиброз или первичный миелофиброз (ХИМФ). У 140 (45,6%) из 307 пациентов не гематологического профиля исследование проведено с целью дифференциальной диагностики ХМПЗ. До обследования больные не получали специфической терапии.

Детекция мутации JAK2V617F выполнена у всех 307 больных. Из них у 127 (41,4%) пациентов дополнительно исследован кариотип клеток костного мозга.

В анализ также включены 149 больных de novo МДС в возрасте от 20 до 83 лет (медиана 73 года). Из больных МДС сформированы 2 возрастные группы: <60 лет и >61 года. В соответствии с этим 62 больных - (41,6%) МДС с медианой возраста 49,5 года были распределены в 1 группу и 87 (58,3%) - с медианой возраста 73 года во вторую группу. У 68 (45,6%) из 149 исследованных пациентов содержание бластов в костномозговом пунктате было меньше 5%. Из них - у 7 (4,7%) больных установлен 5q- синдром, у 18 (12,1%) -рефрактерная анемия (РА), у 4 (2,7%) - РА с кольцевыми сидеробластами (РАКС) и у 39 (26,2%) - рефрактерная цитопения (РЦМД) с кольцевыми сидеробластами или без них. Варианты рефрактерной анемии с избытком бластов (РАИБ) имели место у 81 (54,3%) из 149 больного: 30 (20,1%) с РАИБ-1 и 51 (34,2%) с РАИБ-2.

По типу хромосомных аберраций 149 пациентов с МДС распределены на 4 группы. В группу с нормальным кариотипом включены 50 (33,6%) больных без хромосомных повреждений или с потерей одной из половых хромосом. Группа со сбалансированными аберрациями представлена 6 (4,0%) пациентами с одиночными транслокациями. Из 59 (39,6%) больных, у которых обнаруживались потеря или дополнительный хромосомный материал (делении, моносомии, трисомии или др.) в количестве не более двух, составлена группа с несбалансированным кариотипом. Группа с комплексным кариотипом сформирована из 34 (22,8%) пациентов с 3 и более независимыми хромосомными аберрациями в одном клоне.

С целью определения прогностически значимых мутаций NPM1 и FLT3 у 44 (29,5%) из 149 пациентов с МДС изучен мутационный статус. Среди больных было 19 (43,2%) мужчин и 25 (56,8%) женщин, медиана возраста которых составила 67 лет (35-76).

В исследуемую группу вошли 244 больных de novo ОМЛ. Возраст 110 мужчин (45,1%) и 134 женщин (54,9%) был в диапазоне от 16 до 84 лет, медиана 50 лет. По возрасту были сформированы 2 группы: <60 лет - 182 пациента (74,6%) и >61года - 62 больных (25,4%).

Распределение de novo ОМЛ по морфологическим вариантам было следующим - 49 пациентов с Ml, 74 - М2, 7 - МЗ, 58 - М4, 27 - М5, 16 - Мб, 6 -М7 и 7 с мультилинейной дисплазией.

По результатам цитогенетического исследования пациенты разделены на 4 группы: 83 больных (34,0%) без цитогенетических поломок или только с повреждениями половой хромосомы были объединены в самостоятельную группу; группа со сбалансированным кариотипом представлена 60 пациентами (24,6%) с транслокациями t(8;21) и t(15;17), а также инверсией 16 хромосомы независимо от количества и характера дополнительных цитогенетических поломок; группу пациентов с комплексным кариотипом, у которых в перестройки вовлекались 3 и более хромосом в одном клоне, составили 37 больных (15,2%); группа с несбалансированным кариотипом, т.е. с 1 или 2 хромосомными поломками в виде делеций, моносомий, трисомий и другими вариантами потери или приобретения генетического материала, представлена 64 пациентами (26,2%).

С целью изучения мутационного статуса больных ОМЛ исследованы клетки костного мозга 43 (17,6%) из 244 больных, у которых произведен анализ мутаций NPM1 и FLT3. Молекулярному исследованию подвергнуты клетки периферической крови больных с установленным кариотипом. Другим условием включения в исследование была длительность наблюдения не менее 6 месяцев.

В исследуемую группу вошли 20 мужчин (46,5%) и 23 женщины (53,5%) в возрасте от 19 до 84 лет, медиана 58 лет. У 40 больных (93,0%) верифицирован de novo ОМЛ и у 3 (7,0%) - вторичный, вследствие ранее проведенной цитостатической терапии по поводу онкологических заболеваний разной локализации. Случаев лейкозной трансформации миелодиспластического синдрома не было.

Распределение de novo ОМЛ по морфологическим вариантам было следующим - 7 пациентов с Ml, 11 - М2, 1 - МЗ, 9 - М4, 4 - М5, 4 - Мб, 1 - М7 и 3 с мультилинейной дисплазией.

Цитогенетический метод исследования клеток костного мозга и периферической крови

У пациентов исследуемой группы цитогенетический анализ проводился на клетках костного мозга и, в случаях трудностей с забором костного мозга у больных ОМЛ, когда в периферической крови содержалось 15% и более бластов

и число лейкоцитов превышало 15000/мкл, исследование выполнялось на клетках периферической крови [Berger R., 1995].

Костный мозг (не менее 1 мл) отбирали в стерильный флакон, типа вакутейнер, с напылением гепарина. Посадку и культивирование клеток костного мозга осуществляли выдержав оптимальную концентрацию - 2><109/мл клеток на 1 мл среды RPMI - 1640, дополненной 20% эмбриональной телячьей сывороткой, антибиотиком, глутамином (292,3 мг/л). В момент посадки культуры добавляли колцемид. Клетки костного мозга культивировались в течение 17-22 часов при температуре 37°С в термостате.

После гипотонизации и фиксации культуры клеток полученную суспензию раскапывали на подготовленные предметные стекла. Цитогенетические препараты окрашивали GTG дифференциальным методом. Кариотинирование проводили с помощью микроскопа «Leica» DM1000. В дебюте заболевания анализировались 20 метафазных пластин, а на этапах мониторинга минимального остаточного клона - 30-50 клеток. Интерпретацию патологии кариотипа производили в соответствии с Международной номенклатурой дифференциально сегментированных хромосом [ISCN, 2005]. Исследование проведено с использованием компьютерной системы анализа изображений «ВидеоТесТ».

Метод полимерато-цепной реакции (ПЦР)

ПЦР исследование проводилось несколькими методами, в зависимости от решаемых задач.

Мутацию V617F в гене JAK2 определяли при помощи аллель-специфической ПЦР.

Для определения мутаций в генах FLT3 и NPM1 был использован метод ПЦР тотальной геномной ДНК. Выделение ДНК из всех ядерных клеток костномозговой взвеси осуществляли с помощью набора Genomic DNA Purification kit (Fermentas, Литва).

Для анализа мутаций в гене FLT3 были использованы наборы олигонуклеотидов, предложенные Y. Yamamoto и H. Kiyoi, с небольшими изменениями [Yamamoto Y., 2001, Kiyoi H., 1999]. Для идентификации наиболее часто встречаемых вариантов мутаций в гене NPM1 был использован набор олигонуклеотидов, позволяющий определить наличие мутации более чем в 98% случаев встречаемости мутации.

Для проведения ПЦР использовали программируемый термоциклер «Терцик-2М» (ДНК-технология, Россия). После предварительной денатурации ДНК (3 минуты при 94 °С) проводили 28 циклов амплификации в режимах, разработанных для каждой мутации индивидуально.

Ферментативный гидролиз ДНК осуществлялся по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем эндонуклеаз (СибЭнзим, Россия).

Метод анализа транслокаций, используемый в нашей работе, был описан в работе 1999 года Ван Донгена с соавторами. Предложенный способ определения транслокаций основан на методе вложенной ПЦР (nested PCR). Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР или ферментативного

гидролиза проводили в нативном 6% полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием ксилол-цианола.

Электрофорез вели при напряжении 150 В в течение 10 минут. В дальнейшем напряжение увеличивали до 250 В и останавливали электрофорез, когда до выхода ксилол-цианола из геля оставалось 5-7 см.

Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл), просматривали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе с помощью гель-документирующей системы DocPrint (Vilber Lourmart, Франция).

Метод флуоресцентной на стекле гибридизации (FISH)

Для исследования применялась суспензия клеток костного мозга или лимфоцитов периферической крови, разведенная в меганольно-уксусном фиксаторе и полученная для стандартного цитогенетического исследования или специально приготовленная (прямая культура). В работе использовались ДНК зонды производства «Vysis». FISH анализ проводили согласно протоколу производителя на цитогенетических препаратах, содержащих как метафазные хромосомы, так и интерфазные ядра. Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа «Leica» DM 1000. В каждом случае проанализировано не менее 200 интерфазных ядер. Интерпретация полученных результатов осуществлялась в соответствии с Международной номенклатурой [ISCN, 2005].

Статистическая обработка полученных данных

Процедура статистической обработки полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 и электронных таблиц Excel 2007.

Для больных с одинаковой цитогенетической поломкой определялись средние значения по показателям периферической крови и костного мозга, оценивались результаты клинического обследования в дебюте заболевания, ответ на проводимую терапию, продолжительность ремиссии и выживаемость больных. При проведении цитогенетических исследований в динамике заболевания проводились клинико-цитогенетические сопоставления на момент каждого исследования.

Оценка выживаемости больных была произведена по кривым Каплан-Мейера. Точкой отсчета для общей и бессобытийной выживаемости выбрана дата диагностики. При расчете общей выживаемости завершенным событием считалась смерть больного от любой причины, а бессобытийной выживаемости - рецидив и смерть больного, независимо от ее причины.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Цитогенетический мониторинг целенаправленной («таргетной») терапии хронического миелолейкоза

По результатам регулярного цитогенетического мониторинга терапии 366 из 488 (75%) больных XMJI, у которых в дебюте заболевания была обнаружена

Ph-хромосома, как единственная перестройка, БЦГО к б месяцам терапии достигли 140 (67%) из 208 пациентов, у которых удалось оценить цитогенетический результат. Это приблизительно столько же, как и ПЦГО к 12 месяцам - у 147 (57%) из 258 информативных больных. В то время как за весь период наблюдения ПЦГО достигнут у 223 (89%) из 251 результативного пациента в среднем через 18 месяцев (от 3 до 68 месяцев). При этом бессобытийная выживаемость у больных в среднем составила 38,8 месяцев, а общая выживаемость-75,3 месяца.

В группе больных с вариантными транслокациями (17 (3,5%) из 488 пациентов) (табл.1) выявлялись как сложные вариантные транслокации t(9;22) (рис.1), так и простые. Во всех случаях обнаружения простой вариантной транслокации проводилась детекция BCR/ABL химерного гена при помощи молекулярно-генетического FISH метода.

Таблица 1

Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с

вариантными t(9;22) транслокациями

№п/п Ф.И.О. Пол¡Возраст Фаза Кариотип

1 А.В.И. м 61 ХФ 46,XY,der(22)t(9;22)[20]

2 А.Е.А. ж 44 ФА j 46,XX,t(17;22)(pl3;ql l),add(12)(q24) [20]

3 Б.А.А. м 56 ХФ 46,ХУ ,t(4;9;22)(pl 4;q34;q 11 )[20]

4 Б.В.С. ж 46 ХФ 46,XX,t(5;9;22)(pl2;q34;ql 1) [20]

5 B.E.B. ж 22 БК 46,XX,t(3;9;22)(q31;q34;ql 1)[20]

6 И.Д.В. м 26 ХФ 46,XY,t(2;9;22)(q22;q34;q 11)[ 17]/ 46,ХУ[3]

7 К.Т.Я. м 60 ХФ 46,Xy,der(22)t(9;22)[20]

8 К.А.Ф. м 41 ХФ 46,Xy,t(2;9;22)(q33;q34;qll)[20]

9 К.В.Д. ж 32 ХФ 46,XX,t(9;ll;22)(q34;ql4;qll)[12]/ : 45,XX,-1 l,t(9;l 1 ;22)(q34;ql4;ql 1)[5]/ : 47,XX,t(9;l I;22)(q34;ql4;ql l),+mar[7]

10 Л.С.В. м 38 ХФ 46,Xy,t(9;12;22)(q34;ql5;qll)[20]

11 JI.A.T. ж 71 ХФ : 46,XX,t(9;l 1 ;22)(q34;p 15;q 11 ),del(3)(p23), -22,+mar[20]

12 П.Н.М. м 59 ХФ 46,Xy,t(9; 10;22)(q34;q23;q 11 )[20]

13 Р.Л.В. ж 45 ХФ 46,XX,t(22;22)(pl2;ql 1)[20]

14 С.А.П. м 59 ХФ 46,ХУ ,t(22;22)(q 11 ;q 13)[20]

15 Т.Г.Н. ж 40 ХФ 46,XX,t(9;16;22)(q34;pl3;qll) [20]

16 ш.н.м. м 65 ХФ 46,Xy,t(l;7;9;22)(q21;p22;q34;ql 1)[20]

17 ю.э.ю. м 47 ФА 46,Xy,t(9;9;22)(q34;q22;ql 1)[20]

ч 1 1,4 ||

»11) г

1 М Щ

' у

¡¡-г4

Рис. 1. Кариограмма пациента Ш.Н.М.: 46, ХУ, 1{ 1 ;7;9;22)(я21 ;р22я34;я 11)

Сравнительный анализ результатов терапии у пациентов со стандартной РЬ-хромосомой и вариантными Х(9;22) показал, что больные обеих групп достоверно не различались по всем характеристикам: вероятности достижения БЦГО к 6 месяцам: 93% и 82% (р=0,19), ПЦГО к 12 месяцам: 92% и 87% (р=0,12), бессобытийной и общей выживаемости (р=0,04081 и р=0,09, соответственно).

В качестве дополнительных аберраций к уже существующей РИ-хромосоме у 39 (8%) из 488 больных ХМЛ (табл. 2), у которых до начала терапии иматинибом обнаруживалась клональная эволюция (КЭ), наиболее часто выявлялись: дополнительная РЬ-хромосома (у 7 (18%) из 39) и трисомия 8 хромосомы (у 6 (15,4%) из 39 пациентов).

Таблица 2

Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрациями до начала терапии

иматинибом

№ п/п Ф.И.0 Кариотип

1 Б.Л.Н. 46,ХХД9;22)(Ч34;Ч11)[6]/46,ХХ,йет,<1е1(11)(ч23)[8]/ 46,XX, гЧет,ае!(11)(д23),ту(16)(р13;ч22)[5]

2 В.Т.Ю. 46,ХХд(9;22)(Ч34;я11)[12]/42-45,ХХ, йет,-3,-8[8]

3 В.А.П. 46,ХХД9;22)(ч34;ч 11 ),с!ег(17)1(7; 17)(я 11 ;р13)

4 В.Д.П. 46,Х^е1(У),1(9;22)(я34;я11)[18]/46,Х,ае1(У), кет,+8,-20[5]

5 г.в.в. 46,ХУД(9;22)(я34;я11)[8]/47,ХУ, кет,+8 [12]

6 Г.Т.И. 46,ХХД9;22)(я34;я11)[12]/46,ХХ, Цет,ас!(1(16)(я24)[8]

7 г.ю.в. 46,ХХД(9;22)(ч34;д 11)[ 17]/46,ХХ, Цст,с1е1(8я24)[3]

8 Ж.С.А. 46,X,deI(Y),t(9;22)(q34;q 11), i(17)(ql0)[20]

9 И.В.С. 47,XYY,t(9;22)(q34;ql 1)[20]

10 И.А.М. 47,XY,t(9;22)(q34;qll),+der(22)t(9;22)[20]

11 Й.Л.Н. 46,XX,t(9;22)(q34;qll),dup(l)t(l;7)(q25;q36),del(20)(ql2)[9]/ 47,XX, item,+8[l 1]

12 К.С.В. 46,XY,t(9;22)(q34;ql 1 )[24]/46,XY, item,del(7)(q32)[4]

13 K.B.B. 46,XY,l(9;22)(q34;ql 1)[15]/47,XY, item,+der(22)t(9;22)[5]

14 К. А.И. 46,X Y,t(9;22)(q34;q 11)[17]/47,XY, item,+der(22)t(9;22)[3]

15 К.И.Г. 46,XX,t(9;22)(q34;q 11 )[ 16]/46,XX, item,del(3)(pll)[4]

16 Л.В.А. 47,XX,t(9;22)(q34;q 1l),+8[20]

17 Л.O.A. 46,XY,t(9;22)(q34;q 13 )[ 13]/45,X,-Y, item [7]

18 М.Н.А. 46,XY,t(9;22)(q34;qll)[10]/ 53,XY, item,+6,+8,+10,+19,+20,+der(22)t(9;22)[10]

19 М.С.А. 46,XY,t(9;22)(q34;q 1I),t(3;6)(q26;pl2)[20]

20 Н.В.М. 46,XY,t(9;22)(q34;qll)[9]/46,XY, item,dup(l)(q21;q32)[ll]

21 H.O.B. 45,XX,t(9;22)(q34;qll),add(7)(p22),-14[20]

22 о.н.н. 46,XX,t(9;22)(q34;qll),t(3;8)(q26;q22)[20]

23 O.P.H. 46,XX,t(9;22)(q34;ql 1)[15]/ 46,XX, item,add(19)(ql3)[8]

24 П.Б.И. 46,XY,t(9;22)(q34;ql l),inv(7)(pl3;qll)[20]

25 C.M.B. 46,XX,t(9;22)(q34;ql 1 ),i(der(22)t(9;22))[20]

26 С.В.А. 47,XY,t(9;22)(q34;q 11),+8 [20]

27 С.А.И. 46,XY,t(9;22)(q34;qll),add(12)(q24.3)[20]

28 С.Т.П. 46,XX,t(9;22)(q34;q 11)[10]/46,XX, item,del(7)(q32)[7]

29 С.Н.П. 46,XX,t(9;22)(q34;qll)[24]/46,XX, item,del(ll)(q23)[3]

30 Т.М.Я. 46,XY,t(9;22)(q34;qll)[10]/46,XY,item,del(l)(q31)[5]/46,XY[5]

31 т.т.с. 46,XY,t(9;22)(q34;q 11)[14]/47,XY, item,+mar[4]/46,XYf2]

32 Т.ДА. 46ДУД(9;22)№4;Ч1 1)[17]/47,XY, item,+8[3]

33 Ф.С.А. 46,XY,t(9;22)(q34;q 11 )[20]/45,XY, item,-15[5]

34 Ч.В.Г. 46,XY,t(9;22)(q34;q 11 )[ 16]/ 46,XY, item,add(13)(q34)[4]

35 Ч.А.Н. 46,XX,t(9;22)(q34;q 11 )[14]/47,XX, item,+der(22)t(9;22)[6]

36 Ш.Н.И 46,XX,t(9;22)(q34;ql 1 )[18]/47,XX, item,+der(22)t(9;22)[2]

37 Ш.А.Л 46,XY,t(9;22)(q34;q 11)[11]/47,XY, item,+der(22)t(9;22)[2]/ 46,XY, item,del(l 1 )(q23)[7]

38 Э.В.В. 46,ХХ,с1ег(22),<1е1(5)(цЗЗ)[20]

39 Я.О.Й. 46,ХХД(9;22)(д34;я11 )Д10;13)(ч22;я34)[20]

Анализ результатов терапии больных ХМЛ с единственной РЬ-хромосомой и с дополнительными к РЬ-хромосоме аберрациями, выявленными в дебюте терапии иматинибом, показал достоверные отличия по всем показателям. Анализ вероятности достижения БЦГО к 6 месяцам терапии у пациентов с КЭ показал 46% в сравнении с 93% у больных без КЭ - р=0,002 (рис. 2), ПЦГО к 12 месяцам - 43% и 92%, соответственно (р=0,001) (рис. 3), бессобытийной выживаемости - 32% и 80%, соответственно (р=0,0011) (рис. 4), общей выживаемости - 48% и 88% (р=0,0000) (рис. 5).

Рис. 2. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.

Время, дни

Рис. 3. Вероятность достижения ПЦГО к 12 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.

Л 0.2

ос'д Ю (220 $олыш\)

С {2.* бачьиых)

¡>",0«<И

о

м гз го « м и то го 9а Время. мес.

Рис. 4. Бессобытийная выживаемость больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.

Рис. 5. Общая выживаемость больных ХМЛ без КЭ и с КЭ до терапии иматинибом.

В 4-ю группу включены 39 (8%) из 488 пациентов (табл. 3), у которых на различных этапах терапии препаратами ИТК в РЬ-положительных клетках появились те или иные дополнительные хромосомные аберрации. Чаще других дополнительно к РЬ-хромосоме на фоне терапии ИТК встречались РЬ-хромосома и трисомия 8 хромосомы, у 10 (25,6%) и 12 (30,8%) из 39 пациентов, соответственно.

Расчетный анализ результатов терапии, полученных у больных данной группы и у пациентов без КЭ, показал достоверные различия по всем показателям. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам больных с КЭ равнялась 62% в сранении с 93% у пациентов без КЭ - р = 0,0075 (рис. 6), ПЦГО

*— К.) (226

4— с К') йолышх)

I) * 0,<КН1Ш1

ез ■№

к 12 месяцам соответствовал 44% и 92% - р = 0,001 (рис. 7), вероятность бессобытийной выживаемости показала всего 13% у больных с КЭ в сравнении с 80% у пациентов без КЭ - р = 0,0000 (рис. 8) и общая выживаемость равнялась 53% и 88% соответственно - р = 0,00110 (рис. 9).

Таблица 3

Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрациями в РИ-положительных _клетках, выявленными во время терапии иматинибом_

№ п/п Ф.И.О Пол Кариотип

1 А.В.П. м ! 46,ХУ,1(9;22)(я34;Ч11 )[12]./47,ХУ^ет,+с1ег(22К(9;22)[5]/ : 46,ХУ[23]

2 А.О.П. м 46,ХУД(9;22)(я34;я11)[17]/47,ХУ,Пет,+с1сг(22)«;9;22)[1]/ ! 48,ХУ, ¡1ет,+(кг(22Ж9;22),+8[2]

3 Б.В.И. м 46,ХУ,1(9;22)(я34;я11)[16]/47,ХУ,кет,+8[4]/46,ХУ[1]

4 Б.Ю.И. м 46,ХУД9;22)(я34;Ч11)^е1(7)(я32)[3]/46,ХУ[17]

5 Б.Н.Ф. ж 46,ХХХ9;22)(я34;я11)[16]/47,ХХ, Нет,+8[8]/ 48,ХХ,кет^ег(22Ж9;22)+8[2]

6 Б.А.И м 46,ХУД(9;22)(я34;я 11)[ 19]/47,ХУ,кет,4^ег(22)К9;22)[4]

7 Б.Л.С. ж 46,ХХД(9;22)(Ч34;Ч 11)[ 19]/47,ХХ,кет,+ёег(22Ж9 ;22)[ 1 ]/ ! 46,ХХ[6]

8 В.О.А. м 46,ХУД9;22)(Ч34;Ч 11 )[13]/47,Х У,Пет,+8[5]/46,Х У[8]

9 Г.В.П м 46,ХУД(9;22)(я34;я11)[8]/47,ХУ,иет,+19[2]/46,ХУ[10] ]

10 Г.Д.М. м 46,ХУД9;22)(я34;я11 )[6]/47,ХУ, кет,+дег(22)1(9;22)[7]/ ! 48,ХУ, кет,+йег(22)1(9;22),+8[6]/46,ХУ[1 ]

11 Г.А.А. м 44,XY,t(9;22)(q34;qll),+l,del(l)(p32),-7,-12,add(ll)(q25), | -15,-15,+таг[20]

12 Д.И.В. м 46,ХУД(9;22)(ч34;я 11)[2]/ 46,ХУ,Иет,асМ(2)(я37)[17]/ 47,ХУ, кет^ег(22Ж9;22), add(2Kq37)[l]

13 К.В.А. м 46,ХУ,Г(9;22)(я34;Ч11)[12]/47,ХУ,иет^ег(22)1(9;22)[8] |

14 К.Е.А. м 46,ХУД9;22)(я34;ч11 )[17]/46,ХУ, иет,г(7)[3]

15 К.А.Ф. м 47,ХУД(9;22)(я34;я11),+аег(22)1(9;22)[14]/47,ХУ,+8[6]

16 К.М.Л. м 47,ХУ,К9;22)(я34;ч11),+8{2]/46,ХУ[18]

17 К.А.Г. м 46,ХУД(9;22)(я34;я11)[44]/47,ХУ, Пет,+аег(22Ж9;22)[2] |

18 К.В.С. м 46,ХУд(9;22)(я34;я11)[2]/47,ХУ,иет,+8[1]/45,ХУ,Нет,-7[22]

19 К.Т.Ф. ж 46,ХХД(9;22)(я34;я11)Д(17)(яЮ)[2]/46,ХХ[35]

20 М.В.А. м 47,ХУ,«9;22)(Ч34;Ч11),+таг[20]

21 м.с.в. м 46,ХУ,1(9;22)(я34;я11)[6]/48,ХУ, кет,+с1ег(22)1(9;22),+9[6]/ 46,ХУ[12]

22 М.В.А. м 46,ХУЛ(9;22)(Ч34;Ч11)[10]/4б,ХУ,йеш,1(17)(Я10)[3]/ 47,ХУ,кет,+8Д17)(чЮ)[6]/46,ХУ[ 1 ]

23 М.В.П. ж 47,ХХ,<(9;22)(Ч34;Ч11),+8,«(17КЧЮ)[20]

24 М.Е.В. м 47,Х У,1(9;22)(ч34;я 11 ),+8[8]/46,Х У[ 12]

25 Н.И.А. ж 46,ХХД(9;22)(я34;Ч11) [17]/47,ХХ,кет,+8[2]/ 46,ХХ,кет,а11(1(17)(р13)[1]

26 П.Р.А. м 46,ХУ,К9;22)(я34;я11)[3]/48,ХУ, Иет,+аег(22)1(9;22),+9[14]/ 46,ХУ[3]

27 П.К.Г. м 46,ХУД(9;22)(ч34;я11),ае1(11Кя23)[28]/48,ХУ,иет, +аег(22)^9;22),+8[2]

28 П.Н.В. ж 46,ХХД9;22)(Ч34;я11)[2]/46,ХХДет,1(7;12)(ц22;я13)[181

29 П.В.А. м 45,ХУ,1(9;22)(Ч34;я11),-21[20]/48-49,ХУ,11ет,+5,+8,+16[7]

30 С.В.М. м 46,ХУЛ(9;22)(Ч34;ЧП)[31]/ 47,ХУ, иет,+<1ег(22)1(9;22)[4]

31 С.В.А. м 47,ХУД9;22)(Ч34;Ч11),+8[20]

32 С.Ю.Н м 46,ХУД(9;22)(я34;я11)[16]/47,ХУ, иет,+с1ег(22)Ц9;22)[4]

33 С.Л.С. ж 46,ХХД(9;22)(я34;я11)[10]/47,ХХ,1еет,+8[5]/ 46,ХХ[5]

34 Т.В.В. м 45,Х,-Уд(9;22)(Ч34;я11)[12]/47,Х^1ет,+аег(22Ж9;22),+8[2]/ 46,ХУ[6]

35 У.Г.М. ж 47,ХХ,1(9;22)(д34;я1 1),+8^ (3)(р26)[20]

36 Х.Е.Ю. ж 48,XX,t(9;22)(q34;qll),+2der(22)t(9;22)[2]/49,XX,¡tem+19[19]

37 Ч.В.Ф. ж 47,ХХД(9;22)(ц34;я 11),+8[20]

38 ш.н.м м 47,ХУД 1 ;7;9;22)(я21 ;р22;я34;я 11 ),+8[4]/46,ХУ[26]

39 я.о.и. ж 46,ХХ,1(9;22)(я34;д11)Д(10;13)(я22;д34)[20]/47,ХХ Пет,+8[7]

Влияние на результаты терапии дополнительных хромосомных аберраций в Рй-отрицательных клетках у больных ХМЛ в настоящее время не выяснено, частично это объясняется непродолжительностью периода наблюдения за пациентами и немногочисленностью таких больных (3,6-8,1% по данным разных авторов).

£

Р э

■А

а

о

а

р = 0,0075

200 400 603 300 10» 12<Х> 1«0 ШО

Вре«<1, ДНИ

Рис. 6. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ в РЬ-положительных клетках на фоне терапии

2 Ш

о о

ж

й о

8* ю

400 800 1200 1600

Время, дни

Рис. 7. Вероятность достижения ПЦГО к 12 месяцам у больных ХМЛ без КЭ в РИ-положительных клетках и с КЭ на фоне терапии

У 0;

о o.¿

s

V

3.1

5оЛ!>Ш.4£ ба КЭ

р ~ ,000№>

с КЭ

2С 40 Sfl ?0 SO $3

.Время.. мес.

Рис. 8. Вероятность бессобытийной ЦГ выживаемости у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ в РЬ-положительных клетках на фоне терапии

0 Ú

1 07 ■X

I

о

0,5

БОЛОНЬЮ без КЗ

1

р - ,00110

K<f-í.í:iíífiC С К".)

С: 20 . 4 а 60 Sí! 100 КО 140

8|>гма:. мсс

Рис. 9. Общая выживаемость у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ в Ph-ноложительных клетках на фоне терапии

Так, 5-ю группу составили 27 (5,5%) из 488 больных ХМЛ (табл. 4), у которых при мониторинге терапии НТК в Ph-отрицательных клетках обнаруживались клональные хромосомные аномалии (КХА) кариотипа. У подавляющего большинства пациентов с КХА в Ph-отрицательных клетках обнаружена трисомия 8 хромосомы (рис. 10), у 15 (55,6%) из 27 исследуемых больных данной группы. У 5 (18,5%) пациентов из 27 определялись -7/7q-хромосомы.

« * >■ - « > I - - % * * * * 1 ^ <

1Ь ? ? Цй ! " 5 1 * * * "

6 7 8 »8 9 10 11 12

I у' И * ' Т* * ^

13 14 15 1С I? ш

,Г-Гн |........., ..........,

Рис. 10. Кариограмма пациента С.И.В.: 47,ХУ,+8

Таблица 4

Результаты цитогенетических исследований у больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрациями в РИ-отрицательных клетках, выявленными во время терапии ИТК

№ и/п Ф.И.О кэ, мес. Кариотип

1 А.Л.П. 30 47,ХХ,+8[4]/46,ХХ[30]

2 Б.М.Н. 3 46,ХХ,(9;22)(я34;я11)[7]/46,ХХ,а(Ш(18)^23)[7]/46,ХХ[6]

3 В.Н.Л. 39 47,ХУ,+8[30]

4 в.о.в. 24 47,ХУ,+8[8]/46,ХУ[22]

5 В.А.Ю 33 45,ХУ,-7[20]

6 Г.Т.И. 12 46,ХХ,(9;22)(я34;я 11)[ 19]/47,ХХ,+8[3]/46,ХХ[ 18]

7 Е.В.А. 3 46,ХУд(9;22)(я34;ч11 )[5]/46,ХУ,(1е1(11)(я23)[3]/46,ХУ[ 13]

8 Ж.А.Н. 33 41 -45,ХУ,-8[8]/46,Х У[35]

9 Ж.В.С. 27 47,ХХ,+8[5]/46,ХХ[36]

10 К.А.Ф. 30 46,ХУД9;22)(я34;я11)[ 1 ]/47,ХУ,+8[7]/46,ХУ[ 18]

11 М.Л.Л. 30 47ДХ,+8[5]/46,ХХ[9]

12 М.Н.А. 27 47,ХХ,+8[11]/46,ХХ[9]

13 М.Т.Г. 6 46,ХХ,-9,1(17)(я10),+таг[12]/47,ХХ,1(17)(я10),+таг[4]

14 О.А.А. 12 45,ХУ,-7[3]/46,ХУ[35]

15 О.А.М. 12 47,ХХ,+8[9]/46,ХХ[ 19]

16 П.И.А. 48 4 6,ХХ,ш$(1)(ч11)[4]/46,ХХ[23]

17 П.Т.М. 15 46,ХХ,(9;22)(Ч34^11 )[27]/46,ХХ,с1е1(15)(ч21)[2]

18 П.С.Г. 24 46,ХХ,(1е1(7)(ч31)[8]/46,ХХ[12]

19 Р.Н.Е. 33 46,XX,11 ^24)[3]/46,ХХ[ 17]

20 С.И.В. 30 47,ХУ,+8[7]/46,ХУ[28]

21 С.Л.В. 6 47,ХХ,+8[4]/46,ХХ[36]

22 Т. А. А. 27 45,ХХ,-7[8]/46,ХХ[12]

23 У.Л.А. 27 47,ХХ,+8[6]/46,ХХ[34]

24 Х.Р.И. 21 46,ХХ,(9;22)(ч34;я 11)[ 1 ]/45,ХХ,-7[4]/46,ХХ[ 15]

25 Ч.А.Н. 24 46,ХХ,(9;22)(я34;я11)[4]/47,ХХ,+8[5]/46,ХХ[21]

26 Щ.Г.В. 30 47,ХУ,+8[2]/46,ХУ[48]

27 Ш.Д.А. 24 47,ХХ,+8[9]/46,ХХ[11]

Срок наблюдения за больными данной группы составил от 26 до 82 месяцев. Дополнительные хромосомные нарушения появлялись у пациентов на различных этапах терапии, в среднем через 24,2 месяца (от 3 до 78 месяцев). КХА в РЬ-отрицательных клетках обнаруживались как на фоне приема иматиниба - у 23 (85,2%) из 27 больных, так и в случаях приема препаратов второй линии терапии (дазатиниб, нилотиниб) - у 4 пациентов (14,8%). При этом данные миелограммы на этапе выявления КЭ оставались в пределах нормы и прогрессии заболевания не наблюдалось. При цитогенетическом исследовании костного мозга больных 5-й группы через каждые 3—6 месяцев на фоне лечения ИТК дополнительные аберрации не обнаруживались стабильно, они то появлялись, то исчезали при последующих анализах. Однако у 5 (18,4%) пациентов, которые не достигли БЦГО к 6 месяцам и ПЦГО к 12 месяцам, патологический клон с дополнительными хромосомными аберрациями в Рй-отрицательных клетках сохранялся стабильно. Более того, у 2 из 5 больных (К.А.Ф., М.Л.П.) с трисомией 8 хромосомы в конечном результате появлялась РЬ хромосома через 6 и 12 месяцев, соответственно, от момента обнаружения КХА. У пациентки Т.А.А. моносомия 7 хромосомы была обнаружена на второй линии терапии дазатинибом через 18 месяцев от начала приема препарата и далее сохранялась на протяжении 11 месяцев при всех последующих цитогенетических исследованиях (каждые 3 месяца). В конечном результате у больной развился миелодиспластический синдром.

Сравнительный анализ результатов терапии больных без дополнительных хромосомных аберраций к РЬ хромосоме и с КХА в Р11-отрицательных клетках оказался противоречивым. Так, по достижению БЦГО к 6 месяцам - расчетная вероятность равняется 93% и 62%, соответственно (р=0,17) (рис. 11); ПЦГО

к 12 месяцам - 92% и 65% (р=0,6) (рис. 12) и общей выживаемости: 88% и 79% (р=0,9891) - пациенты достоверно не отличались.

Рис. 11. Вероятность достижения БЦГО к 6 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ в РЬ-отрицательных клетках на фоне терапии

Время, дни

Рис. 12. Вероятность достижения ПЦГО к 12 месяцам у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ в РЬ-отрицательных клетках на фоне терапии

Однако по срокам бессобытийной выживаемости были получены достоверные различия у пациентов двух групп, р = 0,001 (рис. 13).

Рис. 13. Бессобытийная выживаемость у больных ХМЛ без КЭ и с КЭ в Ph отрицательных клетках на фоне терапии

До сих пор не получен ответ на вопрос о возможных механизмах природы происхождения КЭ в Ph-отрицательных клетках у больных ХМЛ, получающих терапию ИТК. В связи с этим был проведен ретроспективный FISH анализ у 10 (37%) из 27 пациентов нашего центра. При помощи FISH метода исследованы: 8 пациентов, у которых в Ph-отрицательных клетках была обнаружена трисомия 8 хромосомы, и 2 больных - с моносомией 7. У 5 пациентов удалось произвести анализ биоматериала, полученного до начала терапии ИТК, т.е. на момент скрининговых цитогенетических исследований (табл. 5).

При FISH исследованиях у 8 больных с трисомией 8 хромосомы, обнаруженной при цитогенетическом исследовании в Ph-отрицательных клетках, выявлен тот же патологический клон. Полученные результаты могут служить подтверждением гипотезы, что трисомия 8 хромосомы представляет предлейкемическую стадию заболевания, а приобретение Ph хромосомы является вторичным событием.

В то время как моносомия 7 хромосомы у обоих исследуемых пациентов не определялась, что может свидетельствовать о вторичном характере возникновения патологического клона, наведенного проводимой терапией.

Таблица 5

Результаты ретроспективного FISH исследования у больных ХМЛ с клональной эволюцией в Ph-отрицательных клетках

№ п/п Ф.И.О. кэ, мес. FISH, мес. Результат FISH, % патологии Кариогин

1 А.Л.П. 30 3 9% 47,ХХ,+8[4]/46,ХХ[30]

2 Г.Т.И. 12 скрининг 12% 46,XX,(9;22)(q34;qll)[19] 47,ХХ,+8[3]/46,ХХ[18]

3 К.А.Ф. 30 6 17% 46,XY,t(9;22)(q34;ql 1 )[1 ]/ 47,XY,+8[7]/46,XY[ 18]

4 М.Л.П. 30 9 8% 47,ХХ,+8[5]/46,ХХ[9]

5 М.Н.А. 27 скрининг 29% 47,ХХ,+8[11]/46,ХХ[9]

6 О.А.М. 12 3 18% 47,ХХ,+8[9]/46,ХХ[19]

7 С.Л.В. 6 скрининг 8% 47,ХХ,+8[4]/46,ХХ[36]

8 У.Л.А. 27 скрининг 11% 47,ХХ,+8[6]/46,ХХ[34]

9 В.АЛО 33 скрининг 0% 45,XY,-7[20]

10 О.А.А. 12 3 0% 45,XY,-7[3]/46,XY[35]

Таким образом, у больных ХМЛ, получающих терапию ИТК, дополнительные хромосомные аберрации появляются как в РИ-положительных, так и в РИ-отрицательных клетках. Прогностическое значение имеют клональные хромосомные аберрации, которые определяются при стандартном цитогенетическом исследовании в РИ-положительных клетках как до начала терапии ИТК, так и на различных этапах ее мониторинга. В то время как вариантные 1(9;22) не влияют на течение заболевания в сравнении со стандартной 1(9;22). Противоречивость полученных результатов терапии больных ХМЛ с клональными хромосомными аномалиями в РЬ-отрицательных клетках в сравнении с пациентами без дополнительных хромосомных изменений обосновывает необходимость более частого цитогенетического мониторинга терапии ИТК больных ХМЛ. Так, клональные хромосомные аномалии в РЬ-отрицательных клетках не влияют на достижение пациентами БЦГО к 6 месяцам, ПЦГО к 12 месяцам и общую выживаемость. Однако клональные аберрации в РЬ-отрицательных клетках оказались статистически значимыми при сравнительном анализе бессобытийной

выживаемости больных ХМЛ. Учитывая рекомендации Европейской организации ЕеикегглаИе! [Вассагаш М., 2009] и собственные данные, цитогенетический мониторинг целесообразно проводить согласно алгоритму, представленному на рис. 14.

К") п Р1ц+) -коррекций герании

КХ V в Р11{-> -каж «ыс 6 мее.

)

Рис. 14. Алгоритм цитогенетической диагностики и мониторинга терапии ХМЛ

Результаты генетических исследований у больных Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативнымн заболеваниями (Ph(-) ХМПЗ) Северо-Западного региона РФ

Как известно, высокоспецифичным маркером Ph(-) ХМПЗ является мутация V617F в гене JAK2. Детекция данной генетической аберрации производилась всем 307 исследуемым пациентам при помощи аллель-специфической ПЦР. Полученные результаты в анализируемой группе представлены в табл. 6.

Таблица 6

Встречаемость JAK2V617F мутации при Ph-отрицательных хронических миело пролиферативиых заболеваниях

....... ..... ............. ИП ЭТ ХИМФ Больные не гематологического профиля

Количество пациентов 56/67* 26/56* 21/44* 12/140*

Встречаемость JAK2 V617F мутации 83,6% 46,4% 47,7% 8,6%

* Количество пациентов с JAK2 V617F мутацией / всего обследованных больных

Как следует из данной таблицы, наиболее высокий процент встречаемости (83,6%) мутации JAK2V617F определялся у пациентов с ИП, обнаружена она у 56 из 67 обследованных больных. При ЭТ мутация выявлялась в 46,4% исследованных пациентов (у 26 из 56). Встречаемость мутации JAK2 V617F в группе больных с ХИМФ составила 47,7% и определялась у 21 пациента из 44 обследованных. В группе первичных больных, обследованных с целью дифференциальной диагностики Ph(-) ХМПЗ и заболеваний не гематологического профиля со схожей клинико-морфологической картиной, мутация выявлялась у 12 (8,6%) из 140 больных, что позволило достоверно подтвердить диагноз.

Наряду с молекулярно-генетическим исследованием с целью детекции мутации JAK2V617F у 127 (41,4%) из 307 больных был выполнен цитогенетический анализ клеток костного мозга. У 121 пациента из 127 (95,3%) определен нормальный кариотип. При этом 36 (28,3%) из 127 больных были направлены в лабораторию с целью исключения Ph(-) ХМПЗ. При кариологическом анализе клеток костного мозга у 6 из 36 (16,7 %) исследуемых пациентов выявлялись клональные хромосомные аберрации: у 2 - комплексный кариотип с множественными хромосомными перестройками, а у 4 пациентов изолированные аномалии: del(13)(q22), dci(Y)(q 12), del(3)(p13) и add(14)(p!0), del(20)(ql2). Только у 2 из 6 больных с патологическим кариотипом была выявлена специфическая для Ph(-) ХМПЗ мутация JAK2V617F.

Все обнаруженные хромосомные перестройки являлись высокоспецифичными для миелопролиферативных заболеваний, что дало возможность достоверно подтвердить либо установить диагноз Ph(-) ХМПЗ. Кроме того, у 3 из 6 пациентов с выявленными аберрациями хромосом был определен неблагоприятный кариотип - множественные нарушения и del(3)(pl3) с дополнительной аномалией add(14)(p!0), что позволило отнести данных больных в группу риска трансформации в ОМЛ или МДС.

Следовательно, мутация JAK2V617F у больных Ph(-) ХМПЗ является одним из основных диагностических маркеров заболевания. В то время как обнаружение хромосомных аберраций при стандартном цитогенетическом анализе у пациентов с Ph(-) ХМПЗ позволяет выявить пациентов из группы риска трансформации в ОМЛ или МДС. Таким образом, как показано нами и другими авторами, генетические методы исследования наряду с клиническими, морфологическими и гистологическими необходимо включить в алгоритм диагностики Ph(-) ХМПЗ и проводить согласно алгоритму, представленному на рис. 15.

Рис. 15. Алгоритм генетической диагностики Ph(-) ХМПЗ.

Значимость генетических методов исследования в терапии миелодиспластического синдрома (МДС)

В исследуемой группе у больных МДС частота нормального кариотипа снижалась по мере увеличения возраста пациентов: 40,3% в группе младше 60 лет и 28,7% в группе старше 61 года (р=0,141). Напротив, число больных с несбалансированными и комплексными аберрациями было выше в старшей возрастной группе: 33,9% против 43,7% (р=0,229) и 19,4% против 25,3% (р=0,396), соответственно (табл.7).

Таблица 7

Распределение вариантов кариотипа среди больных МДС разного возраста

Группы больных Кариотип

Нормальный Несбалансированный Комплексный

возраст п медиана размах п % п % п %

<60 62 49,5 17-60 25 40,3 21 33,9 12 19,4

>61 87 73 61 -83 25 28,7 38 43,7 22 25,3

Вместе с тем у больных МДС с увеличением возраста было установлено достоверное увеличение случаев с моносомией или делецией длинного я плеча 5 хромосомы независимо от количества и вида сопутствующих аберраций, включая и поломки 7 хромосомы. Так, если в группе МДС моложе 60 лег повреждения 5 хромосомы были обнаружены у 14,5% больных, то в группе старше 61 года - у 29,9% (р=0,029). Необходимо отметить, что среди больных МДС увеличение случаев с повреждениями 5 хромосомы имело место преимущественно среди больных с избыточным количеством бластных клеток в костном мозге. Так, если число больных в возрасте до 60 лет и с бластозом более 5% составило 9,7%, то в группе больных РАИБ старше 60 лет - 20,7% (р=0,072).

Анализ общей выживаемости больных МДС в возрасте <60 лет и >61 в зависимости от варианта кариотипа показал, что возраст у больных МДС с нормальным (р=0,001) (рис. 16) и несбалансированным кариотипами (р=0,020) (рис.17) - независимый фактор риска, тогда как у больных с комплексным кариотипом достоверных различий не обнаружено (р=0,273) (рис. 18).

Нормальный кариотип

- моложе 60 г. • старше 60 л.

150 20С 250 300

Время, мес

Рис. 16. Общая выживаемость больных МДС в возрасте <60 лет и >61 в зависимости от нормального кариотипа

до

Время. иве.

бй 7и 80

Рис. 17. Общая выживаемость больных МДС в возрасте <60 лет и >61 в зависимости от несбалансированного кариотипа

!с9чвгИ: р=0.273

Комплексный кариотип

- молохе 60 л.

- стерве 60 л.

0 20 40 «О ео 100 '2': 140 16<" 1Й0 ?.0~1

Рис. 18. Общая выживаемость больных МДС в возрасте <60 лет и >61 в зависимости от комплексного кариотипа

С целью детекции мутаций в генах N.РМ1 и ПТЗ изучен мутационный статус у 44 (29,5%) из 149 больных МДС.

По результатам цитогенетического исследования у 15 больных был выявлен нормальный кариотип (34,1%) и у 15 - комплексный (34,1%), у остальных 14 пациентов обнаруживались другие варианты хромосомных аберраций (31,8%). Больные с различными вариантами кариотипа (нормальным, комплексным и другими аберрациями хромосом) достоверно отличались по выживаемости: р=0,0001 (рис. 19).

Рис. 19. Выживаемость больных МДС и кариотип

У 7 (15,9%) из 44 обследованных пациентов обнаружено 8 мутаций: 2 FLT3-ITD, 1 FLT3-TKD и 5 NPM1. Все больные были de novo МДС. Повреждений генов FLT3 и NPMI у больных вторичным МДС и МДС/МПЗ не выявлено. У 6 больных обнаруживалась экспрессия одной из трех изученных мутаций: NPM1 у 4 (9,1%) и FLT3-1TD у 2 (4,5%). У одного пациента (2,3%) выявлялись 2 мутации одновременно - FLT3-TKD и NPM1 (рис. 20).

•0,2 Ь-,---.-,-----1---

0 5 10 1 5 20 25 30 35 40 45

■ Нормальный Комплексный Другие

4

3,5 3 2,5 2

ММ! FTO-ltD №WD

Рис. 20. Варианты мутаций у 7 больных МДС.

Несмотря на наличие неблагоприятных хромосомных перестроек (комплексный кариотип, повреждения 7 хромосомы), у всех 4 больных МДС с обнаруженной одиночной мутацией ИРМ1, определялась тенденция к снижению риска трансформации в ОМЛ (р=0,09), течение заболевания было стабильным. Напротив, у 3 пациентов с Р£ТЗ мутациями выявлялись множественные хромосомные аберрации, пациенты были с избыточным количеством бластов в костном мозге и неблагоприятным течением заболевания. Летальный исход констатирован у больных в среднем через 1 и 5 месяцев.

Таким образом, возраст и кариотип у больных МДС являются независимыми прогностическими факторами выживаемости. У пациентов по мере увеличения возраста частота встречаемости моносомии или делеции длинного я плеча 5 и/или 7 хромосом достоверно увеличивается (р=0,029). А анализ общей выживаемости больных в возрасте <60 лет и >61 в зависимости от варианта кариотипа показал, что возраст у больных МДС с нормальным (рЮ,001) и несбалансированным кариотипами (р=0,020) - независимый фактор риска, тогда как у больных с комплексным кариотипом достоверных различий не обнаружено (р=0,273).

Вместе с этим, проведенное нами исследование подтверждает обнаруженную тенденцию к снижению риска прогрессии МДС у больных с мутацией в гене ИРМ1. В то время как наличие мутации РЦТЗ-ПЪ ухудшает прогноз заболевания.

Проанализировав результаты других исследователей и собственные данные, становится очевидным, что наряду со стандартным цитогенетическим анализом в алгоритм диагностики и мониторинга терапии МДС необходимо включить молекулярно-генетические методы исследования, позволяющие определять прогностически значимые мутации в генах РЬТЗ и А'РМ!. На рис. 21 представлен алгоритм генетический диагностики МДС.

Роль цитогенетических и молекулярно-генетических маркеров в диагностике и терапии острого миелобластного лейкоза (ОМЛ)

Сравнительная характеристика клинических и цитогенетических характеристик больных ОМЛ (табл. 8), включенных в исследование, в возрасте <60 лет (182 больных (74,6%)) и >61 года (62 (25,4%) больных) показала, что сбалансированный кариотип обнаружен только у 4 (6,4%) пациентов в возрасте старше 61 года, в сравнении с 56 (30,8%) - у больных моложе 60 лет (р=0,003). Отличительной характеристикой кариотипа больных ОМЛ было достоверное увеличение случаев с множественными цитогенетическими аномалиями по мере увеличения возраста: 8,8% среди больных моложе 60 лет и 33,9% среди больных старше 61 года; р=0,000.

Комплекс. Другие Норма,

кариотип*, аберрации с!е1(5Ч),*

ШгШш * <1е1(20я),*

.........

Иоо. .юпр

ГШ+

ЯП* ЩЕМЩ МРМ1*

Ькпопр.

1ф')п1ич

Промежуточный прогноз

Небыюпр

!'• глг онр. проттч

* Необходим дальнейший мониторинг терапии

Рис. 21. Алгоритм генетической диагностики МДС.

Таблица <

Распределение вариантов кариотипа среди больных ОМЛ двух возрастных групп

Группа больпых Кариотип

Норма Несбалансированный Сбалансированный Комплексный

Возраст п Ме лет Размах п % п % п % п %

<60 182 55 16-60 63 34,6 47 25,8 56 30,8** 16 8,8*

>61 62 68 61-84 20 32,3 17 27,4 4 6,4** 21 33,9*

* Комплексный кариотип <60 лет и >61 года; р=0,000. **Сбалансированный кариотип <60 лет и >61 года; р=0,003.

При этом частота нормального и несбалансированного кариотипов была практически одинаковой: 34,6% против 32,3%; р=0,735 и 25,8% против 27,4%, соответственно; р=0,805.

У пациентов исследуемой группы одновременно с увеличением возраста установлено увеличение случаев с моносомией или делецией длинного плеча 5 хромосомы независимо от количества и вида сопутствующих аберраций, включая и поломки 7 хромосомы. Так, у больных OMJ1 старшей возрастной группы количество пациентов с аберрацией -5/5q- было достоверно выше, чем у больных более молодого возраста: 27,4% и 6,6%, соответственно; р=0,000.

Различие в медиане общей выживаемости пациентов с de novo OMJl, включенных в исследование и распределенных в группы <60 лет и >61 года, было достоверным: 18,6 месяцев и 7 месяцев, соответственно; р<0,001 (рис. 22). Общая 5-летняя выживаемость больных в группах составила 31,5% и 0%, соответственно.

Установлено достоверное различие и в медиане выживаемости между группами со сбалансированным, нормальным, несбалансированным и комплексным кариотипами: 15, 13, 10 и 6 месяцев, соответственно; р<0,001 (рис. 23). Общая 5-летняя выживаемость в группах составила 40,5%, 26,7%, 12,4% и 3,6%, соответственно.

При многофакторном анализе было установлено, что возраст и кариотип являются независимыми прогностическими факторами вьшиваемости больных OMJT: р<0,001 и р=0,004, соответственно.

«»»» Моложе 60 лет 1) —» Старше 60 лет (п=62^

Me 18,6 мес.

Me 7 мес.

0,0

р<0,00!

о

50

100 ISO 200

Время, мес.

250

300

Рис. 22. Общая выживаемость больных ОМЛ в разных возрастных группах.

1.0 0.9 0.6 0,7

А

5 0.6

0

1 0.5 К

I °'4 в

0.3 0.2 0.1 0.0

О 50 100 150 200 250 300

Время, мес.

Рис. 23. Общая выживаемость больных ОМЛ в зависимости от варианта кариотипа.

При анализе общей выживаемости больных в каждой возрастной группе по вариантам кариотипа различие было достоверным только среди 182 больных моложе 60 лет (р=0,006) (рис. 24). Напротив, общая выживаемость 62 больных в возрасте 61 года и старше достоверно не различалась: р=0,694 (рис. 25).

1.0

0.9

0.8

^ 0.7 ■а .

В 0.6

га 0.5 £

^ 0.4 Я

0,3 0.2 0.1

0.0

0 50 100 1 50 200 250 300

Время, мес.

Рис. 24. Общая выживаемость больных ОМЛ в возрасте <60 лет в зависимости от варианта кариотипа.

—■Нормальный, п=83

Сбалансированный, л-60

—Несбалансированный, п-6<п

-Комплексный, п=37

5 Ц Ме 15 мес.

| Ме 13 мес.

I Ч Ме 10 мес. р<0,001

Ме 6 мсс.

Нормальным, п~63

1 — Сбалансированный, п=56

Несбалансированный, п=47

Комплексный, п=16

Ц 1—Ме16мес.

Ме 15 мес.

| Ц Ме 12 мес. р=О,0Об

0,5

0.4

Нормальный, п=20. Ме 7,5 мес

Сбалансированный, п=4. Ме 8,0 мес. Несбалансированный, Т1-17. Ме 6,0 мес. Комплексный, [1=21. Ме 6,0 ме\

р=0,694

Время, мес.

Рис. 25. Общая выживаемость больных ОМЛ в возрасте >61 года в зависимости от варианта кариотипа.

С целью изучения мутационного статуса больных ОМЛ исследованы клетки костного мозга 43 (17,6%) из 244 пациентов. Мутации ¡ТО и ТКО в гене РЬТЗ и мутации в гене ЫРМ1 определялись методом полимеразной цепной реакции тотальной геномной ДНК. Мутации обнаружены у 16 из 43 обследованных больных (37,2%). Всего выявлено 19 мутаций (рис. 26): 8 РЬТЗ-ПО, 5 РЬТЗ-ТКО и 6 в гене МРМ1. У 13 пациентов (30,2%) определялись одиночные повреждения генов: у 6 больных РЬТЗ-П'О (13,9%), у 4 - РЬТЗ-ТКО (9,3%) и у 3 - УУРМ/ (7,0%). У трёх пациентов (7,0%) были две мутации одновременно: у двоих в гене ШРМ1 и РЬТЗ - 1ТО (4,7%) и у одного в гене ЫРМ1 и РЬТЗ-ТКО (2,3%).

РЬТЗ-ИО Р1Л'3-ТКП №М1 Мутации

Рис. 26. Мутации у больных ОМЛ.

В табл. 9 представлено распределение 19 мутаций, а также их вариантов среди 16 больных в зависимости от обнаруженного кариотипа.

Таблица 9

Кариотип Распределение 19 мутаций Всего

П ТЗ №М1

1ТО ТК1)

нормальный 6 1 5 12

а<М(14) 1 1

+21 1 1

комплексный 2 1 1 4

К8;21)^е1(9ч) 1 1

Всего 8 5 6 19

Кариотип Варианты мутаций у 16 больных

РЬТЗ МРМ1 РЬТЗ- Всего

т> ТКБ \TWNPM1 ТШ)№РМ1

нормальный 5 3 1 1 10

асЩ(14) 1 1

+21 1 1

комплексный 1 1 1 3

К8;21);(<1е1)(9ч) 1 1

Всего 6 4 3 2 1 16

Из 3 изученных структурных повреждений генов наиболее частой была мутация Т'ХТЗ-ПТ), которая в виде единственной аномалии обнаруживалась у 6 из 43 обследованных больных ОМЛ (13,9%). При этом в 5 из 6 случаев это были пациенты с нормальным кариотипом. Более того, среди больных с нормальным кариотипом мутация FL7,3-lТБ выявлялась чаще (5 больных, 23,8%), чем мутации гаП-ТКВ (0 больных), в гене ЫРМ1 (3 больных, 14,3%) или мутации /ХТЗ-ГГО и Р1ТЗ-7КО в сочетании с мутацией в гене МРМ1 (по одному больному с каждой комбинацией; 9,5%). Исходя из этого, была проведена сравнительная оценка результатов терапии и выживаемости больных с нормальным кариотипом в группах, сформированных по мутационному статусу РЬТЗ-ПТ>.

Расчетная медиана общей выживаемости больных с генотипом ^ХГЗ-ШХ /МРМГ и /ХО-ИО^/ИРМ 1" была 17,3 и 8 месяцев, соответственно; р=0,069 (рис. 27), а бессобытийной - 11 и 5 месяцев; соответственно; р=0,02б (рис. 28).

По результатам однофакторного анализа было обнаружено негативное влияние мутации РЬТЗЛТЪ на показатели бессобытийной выживаемости пациентов с нормальным кариотипом; р=0,013. Что касается общей выживаемости, то установлена тенденция к ухудшению выживаемости больных с генотипом РЬТЗ- ПТ)+/ЫРМГ; р=0,076.

1 Me 17,3 мес. (6 событий)

Me 8 мес. (5 событий) . р-0,069 loa-rank

10 15 20 25 Время, мес.

*» FLT3 1TD/NPM1* FLT3 1TD+/N'PM1"

Рис. 27. Общая выживаемость больных OMJI с FLT3 мутацией и нормальным кариотипом

Рис. 28. Бессобытийная выживаемость больных OMJI с FLT3 мутацией и нормальным кариотипом (Р - рецидив; С - смерть)

Таким образом, у больных de novo OMJI, включенных в исследование и распределенных в группы <60 лет и >61 года, отмечены достоверные отличия в медиане общей выживаемости пациентов. Вместе с тем, по мере увеличения возраста больных увеличиваются случаи с прогностически неблагоприятными множественными цитогенетическими аномалиями, моносомией или делецией длинного плеча 5 и/или 7 хромосом (р=0,000). При этом неизменной остается частота нормального и несбалансированного кариотипов. Кроме этого, по общей выживаемости достоверно отличались только больные с однотипными

вариантами кариотипа моложе 60 лет (р=0,006). Напротив, общая выживаемость больных в возрасте 61 года и старше достоверно не различалась (р=0,694). При мутационном анализе больных ОМЛ с нормальным кариотипом наиболее часто обнаруживалась мутация РЬТЗ-Пй, которая определялась в виде единственной аберрации и негативно влияла на показатели бессобытийной выживаемости пациентов (р=0,013).

Таким образом, одними из основных методов, определяющих диагностические и прогностические особенности заболевания у больных ОМЛ, являются генетические методы исследования. Включение данных методов анализа в алгоритм диагностики и мониторинга терапии ОМЛ (рис. 29) позволит выделить более однородные прогностические группы пациентов и достоверно отслеживать минимальную резидуальную болезнь.

Моносомия*, комплексный кариотип.*

1! юмшр.

НрППКХ

Норма, другие аберрации*

Промежуточный прогноз

ЦГ+ПЦР «8:21) КИМХ1- КиИХГП * шуП6)/«16:16) СВРВ-МУНП* «15:17) РМЬ-ЛАЛА *

ПТЗ+

И. 73* \T\11* М>М1*

Ь шшпр ирш но-,

* Необходим дальнейший мониторинг терапии

Рис. 29. Алгоритм генетической диагностики ОМЛ.

ВЫВОДЫ

1. Генетические методы исследования должны быть включены в алгоритм диагностики и мониторинга терапии миелоидных заболеваний, что позволит не только верифицировать вариант и прогнозировать течение заболевания, но и достоверно отслеживать минимальную резидуальную болезнь.

2. Установлено, что мутация V617F в гене JAK2 является высокоспецифичным диагностическим маркером пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями и встречается у 83,6% больных истинной иолицитемией, у 46,4% - эссенциальной тромбоцитемией и у 47,7% - первичным миелофиброзом. Обнаружение у пациентов комплексного кариотипа, аномалий 5 и/или 7 хромосом и перестройки 17 хромосомы свидетельствует о риске трансформации этих заболеваний в острый миелобдастньш лейкоз.

3. Вариантные транслокации t(9;22) у больных хроническим миелолейкозом, получающих целенаправленную терапию ингибиторами тирозинкиназ, не ухудшают прогноз заболевания.

4. Клональная хромосомная эволюция в Ph-положительных клетках обуславливает у пациентов с хроническим миелолейкозом неблагоприятный исход заболевания.

5. Дополнительные хромосомные аномалии в Ph-отрицательных клетках, обнаруженные на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных хроническим миелолейкозом, не влияют на достижение пациентами большого цитогенетического ответа к 6 месяцам, полного цитогенетического ответа к 12 месяцам и не отражаются на общей их выживаемости, тогда как для бессобытийной выживаемости пациентов они статистически значимы, что обосновывает необходимость регулярного (каждые 6 месяцев) цитогенетического мониторинга терапии пациентов.

6. Возраст и кариотип являются независимыми прогностическими маркерами выживаемости больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелоидными лейкозами. У пациентов по мере увеличения возраста частота встречаемости моносомии или делеции длинного q плеча 5 и/или 7 хромосом достоверно увеличивается.

7. Мутация в гене NPM1 у пациентов с миелодиспластическим синдромом является показателем снижения риска прогрессии заболевания.

8. Больных de novo острыми миелоидными лейкозами с генотипом FLT3-1ТD+/NPM1~ следует относить к группе высокого риска, так же как и больных с комплексным кариотипом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Генетические методы исследования у больных опухолевыми заболеваниями миелоидной ткани рекомендуется проводить как в дебюте, так и на различных стадиях его развития с целью установления диагноза, определения прогноза заболевания и мониторинга минимальной остаточной болезни.

2. У больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ, с выявленными клоналышми хромосомными аберрациями в РЬ-отрицательных клетках, цитогенетический мониторинг необходимо проводить каждые 6 месяцев.

3. С целью верификации диагноза РЬ-отрицательных хронических миелопролиферативных заболеваний рекомендуется включить в алгоритм обследования больных определение мутации F(^/7F в гене МК2.

4. Детекцию мутаций в генах РИЗ и МРМ1 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелоидными лейкозами необходимо проводить с целью определения прогноза заболевания.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Моисеев С.И. О значении цитогенетических исследований в процессе лечения ОМЛ / Моисеев С.И., Мартынкевич И.С., Грицаев C.B., Ряднова Г.М., Балашова В.А., Тиранова С.А., Абдулкадыров К.М. // Гематология и трансфузиология. - 1996, Т. 41, №1,- С. 41-43.

2. Мартынкевич И.С. Прогностическая значимость цитогенетических изменений у больных ОЛЛ. / Мартынкевич И.С., Моисеев С.И., Валько Л.С. // Тезисы докладов 3 Всероссийского съезда гематологов «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». - 1996. - С. 10.

3. Сидорова Ж.Ю. Выявление хромосомной транслокации (9;22) методом РТ-ПЦР. / Сидорова Ж.Ю., Богданов К.В., Капустин С.И., Лышев А.А., Мартынкевич И.С., Маринец О.В. и др. // Вопросы онкологии. - 1997, № 3 -С. 25-29.

4. Abdulkadyrov К.М. Possibilities of treatment of CML patients with limphoblastoid alfa interferon / Abdulkadyrov K.M., Bessmelcev S.S., Rukavicyn O.A., Martynkevich I.S., Udaleva V.U. // Bone marrow transplantation, v. 19, march 1997.

5. Moiseev S. Experience of therapy by interleukin-2 in patients with acute leukemia before bone marrow transplantation. / Moiseev S., Martynkevich I.S., Zapreeva 1., Abdulkadirov K. // Bone marrow transplantation, v. 21, march 1998.

6. Мартынкевич И.С. Цитогенетические исследования в диагностике и лечении больных различными вариантами ОЛ и при трансплантации костного мозга / Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М., Дзявго Л.А., Мартыненко Л.С., Моисеев С.И. // Вопросы клинической и трансфузионной медицины (тезисы докладов 6 конференции молодых ученых), 29-30 марта 1999 г., г. Киров

7. Мартынкевич И.С. Цитогенетические исследования в диагностике и лечении больных различными вариантами ОЛ и при ТКМ. / Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М., Моисеев С.И., Мартыненко Л.С., Дзявго Л.А. // Пособие для врачей, 2000 г.

8. Моисеев С.И. Диагностика и лечение минимальной резидуальной болезни у больных острыми лейкозами. / Моисеев С.И., Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М. // Пособие для врачей, 2000 г.

9. Абдулкадыров К.М. Применение малых доз цитозин-арабинозида (АГА-С) для лечения больных ХМЛ / Абдулкадыров К.М., Рукавицын О.А., Мартынкевич И.С., Удальева В.Ю., Корнилова Т.А. // Вопросы онкологии. -2001. -№ 1.- С. 55-58.

10. Абдулкадыров К.М. Случай атипичного МДС с эозинофилией и комплексными цитогенетическими изменениями t(3;12) и t(I6;I7). / Абдулкадыров К.М., Рукавицын О.А., Грицаев C.B., Мартынкевич И.С., Тиранова С.А., Балашова В.А., Блинов М.Н. // Терапевтический архив. - 2002. № 7. - С. 70-72.

11. Мартынкевич И.С. Дополнительные хромосомные нарушения не влияют на прогноз заболевания у больных OHJIJ1 с t(8;21). / Мартынкевич И.С., Моисеев С.И., Дзявго Л.А., Мартыненко Л.С. // Тезисы конференции, посвященной 70-летию института "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", июнь 2002 г.

12. Абдулкадыров K.M. Антицитокиновая терапия больных первичным миелодиспластическим синдромом. / Абдулкадыров K.M., Бессмельцев С.С., Мартынкевич И.С., Грицаев C.B., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Осипова Р.И. И Вопросы онкологии. - 2003. - № 4. - С. 464-466.

13. Абдулкадыров K.M. Клинико-биологические особенности смешанных миелоидных заболеваний. / Абдулкадыров K.M., Грицаев C.B., Мартынкевич И.С., Бессмельцев С.С., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Ругаль В.И., Усачева Е.И., Бакай М.П. // Терапевтический архив. - 2004. - № 12. - С. 68-73.

14. Мартынкевич И.С. Комплексные нарушения кариотипа у больных МДС / Мартынкевич И.С., М.П. Бакай, C.B. Грицаев, K.M. Абдулкадыров // Тезисы конференции "Современные достижения клинической генетики", ноябрь 2003 г.

15. Абдулкадыров K.M. Вторичный МДС у больных множественной миеломой / Абдулкадыров K.M., Грицаев C.B., Мартынкевич И.С., Бессмельцев С.С., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Стельмашенко Л.В., Пестерова В.В. // Терапевтический архив. - 2004. - № 7. - С. 85-87.

16. А.Ю. Зарицкий. Эффективность терапии препаратом иматиниб мезилат у больных Ph-позитивным ХМЛ, с резистентностью или непереносимостью к препаратам интерферона-альфа. / А.Ю. Зарицкий, Е.Г. Ломана, Мартынкевич И.С., Е.Р. Мачюлайтене, A.B. Шмидт, Т.В. Шнейдер, А.Г. Ковалева, Д.В. Моторин, K.M. Абдулкадыров // Тезисы конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", июнь 2004г.

17. С.В.Грицаев. Прогностический потенциал IPSS применительно к больным с МДС. / С.В.Грицаев, K.M. Абдулкадыров, И.С. Мартынкевич, М.П. Бакай, С.И. Капустин, С.С. Бессмельцев // Тезисы конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", июнь 2004г.

18. Бессмельцев С.С. Экспрессия гена опухоли Вилмса (WT1) в клетках крови больных МДС. / Бессмельцев С.С., Абдулкадыров K.M., Ругаль В.И., Мартынкевич И.С., Грицаев C.B., Тиранова С.А., Блинов М.Н., Капустин С.И. // Вопросы онкологии. - 2004. - № 6. - С. 668-671.

19. Абдулкадыров K.M. Цитогенетические исследования в гематологии при помощи компьютерных технологий. / Абдулкадыров K.M., Мартынкевич И.С., Бакай М.П., Мартыненко Л.С., Клыкова Е.И., Зенина М.Н., Пантелеев В.Г. // Пособие для врачей, 2004 г.

20. C.B. Грицаев. Особенности иммуносунрессивной терапии больных миелодиспластическим синдромом. / C.B. Грицаев, С.А. Тиранова, И.С. Мартынкевич // Вестник гематологии. - 2005. № 1. - С. 43-47.

21. I.S. Martynkevich. Prognostic importance of complex abnormalities of caryotype in patients with myelodysplastic syndrome / I.S. Martynkevich, M.P.Ivanova, L.S.Martynenko, S.V.Gricaev, M.V.Moskalenko, K.M.Abdulkadyrov // «European Journal of Human Genetics» (European Human genetics Conference 2005), p. 135.

22. Грицаев C.B. Прогностический потенциал морфологических и цитогенетических показателей у больных с миелодиспластическим синдромом. / Грицаев С.В., Абдулкадыров К.М., Мартынкевич И.С., Бакай М.П., Дзявго JI.A., Мартыненко Л.С. // Терапевтический архив - 2005. № 7. - С. 22-27.

23. Грицаев С.В. К вопросу о прогностических маркерах у больных МДС. / Грицаев С.В., Мартынкевич И .С., Тиранова С.А., Иванова М.П., Мартыненко Л.С., Дзявго Л.А., Абдулкадыров К.М. // Материалы научно-практической конференции "Актуальные вопросы клинической гематологии", Москва.-2005.-С. 28-31.

24. Gritsaev S.V. Prognostic value of bone marrow blast cells and karyotype in myelodysplastic syndrome / Gritsaev S.V., Martynkevich I.S., Ivanova M.P., Tiranova S.A, Abdulkadirov K.M. // Leuk.Res. - 2005. -V. 29 (Suppl.l). - S25.

25. Gritsaev S.V. Immunosupressive therapy of patients with myelodysplastic syndromes. / Gritsaev S.V., Martynkevich I.S., Ivanova M.P., Tiranova S.A. // Leuk.Res. - 2005. - V. 29 (Suppl.l). - S25.

26. C.B. Грицаев. Миелодиспластический синдром (МДС) с базофилией. / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Е.В. Карягина, С.А.Тиранова, М.П. Иванова, Л.С. Мартыненко, В.А. Балашова // Вестник гематологии. - Том I, № 4, 2005, с. 25-29.

27. А.Ю. Зарицкий. Результаты многоцентрового исследования терапии гливеком больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе. / А.Ю. Зарицкий, Э.Г. Ломайа, О.Ю. Виноградова, Е.Р. Мачюлайтене, В.Ю. Удальева, Т.В. Шнейдер, И.С. Мартынкевич, Абдулкадыров К.М. И Гематология и трансфузиология. - 2007, том 52, номер 2, стр.13-1.

28. И.С. Мартынкевич. Клональная эволюция у пациентов с Ph-позитпвным ХМЛ после терапии Гливеком. / И.С. Мартынкевич, М.П. Иванова, Л.С. Мартыненко, Ю.С. Огородникова, М.В. Москаленко, К.М. Абдулкадыров и др. // Вестник гематологии. - Том III, № 1, 2007, с. 30-34.

29. И.С. Мартынкевич. Дополнительные хромосомные аберрации у больных хроническим миелолейкозом / И.С. Мартынкевич, М.П. Иванова, Л.С. Мартыненко, Ю.С. Огородникова, М.В. Москаленко, Л.А. Дзявго, К.М. Абдулкадыров // Гематология и трансфузиология. -№ 2,2007, с. 28-35.

30. Зарицкий А.Ю. Факторы прогноза ХМЛ / Зарицкий А.Ю., Ломайа Э.Г., Мартынкевич И.С., Виноградова О.Ю., Дружкова Г.А., Круглов С.С., Абакумов Е.М., Соколова М.А. // Терапевтический архив. - 2007. - № 4, с. 17-22.

31. Грицаев C.B. Целесообразность изучения FLT3, RAS, WT1 онкогенов у больных острым миелобластным лейкозом и миелодиспластическим синдромом / Грицаев C.B., Мартынкевич И.С., Иванова М.П., Мартыненко Л.С., Москаленко М.В., Тиранова С.А. // Вестник гематологии. - Том III, № 3, 2007.

32. Грицаев C.B. Иммуносупрессивная терапия больных миелодиспластическим синдромом / Грицаев C.B., Абдулкадыров K.M., Мартынкевич И.С. // Медицинская технология. - 2007.

33. Грицаев C.B. Некоторые аспекты прогноза и лечения миелодиспластического синдрома / Грицаев C.B., Мартынкевич И.С., Тиранова С.А., Котова H.A. // Вестник гематологии. - 2008. - Т. 5. - № 2. -С. 12-19.

34. Мартынкевич И.С. Комплексные нарушения кариотипа у больных МДС. / Мартынкевич И.С., Иванова М.П., Мартыненко Л.С., Огородникова Ю.С., Москаленко М.В., Грицаев C.B., Зюзгин И.С., Карягина Е.В., Абдулкадыров K.M. // Артериальная гииертензия - том 14, №1 - 2008 г.

35. Мартынкевич И.С. Прогностическая значимость дополнительных хромосомных аберраций при терапии ХМЛ гливеком / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С. Иванова М.П., Огородникова Ю.С., Удальева В.Ю., Мачюлайтене Е.Р., Ломаиа Э.Г., Зарицкий А.Ю., Абдулкадыров K.M. // Артериальная гипертензия. - Том 14, № 1, 2008.

36. И.С. Мартынкевич. Дополнительные хромосомные аберрации при терапии ХМЛ гливеком / Мартынкевич И.С., М.П.Иванова, Л.С. Мартыненко, Ю.С. Огородникова, К.М.Абдулкадыров. // Тезисы IV съезда медицинских генетиков Украины с международным участием.

37. Мартынкевич И.С. Встречаемость JAK2 V617F мутации у больных миелопролиферативными заболеваниями в Санкт-Петербурге и Ленинградской области / Мартынкевич И.С., Огородникова Ю.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Москаленко М.В., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Карягина Е.В., Усачева Е.И., Абдулкадыров K.M. // Артериальная гипертензия. - Том 15. -№ 1. 2009 год.

38. Мартынкевич И.С. Особенности цитогенетических и молекулярно-генетических данных у больных МДС с комплексными нарушениями кариотипа / Мартынкевич И.С., Иванова М.П., Огородникова Ю.С., Мартыненко Л.С., Москаленко М.В., Карягина Е.В., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Грицаев C.B., Абдулкадыров K.M. П Артериальная гипертензия. - Том 15. -№ 1,2009.

39. Мартынкевич И.С. Частота встречаемости JAK2V617F мутации у больных миелопролиферативными заболеваниями в Санкт-Петербурге и Ленинградской области / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л,С., Иванова М.П., Москаленко М.В., Аксенова Ю.В., Абдулкадырова A.C., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Карягина Е.В., Абдулкадыров K.M. // Вестник Гематологии. -2009. - Т. 5. - № 3. - С. 16-21.

40. Грицаев С.В. Острый миелобластный лейкоз с транслокацией T(8;21)(Q22;Q22): ретроспективный анализ выживаемости больных // Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Абдулкадыров К.М., Иванова М.П., Тиранова С.А., Балашова В.А., Запреева И.М., Кузяева А.А., Сельцер А.В. // Вестник Гематологии. - 2010. - Т. 6. - № 1. - С. 80-85.

41. K.Abdulkadirov. 6 Year Experience of Treatment by Imalinib in CML CP Patientsin 6 Million Population Region of Russia (Saint-Petersburg and Leningrad region) with Impact On Time and Kind of Pretreatment. K.Abdulkadirov, E.Lomaia, V.Shuvaev, A.Abdulkadirova, V.Udalieva, E.Usacheva, E.Machulaitene, l.Zotova, E.Poznyak, E.Koryagina, N.Ilina, T.Shneider, S.Stepanova, E.Romanova, E.Salamatova, E.Goryunova, N.Lazorko, I.Martinkevich, A.Zaritskey // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2009; 114: 4278.

42. K.Abdulkadirov. Experience in Second Line TKI Treatment in 6 Million Region of Russia(St-Petersburg and Leningrad region Meeting Abstracts) / K.Abdulkadirov, E.Lomaia, V.Shuvaev, A.Abdulkadirova, V.Udalieva, E.Usacheva, E.Machulaitene, l.Zotova, E.Poznyak, E.Koryagina, N.Ilina, T.Shneider, S.Stepanova, E.Romanova, E.Salamatova, E.Goiyunova, N.Lazorko, I.Martinkevich, A.Zaritskey. // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Nov 2009; 114: 4288.

43. Абдулкадыров K.M. Оценка эффективности терапии второй генерации ингибиторов тирозинкиназ при резистентности и или непереносимости терапии иматинибом / Абдулкадыров К.М., Ломаиа Е.Г., Шуваев В.А, Абдулкадырова А.С., Удальева В.Ю., Усачева Е.И., Шихбабаева Д.И., Мачюлайтене Е.Р., Зотова И.И., Позняк Е.И, Иванова М.О., Карягина Е.В., Ильина Н.В, Шнейдер Т.В., Романова Е.Г., Саламатова Е.И., Лазорко Н.С., Мартынкевич И.С., Зарицкий А.Ю. // Вестник гематологии. - 2010. - Т. 6. - № 2. - С. 6.

44. Абдулкадыров К.М. Оценка выживаемости, достижения молекулярного, цитогенетического ответов у пациентов с хроническим миелолейкозом в хронической фазе, получающих терапию иматинибом: данные девятилетнего популяционного наблюдения больных хроническим миелолейкозом Санкт-Петербурга и Ленинградской области. // Абдулкадыров К.М., Ломаиа Е.Г., Шуваев В.А., Абдулкадырова А.С., Удальева В.Ю., Усачева Е.И., Шихбабаева Д.И., Мачюлайтене Е.Р., Зотова И.И, Позняк Е.И, Иванова М.О., Карягина Е.В., Ильина Н.В., Шнейдер Т.В., Романова Е.Г., Саламатова Е.И., Лазорко Н.С., Мартынкевич И.С., Зарицкий А.Ю. // Вестник гематологии. - 2010. - Т. 6. - № 2. - С. 5-6.

45. Грицаев С.В. Возрастные особенности кариотипа острого миелоидного лейкоза / Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Цыбакова Н.Ю., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Карягина Е.В., Абдулкадыров К.М. // Вестник гематологии. -2010.-Т. 6.-№2.-С. 25-26.

46. A. Zaritskey. Busulfan, and not duration of disease of response to in very late chronic phase of chronic myeloid leukemia (CML). A. Zaritskey, I. Martinkevich, V. Shuvaev, A. Abdulkadyrova, V. Udalieva, E. Usacheva,

D. Shikhbabava, M. Golubeva, S. Meresii, E. Machulaitene, I. Zotova, E. Poznyak,

E. Koryagina, N. llina, T. Shneider, E. Romanova, E. Salamatova, N. Lazorko, E. Lomaia, K. Abdulkadyrov. // 15th Congress of the European Hematology Association Barcelona, Spain, June 10-13, 2010 ABSTRACT BOOK // Haematologica. - 2010. - Vol. 95 (s2), p. 544.

47. K. Abdulkadyrov. Survival, cytogengtic and molecular responses in chronic myeloid leukemia chronic phase patients treated by imatinib: 9-year follow-up data from population St-Petersburg and Leningrad region database. / K. Abdulkadyrov, E. Lomaia, V. Shuvaev, A. Abdulkadyrova, V. Udalieva, E. Usacheva, D. Shikhbabava, E. Machulaitene, I. Zotova, M. Ivanova, E. Poznyak, E. Koryagina, N. Ilina, T. Shneider, E. Romanova, E. Salamatova, N. Lazorko, I. Martinkevich, A. Zaritskey. // 15,h Congress of the European Hematology Association Barcelona, Spain, June 10-13, 2010 ABSTRACT BOOK // Haematologica. - 2010. - Vol. 95 (s2), p. 535.

48. Мартынкевич И.С. Прогностическая значимость мутаций генов FLT3 и NPM1 у больных OMJ1. / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Цыбакова Н.Ю., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Зюзгин И.С., Абдулкадыров К.М. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г. - С. 111-112.

49. Abdulkadyrov К. Only time before the beginning of treatment and time to CCYR influence the stability of CCYR in CML CP patients./ Abdulkadyrov K., Lomaia E., Shuvaev V., Abdulkadyrova A., Udalieva V., Usacheva E., Zotova I., Shikhbabaeva D., Machulaitene E., Ivanova M., Poznyak E., Koryagina E„ Ilina N., Shneider Т., Stepanova S„ Romanova E., Salamatova E., Lazorko N., Martinkevich I., Zaritskey A. // Blood. - 2010.

50. Мартынкевич И.С. JAK2V617F мутация у больных миелопролиферативными заболеваниями в Санкт-Петербурге и Ленинградской области. / Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П., Цыбакова Н.Ю., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Зюзгин И.С., Шнейдер Т.В., Абдулкадыров К.М. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г. - С. 120.

51. Мартынкевич И.С. Молекулярная основа острого миелоидного лейкоза. / Мартынкевич И.С // Клиническая онкогематология. - 2010. - Т. 3, №3, стр. 300-301.

52. С.В. Грицаев. Сравнительный анализ кариотипа пожилых больных миелодиспластическим синдромом и острым миелоидным лейкозом. / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Л.С. Мартыненко, М.В. Москаленко, М.П. Иванова, В.Ю. Аксенова, Н.Ю. Цыбакова, С.А. Тиранова, Н.А. Потихонова, К.М. Абдулкадыров // Клиническая онкогематология. - 2010. - Т. 3, № 2, стр. 114-118.

53. К. Abdulkadyrov. Factors influencing the stability of CCyR in CML-CP patients on imatinib therapy. // K. Abdulkadyrov, E. Lomaia, A. Abdulkadyrova, V. Udalieva, E. Usacheva, I. Zotova, D. Shikhbabaeva, E. Machulaitene, M. Ivanova, E. Poznyak, E. Koryagina, N. Ilina, T. Shneider, S. Stepanova, E. Romanova, E. Sbityakova, N. Lazorko, I. Martynkevich, V. Shuvaev, A. Zaritskey // ELN Frontiers Meeting «New benchmarks in leukemia: Focus on CML, AML and MDS» October 22-24, 2010, Vienna, Austria // ELN Newsletter special edition abstracts. - P. 14.

54. K.M. Abdulkadyrov. Successful treatment of mixed-cell CML blast crisis without chemotherapy. // K.M. Abdulkadyrov, A.S. Abdulkadyrova, V.Y. Udalyeva, I.S. Martynkevich, E.V. Karyagina, E.Y. llushina, V.A. Shuvaev, E.B. Rusanova, E.E. Zueva // ELN Frontiers Meeting «New benchmarks in leukemia: Focus on CML, AML and MDS» October 22-24, 2010, Vienna, Austria // ELN Newsletter special edition abstracts. - P. 21.

55. Грицаев C.B. Изучение мутаций генов FLT3 и NPM1 у больных миелодиспластическим синдромом и смешанными миелоидными заболеваниями. / Грицаев С.В., Мартынкевич И.С., Иванова М.П., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Тиранова С.А., Абдулкадыров К.М. // Вопросы онкологии. - 2010. - Т. 56. - № 6. - С. 671-676.

56. Мартынкевич И.С. Мутации генов FLT3 и NPMIy больных острыми миелоидными лейкозами и влияние мутации FLT3-ITD на выживаемость больных с нормальным кариотипом. / Мартынкевич И.С., Грицаев С.В., Иванова М.П., Москаленко М.В., Аксенова В.Ю., Тиранова С.А., Абдулкадыров К.М. // Терапевтический архив. - 2010. - № 2. - С. 33-39.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

- ПЦР - полимеразная цепная реакция;

- FISH - флуоресцентная in situ гибридизация;

- НТК - ингибиторы тирозинкиназ;

- ХМПЗ - хроническое миелопролиферативное заболевание;

- ИП — истинная полицитемия;

- ЭТ - эссенциальная тромбоцитемия;

- ХИМФ - хронический идиопатический миелофиброз;

- ХМЛ - хронический миелолейкоз;

- МДС - миелодиспластический синдром;

- ОМЛ - острый миелобластный лейкоз;

- ПЦГО - полный цитогенетический ответ;

- БЦГО - большой цитогенетический ответ;

- Ph - Филадельфийская хромосома;

- КЭ - клональная эволюция;

- КХА - клональные хромосомные аберрации.

Подписано в печать 18.02.2011 г. Формат 60x90/16

Объем3 п.л. _ Заказ№138

Тираж 150 экз.

Отпечатано ООО «ИПК «КОСТА»

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В основе развития гемобластозов лежат генетические изменения в клетке - предшественнице гемопоэза, приводящие к торможению дифференцировки кроветворной клетки, нарушению механизмов регуляции клеточного цикла и неконтролируемой пролиферации клеток. Все потомки такой клетки-предшественницы несут одни и те же генетические изменения, иногда приобретая и новые в процессе опухолевой прогрессии.

Генетические изменения при заболеваниях системы крови обычно представлены мутациями хромосомного типа (транслокациями, инверсиями, делециями, наличием дополнительных хромосом и другими) и могут быть выявлены методами стандартной цитогенетики и молекулярной генетики. В последние годы было показано, что генетические изменения (тандемные повторы и мутации генов р53, NPM1, FLT3, Ras) можно обнаружить только с помощью молекулярно-биологических методов [Mrozek К., 2007, Czibere А., 2009].

Хромосомные и/или молекулярно-генетические перестройки, играя важную роль в патогенезе гематологических неоплазий, определяют биологические свойства лейкозных клеток и, соответственно, морфологические, иммунологические и клинические особенности заболевания. Большинство наиболее распространенных хромосомных перестроек имеют самостоятельное прогностическое значение, как при миелоидных, так и при лимфоидных вариантах опухолевых заболеваний. Кроме того, данные цитогенетических и молекулярно-биологических исследований при ряде заболеваний системы крови являются одним из главных критериев при выборе адекватной терапии.

Генетическая диагностика опухолевых заболеваний системы крови в настоящее время является одним из основных методов, определяющих прогностические и диагностические особенности заболевания. Высокоспецифичные хромосомные аберрации изучены достаточно хорошо, однако вариабельность течения и прогрессии заболевания неоднородны у больных в пределах одинаковых цитогенетических нарушений. В то же время, согласно сообщениям различных авторов, информационная ценность мутаций ряда генов остается неопределенной [Thiede С., 2006, Falini В., 2005].

Вместе с тем изменение тактики терапевтических режимов при опухолевых заболеваниях кроветворной системы и введением в практику новых препаратов направленного действия («таргетной» терапии), мишенью для которых являются химерные гены (BCR/ABL, PML/RARa) привели к повышению роли молекулярно-генетических исследований. В связи с этим становится актуальной необходимость разработки алгоритма генетической диагностики гемобластозов, который позволит получить наиболее полную картину заболевания. Следовательно, алгоритм диагностики поможет адекватно верифицировать вариант заболевания, определить прогностические особенности генетических маркеров и тем самым выбрать рациональную терапию, что, в свою очередь, позволит получать у больных длительную безрецидивную выживаемость.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определить значимость и место цитогенетических и молекулярных аберраций в верификации форм, оценке прогностических особенностей течения и в алгоритме генетической диагностики миелоидных неоплазий.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать алгоритм генетической диагностики больных различными вариантами миелоидных неоплазий.

2. Оценить прогностическую значимость дополнительных клональных хромосомных аберраций у пациентов с хроническим миелолейкозом на различных этапах целенаправленной терапии.

3. Выявить механизмы и природу происхождения клональной эволюции у больных хроническим миелолейкозом, получающих ингибиторы тирозинкиназ.

4. Определить частоту встречаемости мутации ¥617Г в гене 1АК2 и прогностические особенности течения заболевания в зависимости от типа цитогенетических аберраций у пациентов с РЬ-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями.

5. Исследовать прогностическую значимость кариотипа с учетом возраста больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами, обнаруженными в дебюте заболевания.

6. Изучить влияние на прогноз мутаций генов ЫРМ1, РЬТЗ у пациентов с миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Разработанный алгоритм генетической диагностики позволяет эффективно верифицировать формы заболевания и проводить адекватную терапию пациентов с миелоидными неоплазиями.

2. Возраст и кариотип являются самостоятельными прогностическими маркерами у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами.

3. Детекция мутаций генов NPM1, FLT3 у пациентов с миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами способствуют определению прогностических особенностей заболевания.

4. Клональная эволюция в Ph-положительных клетках у больных хроническим миелолейкозом, обнаруженная до и на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ, является прогностически неблагоприятным фактором. В то время, как дополнительные клональные хромосомные аберрации, выявляемые в Ph-отрицательных клетках, значимы только для бессобытийной выживаемости пациентов.

5. Мутация V617F в гене JAK2 является высокоспецифичным маркером Ph-отрицательных хронических миелопролиферативных заболеваний и включение данного теста в алгоритм диагностики делает распознавание этих заболеваний более достоверным.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В настоящем исследовании впервые:

- разработан алгоритм генетической диагностики различных вариантов миелоидных неоплазий.

- установлено, что клональная хромосомная эволюция, обнаруженная на различных этапах терапии в Ph-положительных клетках, достоверно ухудшает прогноз заболевания у пациентов с хроническим миелолейкозом, в то время как дополнительные клональные хромосомные аберрации в Ph-отрицательных клетках являются статистически значимыми только для бессобытийной выживаемости больных.

- проведен ретроспективный FISH анализ клеток костного мозга пациентов с XMJI, получающих целенаправленную терапию, с выявленными дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-отрицательных клетках, позволивший определить природу происхождения клональной эволюции.

- определены новые данные о прогностическом потенциале мутаций NPM1 и FLT3 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами, свидетельствующие о благоприятном (NPM1) или агрессивном (.FLT3) течении этих процессов.

- выявлена частота встречаемости и распределение между вариантами заболевания мутации V617F в гене JAK2 у пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями Северо-Западного региона РФ.

- показана необходимость проведения параллельного цитогенетического и молекулярно-генетического исследований у больных Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями с целью обнаружения прогностически значимых хромосомных аберраций.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

- Разработанный алгоритм генетической диагностики миелоидных неоплазий помогает адекватно верифицировать их различные варианты и прогностические особенности.

- Обнаруженные комплексные нарушения кариотипа, аберрации 5 и 7 хромосом, перестройки 17 хромосомы являются неблагоприятными аномалиями кариотипа и позволяют прогнозировать агрессивное течение миелоидных неоплазий и раннее развитие рецидива.

- Наличие мутаций генов ЫРМ1 и ЕЬТЗ у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелобластными лейкозами свидетельствуют о благоприятном или агрессивном течении заболеваний.

- Высокая частота встречаемости мутации V617Е в гене у пациентов с РЬ-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями убедительно доказывает целесообразность включения данного маркера в алгоритм диагностики заболевания.

- Обнаружение дополнительных хромосомных аберраций у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ, позволяет верифицировать терапию заболевания.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

Полученные результаты докладывались на:

- 3 Всероссийском съезде гематологов, Санкт-Петербург, 1996;

- 6 конференции молодых ученых «Вопросы клинической и трансфузионной медицины» Киров, 1999; научно-практической конференции «Гематологический диагноз в лаборатории» Санкт-Петербург, 1999;

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию института "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", Санкт-Петербург, 2002г.;

- Всероссийской научно-практической "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", Санкт-Петербург, 2004г.

- Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы клинической гематологии", Москва, 2005 г.;

Международной конференции «Молекулярно-генетические аспекты современной терапии гемобластозов», Кисловодск, 2006;

- Международной конференции «Современная терапия ХМЛ», Киев, 2008;

- Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2008г.;

- IV съезде медицинских генетиков Украины с международным участием, г. Львов, 2009;

- Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт, Петербург, 2009г.;

- VI симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 2009 г.;

- Международной конференции «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2009г.;

- Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт, Петербург, 2010г.;

- 15th Congress of the European Hematology Association, Barcelona, Spain, 2010;

Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010г.;

- VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010г.

- V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в гематологии» - Новосибирск, 18-19 ноября 2010 г.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования широко используются в диагностике и оценке прогноза заболевания у больных гематологическими неоплазиями, находящимися на лечении в ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. Павлова, ФГУ «Федеральный центр сердца, крови, эндокринологии» им. Алмазова, Городской больнице №15, Городской больнице №17, Детской городской больнице №1, Ленинградской клинической областной больнице, в ряде областных клинических больниц Северо-Западного региона Российской Федерации. Полученные данные используются при чтении лекций и проведения семинаров на кафедре медицинской генетики в Медицинской академии последипломного образования (г.Санкт-Петербург). Полученные результаты исследования легли в основу изданных 2 методических рекомендаций для врачей гематологов.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 87 печатных работ, утверждено 3 пособия для врачей.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 241 странице и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 70 рисунками, 23 таблицами. Список литературы включает 213 источников отечественной и зарубежной литературы.

ВЫВОДЫ.

1. Генетические методы исследования должны быть включены в алгоритм диагностики и мониторинга терапии миелоидных заболеваний, что позволит не только верифицировать вариант и прогнозировать течение заболевания, но и достоверно отслеживать минимальную резидуальную болезнь.

2. Установлено, что мутация V617F в гене JAK2 является высокоспецифичным диагностическим маркером пациентов с Ph-отрицательными хроническими миелопролиферативными заболеваниями и встречается у 83,6% больных истинной полицитемией, у 46,4% - эссенциальной тромбоцитемией и у 47,7% - первичным миелофиброзом. Обнаружение у пациентов комплексного кариотипа, аномалий 5 и/или 7 хромосом и перестройки 17 хромосомы свидетельствует о риске трансформации этих заболеваний в острый миелобластный лейкоз.

3. Вариантные транслокации t(9;22) у больных хроническим миелолейкозом, получающих целенаправленную терапию ингибиторами тирозинкиназ, не ухудшают прогноз заболевания.

4. Клональная хромосомная эволюция в Ph-положительных клетках обуславливает у пациентов с хроническим миелолейкозом неблагоприятный исход заболевания.

5. Дополнительные хромосомные аномалии в Ph-отрицательных клетках, обнаруженные на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных хроническим миелолейкозом, не влияют на достижение пациентами большого цитогенетического ответа к 6 месяцам, полного цитогенетического ответа к 12 месяцам и не отражаются на общей их выживаемости, тогда как для бессобытийной выживаемости пациентов они статистически значимы, что обосновывает необходимость

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Генетические методы исследования у больных опухолевыми заболеваниями миелоидной ткани рекомендуются проводить как в дебюте, так и на различных стадиях его развития с целью установления диагноза, определения прогноза заболевания и мониторинга минимальной остаточной болезни.

2. У больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ, с выявленными клональными хромосомными аберрациями в РЬ-отрицательных клетках, цитогенетический мониторинг необходимо проводить каждые 6 месяцев.

3. С целью верификации диагноза РЬ-отрицательных хронических миелопролиферативных заболеваний рекомендуется включить в алгоритм обследования больных определение мутации У617Р в гене МК2.

4. Детекцию мутаций в генах РЬТЗ и ЫРМ1 у больных миелодиспластическим синдромом и острыми миелоидными лейкозами необходимо проводить с целью определения прогноза заболевания.

27. Bacher U., Kern W., Schnittger S. et al. Populattion-based age-specific incidences of cytogenetic subgroups of acute myeloid leukemia. Haematologica 2005; 90: 1502 -1510.

28. Bacher U., Haferlach T., Kern W. et al. A comparative study of molecular mutations in 381 patients with myelodysplastic syndrome and in 4130 patients with acute myeloid leukemia // Haematologica. - 2007. - Vol. 92. - P. 744 -752.

29. Bain BJ. Classification of acute leukaemia: the need to incoiporate cytogenetic and molecular genetic information. //J Clin Pathol. - 1998 -51:420-3.

30. Baldus CD, Mrozek K, Marcucci G, Bloomfield CD. Clinical outcome of de novo acute myeloid leukaemia patients with normal cytogenetics is affected by molecular genetic alterations: a concise review. // Br J Haematol. - 2007 -137:387-400.

31. Barosi J., Bergamaschi C., Marchetti M. et al. JAK2V617F mutational status predicts progression to large splenomegaly and leukemic transformation in primary myelofibrosis. Blood 2007; 110: 4030-4036.

32. Barosi J., Bordessoule D., Briere J. et al. Response criteria for myelofibrosis with myeloid metaplasia: results of an initiative of the European Myelofibrosis Network (EUMNET). Blood 2005; 106: 2849-2853.

33. Bartram C., de Klein A., Hagemeijer A. Translocation of c-abl oncogene correlates with the presence of the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. //Nature. - 1983 - 306: 277-80.

34. Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders // Lancet - 2005. Vol. 365. P.1054-1061.

35. Bench AJ, Cross NC, Huntly BJ, Nacheva EP, Green AR. Myeloproliferative disorders. // Best Pract Res Clin Haematol. - 2001 - 14:531-51.

36. Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T. et al. Proposals for the classification associations, and role in leukemic transformation. // Blood. - 2006 - 108:354855.

48. Cervantes F., Dupriez B., Pereira A. et al. New prognostic scoring system for primary myelofibrosis based on a study of the International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment. Blood 2009; 113: 2895-2901.

49. Cortes J., Jabbour E., Kantarjian H., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. // Blood — 110:4005-4011 — 2007.

50. Cragie D. Case of disease of the spleen, in wich death took place in consequence of the presence of purulent matter in the blood. // Edinburg Medical and Surgical Journal - 1845 - 64: 400-413.

51. Cutler C.S., Lee S.J., Greenberg P. et al. A decision analysis of allogeneic bone marrow transplantation for the myelodysplastic syndromes: delayed transplantation for low-risk myelodysplasia is associated with improved, outcome // Blood. - 2004. - Vol. 104. - P. 579 - 585.

52. Czibere A., Bruns I., Junge B. et al Low RPS14 expression is common in myelodysplastic syndromes without 5q- aberration and defines a subgroup of patients with prolong survival // Haematologica. - 2009. - Vol. 94. - P. 1453 -1455.

53. Dameshek W. Some speculations on the myeloproliferative syndromes // Blood. - 1951 - Vol. 6. P. 372-375.

54. Deininger M. W. Nilotinib. I I Clin Cancer Res — 14:4027-4031 — 2008

55. Deininger M.W., Cortes J., et al. The prognosis for patients with chronic myeloid leukemia who have clonal cytogenetic abnormalities in Philadelphia chromosome-negative cells. // Cancer- 110:1509-1519 -2007.

56. Derolf A.R., Kristinsson S.Y., Andersson T.M.L. et al. Improved patient survival for acute myeloid leukemia: a population-based study of 9729 patients diagnosed I Sweden between 1973 and 2005. Blood 2009; 113: 3666 - 3673.

57. Deschler B., de Witte T., Mrtelsmann R., Lubbert M. Treatment decisionpatients 60 years of age or older with acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B 8461. // Blood - 2006 - 108:63-73.

68. Fenaux P. Myelodysplasia syndromes. 11 Hematol Cell Ther. 1996;38:363-80.

69. Fernandez H.F., Sun, Z., Yao X. et al. Anthracycline dose intensification in acute myeloid leukemia. // N. Engl. J. Med. - 2009 - 361: 1249 - 1259.

70. Fidler C., Watkins F„ Bowen D. et al. NRAS, FLT3 and TP53 mutations in patients with myelodysplastic syndrome and a del(5q) // Haematologica. -2004. - Vol. 89. - P. 865 - 866.

71. Finazzi G, Caruso V, Marchioli R et al. Acute leukemia in Polycythemia vera: an analysis of 1638 patients enrolled in a prospective observational study. // Blood. - 2005 - 105:2664-70.

72. Frohling S., Schlenk R.F., Kayser S. et al. Cytogenetics and age are major determinants of outcome in intensively treated acute myeloid leukemia patients older than 60 years: results from AMLSG trial AML HD98-B. // Blood - 2006- 108: 3280-3288.

73. Fruchtman SM, Petitt RM, Gilbert HS, Fiddler G, Lyne A. Anagrelide: analysis of long-term efficacy, safety and leukemogenic potential in myeloproliferative disorders. // Leuk Res. - 2005 - 29:481-91.

74. Gangat N, Wolanskyj AP, McClure RF et al. Risk stratification for survival and leukemic transformation in essential thrombocythemia: a single institutional study of 605 patients. // Leukemia. - 2007- 21:270-6.

75. Garipidou V. and Seeker-Walker L. M. The use of fluorodeoxyuridine synchronization for cytogenetic mvestigatron of acute lymphobiasttc leukemia.//Cancer Genet. Cytogenet- 1991 - 52, 107-111

76. Georgii A, Buesche G, Kreft A. The histopathology of chronic myeloproliferative diseases. // Baillieres Clin Haematol. - 1998 - 11:721-49.

77. Goldman J.M. How I treat chronic myeloid leukemia in the imatinib era. // Blood - 110: 2828-2837 - 2007.

78. Goldman JM, Melo JV. Chronic myeloid leukemia - advances in biology and with acute myeloblasts leukemia in the early 21st century. // Haematologica -2008 -93:594-600.

161. Quintas-Cardama A., Cortes J. Molecular biology of BCR-ABL1-positive chronic myeloid leukemia. // Blood - 113: 1619-1630 - 2009.

162. Rane S. G., Reddy E. P. Janus kinases: components of multiple signaling pathways. // Oncogene. - 2005 - Vol. 19. P. 5662-5679.

163. Razelle Kurzrock, Hagor M. Kantarjian et al. Philadelphia Chromosome-Positive Leukemias: From Basic Mechanisms to Molecular Therapeutics. // Annals of Internal Medicine - 2003 - Vol. 138. P. 819-831.

164. Rege-Cambrin G, Mecucci C, Tricot G et al. A chromosomal profile of Polycythemia vera. // Cancer Genet Cytogenet. - 2007 - 25:233-45.

165. Rowley JD, Testa JR. Chromosome abnormalities in malignant hematologic diseases. // Adv Cancer Res — 1982 - 36:103^18.

166. Saharinen P., Vihinen M., Silvennoinen O. Autoinhibition of Jak2 tyrosine kinase is dependent on specific region in its pseudokinase domain. // Mol. Biol. Cell-2003- 14: 1448-1459.

167. Sandberg A.A. The chromosomes in human cancer and leukemia. // Elsevier North Holland. - 1995 - New York.

168. Sanz G., Nomdedeu B., Such E. et al. Independent impact of iron overload and transfusion dependency on survival and leukemic evolution in patients with myelodysplastic syndrome // Blood. - 2008. - Vol. 112. - Abstr. 640.

169. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosome. // Lancet - 1971 —2:970-975.

170. Sekeres M., Elson P., Kalaycio M. E et al. Time from diagnosis to treatment initiation predict survival in younger, but not older, acute myeloid leukemia patients // Blood. 2009. V. 113. P. 28 - 36.

171. Sekeres M. Treatment of MDS: something old, something new, something borrowed. // Hematology (Am.Soc.Hematol.Educ.Program.) - 2009 - 656 -663.

172. Shah N.P., Kantarjian H.M., Kim D.W., et al. Intermittent target ingibition with dasatinib 100 mg once daily preserves efficacy and improves tolerability in imatinib-resistant and -intolerant chronic-phase chronic myeloid leukemia. // J Clin Oncol —26:3204-3212- 2008.

173. Sherbenou D.W., Wong M.J., Humayun A., et al. Mutations of the Bcr-Abl kinase domain occur in a minority of patients with stable complete cytogenetic response to imatinib. // Leukemia — 21:489-493 — 2007.

174. S hi h L.Y., Lin T.L., Wang P.N. et al. Internal tandem duplication of fms-like tyrosine kinase 3 is associated with poor outcome in patients with myelodysplasia syndrome // Cancer. - 2004. - Vol. 101. - P. 989 - 998.

175. Shi h LY, Lin TL, Wang PN et al. Internal tandem duplication of fms-like tyrosine kinase 3 is associated with pooroutcome in patients with myelodysplasia syndrome. Cancer. 2004;101:989-98.

176. Shtivelman E., Lifshits B., Gale R.P., Canaani E. Fused traskript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukemia. //Nature - 1985 - 315: 550-554.

177. Soverini S., Baccarani M., Iaccobucci I, et al. Resistance to tyrosine kinase inhibitor in Philadelphia chromosome-positive leukemias: Which mutations matter? // Clin Leukemia - 1:223-228 - 2007.

178. Soverini S., Grani A., Colarossi S., et al. Long-term mutation follow-up of Philadelphia chromosome-positive leukemia patients treated with second generation tyrosine kinase inhibitors after imatinib failure shows that newly acquired BCR-ABL kinase domain mutations leading to relapse are mainly detected during the first year. // Blood — 112:737-738 — 2008.

179. Staudt LM. Molecular diagnosis of the hematologic cancers. // N Engl J Med. -2003 -348:1777-85.

180. Steensma D.P., Dewald G.W., Lasho T.L. et al. The JAK2V617F activating tyrosine kinase mutation is an infrequent avent in both "atypical" myeloproliferative disorders and the myelodysplastic syndrome. // Blood -2005 - 106: 1207-1309

181. Strasser-Weippl K., Steurer M., Kees M. et al. Prognostic relevance of cytogenetics deteimined by fluorescent in situ hybridization in patients having myelofibrosis with myeloid metaplasia. Cancer 2006; 107: 2801-2806.

182. Sun G., Koeffier H.P., Gale R. P., Sparkes R. S., and Schreck R. R. Use of conditioned media in cell culture can mask cytogenetic abnormalities acute leukaemia. // Cancer Genet. Cyfogenet - 1990 - 46,107-113.

183. Swolin B, WeinfeldA, WestinJ. A prospective long-term cytogenetic study in Polycythemia vera in relation to treatment and clinical course. // Blood. - 1988 - 72:386-95.

184. Szczepanski T, Orfao A, van der Velden VH, San Miguel JF, van Dongen J J. Minimal residual disease in leukaemia patients. // Lancet Oncol. - 2001 -2:409-17

185. Tarn C.S., Nusssenzveig R.M., Popat TJ. et al. The natural history and treatment outcome of blast phase BCR-ABL" myeloproliferative neoplasms. Blood 2008; 112: 1628-1637.

186. Tam C.S., Abruzzo L. V., Lin K.I. et al. The role of cytogenetic abnormalities as a prognostic marker in primary myelofibrosis: applicability at the time of diagnosis and later during disease course. // Blood - 2009 - 113: 4171-4178.

187. Tefferi A., Lasho T.L., Schwager S.M. et al. The JAK2V617 tyrosine kinase mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia: lineage specificity and clinical correlates. Br. J. Haematol. 2005; 131: 320-328.

188. Tefferi A., Dingli D., Li C.-Y. et al. Prognostic diversity among cytogenetic abnormalities in myelofibrosis with myeloid metaplasia. // Cancer - 2005 -104: 1656-1660.

189. Tefferi A., Mesa R.A., Schroeder G. et al. Cytogenetic findings and their clinical relevance in myelofibrosis and myeloid metaplasia. // Br. J. Haematol. -2001 - 113: 763-771.

190. Tefferi A., Vardiman JW. Classification anddiagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care iagnostic algorihm // Leukemia - 2008. Vol. 22. P. 14-22.

191. Tefferi A., Lasho T.L., Huang J. et al. Low JAK2V617F allele burden in primary myelofibrosis compared to either a higher allele burden or unmutated status, is associated with inferior overall and leukemia-free survival. Leukemia 2008; 22: 756-761.

192. Textbook of Malignant Haematology // 1999-188-225.

193. Temerinac S et al. Cloning of PRV-1, a novel member of the uPAR receptor superfamily, which is overexpressed in polycythemia rubra vera. // Blood -2000 - 95(8):2569-2576

194. Theocharides A., Boissinot M., Girodon F. et al. Leukemic blasts in transformed JAK2-V617F-positive myeloproliferative disorders are frequently negative for the JAK2-V617F mutation. Blood 2007; 110: 375-379.

195. Thiede C, Koch S., Creutzig E. et al. Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia // Blood. -2006. - Vol. 107. - P. 4011-4020.

196. Thiele J, Kvasnicka HM, Facchetti F, Franco V, van derWalt J, Orazi A. European consensus on grading bone marrow fibrosis and assessment of cellularity. // Haematologica. - 2005 - 90:1128-32.

197. Van Dongen JM, SzczepansJä, T. et al. Detection of minimal residual disease in lymphoid malignancies. In: Degos L, Linch, D. C., Lowenberg, B., eds. Textbook of Malignant Hematology, (2nd edn). // London and New York: Taylor & Francis - 2005 - 267-307.

198. Vannucchi A.M, Antonioli E., Guglielmelli P. et al. Clinical correlates of JAK2V617F presence or allele burden in myeloproliferative neoplasms: a critical reappraisal. Leukemia 2008; 22: 129-307.

199. Vardiman J.W., Harris N.L., Brunning R.D. The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. // Blood - 2002 - 100: 2292 -2302.

200. Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the World

Health Organisation (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes // Blood. - 2009. - Vol. 114. - P. 937 -51.

201. Velazquez L et al. A protein tyrosine kinase in the interferon alpha/beta signaling pathway. // Cell - 1992 - 70:313-322.

202. Verma R„ Babu A. Human chromosomes manuel of basic techniques. // Pergamon Press - 1989 - 4-256

203. Virchow R. Weisses Blut. // Froriep's Notizen - 1845 -36: 151 -156.

204. Warlick E.D., Smith B.D. Myelodysplasia Syndromes: Review of Pathophysiology and Current Novel Treatment Approaches. // Current Cancer Drug Targets - 2007 - 7, 541-558 541.

205. Weisberg E., Griffin J. D. et al. Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor S TI-571 in BCR/ABL-transformed hematopoietic cells // Blood. - 2000. - Vol. 95. - P. 3498—3505.

206. Wolanskyj AP, Lasho TL, Schwager SM et al. JAK2 mutation in essential thrombocythaemia: clinical associations and long-term prognostic relevance. // Br J Haematol. - 2005 - 131:208-13.

207. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. // Lyon: IARC Press -2001.

208. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. // Lyon: IARC Press -2008

209. Yamaoka K et al. The Janus kinases (Jaks) // Genome Biol. - 2004 - 5(12): 253.

210. Yamamoto Y., Kiyoi H., Nakano Y. et al. Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies. Blood 2001; 97(8): 2434-2439.

211 .Zaccaria A., Valenti A., Donti E., et al. Persistence of chromosomal abnormalities additional to the Philadelphia chromosome after Philadelphia chromosome disappearance during imatinib therapy for chronic myeloid leukemia. // Haematologica. - 2007 - 92 - P.564-565.

212. Zamora L, Espinet B, Florensa L et al. Is fluorescence in situ hybridization a useful method in diagnosis of Polycythemia vera patients? // Cancer Genet Cytogenet. - 2004 - 151:139-45.

213. Zhou Y.J. et al. Unexpected effects of FERM domain mutations on catalytic activity of Jak3: structural implication for Janus kinases. // Mol Cell - 2001 -8:959-969.