Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярная и цитогенетическая характеристика Ph-позитивного клона у больных хроническим миелолейкозом при длительном воздействии ингибиторов тирозинкиназ

«Молекулярная и цитогенетическая характеристика РЬ-позитивного клона у больных хроническим миелолейкозом при длительном воздействии ингибиторов тирозинкиназ»

14.01.21.- Гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 3 АВГ 2015

Москва 2015

005561594

005561594

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Туркина Анна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор. Официальные оппоненты:

Михайлова Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения биотерапии научно-исследовательского института клинической онкологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина"

Зинченко Рена Абульфазовна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории генетической эпидемиологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр»

Ведущее учреждение:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Защита состоится "_"_2015г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при ФГБУ Гематологический научный центр МЗ России по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Гематологический научный центр МЗ РФ

Актуальность исследования

Основным молекулярно-генетическим событием, приводящим к лейкемической трансформации стволовых клеток и развитию хронического миелолекоза (XMJI) является образование гена BCR-ABL, который возникает в результате обмена генетическим материалом между хромосомами 9 и 22 (Ph+ хромосома). Продукт гена BCR-ABL - онкобелок р210, является тирозинкиназой, играющей ключевую роль в патогенезе заболевания [Daley et al 1990]. Изучение молекулярных основ XMJI привело к разработке препаратов - ингибиторов тирозинкиназ (ИТК), блокирующих патологический белок р210. Лечение ИТК первого поколения иматинибом изменило представление о возможности подавления Ph+позитивного гемопоэза. Больные, достигшие полного цитогенетического ответа, имеют достоверное преимущество в выживаемости по сравнению с больными, имеющими большую массу опухоли [Baccarani М. et.al 2009, Ломайа 2007, Гусарова 2005]. Вероятность достижения полного цитогенетического ответа (ПЦО) по результатам различных клинических исследований значительно варьирует и составляет от 60 до 82 % [Baccarani et al 2009, 2013, De Lavallade et al 2008, Hughes et al 2010, Виноградова 2011]. Вопросы стабильности цитогенетического ответа при длительной терапии иматинибом обсуждаются редко и наиболее полно отражены при анализе результатов международного исследования IRIS. Через 8 лет после начала терапии больных в ранней хронической фазе (РХФ) только 55 % из них продолжали прием иматинба [Hughes et al 2010]. Причинами прекращения являлись прогрессия ХМЛ, неэффективность или непереносимость. Полного цитогенетического ответа достигли 82 % больных, 17 % из них в дальнейшем потеряли ответ.

Ингибиторы тирозинкиназ второго поколения (ИТК2) (нилотиниб, дазатиниб и бозутиниб) за счет большей специфичности значительно более активно блокируют белок р210, в том числе и его мутантные формы. В литературе имеется большое число сообщений об эффективности ИТК2 по

сравнению с иматинибом [Bradeen et al 2006, Garg et al 2009, Quintas-Cardama 2007].

Вероятная продолжительность жизни пациентов, которые достигли полного цитогенетического ответа (ПЦО), практически достигает уровня общей популяции [Gugliotta et al 2013]. У пациентов с более глубоким ответом, таким как большой молекулярный ответ (БМО) или полный молекулярный ответ (ПМО, М04 или М04,5) не показано достоверного преимущества в выживаемости, по сравнению с больными, достигшими ПЦО. Достижение более глубокого ответа позволяет уменьшить вероятность цитогенетического рецидива и прогрессии заболевания, а длительный стабильный глубокий молекулярный ответ дает возможность ведения ремиссии без лечения у значительной доли пациентов [Mahon F. X. et al. 2010, Ross D. M. et al 2013]. В настоящее время нет полного понимания того, какая доля больных может достичь глубокого молекулярного ответа и каково влияние глубины ответа на отдаленные результаты терапии ИТК. На сегодняшний день недостаточно представлены отдаленные результаты терапии при последовательном применении иматиниба и ИТК2 во вторую и третью линии лечения. Описаны противоречивые данные о значении исторически используемых прогностических моделей, клинических факторах, влияющих на эффективность терапии иматинибом и ИТК2 [Milojkovic D et al 2010, Jabbour E et al 2011. Виноградова 2011].

Успех, достигнутый ингибиторами BCR-ABL, был несколько омрачен развитием резистентности у некоторых пациентов. Наиболее изученным и общим механизмом резистентности является появление различных мутаций киназного домена BCR-ABL во время лечения (Куцев 2009, Soverini 2009). Довольно много данных накопилось о роли мутаций в развитии приобретенной резистентности, при этом частота, спектр мутаций, их потенциальное значение в развитии первичной резистентности исследовано недостаточно, особенно у больных, длительно получающих иматиниб. Единичные публикации

посвящены значению и частоте сочетаний мутаций и дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) при терапии иматинибом и ИТК2.

Цель исследования

Оценить динамику изменения РЬ+ клона у больных ХМЛ при длительной терапии ингибиторами тирозинкиназ, а также выявить молекулярные, цитогенетические и клинические факторы, влияющие на редукцию лейкемического клона и выживаемость.

Задачи исследования

1. Оценить выживаемость больных в хронической фазе хронического

миелолейкоза и ее взаимосвязь со степенью редукции лейкемического клона при длительной терапии ингибиторами тирозинкиназ.

2. Оценить вероятность достижения полного цитогенетического и глубокого молекулярного ответа при терапии иматинибом в зависимости от сроков начала терапии.

3. Оценить вероятность сохранения достигнутого полного цитогенетического ответа у больных в хронической фазе хронического миелолейкоза в зависимости от терапии и степени редукции лейкемического клона.

4. Оценить вероятность достижения полного цитогенетического и глубокого молекулярного ответа при применении ингибиторов тирозинкиназ второго поколения у больных с неудачей терапии иматинибом.

5. Проанализировать влияние клинических, молекулярных и цитогенетических факторов, ассоциированных с неэффективностью терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При длительной терапии иматинибом вероятность сохранения полного цитогенетического ответа достоверно больше у больных с большим и полным молекулярным ответом.

2. Достижение полного цитогенетического ответа на любом этапе терапии ХМЛ является ключевым благоприятным фактором общей

5

выживаемости и выживаемости без прогрессии до фазы акселерации и бластного криза.

3. Позднее начало терапии иматинибом (более 12 месяцев) уменьшает вероятность достижения полного цитогенетического, большого и полного молекулярного ответов, увеличивает вероятность прогрессии заболевания.

4. Ингибиторы тирозинкиназ второго поколения позволяют восстановить, а также достигнуть впервые полный цитогенетический ответ у значительной части больных с неудачей на терапии иматинибом.

5. Мутации гена ВСЯ-АВЬ являются значимым фактором, влияющим на прогрессию и смерть у больных с неудачей терапии иматинибом и ИТК2.

Научная новизна исследования

Данное исследование позволило дополнить имеющееся на сегодняшний день представление об молекулярных и цитогенетических основах целенаправленной терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Впервые произведена оценка возможности достижения различных уровней снижения объема лейкемического клона у больных при длительном последовательном воздействии иматиниба и ИТК2. Представлены данные по выживаемости и вероятности прогрессии у больных в ранней и поздней ХФ ХМЛ, получающих терапию иматинибом и ИТК2 как во вторую, так и в третью линию при длительном наблюдении (Ме 123 мес.). Показана высокая прогностическая значимость цитогенетической и глубокой молекулярной ремиссии вне зависимости от срока ее достижения, при этом отмечено снижение вероятности получения цитогенетической ремиссии с каждым последующим годом терапии иматинибом. Впервые представлена текущая кумулятивная частота цитогенетической ремиссии у больных ХМЛ во время терапии иматинибом и после перехода на ИТК2. Описана частота и спектр мутаций ВСЯ-АВЬ в зависимости от типа резистентности на терапии иматинибом, сочетание мутаций и ДХА, показано влияние мутаций ВСЯ-АВЬ на выживаемость, прогрессию, достижение цитогенетической и молекулярной ремиссии, а также динамика клонов с мутациями на терапии ИТК2.

б

Практическое значение работы

Показано, что риск прогрессии XMJI до фазы акселерации и бластного криза снижается при достижении полного цитогенетического ответа в не зависимости от срока его достижения. Установлено значение большого молекулярного ответа для снижения риска потери полного цитогенетического ответа. Подтверждено, что время начала лечения (менее 12 мес. после установления диагноза XMJI) является ключевым фактором не только для достижения глубоких молекулярных ответов, но и для стабильного их сохранения. Показана высокая вероятность редукции опухолевого клона после переключения на ИТК2 у больных с неудачей терапии иматинибом. Продемонстрирована важность исследования мутаций гена BCR-ABL не только у больных с неудачей терапии иматинибом, но и при неэффективности ИТК2.

Публикации

Всего по теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из которых - 3 в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Апробация диссертации

Материалы диссертации представлены на I Конгрессе гематологов России (Москва, 2012), П Конгрессе гематологов России (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генетика опухолей кроветворной системы» (Санкт-Петербург 2015 г), симпозиуме "Итоги и перспективы терапии XMJI в Российской Федерации" (Москва 2015 г.), Гематологический декадник (Москва 2013, 2014 г.г.), 20th Congress of European Hematology Association (Vienna, Austria), "European Investigators on Chronic Myeloid Leukemia (EI-CML)" meeting (Italy, Bologna 2015).

Личный вклад автора

Автором лично проведены планирование диссертационного исследования и анализ литературных данных, выполнено молекулярно-

генетическое исследование мутаций гена BCR-ABL у части пациентов, осуществлены статистический анализ, обобщение и интерпретация полученных данных.

Структура работы

Диссертационная работа изложена на 113 страницах текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания пациентов и методов, главы результатов исследования, главы заключение, выводов и библиографии. Список литературы включает 14 источников на русском языке и 219 источников на иностранном языке. Работа содержит 46 рисунков и 10 таблиц.

Пациенты и методы исследования

В исследование включены 235 пациентов Ph'-позитивным XMJI, начавшие терапию иматинибом в период с 2000 по 2007 год и зарегистрированные в Гематологическом научном центре в рамках благотворительной международной программы GIPAP (Glivec® International Patient Assistance Program). Критерии включения в исследование: подтвержденный цитогенетическим методом диагноз XMJI в хронической фазе вне зависимости от длительности заболевания и предшествующего иматинибу лечения. Критерии исключения из исследования: фаза акселерации или властный криз на момент начала терапии. В зависимости от сроков начала лечения больные были разделены на 2 группы: в ранней (<12 мес. от даты диагноза) и поздней (>12 мес.) хронической фазе (ХФ) XMJI. В ранней ХФ (РХФ) начали терапию 36,6% (п=86) человек, в поздней ХФ (ПХФ) терапию начали 63,4% (п=149) человек. Средний возраст составил 40 лет (9-66 лет), Распределение по полу: мужчин 116 (49%), женщин 119 (51%).

Получали терапию только иматинибом 66,4% (п=156/235). ИТК2 33,6% (79/235) больных. Терапия иматинибом проводилась в дозе не более 400 мг в сутки у 49,8% (п=117), а у 50,2% (п=118) доза иматиниба была увеличена на разных этапах терапии. Медиана терапии иматинибом до переключения на ИТК2 составила 61 мес. (10-147 мес.). Терапию нилотинибом получали 56 больных, дазатинибом 48 больных, бозутинибом 8 пациентов.

8

Оценка эффективности терапии

Для оценки цитогенетического ответа использовали метод G — дифференцированной окраски хромосом по стандартной методике (СЦГИ); при недостаточном количестве метафаз в костном мозге (<15) использовали метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). ПЦО - отсутствие Ph-хромосомы по данным СЦГИ или FISH-исследования. Исследования проводили каждые 6 месяцев до достижения ПЦО. После достижения ПЦО оценку результатов лечения проводили цитогенетическим методом 1 раз в год и/или методом количественной ПЦР. Потерей ПЦО считалось превышение уровня 30% Ph-позитивных клеток при повторном цитогенетическом исследовании или уровня BCR-ABL более 1 %, если проводился только молекулярный мониторинг. Оценку экспрессии гена BCR—ABL проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, включающей этапы выделения РНК, постановки реакции обратной транскрипции и проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Молекулярное исследование выполнялось всем больным, начиная с 2005 года, когда стала доступна методика определения относительной экспрессии гена BCR-ABL. Молекулярный мониторинг осуществлялся в среднем 1 раз в год. БМО - уровень bcr-abl <0,1%, ПМО (полный/глубокий молекулярный ответ) - уровень bcr-abl <0,01%.

Мутационный статус гена BCR-ABL определяли с помощью метода прямого секвенирования. Последовательность кДНК киназного домена амплифицировали в два этапа и затем секвенировали в обоих направлениях с использованием реактивов Beckman Coulter Genome Lab Method Development Kit («Beckman Coulter»). Нуклеотидную последовательность сравнивали с

референсной последовательностью транскрипта c-abll. Показанием для

выполнения исследования мутаций BCR-ABL явилась неудача терапии иматинибом, прогрессия заболевания, а также планируемый переход на ИТК2. Больным, получающим ИТК2, мутационное исследование проводилось при отсутствии уменьшения опухолевой массы по данным цитогенетического и/или

молекулярного мониторинга через 12 месяцев терапии, признаках прогрессии заболевания, а также перед планируемой сменой ИТК. Исследование мутационного статуса выполнены 68 пациентам с резистентностью на терапии иматинибом и 20 пациентам на терапии ИТК2.

Для статистической компьютерной обработки данных применялись пакеты программ STATISTICA 12.0, XLSTAT 2014. Анализ вида распределения признаков осуществлялся согласно критериям нормальности Колмогорова-Смирнова и Лиллиефорса, а также критерию Шапиро-Уилка. Для сравнения бинарных данных использовались точный критерий Фишера и %2. Сравнительный анализ вероятности времени до события проводился по методу Каплан-Майер, используя лог-ранк-тест для оценки достоверности различий. Статистически достоверными считали различия при значении р < 0,05. Расчет текущей кумулятивной частоты (current cumulative incidence) осуществлялся с использованием программы R по авторской методике [Pavlik, Т. 2013].

Работа осуществлялась в период с 2011 по 2014 год на базе Научно-консультативного отделения химиотерапии миелопролиферативных заболеваний ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (зав. НКО ХМПЗ проф. Туркина А.Г., директор ФГБУ ГНЦ академик Савченко В.Г.). Цитогенетические исследования проводились в лаборатории кариологии ГНЦ (зав. лаб. к.м.н. Обухова Т.Н.). Молекулярно-генетические исследования - в лаборатории молекулярной гематологии (зав. лаб. д.б.н. Судариков А.Б.).

Результаты исследования и их обсуждения

Общая выживаемость и прогрессия на терапии ингибиторами тирозинкиназ

Двенадцатилетняя общая выживаемость (ОВ) и выживаемость без профессии (ВБП) до ФА и БК составила 79% и 82%. Всего за весь период терапии ИТК умерли 18,7% (п=44/235) пациента. За весь период наблюдения прогрессия до ФА и БК зафиксирована у 15,3% (п=36/235). От прогрессии ХМЛ умерли 13,2% (n=31/235). Me времени до прогрессии составила 36,5 мес. (ИР

17,5-59). Умерли 88,9% (п=32/36) больных в продвинутых фазах. Ме ОВ в продвинутых фазах составила 9 месяцев.

Показан значительный вклад фактора длительности заболевания до начала терапии иматинибом в развитие прогрессии у больных ХМЛ. Больные, начавшие лечение в ПХФ, имели достоверно меньшую (77% против 94%) ВБП в ФА и БК (рис. 1а).

Со временем не отмечено увеличения частоты случаев смерти от прогрессии ХМЛ на терапии НТК (Рис. 16)

к СЕ

fc w с;

>. 5 >, 02

- Более 12 мес.

----12 мес. и менее

(91-97%) 20 18

16

77% S 14

(74-80%) d п. 12

р=0,006 § 10 Я

о в 6

о 5 4

ЕГ 2 0

.И'

Сопутствующие причины Прогрессия ХМЛ

II -I..

О 12 24 36

80 72 84 96 108 120 132

Время (мес.) А

4 5 6 7 8 9 10 11 12

Годы терапии Б

Рисунок 1. ВБП при терапии ИТК в РХФ и ПХФ (а) и динамика умерших больных за каждый год терапии ИТК (б).

При анализе роли клинико-гематологических факторов в данной группе больных не показано достоверного различия в ОВ и ВБП в зависимости от группы риска по критериям Sokal, Euro, ГНЦ.

Цитогеиетический ответ при терапии иматинибом.

Всего за весь период терапии иматинибом ПЦО достигли 72% (п= 169/235), медиана (Me) времени до получения ПЦО во всей группе составила 34 мес. (ИР 17-59 мес.). Потеряли достигнутый ранее ПЦО 25% (п=43/169), или 18% от всей группы. Кумулятивная частота достижения ПЦО через 10 лет терапии иматинибом составила 81%. Вероятность потери ПЦО на терапии иматинибом за тот же срок составила 28%.

Важным фактором, ассоциированным с достижением и сохранением

ПЦО, определяющим прогноз заболевания, является время до начала терапии менее чем 12 мес. Показано, что вероятность достижения ПЦО (Рис.2а) выше у больных в РХФ на момент начала терапии иматинибом (90% против 77%). Вероятность потери ПЦО (Рис.2б) выше у больных в ПХФ (48% против 19%)

90% (88-92%) ------"

0=0,046

48% (29-79%)

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120132

_ ПХФ Время (мес.)

----- РХФ А

19% (11-31%)

Н—I—1—I—н

0 12 24 36 48 60 72 84 96108120132144156 Время (мес.)

Рисунок 2. Кумулятивная вероятность достижения (а) и потери (б) ПЦО при терапии иматинибом.

Значение сроков достижения полного цитогенетического ответа

Достижение цитогенетического ответа через 12 месяцев терапии иматинибом является благоприятным фактором прогноза для больных ХМЛ [Вассагаш М. е!а1 2009]. По результатам проведенного сравнительного анализа 12 летней ОВ на терапии ИТК показано, что больные, не достигшие ПЦО к 12 месяцу терапии, имеют достоверно меньшую выживаемость, чем больные, достигшие ПЦО к 12 месяцу. Дополнительно проведен сравнительный анализ ОВ и ВБП в группе больных, достигших ПЦО на первом году терапии, на втором и третьем год, и не достигших ПЦО к 3 году лечения (Рис.За и 36).

1ЮТ.

X -

8 ал

3 а

к

|

2 =

а эзч * **

^ 10*

Общая выживаемость (%)

Вьоюваемость без прогрессии в ФА/БК

1

-ПЦО на 1 году терапии

-ПЦО на 2 и 3 году терапии

— Нет ПЦО к 36 месяцу терапии

£ о.'

X

I

С

Iм

—Г -1Т____ «- МИ Ф«-| мчия -1 тп°/

\ ^ 92о/о

—^»-н-н—* р=0.0001

74%

— ПЦО на 1 году

ПЦО на 2 и 3 году

Нет ПЦО за 3 года

12 24 36 48 60 72 84 Й6 108 120 132 144 156 168 180

Время (мес.)

А Б

Рисунок 3. ОВ (а) и ВБП (б) в зависимости от цитогенетического ответа

к 3 году терапии иматинибом.

У больных, достигших ПЦО до 12 месяца терапии и после 12 месяца, не

отмечено достоверного различия в ОВ (92,7%) и ВБП (100% и 92%), при этом

ОВ и ВБП в группе без цитогенетического ответа достоверно ниже (63% и 74%

соответственно). Достижение ПЦО на любом этапе уменьшает риск прогрессии

и смерти на терапии ИТК. При этом показано, что с каждым годом вероятность

достижения ПЦО достоверно уменьшается и составляет 40 % против 5,7 % в

течение первого и пятого года терапии иматинибом соответственно (Рис.4а).

46%

I

■ I |рогрсссия н ФА или №

4 - • - 5

ПЦО(в=74) Нп ПЦО ПЦО (в—95) Нет ПЦО (■=1!) 111=54)

РХФЦ-86) ПХФШ-149)

А Б

Рисунок 4. Вероятность достижения ПЦО на каждом году лечения за 5

лет терапии иматинибом (а) и доля больных с прогрессией (б) в зависимости от

цитогенетического ответа.

Доля больных с прогрессией в ФА и БК достоверно выше в группе больных без ПЦО, чем с ПЦО как в РХФ (33% и 1%), так и в ПХФ (46% и 6%) (Рис 46).

Цитогенетический ответ при терапии ингибиторами тирозинкиназ второго поколения

Терапию ИТК2 получали 79 человек. Ме длительности терапии ИТК2 составила 59 мес. (ИР 25-80 мес.). Переведены на ИТК2 из-за первичной цитогенетической резистентности 57% (п=45), в связи с отсутствием гематологического ответа на иматиниб 5% (п=4), из-за потери цитогенетического ответа на иматиниб 29% (п=23), токсичность и другие причины 9% (п=7). Кумулятивная вероятность достижения ПЦО через 8 лет терапии ИТК2 составила 74% (Рис.5а). Проведен анализ вероятности достижения ПЦО на терапии ИТК2 у больных, не достигших ПЦО и потерявших ПЦО на терапии иматинибом (Рис. 56). Показано, что вероятность достижения ПЦО выше у больных, которые потеряли ответ за время предшествующего лечения иматинибом (85,6% против 41%).

74%

ДИ:(62-87%)

О 12 24 36 48 60 72 84 96 108120 Время (мес.)

После потери 1ЩО 85,6%

р =0,0005

А Б

Рисунок 5. Кумулятивная вероятность достижения ПЦО на ИТК2 в

целом (а) и в зависимости от ответа при терапии иматинибом (б).

Переключение на ИТК2 позволило впервые получить ПЦО у 41%

больных к 3 году терапии. Для того, чтобы продемонстрировать реальную

вероятность сохранения ПЦО на различных этапах терапии, рассчитана

текущая кумулятивная частота ПЦО (Рис.6), которая учитывает не только вероятность достижения, но и потери ПЦО за весь период терапии иматинибом и после переключения на ИТК2.

Г 74,3%

^-ГДН65.9 82.846

50,6% ДИ 43,3-61,6%

О

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Время (лет)

Рисунок 6. Текущая кумулятивная частота ПЦО при терапии иматинибом и после переключения на ИТК2

Переключение на ИТК2 позволило увеличить вероятность пребывания в ПЦО к 13 году терапии с 50,6% до 74,3%.

Молекулярный ответ при терапии иматинибом

Оценка уровня экспрессии гена BCR-ABL стала доступна с 2005 года, когда была внедрена в клиническую практику методика ОТ-ПЦР РВ, поэтому корректно оценить кумулятивную частоту достижения БМО возможно только у 222 больных. У 178 больных проводился регулярный молекулярный мониторинг, у 44 на терапии иматинибом не проводился молекулярный мониторинг, при этом у них отсутствовал ПЦО за весь период терапии иматинибом, что позволило отнести их к группе больных, не достигших БМО. БМО получен у 126 больных (53,6% от всей группы, 70,8% от исследованных больных). Стабильная потеря БМО наблюдалась у 11,1% (n=14). Me времени до потери БМО составила 9,7 мес. (ИР 7,6-34,7 мес.). Расчетная 12-летняя кумулятивная частота достижения БМО на терапии иматинибом составила 76% (Рис.7а). Вероятность потери БМО через 10 лет составила 18% (Рис.7б)

76% (n=222)

goo

o=>

H

X

12-

18% (n=126)

12 24 36 48 60 72

96 108 120 132 144 156

0 12 24 36

96 108 120 132 144 156

Время (мес.) Время (мес.)

Рисунок 7. Кумулятивная частота достижения БМО (А) и вероятность потери БМО (Б) при терапии иматинибом

Среди больных, достигших БМО на любом этапе терапии иматинибом, умерли 4,7% (п=6/127), при этом все смерти от сопутствующей патологии, не связанные с прогрессией ХМЛ. Проведенный анализ показал, что отсутствие БМО через 5 лет терапии достоверно увеличивает вероятность потери ПЦО (84% против8%) (Рис. 8а) и прогрессии заболевания (83% против 100%) (Рис. 86).

100% 83%

А Б

Рисунок 8. Вероятность потери ПЦО (а) и ВБП (6) в зависимости от

результатов молекулярного исследования через 5 лет терапии иматинибом

Наибольший интерес представляла оценка возможности максимальной

редукции опухолевого клона до уровня, соответствовавшего стабильному

полному молекулярному ответу со снижением на 4 log (М04), т.е. уменьшение

уровня экспрессии BCR-ABL до 0,01% и ниже по данным минимум двух

16

последовательных анализов за последние два года терапии иматинибом. Кумулятивная частота достижения М04 через 12 лет терапии иматинибом составила во всей группе 47% (рис. 9а), при этом она достоверно отличалась у больных в РХФ (58%) и ПХФ (39%) (рис.9б).

47%

72 96 120 144 168 Время (мес.) А

Время (мес.) Б

Рисунок 9. Кумулятивная частота достижения М04 при терапии иматинибом у всей группы (А) и в РХФ и ПХФ (б).

Молекулярный ответ при терапии ингибиторами тирозинкиназ второго поколения

Молекулярный ответ оценивали у 76 из 79 больных на ИТК2. Переключение на ИТК2 у больных с неудачей терапии иматинибом привело к редукции опухоли до уровня БМО у 41% (п=31/76). Ме времени достижения БМО составила 16,6 мес. (ИР 6,7-35,3 мес.). Кумулятивная вероятность достижения БМО на ИТК2 к 5 году терапии достигает 45% (рис.Ю). Впервые достигли ПМО при терапии ИТК2 18% (14/76).

Время (мес.)

Рисунок 10. Вероятность достижения БМО при терапии ИТК2 В

Мутации гена ВСЯ-АВЬ

Исследование мутационного статуса выполнены 68 пациентам, получающим иматиниб (29% от всей группы). Мутации выявлены в 32,4% (п=22/68) случаев (Табл. 1), при этом у двух больных выявлено одновременно 2 мутации. Из 68 больных, которым выполнено мутационное исследование, 32,4% (п=22/68) составили больные в РХФ. У больных в РХФ мутации выявлены в 31,8% (п=7/22), в ПХФ в 32,6% (п= 15/46). На момент исследования мутационного статуса в ФА и БК находились 8,8% пациентов (п=6/68), из них у половины (п=3) обнаружены мутации. У больных, не достигших ПЦО за весь период наблюдения, мутации выявлены в 40,6% (п= 13/32), а у больных, потерявших достигнутый на любом этапе терапии ПЦО, в 25% (п=9/36) (р=0,17). Достоверного различия по частоте выявления мутаций у больных в РХФ и ПХФ, а также с первичной и вторичной резистентностью на терапии иматинибом получено не было.

Таблица 1. Спектр и частота мутаций ВСЯ-АВЬ у больных с неудачей терапии иматинибом и ИТК2

Локализация Мутации N больных Мутации N больных

(иматиниб) (ИТК2)

Р-петля М244У 2 У253Н 1

Е248У 2 Ь248У 2

0250Е 2 0250Е 1

Е255У\К 4 Е255У\К 1

АТФ- Р3111 1 У299Ь 1

У312С 1

Т3151 1 Т3151 1

Р317Ь 2 Р317Ь 5

Каталитический М351Т 1

домен Е355С 2

Р359У 2 Р359У 2

А-петля У3791 1

Н396Я 2

Ь383Р 1

Мутации, влияющие на выбор ИТК2, выявлены в 36,4% (п=8). Среди них Б317Ь (п=2), Т3151 (п=1), вызывающие клинически значимую резистентность при терапии дазатинибом и Е255К (п=4), Б359С (п=2), Т3151 (п=1), вызывающие клинически значимую резистентность при терапии нилотинибом. За время терапии ИТК2 мутации выявлены у 12 больных. У 2 больных обнаружены одновременно 2 клона с мутациями. Спектр мутаций представлен в таблице 1.

Для оценки значения мутаций гена ВСЯ-АВЬ для вероятности прогрессии в продвинутые фазы ХМЛ проведен сравнительный анализ в группе больных с мутациями (п=16) и без мутаций (п=45). Расчет выживаемости проводили от даты проведенного мутационного исследования (Рис И). ВБП достоверно ниже в группе больных с мутациями киназного домена ВСЯ-АВЬ (52 % против 94 %).

0.0 -'--------

О 24 46 72 96 120

Вреш (ыес )

—— М..ТЭЦИ1

- - Без мутаций

Рисунок 11. Сравнительный анализ ВБП при терапии ИТК в зависимости от мутационного статуса ВСЯ-АВЬ.

Проанализировано влияние мутаций гена ВСЯ-АВЬ, выявленных во время терапии иматинибом, на эффективность ИТК2. В анализ включены 47 пациентов, переведенных на ИТК2 по причине резистентности, у которых проведено мутационное исследование на разных этапах терапии иматинибом. Для оценки значения данного фактора выполнен сравнительный анализ вероятности достижения ПЦО и БМО на терапии ИТК2 в группе без мутаций и в группе с мутациями ВСЯ-АВЬ. Вероятность достижения ПЦО в группе с мутациями ВСЯ-АВЬ достоверно не отличалась от таковой в группе без мутаций (77% и 72%). При этом у больных без мутаций наблюдалась тенденция к большей вероятности достижения БМО (69% и 34%).

Проведен дополнительный сравнительный анализ значения мутаций ВСЖ-АВЬ, выявленных во время терапии иматинибом, в группе резистентных к иматинибу и ИТК2 больных. ОВ на терапии ИТК2 у резистентных ко всем ИТК больных с мутациями (п=6) достоверно ниже, чем у больных без мутаций (п=9) (16,7% и 84,6%, р=0,014), при этом 8-летняя ОВ после выявления мутаций на ИТК2 (п=12) составила 30,7% (Рис. 12). Это может свидетельствовать о том, что наличие определенных мутаций гена ВСЯ-АВЬ может быть фактором не только резистентности, но и прогрессии болезни.

Время (мес )

Рисунок 12. ОВ у больных с мутациями, выявленными при терапии

ИТК2.

Сравнительный анализ выживаемости больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аберрациями в зависимости от наличия мутаций гена ВСЛ-АВЬ

ДХА в РЬ-позитивных клетках выявлены у 6 % (п=13/235). Спектр выявленных ДХА в РЬ-позитивных клетках представлен в таблице 2.

Таблица 2. Дополнительные хромосомные аномалии

Дополнительные хромосомные перестройки в РЬ-позитивных клетках (6%, п-13/235)

Тип аномалии Хромосома Число больных

Дупликация РЬ 3

Удвоение 3 1

У 1

8 3

21 1

Делеция 7 1

Инверсия 13 1

Доп.транслокации Ю;7), ((1;15) 2

Сочетание мутаций гена ВСК-АВЬ и ДХА в РЬ-позитивных клетках выявлено у 54% (п=7/13) больных с ДХА. Из 7 больных с сочетанием ДХА и мутаций за все время наблюдения умерло 57% (п=4/7). Больные с ДХА, но без мутаций (п=6) за весь период наблюдения живы все, у одного больного произошла прогрессия в ФА.

1.0

1

100%

о 4

р<0,05

5

К 0,4 С

38%

о.о

24

72

96

120

Время(мес) — мугации+ДХА(п=7) ДХА(п=6)

Рисунок 13. Сравнительный анализ ОВ больных с ДХА и с сочетанием ДХА и мутаций

Сравнительный анализ выживаемости больных с ДХА и с сочетанием ДХА и мутаций (Рис.13) при терапии ИТК за весь период наблюдения показал, что выявление мутаций у больных с ДХА является достоверно значимым фактором, уменьшающим выживаемость, по сравнению с больными, у которых определялись только ДХА (38% против 100%).

1. При терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных в хронической фазе хронического миелолейкоза 12-летняя общая выживаемость и выживаемость без прогрессии до фазы акселерации и властного криза составляет 78,8% и 82,3% соответственно.

2. Длительная терапия иматинибом приводит к редукции лейкемического клона до уровня полного цитогенетического и глубокого молекулярного ответа у 81% и 47% больных соответственно. Достижение полного цитогенетического ответа на любом этапе терапии значительно уменьшает вероятность прогрессии и смерти.

3. Вероятность сохранения цитогенетического ответа после 12 лет терапии иматинибом составляет 51%, применение ингибиторов второго поколения у части больных с отсутствием или потерей цитогенетического ответа при терапии иматинибом позволило увеличить вероятность пребывания

Выводы

в цитогенетическом ответе до 74%. Сохранение полного цитогенетического ответа при терапии иматинибом достоверно выше у больных, достигших снижения уровня экспрессии ВСЯ-АВЬ менее 0,1% через 5 лет терапии.

4. Длительность периода до начала терапии иматинибом более 12 месяцев уменьшает вероятностью достижения полного цитогенетического, глубокого молекулярного ответов, увеличивает вероятность потери ответов, прогрессии и смерти у больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе. Кумулятивная вероятность достижения полного цитогенетического ответа у больных в ранней и поздней хронической фазе хронического миелолейкоза к 10 году терапии составляет 91% и 77 % , а глубокого молекулярного 58% и 39% соответственно.

5. У больных с резистентностью к иматинибу ингибиторы тирозинкиназ второго поколения позволяют получить полный цитогенетический ,большой и полный молекулярные ответы с вероятностью 77%, 45% и 18% соответственно, при этом вероятность достижения ответов достоверно выше у больных, которые потеряли цитогенетический ответ, чем у больных без цитогенетического ответа за весь период терапии иматнибом.

6. Выявление мутаций ВСЯ-АВЬ и дополнительных хромосомных аномалий у больных хроническим миелолейкозом ассоциировано с большей вероятностью прогрессии и смерти. У больных с сочетанием мутаций и дополнительных хромосомных аномалий общая 8-летняя выживаемость составила 38%, а у больных с мутациями, выявленными при терапии ИТК2 -30,7%.

Практические рекомендации

Целесообразно назначение ИТК в ранние сроки после установления диагноза ХМЛ, учитывая значительное преимущество как по частоте достижения ПЦО и БМО, так и по их сохранению.

Молекулярный мониторинг экспрессии ВСЯ-АВЬ позволяет отслеживать динамику изменения опухолевого клона у больных с ПЦО. При длительных сроках терапии иматинибом отсутствие БМО значительно

23

увеличивает вероятность потери ПЦО, поэтому рекомендуется рассмотрение вопроса об интенсификации терапии у данной категории больных.

Переключение на ИТК2 наиболее эффективно у больных с потерей полного цитогенетического ответа на терапии иматинибом, при этом у 41% больных существует вероятность получить цитогенетический ответ на терапии ИТК2 впервые.

Исследование мутаций гена BCR-ABL необходимо выполнять больным с неудачей терапии иматинибом для принятия решения о выборе наиболее эффективного ИТК2, а при неэффективности ИТК2, для рассмотрения вопроса о проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Шухов O.A., Челышева Е.Ю., Гусарова Г.А., Быкова A.B., Туркина А.Г. Оценка эффективности терапии больных хроническим миелолейкозом согласно критериям современных рекомендаций Гематология и трансфузиология. 2014. Т. 59. № S1. С. 75.

2. Шухов O.A., Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Гусарова Г.А., Виноградова О.Ю., Кузнецов C.B., Лазарева О.В., Афанасьева H.A., Горячева С.Р., Иванова Т.В., Колошейнова Т.И., Аксенова Е.В., Мисюрин A.B., Хорошко Н.Д. Характеристика больных хроническим миелолейкозом с резистентностью к терапии иматинибом, у которых выполнено исследование мутаций киназного домена гена bcr-abl Гематология и трансфузиология. 2012. Т. 57. № S3. С. 90.

3. Шухов O.A., Челышева Е.Ю., Абдуллаев А.О., Обухова Т.Н., Туркина А.Г. Молекулярно-цитогенетические факторы неэффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных ХМЛ Медицинская генетика 2015 Т 14 №4 С 82

4. Челышева Е.Ю., Шухов O.A., Лазарева О.В., Туркина А.Г. Мутации киназного домена гена bcr-abl при хроническом миелолейкоз Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2012. Т. 5. № 1.С. 13-21.

5. Абдуллаев А.О., Скоробогатова A.B., Треглазова С.А., Степанова Е.А., Бидерман Б.В., Шухов O.A., Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Судариков А.Б. Количественная оценка уровня транскрипта bcr-abl13151 у больных хроническим миелоидным лейкозом при помощи аллель-специфичной полимеразной цепной

реакции в режиме реального времени Гематология и трансфузиология. 2014. Т. 59. №4. С. 7-11.

6. Гусарова Г.А., Туркина А.Г., Воронцова А.В., Горячева С.Р., Кузнецов С.В., Челышева Е.Ю., Лазарева О.В., Иванова Т.В., Шухов О.А., Быкова А.В., Абдуллаев А.О., Виноградова О.Ю. Отдаленные результаты терапии дазатинибом и анализ особенностей течения плеврального выпота у больных в поздней хронической фазе хронического миелолейкоза после неудачи лечения иматинибом Сибирский научный медицинский журнал. 2014. Т. 34. № 6. С. 2736.

7. Лавров А.В., Смирнихина С.А., Адильгереева Э.П., Челышева Е.Ю., Шухов О.А., Туркина А.Г., Куцев С.И.Анализ транскриптома опухолевых клеток при хроническом миелоидном лейкозе Гематология и трансфузиология. 2014. Т. 59. № S1. С. 49.

8. Лазарева О.В., Туркина А.Г., Гусарова Г.А., Челышева Е.Ю., Захарова Е.С., Шухов О.А., Быкова А.В., Горячева С.Р., Колошейнова Т.И., Иванова Т.В., Тищенко И.А., Куликов С.М. Итоги 12-летней терапии ингибиторами тирозинкиназ больных в поздней хронической фазе хронического миелолейкоза после неудач лечения ифн-а Сибирский научный медицинский журнал. 2015. Т. 35. № 1.С. 90-97.

9. Скоробогатова А.В., Абдуллаев А.О., Степанова Е.А., Шухов О.А., Судариков А.Б. Молекулярная диагностика мутации t3151 у больных хроническим миелоидным лейкозом Гематология и трансфузиология. 2014. Т. 59. № S1. С. 64-65.

10. Смирнихина С.А., Цаур Г.А., Челышева Е.Ю., Яковлева Ю.А., Лавров А.В., Абдуллаев А.О., Бедерак Н.В., Шухов О.А., Солодовников А.Г., Попов A.M., Адильгереева Э.П., Фечина Л.Г., Туркина А.Г., Куцев С.И. Сравнительный анализ использования полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и автоматизированной системы genexpert dx system для оценки экспрессии гена bcr-abl у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, находящихся в большом и полном молекулярном ответе Онкогематология. 2013. № 3. С. 16-21.

11. Fominykh М., Shuvaev V., Martynkevich I., Tsaur G., Bederak N., Chelysheva E., Shukhov O.,. et al. The rate of bcr-abl decline as an optimized predictor of outcome for patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase on treatment with tyrosine kinase inhibitors Haematologica. 2015. T. 100. № SI. C. 444.

12. Lavrov A., Adilgereeva E., Smimikhina S., Chelysheva E., Shukhov O., Turkina A., Kutsev S.Analysis of transcriptome in chronic myeloid leukemia reveals genes and pathways potentially involved in the resistance to tki therapy Haematologica. 2014. T. 99. № SI. C. 607.

25

13. Lazareva O.V., Gusarova G.A., Chelysheva E.Y., Bykova A., Shukhov O.A., Zakharova E.S., Kolosheinova T.I., Kuznetsov S.V., Tishchenko I.A., Kulikov S.M., Turkina A.G. Long-term survival of patients with chronic phase chronic myeloid leukemia receiving tyrosine kinase inhibitors therapy after interferon-alfa failure Haematologica. 2014. T. 99. № SI. C. 604-605.

14. Shukhov O., Chelysheva E., Gusarova G., Abdullaev A., Sudarikov A., Obukhova T., Turkina A. Early switch therapy approach for patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase Haematologica. 2014. T. 99. № SI. C. 604.

15. Shukhov O., Chelysheva E., Gusarova G., Lazareva O., Turkina A. Imatinib treatment in chronic myeloid leukemia patients in early and late chronic phase: current incidence of cytogenetic remission and a very long-term an intention-to-treat analysis Haematologica. 2015. T. 100. № SI. C. 437.

Список сокращений

Ph-хромосома филадельфийская хромосома

БК бластный криз

БМО большой молекулярный ответ

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДХА дополнительные хромосомные аномалии

НТК ингибиторы тирозинкиназ

ИТТС2 ингибиторы тирозинкиназ второго поколения

М04, М04.5 молекулярный ответ со снижением BCR-ABL на 4

или 4,5 log

ОТ-ПЦР реакция обратной транскрипции - полимеразная

цепная реакция

ПМО полный (глубокий) молекулярный ответ

ПХФ поздняя хроническая фаза

пцо полный цитогенетический ответ

РНК рибонуклеиновая кислота

РХФ ранняя хроническая фаза

ФА фаза акселерации

хмл хронический миелолейкоз

ХФ хроническая фаза

Шухов Олег Александрович

Молекулярная и цитогенетическая характеристика Ph-позитивного клона у больных хроническим миелолейкозом при длительном воздействии ингибиторов тирозинкиназ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата мед. наук

Подписано в печать 10.08.2015. Заказ № 398

Формат 60x90/16 Тираж 100 экземпляров

ООО «Копимастер»

ИНН 7721282097

КПП 772101001

Г. Москва, Рязанский пр., дом №10

+7(495)229-56-62