Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Интраэпителиальная неоплазия молочной железы

На правах рукописи

Ефремов Геннадий Дмитриевич

«Интраэпителиальная пеоплазия молочной железы»

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

8 АВГ г013

Москва - 2013

005532038

Работа выполнена в патологоанатомическом отделении ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имели П.А. Герцена» Ми нистерства здравоохранения Российской Федерации (директор — член-корреспондент РАМН, профессор А.Д.Каприн)

Научный руководитель: академик РАМН, профессор, доктор медицинских

наук Франк Георгий Авраамович

Официальные оппоненты:

Петерсон Сергей Борисович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой онкологии и лучевой терапии ГБОУ ВПО «Российского национального исследовательского медицинского университета им. НЛ. Пирогова».

Щеголев Александр Иванович, доктор иедицинских наук, профессор, руководитель второго патологоанатомического отделения ФГБУ «Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_»_2013 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.047.01 при ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Ми нистерства здравоохранения Российской Федерации (Москва, 125284,2-й Боткинский проезд, дЗ).

С диссеретацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Ми нистерства здравоохранения Российской Федерации (Москва, 125284,2-й Боткинский проезд, дЗ).

Автореферат разослан «_»_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологический наук Завалишина Лариса Эдуардовна

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место по частоте возникновения среди злокачественных новообразований у женщин и является одной из основных причин смертности от онкологических заболеваний. Прогноз РМЖ определяется ранней диагностикой, что требует проведения скрининга среди женщин группы повышенного риска, к которым относятся, в первую очередь, пациентки с предопухолевыми поражениями молочной железы. Интенсивно разрабатываются вопросы верификации и определения прогностического значения прединвазивных поражений молочной железы, среди которых выделяют тяжелую дисплазию, рак in situ молочной железы (carcinoma in situ - CIS), рак с началом инвазии. Эти заболевания существенно отличаются друг от друга по течению и риску последующего развития инвазивного РМЖ.

Большинство исследователей полагают, что для установления характера поражения необходимо уточнить степень степень злокачественности, пролиферативную активность и другие биологические характеристики опухоли, первоначальное определение которых производится при морфологическом исследовании. В материалах Международной конференции по классификации CIS зафиксировано, что для точной верификации этого заболевания недостаточно одной морфологической оценки. В ряде случаев критерии диагностики неоднозначны, что требует проведения дополнительных исследований, в том числе с применением современных иммуногистохимических методов. Иммуногистохимический метод (ИГХ) позволяет не только определить гистогенетические особености предраковых поражений молочной железы, экспрессию гормональных рецепторов, различных онкопротеинов, пролиферативную активность, но и выявить наличие минимальной инвазии, зачастую существенно меняя прогноз заболевания. В связи с этим ИГХ метод стал широко использоваться исследователями при изучении интраэпителиальных неоплазий молочной железы.

В большинстве опубликованных работ, использовавших этот метод, ограниченное число маркеров не позволяет в полной мере уточнить биологический профиль изучаемых заболеваний, отсутствуют данные о прогностической значимости данных видов неоплазий, не определен алгоритм комплексной диагностики, сочетающий морфологические и ИГХ критерии.

Вышеизложенное свидетельствует о высокой актуальности проблемы разработки критериев верификации прединвазивных заболеваний молочной железы для онкологии и патологической анатомии и определяет необходимость проведения настоящей работы.

Цель исследования - разработка критериев дифференциального диагноза вариантов интраэпителиальной неоплазии молочной железы на основе применения комплексного морфологического метода исследования с применением оптимальной панели маркеров для улучшения качества диагностики и оценки риска развития инвазивного рака.

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Определить комплекс морфологических критериев дифференциальной

диагностики дисплазий и карциномы in situ молочной железы.

2. Уточнить критерии дифференциальной диагностики протоковых и

дольковых преинвазивных поражений молочной железы.

3. Определить оптимальный набор иммуногистохимических маркеров,

необходимых для выявления фокусов микроинвазии при карциномах

in situ.

4. Оценить роль некоторых ИГХ маркеров в оценке инвазивного

потенциала предраковых изменений.

5. Сравнить морфологические и иммуногистохимические критерии,

определяющие степень злокачественности протоковой карциномы in

situ молочной железы.

Научная новизна исследования. Проведено комплексное изучение широкого спектра структурных характеристик предраковых изменений молочной железы, отражающих различные аспекты биологической агрессивности неоплазий с учетом их гистологического строения (основных морфологических типов). Систематизированы характерные признаки различных видов неоплазий молочной железы, предложен алгоритм дифференциальной диагностики между протоковыми и дольковыми поражениями.

Сформулированы критерии дифференциальной диагностики дисплазии молочной железы и высокодифференцированной карциномы in situ. Показано, что в качестве таковых могут быть использованы уровень пролиферации мономорфных клеток, наличие патологических митозов и некроза, поляризация ядер по отношению к базальной мембране, количество структур вовлеченных в патологический процесс, уровень экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону и цитокератинам 5/6 и 14 типов.

Определена диагностическая ценность применения двух маркеров-коллагена IV типа и гладкомышечного актина для выявления фокусов микроинвазии при карциномах in situ.

Определен комплекс морфологических и иммуногистохимических признаков, сочетающихся с повышением инвазивного потенциала внутрипротокового рака. Доказано, что к ним можно отнести степень дифференцировки клеток, наличие некроза, поляризации, уровни экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, р53, bcl-2, Ki-67. Продемонстрировано, что для низкодифференцированного и микроинвазивного протокового рака in situ характерны максимальные уровни риска инвазивного потенциала опухоли, в то время как минимальные значения этих параметров выявляются при дисплазиях и дольковой карциноме in situ.

На основе экспрессии иммуногистохимических маркеров, выявлены корреляции между факторами инвазивности внутрипротоковой карциномы in situ и морфологическими характеристиками предопухолевых поражений.

Практическая значимость работы. Полученные данные о частоте и выраженности экспрессии различных иммуногистохимических маркеров позволяют создать основу для определения индивидуального прогноза течения заболевания, что, в свою очередь, будет способствовать разработке адекватных схем терапии прединвазивных неоплазий молочной железы. Предложены подходы к оптимальной морфологической диагностике прединвазивных поражений молочной железы, что позволит свести к минимуму риск развития рецидивов и определить возможность возникновения последующей инвазии. Предложен алгоритм исследования биологических свойств и проведения дифференциальной диагностики различных видов неоплазий молочной железы.

Определение использованных в работе показателей рекомендовано к применению в крупных региональных онкологических центрах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гистологическое исследование предраковых поражений молочной железы следует дополнить оценкой экспрессии иммуногистохимических маркеров. Определение уровней экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, р53, bcl-2, Ki-67, цитокератинов 5/6, Н, циклину D1, Е-кадхерину и Р-катенину является важнейшим инструментом дифференциальной диагностики различных видов неоплазий молочной железы и независимым фактором оценки инвазивности опухоли.

2. Определение наличия фокусов микроинвазии при карциноме in situ должно проводиться с использованием иммуногистохимического исследования. Оценка экспрессии двух протеинов: коллагена IV типа и гладкомышечного актина позволяет установить диагноз микроинвазивного рака в большинстве случаев, однако, рекомендуется

добавление к панели дополнительных маркеров для улучшения диагностики.

3. Признаками повышения инвазивности неоплазий молочной железы являются: повышение частоты выявления некроза, нарушения поляризации клеток, снижение частоты экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, сочетание максимальной экспрессии р53 и Ki-67 при минималной экспрессии Ьс12.

4. Признаками снижения степени дифференцировки опухолевых клеток при внутрипротоковой карциноме in situ также являются: повышение частоты выявления некроза, нарушений поляризации клеток, снижение частоты экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, снижение уровня экспрессии bcl-2, повышение частоты экспрессии р53, Ki-67. Внедрение результатов в клиническую практику. Результаты

исследования применяют для диагностики рака in situ молочной железы в патологоанатомическом отделении ФГБУ «Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена» Минздрава Россини и лаборатории патологической анатомии ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России.

Апробация работы. Диссертация апробирована 31 января 2013 года на заседании межотделенческой конференции ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздрава России. Основные положения исследования доложены на: Конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» 9-10 октября 2009 г.; Всероссийской конференции «Новые технологии в диагностике и лечении рака молочной железы и меланомы кожи» 16-17 декабря 2010, на конференции «Актуальные вопросы в диагностике и лечении больных раком молочной железы и меланомой кожи» 2011 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 научные работы, которые изданы в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий».

Струюгура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста. Состоит из введения, трех глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 14 отечественных и 313 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 35 рисунками и 16 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Обследованы 182 пациентки, получавших лечение в МНИОИ им. П.А.Герцена с 1993 по 2009 год по поводу предраковых заболеваний молочной железы. По результатам морфологического исследования больные были разделены на 4 группы (таблица 1).

Первую группу, в которую вошли 62 пациентки (34,1 %) с тяжелой дисплазией, которую обозначали далее как «дисплазия». Вторую группу составила 71 пациентка (39,0 %) с протоковой карциномой in situ молочной железы, («внутрипротоковый рак»). В третью группу включены 28 женщин (15,4 %) с дольковой карциномой in situ («виутридольковый рак». В четвертую группу вошла 21 пациентка (11,5 %) с карциномой in situ с началом инвазии, эта группа обозначалась как «микроинвазивный рак».

Таблица 1: Распределение пациенток по группам

Группы Абс. %

Дисплазия 62 34,1

Внутрипротоковый рак 71 39,0

Виутридольковый рак 28 15,4

Микроинвазивный рак 21 11,5

Всего 182 100

Средний возраст больных составлял 56,4 года (20 - 75 лет). 75 (41,2 %) пациенток находились в менопаузе, 107 (58,8 %) - в репродуктивном периоде.

Больным выполнены следующие виды оперативных вмешательств. Секторальные резекции проведены 138 (75,8 %) пациенткам, из них 61 (98,4 %) по поводу дисплазии, 45 (63,4 %) - при внутрипротоковом раке, 18 (64,3 %) - при внутридольковом и 14 (66,7 %) при микроинвазивном раке (таблица 3). В 16 (11,6 %) случаях выполнены двусторонние секторальные резекции. 7

больным выполнена радикальная мастэктомия (двум женщинам при внутрипротоковом раке, 5 - при микроинвазивном). В 6 случаях диагноз был поставлен после толстоигольной биопсии: 5 пациенткам при внутрипротоковом раке и одной - при микроинвазивном.

В ранние сроки после постановки диагноза части пациенток выполнялись повторные операции, в основном расширенные секторальные резекции с лимфаденэктомией, которые были выполнены в 32 случаях (17,6 % всей выборки). Повторные операции в объеме мастэктомии была выполнена в 13 случаях (7,1% из общей группы больных). У 97,3% пацеинты были отслежены после операции.

Методы исследования. Из опухоли вырезали 3-7 кусочков размерами 2x2x0,5см для гистологического исследования; из ткани, окружающей опухоль, - 5-8 штук. При секторальной резекции исследовали края резекции. Если макроскопически опухоль не обнаруживалась, иссекали фрагменты ткани более плотные на ощупь, отличающиеся по цвету и оттенку. Размеры образцов были такие же. Материал фиксировали в 10 % растворе забуференного нейтрального формалина в течение 24 ч., обезвоживали в батарее спиртов в возрастающей концентрации от 70 до 100 %, заливали в парафин и на ротационном микротоме готовили срезы толщиной 5-7 микрон, которые окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике. При установлении диагноза дисплазии, карциномы in situ или карциномы in situ с началом инвазии проводили иммуногистохимические исследования.

Для количественной оценки ряда морфологических характеристик (некроз, поляризация клеток по отношению к базальной мембране) производили оценку по принципу: 0 - отсутствие признака, 1 - наличие признака.

Для иммуногистохимического исследования были использованы 15 коммерческих наборов моно- и поликлоналыгах антител, которые по функциональной значимости распределялись следующим образом: маркеры пролиферативной активности (Ki-67), рецепторы стероидных гормонов

(эстрогеновые (ER) и прогестероновые (PgR)), маркеры апоптоза (Вс1-2), супрессоры опухолевого роста (р53, циклин D1), молекулы адгезии (Е-кадхерии, бета-катеиии), компоненты внеклеточного матрикса (коллаген IV типа), цитокератины (СК-5/6, СК-7, СК-19, СК-14, СК-Н), актины (гладкомышечный актин).

Материал для исследования методом иммуногистохимии фиксировали 10 % нейтральным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 ч.

Восстановление антигенной активности проводили в миниавтоклаве «2100 Retrieval» («Pick Cell») при 121° С в течение 20 мин и последующем остывании в течение 90 мин. Восстановление проводили в цитратном буфере pH 6,0 или в трис-ЭДТА-буфере pH 9,0, для некоторых антител использовалась протеазная обработка.

В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision» («Dako»), в качестве хромогена - диаминобензидин и АЕС. Для получения результатов, пригодных для количественной обработки, реакции проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Autostainer Dako».

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме и на мембранах клеток, оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью анализатора изображения «Leica Q550»: 0 — отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция.

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (Ki67, р53, Ьс12, рецепторы эстрогенов и прогестеронов), оценивали путем подсчета количества окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения, полученные результаты выражали в процентах. Результаты реакции с рецепторами эстрогенов и прогестерона оценивали по 8 бальной шкале. Статистическая обработка данных. Обработку данных проводили на персональном компьютере в программе «Статистика» (Statsoft, Inc). Сравнительный анализ параметрических признаков проводился с помощью

критерия Стьюдента, непараметрических количественных признаков проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использовали критерии хи-квадрат (х2) и Фишера.

Для определения наличия и количественной характеристики выраженности связи между отдельными структурно-функциональными показателями проводили корреляционный анализ с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфологические характеристики предраковых поражении молочной железы

Днсилазия. Морфологические признаки тяжелой дисплазии обнаружены у 62 пациенток.

Во всех случаях определялось полное или частичное заполнение единичных увеличенных в размерах протоков, укрупнение, небольшой полиморфизм и гиперхромия ядер клеток с наличием единичных митозов. Некрозы не обнаруживались.

Дольковая карцинома in situ. Морфологический диагноз внутридолькового рака был установлен в 28 случаях. В зависимости от клеточного состава и структурных особенностей дольковой карциномы in situ, мы разделили все наблюдения с данным видом патологии на два основных типа: классический тип, тип А (19 случаев, 68%) и тип Б (6 случаев, 21,4 %) В двух случаях (7%) были отмечены черты солидной внутридольковой карциномы, в одном случае (3,5%) выявлялось поражение со смешанными чертами внутридольковой и внутрипротоковой карцином.

Протоковая карцинома in situ. Морфологический диагноз внутрипротокового рака был установлен в 71 случае. Для оценки степени дифференцировки внутрипротоковой карциномы использовались следующие критерии: степень ядерного полиморфизма, митотическая активность, поляризация клеток и архитектоника опухоли.

Среди обследованных нами случаев встречались следующие степени ядерного полиморфизма:

- низкая степень (ЯП 1) (24 случая, 33,8 %).

- высокая степень полиморфизма (ЯП 3) (26 случаев, 38 %);

- умеренная степень полиморфизма (ЯП 2) (20 случаев, 28,2%).

Фигуры митоза и микрокальцинаты встречались в 68% случаев, некроз

по типу «комедо» - в 19% всех случаев. Поляризация клеток оценивалась как радиальная ориентация апикальной части опухолевых клеток по отношению к базальной мембране.

В структурном отношении мы выделяли следующие архитектурные варианты: угревидный, криброзный, папиллярный, солидный, стелющийся.

В зависимости от степени ядерного полиморфизма, наличия внутрипротокового некроза, митотической активности и гистологического строения, мы разделили внутрипротоковые неоплазии на две группы по степени дифференцировки.

Высокодифференцированная протоковая карцинома in situ (34 случая, 48,9%) была представлена мелкими, мономорфными клетками, образующими аркады, микропапиллярные, криброзные или солидные структуры. Ядра были однородны и имели правильное распределение хроматина с малозаметными нуклеолами. Степень ядерного полиморфизма была низкой в 60% случаев, в остальных случаях - умеренная степень полиморфизма. Фигуры митоза встречались крайне редко. Некроз и угревидные структуры отсутствовали.

Соответственно вариантам архитектоники, 35,5%, (12 случаев) высокодифференцированной DCIS были солидного строения, 20,6% (7 случаев) - криброзного строения, 44,1 % (15 случаев) - папиллярного.

Очаги низкодифференцированной DCIS (37 случаев, 52,1 %) были образованы резко атипичными клетками, расположенными как в один слой, так и с формированием микропапиллярных, криброзных и солидных структур. Ядра были резко полиморфны, плохо поляризованы, с нечетким

контуром и грубым распределением хроматина и четкими нуклеолами. Высокая степень ядерного полиморфизма определялась в 83,9% случаев, во всех случаях часто встречались фигуры митоза. Характерным признаком низкодифференцированного внутрипротокового рака in situ являлся так называемый «комедо-некроз» с наличием большого количества некротических масс, окруженных пролиферирующими крупными полиморфными клетками опухоли.

При низкодифференцированном внутрипротоковом раке отмечалась обратная тенденция, преобладала угревидная структура - 19 случаев (64,5 %), в 2 случаях (5,4%) структура была солидной, в 12 (32,4 %) - папиллярной, криброзной - в 3 случаях (8,1 %) и в 1 случае (2,7 %) - представлена стелющейся, или так называемой плоской атипией. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Варианты архитектоники внутрипротокового рака in situ.

Варианты Высокодифференцированный (п=34) Низкодифференциро ванный (п=37)

Абс. % Абс. %

Угревидный - - 19 51,4

Солидный 12 35,3 2 5,4

Криброзный 7 20,6 12 32,4

Папиллярный 15 44,1 3 8,1

Стелющийся - - 1 2,7

В обследованной группе было обнаружено примерно равное распределение между высоко- и низкодифференцированными формами внутрипротоковой карциномы. Наиболее характерными признаками низкой степени дифференцировки были высокая степень ядерного полиморфизма и угревидная структура опухоли с наличием комедонекрозов.

Мпкроинвазивный рак. В своей работе мы придерживались следующего определения микроинвазивной карциномы — это один микрофокус не более 2мм или 2-3 фокуса, не превышающие 1мм в наибольшем измерении.

В исследовании карцинома in situ с началом инвазии обнаружены в 21 случае. Большинство имело структуру протоковой карциномы - 19 образцов

(90,5%), остальные - сруктуру дольковой карциномы. Выявлена закономерность: низкая степень дифференцировки клеток отмечалась в 95% от общего количества протоковых карцином с микроинвазией (18 человек). В 3 случаях, несмотря на преобладание высокодифференцированных опухолевых клеток, встречались структуры с низкой степенью дифференцировки.

Сравнительная характеристика фоновых проявлений при неоплазиях молочной железы. Мы сравнивали частоту выявления морфологических признаков фоновых процессов в группах с различными видами неоплазии МЖ. Среди фоновых процессов встречались: пролиферация нормального эпителия протоков и долек, аденоз, внутрипротоковые папилломы, фиброаденомы, миоэпителиоз, апикриновая метаплазия эпителия, воспаление, центр ЗешЬа и аденома соска.

Статистически достоверных различий изученных фоновых изменений при различных видах интраэпителиальных неоплазий получено не было. Морфологические факторы, характеризующие инвазивный потенциал опухоли при неоплазии.

В качестве основных морфологических параметров, определяющих инвазивый потенциал опухоли, нами были проанализированы следующие: ядерный полиморфизм (N6), наличие некроза и степень поляризации опухолевых клеток. Выраженность ядерного полиморфизма (N0) оказалась наименьшей у женщин с внутридольковым раком, а наивысшей у группы с микроинвазивным раком значения такового были достоверно выше (р<0,05), составив 2,08+0,12 и 2,33+0,22 балла соответственно (Рис.1). Достоверных различий между среднегрупповыми значениями последних обнаружено не было.

Рис. 1. Сравнительная оценка частоты выявления показателя N0.

а Внутридольковый □ Внутри протоков ый [3 Микроинвазивныи

Признаки некроза у больных с внутридольковым раком не выявлялись, тогда, как у женщин из группы микроинвазивного рака эти значение было максимальным - 0,58+0,15 балла, достоверно превышая значение в группе с внутрипротоковым раком (р<0,05) (Рис.2).

Рис.2. Сравнительная оценка частоты выявления некроза.

При внутридольковом раке поляризация была максимальной по сравнению с микроинвазивным раком, составив 0,50+0,14 (Рис.3). (р<0,05). Рис.3. Сравнительная оценка степени поляризации.

% .лвМШ^сШШМНВНШКЯНННБ

Минимальное количество микрокальцинатов было при

внутридольковом раке - 0,43+0,20 баллов (Рис.4). В случае внутрипротокового и микроинвазивного рака in situ встречаемость микрокальцинатов был примерно в 1,5 раза выше (соответственно 0,62+0,12 и 0,67+0,19 баллов) (р>0,05).

Рис.4. Частота встречаемости микрокальцинатов.

% I щ ~ ~ >шvV" ||1| :

□ Внутридольковый !", Вкутрипротоковый □ Микроинвазивный

Наибольшими средние значения изученных признаков инвазивности были в группах низкодифференцированного внутрипротокового рака и микроинвазивного рака in situ (Рис.5). Несколько меньшими были уровни показателей в группе больных с высокодифференцированным внутрипротоковым раком. В группе пациенток с дольковым раком in situ значения параметров, характеризующих инвазивность, были наименьшими.

Рис.5. Сравнительная оценка частоты выявления признаков инвазивности.

............А; .............-

- - / X Внутридольковый

Внутри п рото ковы й

/ \ -

\

Некроз Ng Поляризация

Результаты иммуногистохимпческого исследования.

Экспрессия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов.

Экспрессия рецепторов к эстрогенам определялась при тяжелой дисплазии, в группе внутридольконого и высокодифференцированного внутрипротокового рака, соответственно в 98%, 93% и 95% случаев. В группах больных с низкодифференцированным протоковым раком in situ и микроинвазивным раком количество образцов с экспрессией ER было значительно ниже (45% и 47,6%) (р = 0.0006). В группе внутрипротокового рака отмечалась четкая зависимость этого показателя от степени дифференцировки ядер, показатель снижался в зависимости от нарастания клеточной анаплазии (соответственно NG-1 - 98%, NG-2 - 76%, NG-3 - 36%).

Частота экспрессии прогестероновых рецепторов имела сходный характер. При этом, как и в случаях с экспрессией эстрогеновых рецепторов, этот показатель снижался в зависимости от снижения степени дифференцировки клеток (соответственно NG-1 - 80%, NG-2 - 40%, NG-3 -14%). Объединенные данные по экспрессии рецепторов представлены на Рис. 6.

Рис.6. Экспрессия рецепторов к эстрогенам и прогестерону.

120 -1-—-

Проведение статистического анализа подтвердило, что экспрессия обоих типов рецепторов достоверно чаще (р 0,0005) обнаруживалась у больных с морфологически более высокодифференцированными предраковыми поражениями (дисплазиями, внутридольковым раком и внутрипротоковом раке с высокой степенью дифференцировки).

Экспрессия Е-кадхерипа, р-катенина и цитоксратинов.

Экспрессия Е-кадхерипа выявлена во всех образцах дисплазии (100%), 68 образцах внутрипротокового рака (95,7%), и в 19 образцах микроинвазивного рака (90,4%).

Уровень экспрессии протокового рака in situ был оценен как 3+ в 66 образцов (93%) и лишь в 2 случаях оценивался как 2+. Три случая, при котором экспрессия Е-кадхерина отсутствовала, были первоначально охарактеризованы как высокодифференцированная протоковая карцинома in situ солидного строения по морфологическим критериям, однако иммуногистохимическое исследование позволило отнести их в группу внутридольковых карцином.

Во всех случаях классической внутридольковой карциномы первого типа (19 случаев, 68%) определялось полное отсутствие экспрессии Е-кадхерина. Среди 9 случаев, квалифицированных при морфологическом исследовании как внутридольковый рак с выраженной клеточной атипией (второго типа), были выявлены 4 случая (14,2%) полномембранного окрашивания клеток. В трех случаях интенсивность окрашивания была оценена как 3+, в одном случае - как 2+. Случай, определенный как обладающий смешанными морфологическими признаками, также показал выраженную экспрессию Е-кадхерина, расцененную как 3+. В целом, окрашивание на Е-кадхерин отсутствовало в 23 случаях морфологически диагностированного долькового рака (82%). Е-кадхерин доказал высокую специфичность, как маркер, характерный для внутрипротоковой карциномы, его экспрессия определялась при этом виде опухолей достоверно чаще (р=0.0005). Полученные результаты представлены на Рис. 7.

Рис.7. Экспрессия Е-кадхерина в исследованных образцах.

80 60 40 20

— Ш Е-кадхерин I

Такая же тенденция была отмечена и при определении экспрессии (3-катенина при различных типах предраковых поражений молочной железы.

Достоверно чаще |3-катенин определялся при дисплазиях - в 98%, внутрипротоковом раке - в 95,7%, при микроинвазивном раке — в 89% случаев. При дольковом раке in situ экспрессия обнаруживалась лишь в двух случаях, которые будут обсуждены ниже (Рис. 8).

Рис. 8. Экспрессия р-кагенина в исследованных образцах.

120 100 80 60 40 20 0

В |В-катенин

Дисплазия LCIS DCIS Микроииеаэ

В семи случаях аберрантной экспрессии Е-кадхерина окрашивание на р-катенин было использовано как дополнительный маркер протоковых неоплазий. Позитивное окрашивание было получено в 2 из 3 внутрипротоковых карцином, негативных по экспрессии Е-кадхерина, что

подтвердило нротоковую природу этих поражений. В одном случае экспрессия (3-катенина также не определялось, этот случай былквалифицирован как внутридольковая карцинома. В двух из 4 случаев дольковой карциномы in situ с аберрантной экспрессией Е-кадхерина была обнаружена экспрессия р-катенина, что позволило отнести эти опухоли к внутрипротоковым, несмотря на первичный морфологический диагноз. В 2 случаях окрашивание на р-катепин было негативным.

В дополнении нами выполнялось окрашивание образцов для выявления экспрессии высокомолекулярного цитокератина, который считается рядом авторов специфическим маркером долькового эпителия.

При оценке полученных результатов было отмечено, что позитивное окрашивание выявлялось в большинстве случаев классической дольковой карциномы in situ (16 случаев из 19, 84%), а его интенсивность варьировала от 2+ до 3+. В целом, экспрессия высокомолекулярного цитокератина выявлялась при дольковой карциноме in situ достоверно чаще (р= 0.0006). При микроинвазивном раке экспрессия высокомолекулярного цитокератина была найдена лишь в 1 случае (4,7%), однако окрашивание было неравномерным и оценивалось на +1 или +2 балла в разных зонах. Полученные результаты представлены на Рис.9.

Рис.9. Экспрессия высокомолекулярного цитокератина в исследованных образцах

60 50 40 30 20 10 о

3 ск-н

микроинваз

Кроме того, было оценена иммуногистохимическая реакция с антителами к цитокератинам 5/6 и 14 типов, которая выполнялась не только

для проведения дифференциальной диагностики между протоковой гиперплазией и раком in situ, но и для выявления базальноклеточной дифференцировки.

Экспрессия цитокератинов 5/6 и 14 типов достоверно чаще наблюдается при дисплазиях (р= 0,0005), что позволяет использовать их для дополнительной дифференциальной диагностики дисплазий и высокодифференцированных карцином in situ.

Очевидно, что эти маркеры не могут быть использованы для дифференциальной диагностики между дольковыми и протоковыми карциномами in situ. Они позволяют дополнительно охарактеризовать поражение: во всех позитивных случаях так же отсутствовала экспрессия рецепторов к эстрогенам и прогестерону, что позволило отнести их к базальноклеточному раку in situ.

Экспрессия маркеров регуляции клеточного цикла, пролиферации

и апоптоза (р53, Ki-67, bcl-2, циклин D1)

Экспрессия р53 встречалась у больных с дисплазией, дольковым и высокодифференцированным внутрипротоковым раком в 1,6%, 3,5% и 14,7% соответственно. Различие с низкодиффереицированным внутрипротоковым раком (40,5%) и внутрипротоковым раком с микроинвазией (47,6%) достоверно (р<0,05). Экспрессия маркера р53 при микроинвазивным раке in situ не отличалось (р=0,9024) от низкодифференцированной протоковой карциномы in situ (рис.10).

Рис. 10. Экспрессия р53 при различных видах неоплазии.

20

40

30

10

О

Экспрессия циклина D1 в группах внутридолькового, внутрипротокового и внутрипротокового рака in situ с началом инвазии отмечалась в 64,3%, 66,2% и 69% соответственно; в группе с дисплазией экспрессия циклина D1 отмечалась в 3,5% (р<0,05) (Рис.11).

Рис. 11. Экспрессия циклина D1 при разных видах неоплазии

микроинвэз

Экспрессия маркера апоптоза Ьс1-2 выявляется у больных с дисплазией, внутридольковым раком и высокодифференцированным внутрипротоковым раком в 85,5%, 89,3% и 87,5% случаев соотвественно. При низкодифференцированном внутрипротоковым и микроинвазивным раком экспрессия отмечется реже в 39,4 и 39% (р=0,0005) (Рис.12). Рис.12. Уровни экспрессии Ьс1-2 при различных видах неоплазии.

100

80 -60

40 420 о

ч

I

у

,■!? ¿f J

Оценка значений экспрессии Й-67 продемонстрировала, что максимально часто она встречалась у больных с низкодифференцированным внутрипротоковым раком и пациенток с микроинвазивным раком, значения показателей при этом составили 24,3% и 50% соответственно.

Уровни данных показателей были достоверно (р<0,05) больше значений экспрессии маркера Кл-67 у больных с диплазией,

виутридольковым раком и высококодифференцированной протоковой карциномой in situ (1,6%, 3,5% и 2,9%). Достоверных различий между последними значениями выявлено не было.

Рис.13. Уровни экспрессии Ki-67 при различных видах неоплазии

60 50 40 30 20 10 0

В целом сопоставление профилей экспрессии вышеописанных маркеров показало, что для микроинвазивного рака in situ с началом инвазии было характерно сочетание повышения экспрессии р53 и Ki-67. Реже всего экспрессия р53 и Ki-67 определялась у больных с высокодифференцированным внутрипротоковым раком, виутридольковым раком и дисплазией. В то же время Ьс12 экспрессировался при этих видах неоплазий значительно чаще, демонстрируя разнонаправленныые тенденции с р53 и Ki-67. Различия в экспрессии циклина D1 были существенно меньше и достигли статистически достоверно более низких значений только при дисплазии.

Экспрессия коллагена IV и гладкомышечного актина при различных видах неоплазии.

Склерозируюший аденоз, пролиферативный центр Семба могут симулировать инвазию. Важный признак, говорящим об отсутствии инвазии, является наличие сохранённого слоя миоэпителиальных клеток вокруг опухолевого поражения. С этой целью мы определяли экспрессию гладкомышечного актина, коллагена IV типа. В 17 из 21 случаев четко определено наличие инвазивного компонента. В 4 (19%) случаях микроинвазивного рака экспрессия гладкомышечного актина, коллагена IV

типа была слабой. Использование комбинации позволило определить очаг инвазии не во всех исследованных случаях.

Морфологические характеристики и особенности экспрессии маркеров в зависимости от степени дифференцировки протоковой карциномы in situ.

Сравнение морфологических и иммуногистохимических характеристик в этой группе проводилось отдельно. Некроз при внутрипротоковой карциноме встречался только при

низкодифференцированных опухолях. Опухолевые пролифераты имели угревидную структуру в 64,5% случаев. Степень выраженности поляризации была наибольшей при высокодифференцированном внутрипротоковом раке и не зависело от структуры опухоли. Показатели степени поляризации и выраженности некроза имели ранонаправленные тенденции при DCIS с разной степенью дифференцировки (Рис.14).

Рис.14. Сравнительная оценка степени поляризации и выраженности некроза при внутрипротоковом раке с различной степенью дифференцировки.

553

■ • г.

Щ1ш!

шшш

ОаЭниз.диф 0С|5выс.диф

Микрокальцинаты обнаружены в 49 % случаев; в 16 % были множественными. Последнее характерно для низкой степени дифференцировки (60 % случаев). В 75 % случаев определялась угревидная и криброзная структура опухоли. Экспрессия рецепторов к эстрогенам была положительной в 95% случаев высокодифференцированного DCIS и в 45% низкодифференцированного, но зависимости от структурной характеристики внутрипротокового рака выявлено не было. Частота экспрессии прогестероновых рецепторов имела сходный характер.

Экспрессия Е-кадхерина, ß-катенина и высокомолекулярного цитокератина была ассоциирована с протоковым или дольковым происхождением неоплазии, а не со структурой опухоли и степенью ее дифференцировки. Уровень экспрессии р53 был наименьшим в подгруппе с высокодифференцированным внутрипротоковым раком (14,7% случаев) и повышался при снижении степени дифференцировки опухоли (40,5%). Уровень экспрессии циклина D1 не зависел от степени дифференцировки опухоли и ее структурной характеристики.

Экспрессия bcl-2 связана со степенью дифференцировки опухоли (87,5% при высокодифференцированной DCIS и 39,4% при низкодифференцированной) и ассоциировалась с солидной и папиллярной структурой, соответственно. Максимальный уровень экспрессии Ki-67 была при низкой степени дифференцировки (24,3%) и снижался с нарастанием степени дифференцировки (2,9%).

При нарастании уровня катаплазии клеточных элементов резко увеличивается уровень пролиферативной активности при одновременном падении уровня апоптоза. Со снижением степени дифференцировки опухоли отмечается нарастание экспрессии белка р53, что является плохим прогностическим фактором. Наибольшие значения показателей пролиферативной активности и нарушений дифференцировки отмечались в угревидных и криброзных структурах

Рис.15. Сравнительная оценка уровней экспрессии Ki-67, р53 и bcl-2 при внутрипротоковом раке с различной степенью дифференцировки.

Результаты корреляционного анализа показателей больных при протоковой карциноме in situ.

Взаимосвязь между показателями выраженности дифференцировки опухолевых клеток (NG — nuclear grade), морфологическими параметрами и уровнями экспрессии различных маркеров показано табл.13.

Таблица 3: Коэффициенты корреляции NG с различными морфологическими показателями

Параметры г

Частота выявления некроза 0,70

Выраженность поляризации 0,57

Рецепторы к эстрогену и 0,41

р53 0,49

Вс1-2 0,36

Кл-67 0,42

Низкий уровень дифференцировки клеток был связан с частотой выявления признаков некроза - (г=0,70). Обратной и достаточно выраженной (умеренной силы) была связь степени дифференцировки с выраженностью нарушений поляризации (г=-0,57). Уровень экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону был положительно связан со степенью дифференцировки (г=0,42). Была выявлена значимая обратная связь умеренной силы для частоты выявления р53 (г=-0,49) и К1-67 (г=-0,42). Отмечена положительная связй и с уровнем экспрессии Ьс1-2 (г=0,36).

Таким образом, снижение степени дифференцировки опухолевых клеток ассоциируется с повышением: частоты выявления некроза, выраженности нарушения поляризации клеток, частоты экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону, частоты экспрессии р53, частоты экспрессии К-67, и снижением: частоты экспрессии Ьс1-2.

Морфологические и нммуногнстохимические характеристики микроинвазивного рака.

При исследовании карцином с фокусами микроинвазии низкая степень дифференцировки клеток отмечалась в 92%; в 8% преобладающее количество опухолевых структур имели высокую степень дифференцировки клеток, но встречались структуры с низкой степенью дифференцировки.

Уровень NG, степень поляризации клеток, частота встречаемости некрозов ие отличались с группой с низкодифференцированным внутрипротоковым раком; аналогичная тенденция - при сравнении иммуногистохимических характеристик. Экспрессия маркеров при внутрипротоковом раке низкой степени дифференцировки и микроинвазивным раком достоверных различий обнаружено не было вследствие сходства биологических характеристик.

ВЫВОДЫ

1. Высокая частота экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, наличие рассеянной экспрессии СК-5/6 и СК-14 (р=0,0005), менее частая экспрессия циклина D1 (р<0,05) наряду с гистологическими критериями, характерна для дисплазии, а не для внутрипротоковой карциномы.

2. Отсутствие экспрессии СК-Н и положительная экспрессия Е-кадхерина и р-катенина (р=0.0005) наряду с компактным расположением клеток во внутрипросветных пролифератах позволяет достоверно дифференцировать протоковую карциному in situ от дольковой.

3. Применение р-катенина в случаях абберантной экспрессии Е-кадхерина позволяет избежать ошибок в диагоностике интраэпителиальных неоплазий молочной железы.

4. Использование двух иммуногистохимических маркеров: коллагена IV типа и гладкомышечного актина позволяет установить диагноз микроинвазивного рака в большинстве случаях (70,8%), однако для увеличения чувствительности метода оптимально применение дополнительных маркеров.

5. При увеличении уровня катаплазии клеточных элементов прединвазивных поражений молочной железы значительно возрастает частота экспрессии Ki-67 и р53 (р<0,05) с одновременным снижением частоты экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону и Ьс12 (р<0,05), что позволяет выделить эти маркеры в панель, используемую для оценки уровня дифференцировки и злокачественного потенциала неоплазий.

6. Низкая степень дифференцировки опухолевых клеток (NG-3) при внутрипротоковой карциноме in situ ассоциируется с высокой частотой выявления некроза, нарушением поляризации клеток, снижением частоты экспрессии рецепторов к эстрогенам, прогестерону (р=0,0006) и bcl-2 (р=0,0005), повышением экспрессии рецепторов к р53, Ki-67 (р<0.05).

7. Отсутствие различий в экспрессии протеинов-регуляторов клеточного цикла, пролиферации и апоптоза между низкодифференцированным внутрипротоковым раком и микроинвазивной карциномой, позволяет предположить сходный потенциал злокачественности этих видов неоплазий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Гистологическое исследование при неоплазиях молочной железы следует дополнять иммуногистохимическим анализом, результаты которого позволяют осуществлять дифференциальную диагностику различных видов неоплазий и дают возможность уточнения прогноза заболевания.

2. В качестве критериев дифференциальной диагностики между тяжелой дисплазией молочной железы и высокодифференцированной карциномой in situ рекомендуется использовать: уровень пролиферации мономорфных клеток с незначительным укрупнением и полиморфизмом ядер; наличие патологических митозов; сохранение поляризации ядер по отношению к базальной мембране; количество структур вовлеченных в патологический процесс; оценку экспрессии цитокератинов 5/6 и 14 типов и циклина D1.

3. В качестве критериев дифференциальной диагностики между дольковой и протоковой карциномой in situ рекомендуется использовать: характер взаимодействия клеточных элементов между сосбой во внутрипросветных пролифератах; нарушение поляризации ядер по отношению к базальной мембране; уровень экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону; характер экспрессии СК-Н, Е-кадхерина и Р-катенина; характер экспрессии р53 и циклина D1.

4. Для прогноза инвазивного потенциала неоплазий МЖ целесообразно использовать следующие гистологические и иммуногистохимические признаки: степень дифференцировки клеток; наличие некроза; наличие поляризации; экспрессию эстрогеновых и прогестероновых рецепторов; экспрессию р53, bcl-2, Ki-67.

5. Для достоверного определения микроинвазии необходимо использование комбинации из нескольких иммуногистохимических маркеров (например, гладкомышечного актина и коллагена IV типа).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Ефремов Г.Д . - Классификация протокового рака in situ молочной железы. /Г.Д.Ефремов, Г,А.Франк - Российский онкологический журнал. 2010 № 3, с.53-56.

2. Ефремов Г.Д. - Иммуногистохимические методы дифференциальной диагностики протоковых и дольковых карцином in situ молочной железы. /Г.Д.Ефремов, Л.Э.Завалишина, Г.А.Франк - Онкохирургия 2012, Т 4-2, с.26-32.

3. Ефремов Г.Д. - Иммуногистохимическая характеристика протокового рака молочной железы in situ и ее корреляция с морфологическими факторами прогноза./Г.Д. Ефремов, Л.Э.Завалишина

http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/vl2/papers/efremov_vl2.htiii// Статья опубликована 25 октября 2012 года.

Подписано в печать:

22.07.2013

Заказ № 8632 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru