Молекулярно-генетическая диагностика и мониторинг терапии хронического миелоидного лейкоза

Вельченко, Мария Владимировна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярно-генетическая диагностика и мониторинг терапии хронического миелоидного лейкоза

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Вельченко, Мария Владимировна Ростов-на-Дону 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Молекулярно-генетическая диагностика и мониторинг терапии хронического миелоидного лейкоза

003474230

На правах рукописи

ВЕЛЬЧЕНКО Мария Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО

ЛЕЙКОЗА

14.00.14 - онкология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2009

2 5 ад ад

003474230

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители: - доктор медицинских наук, профессор

Ю. В. Шатохин - кандидат медицинских наук, доцент С. И. Куцев

Официальные оппоненты: - доктор медицинских наук, профессор

И. Б. Лысенко

- доктор биологических наук, профессор Т. П. Шкурат

Ведущая организация: ФГУ Федеральный научно-клинический

центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава

Защита состоится " ^^" 2009 г. в ^ часов на заседании совета

по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.083.01 при ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий».

Автореферат разослан". _ 2009 года

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций, /

член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор / Г.А. Неродо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Хронический миелоидный лейкоз (XMJI) -клональное миелопролиферативное заболевание, для которого характерна специфическая приобретенная генетическая аномалия - «филадельфийская хромосома» (Ph-хромосома). Ph-хромосома возникает в результате реципрокной транслокации между 9 и 22 хромосомами, образуя химерный онкоген BCR-ABL. На момент клинической и гематологической манифестации хронического миелоидного лейкоза обычно в костном мозге при цитогенетическом исследовании выявляется 95-100% Ph-положительных клеток (Kantarjian Н., Talpaz М., Giles F. et al., 2006; Branford S., 2007; Goldman J. M., 2007).

Заболеваемость хроническим миелоидным лейкозом составляет 1-1,5 случая на 100 000 населения в год (15%-20% от всех случаев гемобластозов у взрослых) (Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и соавт., 2005). Высокая социальная значимость хронического миелоидного лейкоза обусловлена преимущественным поражением людей трудоспособного возраста: пик заболеваемости наблюдается в 30-50 лет.

Современная терапия XMJI препаратом иматиниба мезилат, относящегося к группе противоопухолевых ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназ, позволяет добиться значительного подавления опухолевого клона клеток и восстановить нормальное кроветворение, что приводит к значительному увеличению бессобытийной выживаемости больных. Полный цитогенетический ответ, при котором в гемопоэтических клетках не выявляется Ph-хромосома, является стандартным критерием эффективности терапии больных хроническим миелоидным лейкозом, определяющим благоприятный прогноз заболевания (Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и соавт., 2005; Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова О.Ю. и соавт., 2007; Goldman J. М., 2007).

Несмотря на впечатляющие результаты терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом, у 15-20% пациентов отсутствует ответ на

это лечение. Эту группу пациентов определяют как группу рефрактерных к терапии иматинибом пациентов (Shah N.P., 2007). Помимо этого, примерно 4% пациентов, получающих лечение иматинибом, ежегодно "теряют" ответ на эту терапию, что закономерно приводит к появлению клинико-гематологических признаков прогрессии XMJ1. В настоящее время считают, что основной причиной потери ответа в 42% - 90% случаев являются мутации киназного домена гена BCR-ABL (Baccarani M., Saglio G., Goldman J., Hochhaus A., et al.,

2006). Роль мутаций в развитии вторичной резистентности хорошо изучена, в то время как роль мутаций в развитии рефрактерности требует уточнения. Недостаточно изучена взаимосвязь между выявляемыми у больных хроническим миелоидным лейкозом мутациями и развитием рефрактерности к терапии.

2007). При этом, у большинства больных сохраняется многолетняя клинико-гематологическая и цитогенетическая ремиссия заболевания, а у некоторых -развивается рецидив патологического процесса. Это позволяет предположить, что остаточная болезнь, определяемая по количеству BCR-ABL позитивных клеток, не является единственным прогностическим фактором, определяющим вероятность развития рецидива хронического миелоидного лейкоза и вторичной резистентности к терапии иматинибом. Вероятно, только сочетание определенного уровня опухолевых клеток с характером приобретенных мутаций гена BCR-ABL является решающим прогностическим фактором, определяющим эффективность терапии иматинибом.

Учитывая вышеизложенное, мы поставили целью исследования:

Оценить клинико-прогностическую значимость молекулярно-генетических исследований в диагностике хронического миелоидного лейкоза и

детекции минимальной остаточной болезни, а так же - в анализе характера мутаций киназного домена гена ВСЯ-АВЬ у больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих лечение иматинибом.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить информативность метода количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени в диагностике и мониторинге эффективности терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом.

2. Оценить достоверность исследования минимальной остаточной болезни при терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом по сравнению с цитогенетическим исследованием.

3. Оценить информативность различных способов выражения результатов количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени по отношению к результатам цитогенетического исследования.

4. Определить уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ характерный для развития рефрактерности и для оптимального ответа на проводимую терапию иматинибом.

5. Определить факторы, ассоциирующиеся с развитием рефрактерности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом.

6. Оценить вклад мутаций киназного домена гена ВСЯ-АВЬ в формирование первичной резистентности у пациентов с хроническим миелолейкозом к терапии иматинибом.

Научная новизна исследования

• Впервые на основе данных количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и данных цитогенетического исследования костного мозга произведена характеристика минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелоидным лейкозом, проживающих на юге России.

• Сопоставлены различные способы выражения результатов количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и данные цитогенетических исследований костного мозга, оценена их клинико-прогностическая значимость.

• Определены факторы, ассоциирующиеся с развитием рефрактерности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом.

• Дана характеристика спектра и частоты мутаций гена ВСЯ-АВЬ у рефрактерных к терапии иматинибом пациентов.

Практическая значимость Установлено, что определение уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ значительно повышает достоверность оценки минимальной остаточной болезни при терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом. На основании сопоставления результатов цитогенетического исследования и метода количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени установлен прогностически значимый уровень экспрессии гена ВСЯ-АВЬ для развития рефрактерности и уровень экспрессии, ассоциированный с успешным ответом на проводимую терапию хронического миелоидного лейкоза. Установлен наиболее информативный способ выражения результатов количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Определена значимость мутационного анализа гена ВСЯ-АВЬ в оптимизации и индивидуализации терапии хронического миелоидного лейкоза.

Основное положение, выносимое на защиту Целесообразность молекулярно-генетической диагностики и мониторинга терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом.

Апробация работы

Диссертация апробирована на совместной конференции кафедры гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС РостГМУ и кафедры патологической анатомии, судебной медицины и генетики ФПК и ППС РостГМУ 5 мая 2009 года.

Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Высокотехнологичные методы диагностики и лечения сердечно-сосудистых и эндокринных заболеваний» (20-21 сентября 2007 года, г. Санкт-Петербург), на II ежегодной научно-практической конференции ЮФО «Диагностика и мониторинг эффективности терапии XMJI в ЮФО» (14 декабря 2007 года, г.Ростов-на-Дону), на XX Интернациональном Конгрессе генетиков (12-17 июля 2008 года, г. Берлин, Германия), на Европейском Конгрессе Генетиков 2008 (31 мая - 3 июня, 2008 год, г. Барселона, Испания), на III ежегодной научно-практической конференции ЮФО «Диагностика и мониторинг эффективности терапии XMJI в ЮФО» (13-14 декабря 2008 года, г.Кисловодск), на VI Симпозиуме с международным участием «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (29-31 января 2009 года, г. Москва).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ в отечественной и зарубежной литературе.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах, состоит из введения, обзора литературы, характеристики клинического материала, методов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя литературы, включающего 142 источника литературы. Работа содержит 9 таблиц и 40 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика клинического материала и методов исследования

Материалом для данной работы являются результаты лабораторных обследований 150 пациентов с Ph-положительным хроническим миелоидным лейкозом в хронической фазе. Исследования проводились в Ростовском государственном медицинском университете на базе лаборатории медицинской генетики с 2005 по 2008 год.

Обследованные пациенты были разделены на 4 группы в зависимости от эффективности лечения иматинибом в соответствии с критериями ELN (Baccarani М., Saglio G., Goldman J. et al., 2006).

Первую группу составили 30 пациентов (12 мужчин и 18 женщин) с вновь установленным диагнозом XMJI до начала терапии иматинибом. В этой группе пациентов медиана возраста составила 42,5 года (от 23 до 61 года).

Вторую группу составили 40 пациентов (19 мужчин и 21 женщина) с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Отбор пациентов в эту группу осуществлялся согласно критериям оптимального ответа на терапию иматинибом, предложенным в 2006 году European LeukemiaNet. У пациентов входящих в эту группу за 12 месяцев непрерывной терапии иматинибом был достигнут полный цитогенетический ответ. Медиана возраста пациентов в группе с оптимальным ответом на терапию иматинибом составила 44,5 года (от 22 до 63 лет). Медиана длительности наблюдения в этой группе составила 11 месяцев (от 8 до 20 месяцев), а продолжительности приема иматиниба -11 месяцев (от 8 до 20 месяцев). Медиана времени с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом в группе пациентов с оптимальным ответом составила 9,4 месяцев (от 1 до 20 месяцев). Суточная доза иматиниба в этой группе пациентов за время наблюдения составила 415 мг/сут.

Третью группу составили 45 пациентов (24 мужчины и 21 женщина) с субоптимальным ответом на терапию иматинибом в соответствии с рекомендациями European LeukemiaNet (М. Baccarani et al., 2006). В эту группу были включены пациенты с частичным цитогенетическим ответом (Ph-позитивных клеток в костном мозге от 1% до 35%) - 20 пациентов, с малым цитогенетическим ответом (Ph-позитивных клеток в костном мозге от 36% до 65%) - 20 пациентов и минимальным цитогенетическим ответом (Ph-позитивных клеток в костном мозге от 66% до 94%) - 5 пациентов. В этой группе пациентов медиана возраста составила 44 года (от 20 до 60 лет). Медиана длительности наблюдения в данной группе пациентов - 10 месяцев (от 6 до 18 месяцев), а продолжительности беспрерывной терапии иматинибом

- 8,3 месяцев (от 4 до 12 месяцев). Медиана времени с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом составила 9 месяцев (от 0 до 21 месяца). В этой группе пациентов суточной дозы иматиниба за время наблюдения составила 420 мг/сут.

Четвертая группа - 35 пациентов (15 мужчин и 20 женщин) рефрактерных к терапии иматинибом. У пациентов, входящих в эту группу, непрерывная терапия иматинибом в течение не менее 6 месяцев оказалась неэффективной: отсутствие какого-либо цитогенетического ответа (Ph>95%) к 6-ому месяцу терапии, менее чем, частичный цитогенетический ответ (Ph>35%) к 12-ому месяцу терапии, отсутствие полного цитогенетического ответа (Ph>l%) к 18-ому месяцу непрерывной терапии иматинибом.

В группе рефрактерных к иматинибу пациентов медиана возраста составила 42,8 года (от 22 до 61 года). Медиана длительности наблюдения в данной группе пациентов - 18,3 месяцев (от 8 до 51 месяца), а продолжительности беспрерывной терапии иматинибом - 19,6 месяцев (от 8 до 48 месяцев). Медиана времени с момента постановки диагноза до начала приема иматиниба в группе рефрактерных к иматинибу пациентов составила 32,2 месяца (от 0 до 120 месяцев). В группе рефрактерных к иматинибу пациентов суточной дозы иматиниба в течение наблюдаемого периода составила 430 мг/сут.

Стандартное цитогенетическое исследование. Диагноз Ph-позитивного хронического миелоидного лейкоза был поставлен на основании результатов цитогенетического исследования клеток костного мозга. Стандартное цитогенетическое исследование проводилось методом культивирования клеток с G-дифференциальной окраской хромосом. Кариотипирование G-окрашенных метафаз проводилось с помощью микроскопа Аксиоплан-2-мот («Carl Zeiss») и программного обеспечения ikaros («Metasystems»). При отсутствии достаточного количества метафаз при цитогенетическом исследовании диагноз подтверждали методом флуоресцентной гибридизации хромосом in situ (FISH) с использованием ДНК-зонда к BCR-ABL.

Количественная оценка экспрессии химерного онкогена BCR-ABL типа р210. Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени технологии TaqMan проводилась в термоциклере Rotor-Gene 6000 версии 1.7 («Corbett Life Science», Австралия). Для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени использовались наборы реагентов ОНКОСКРИН 1-1-Q, ООО «ГеноТехнология», разработанные с учетом рекомендаций протокола стандартизации «Европейской программы против рака» (Gabert J. et al., 2003).

В качестве контрольного гена использовали ген ABL. Для каждого образца проводились две независимые полимеразные цепные реакции: для количественного определения гена BCR-ABL и гена ABL. Относительную экспрессию химерного гена BCR-ABL по данным количественной ПЦР в реальном времени определяли тремя способами. Первый способ: экспрессия гена BCR-ABL определялась как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное на 106. Коэффициент 10б является эмпирическим и используется для удобства представления результатов экспрессии гена. Второй способ: относительная экспрессия гена BCR-ABL в-образце определялась как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженной на 100%. Для определения экспрессии гена BCR-ABL третьим способом был определен базовый уровень экспрессии гена BCR-ABL.

Определение первичной последовательности гена BCR-ABL методом прямого ДНК секвенирования. Мутационный анализ проводился методом прямого ДНК секвенирования. Реакция прямого ДНК секвенирования проводилась с использованием геномной ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови, и кДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции тотальной РНК.

Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК проводилась в амплификаторе "Biometra" (BIOMETRA biomedizinische Analytik GmbH). Для амплификации интересующих фрагментов гена ABL были использованы две

пары праймеров. С помощью первой пары праймеров амплифицировали участок длиной 492пн (150 996 ... 151 488), а с помощью второй пары праймеров участок гена ABL длиной 495пн (160 826 ... 161 321).

Полимеразная цепная реакция синтеза кДНК проводилось в амплификаторе РТС 100 («Bio-Rad»), Амплификация интересующего фрагмента гена ABL производилась в два этапа. На первом этапе амплификации использовался 5'BCR праймер и 3'ABL праймер, на втором этапе - только праймеры к гену ABL (Branford S., Hughes Т., 2006). Подобный метод двухэтапной ПЦР позволяет значительно увеличить чувствительность используемой методики. На первом этапе амплифицировался участок длиной 1504 пн (в случае варианта Ь2а2 гена BCR-ABL) или 1579 пн (при варианте Ь3а2). На втором этапе с помощью праймеров к гену ABL амплифицировали фрагмент гена длиной 863 пн, кодирующий Р-петлю, С-спираль, область 8Н2-контакта, А-петлю в BCR-ABL тирозинкиназе (Branford S., Hughes Т., 2006).

Для определения нуклеотидной последовательности использовали наборы GenomeLab™Methods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing («Beckman Coulter»). Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК и кДНК проводили методом капиллярного электрофореза на автоматическом генетическом анализаторе Beckman Coulter CEQ8000. Анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения Beckman Coulter CEQ8000. Результаты исследования мутаций гена ABL изученных образцов пациентов с хроническим миелоидным лейкозом сравнивали с контрольной последовательностью нуклеотидов гена ABL дикого типа.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 электронных таблиц Excel 2003 и включала в себя определение медианы, минимальных и максимальных значений, коэффициента корреляции. Для оценки достоверности

различий применялись критерий Стьюдента. Для сравнения бинарных данных использовались точный критерии Фишера и %2.

Результаты исследования Исследование минимальной остаточной болезни у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом. Для возможности выражения результатов количественной ПЦР в режиме реального времени в виде десятичного логарифма (Alog) снижения относительной экспрессии гена BCR-ABL по отношению к базовому уровню нами был использован методический подход с определением диагностического (или базового) уровня экспрессии (Hughes Т., Kaeda J., Branford S. et al., 2003).

Экспрессия гена BCR-ABL была определена y 30 больных с впервые диагностированным хроническим миелоидным лейкозом до начала терапии. Диапазон вариабельности этого показателя составил от 9118 до 501189 копий ВС11-АВЬх106/копий ABL. Медиана экспрессии гена BCR-ABL у этих больных с впервые выявленным хроническим миелоидным лейкозом была принята за величину базового уровня (БУ). Значение базового уровня составило 94211 копий BCR-ABLx 106/копий ABL, или 4,97 log.

В настоящее время «золотым стандартом» для оценки объема остаточной опухолевой массы у больных с хроническим миелоидным лейкозом является цитогенетическое исследование, а цитогенетический ответ - важнейшим критерием эффективности терапии. Более чувствительный метод ПЦР в режиме реального времени также предназначен для оценки объема остаточной опухоли при XMJ1. Поэтому важным является вопрос о сопоставимости результатов этих двух исследований.

Мы определили степень корреляции между результатами стандартного цитогенетического анализа и результатами количественной ПЦР в реальном времени. В случае выражения результатов молекулярно-генетического исследования в абсолютных числах копий BCR-ABLx 10б/копий ABL и в процентном соотношении к экспрессии контрольного гена ABL коэффициент корреляции составил 0,54. В случае же выражения результатов в виде

десятичного логарифма (Alog) снижения экспрессии по отношению к базовому уровню коэффициент корреляции составил -0,83. Полученные нами результаты свидетельствует о высокой степени корреляции результатов цитогенетического и молекулярного исследования.

В рамках нашего исследования мы провели сопоставление результатов стандартного цитогенетического исследования и молекулярного исследования выраженного в процентном соотношении к экспрессии контрольного гена ABL в исследуемых группах пациентов (пациенты с оптимальным ответом на терапию иматинибом, с субоптимальным ответом и рефрактерных к терапии иматинибом). В проведенном нами исследовании в группе пациентов с полным цитогенетическим ответом медиана экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови составила 0,1%, максимальное значение экспрессии гена - 0,57%, а минимальное значение составило 0%. В группе пациентов, где по данным цитогенетического исследования Ph-хромосома обнаруживалась от 1% до 95% клеток костного мозга, медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 4,6%, максимальное значение экспрессии соответствовало 53,6%, а минимальное - 0,04%. При обнаружении Ph-хромосомы в более чем 95% клеток костного мозга, медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 16%, максимальное значение - 62,4%, а минимальное 0,7% (табл. 1).

Таблица 1

Уровень экспрессии гена BCR-ABL (%) в исследуемых группах _пациентов_

Молекулярный ответ Цитогенетический ответ

Экспрессия гена BCR-ABL (копии гена BCR-ABLx 100%/копии гена ABL) Ph-хромосома 0% (п=40) Ph-хромосома в 1-95% клеток (п=45) Ph-хромосома в > 95% клеток (п=35) Р

Медиана % 0,1 4,6 16 <0,05

Максимальное значение % 0,57 53,6 62,4 <0,05

Минимальное значение % 0 0,04 0,7 <0,05

Различия в уровнях экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови определяемое методом количественной ПЦР в реальном времени и выраженное в процентном соотношении к контрольному гену между тремя рассматриваемыми группами статистически достоверны (р>0,05).

Таким образом, в нашем исследовании в случаях обнаружения Ph-хромосомы более чем в 1% клеток костного мозга, уровень экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови был более 1%. В тех случаях, когда при помощи стандартного цитогенетического исследования оценка остаточного опухолевого клона была невозможна, экспрессия гена BCR-ABL составляла <0,1%.

При изучении минимальной остаточной болезни методом количественной ПЦР в реальном времени в рамках нашего исследования в группе пациентов (п=40) с оптимальным цитогенетическим ответом в 25% случаев (п=10) был обнаружен полный молекулярный ответ (0 копий BCR-ABLxl 06/копий ABL). В 75% случаев (п=30) был обнаружен остаточный опухолевый клон клеток. В группе пациентов с обнаруженным остаточным опухолевым клоном клеток медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL составила 1326 копий BCR-ABLxl 06/копий ABL. Минимальное значение экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с полным цитогенетическим ответом составило 112 копий BCR-ABLxl0б/копий ABL, а максимальное - 5753 копий BCR-ABLxlO6/ копий ABL.

Среди пациентов с полным цитогенетическим ответом медиана экспрессии гена BCR-ABL по данным количественной ПЦР в реальном времени составила 1047 копий BCR-ABLxl0б/копий ABL. Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в этой группе пациентов составил от 0 до 5753 копий BCR-ABLxl06/KonHtt ABL.

Следующая группа пациентов (п=45) в нашем исследовании включала больных хроническим миелоидным лейкозом с субоптимальным ответом на терапию иматинибом. В группе пациентов с цитогенетическим ответом, у которых Ph-хромосома выявлялась в 1-95% клеток костного мозга медиана

экспрессии гена BCR-ABL составила 46029 копий BCR-ABLx 106/копий ABL, максимальное значение 536205 копий ВСЯ-АВЬх106/копий ABL, минимальное -428 копий BCR-ABLx 106/копий ABL.

Третья группа состояла из пациентов (п=35) с хроническим миелоидным лейкозом, не достигших цитогенетического ответа на терапии иматинибом. В случае выявления Ph-хромосомы в более чем 95% клеток, медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 161104 копий BCR-ABLx 106/копий ABL, максимальное значение экспрессии гена BCR-ABL составило 624487 копий BCR-ABLxl06/Konnfl ABL, а минимальное 7150 копий BCR-ABLx 106/копий ABL (табл. 2).

Таблица 2

Уровень экспрессии гена BCR-ABL (копии гена BCR-ABLxl 06/копии

гена ABL) в исследуемых группах пациентов

Молекулярный ответ Цитогенетический ответ

Экспрессия гена BCR-ABL (копии гена BCR-ABLx 10б/копии гена ABL) Ph-хромосома 0% (п=40) Ph-хромосома в 1-95% клеток (п=45) Ph-хромосома в > 95% клеток (п=35)

Медиана 1047 46029 161104

Максимальное значение 5753 536205 624487

Минимальное значение 0 428 7150

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что данных стандартного цитогенетического исследования (чувствительность 1:10"2 клеток) может быть недостаточно для суждения о степени полноты ответа на терапию.

В исследовании нами была изучена структура молекулярного ответа между рассматриваемыми группами. При сопоставлении процента РЬ-положительных клеток в костном мозге и экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови выяснилось, что, несмотря на широкий диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL, различие между медианами уровня экспрессии в исследуемых группах статистически достоверно. Медиана

снижения уровня экспрессии ВСЯ-АВЬ относительно базового уровня экспрессии в случае полного цитогенетического ответа составляла 3,64 Д1о§, в случае выявления РИ-хромосомы в 1-95% клеток костного мозга - 0,95 Д1о§, при выявлении РЬ-хромосомы более чем в 95% клеток - -0,003 Д1о§.

При анализе структуры молекулярного ответа было установлено, что в группе пациентов с полным цитогенетическим ответом (РЬ-хромосома не обнаруживается в клетках костного мозга) в 53% случаев отмечалось снижение экспрессии ВСЛ-АВЬ более чем на 3 Д1о§ по сравнению с базовым уровнем, в 25% случаев - на 2-2,99 Д1о§, в 22% случаев - на 1-1,99 Д1о§, в 0% случаев -менее чем на 1 Д1о§. Таким образом, у большинства больных с полным цитогенетическим ответом (78%) было отмечено снижение экспрессии ВСЯ-АВЬ более чем на 2 Д1о§ по сравнению с базовым уровнем (рис. 1).

11« ■ 33%

111

37%

к*!***

нН ш 22%

РИ >95% РЬ= 1-95% РЬ=0%

цитогенетическим ответ

Рис. 1. Структура молекулярного ответа в исследуемых группах пациентов.

В группе пациентов, у которых РЬ-хромосома обнаруживается в 1-95% клеток костного мозга, в 16% случаев отмечалось снижение экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в клетках периферической крови на 2-2,99 Д1о§ по сравнению с базовым уровнем, в 37% случаев - на 1-1,99 Д1о§, в 47% случаев - менее чем на 1 Д^.

В группе пациентов, не ответивших на терапию иматинибом, то есть Ph-хромосома обнаруживалась более чем в 95% клеток костного мозга, во всех случая (100%) преобладало снижение экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови менее чем на 1 Alog по сравнению с базовым уровнем. Все различия статистически достоверны (р<0,05).

За время наблюдения у 70 пациентов с хроническим миелоидным лейкозом из 150 обследованных нами было проведено динамическое наблюдение за минимальной остаточной болезнью методом количественной ПЦР в реальном времени. Повторное молекулярно-генетическое исследование экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови проводилось в среднем через 6 месяцев (минимальный интервал повторного исследования 3 месяца, максимальный 12 месяцев). У 38 пациентов наблюдалось снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови, из них у 61% пациентов было отмечено снижение уровня экспрессии более чем на 2 log относительно предыдущего результата.

Из 10 пациентов, у которых наблюдалась отрицательная динамика ответа на терапию иматинибом, у 8 (80%) пациентов было отмечено повышение уровня экспрессии гена BCR-ABL более чем на 1 log относительно предыдущего результата. У 7 пациентов, из числа изучаемых, наблюдался стабильно низкий уровень (большой молекулярный ответ) экспрессии гена BCR-ABL. Стабильно высокий уровень экспрессии гена BCR-ABL наблюдался у 15 пациентов, несмотря на проводимую терапию иматинибом, медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL составила 3,8 log, максимальное значение -4,2 log, минимальное - 3 log.

Стабильность уровня экспрессии гена BCR-ABL при повторных исследованиях, несмотря на то, что некоторые из них были проведены через три месяца, а некоторые через 6 и более месяцев говорит в пользу мониторирования молекулярным методом минимальной остаточной болезни с интервалом между исследованиями 3 месяца. Отсутствие снижения экспрессии

гена ВСЯ-АВЬ свидетельствует о рефрактерности к проводимой терапии иматинибом.

Анализ рефрактерности у пациентов с ХМЛ. Среди наблюдаемых пациентов наибольших интерес, с нашей точки зрения, представляли рефрактерные к терапии иматинибом пациенты, как достаточно многочисленная и наименее изученная когорта больных (Кагйафап Н., 2006).

Выполненное нами сравнительное исследование группы рефрактерных к иматинибу пациентов с группой пациентов достигших оптимального ответа на терапию иматинибом не позволяли выявить связь между развитием резистентности к терапии ХМЛ иматинибом и возрастом, полом, а так же принимаемой дозой иматиниба больными ХМЛ (р>0,05).

Однако при сравнении длительности периода с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом, а так же, соотношения пациентов, находящихся в ранней хронической фазе и поздней хронической фазе на момент начала терапии иматинибом в группе рефрактерных к иматинибу пациентов и группе пациентов с оптимальным ответом на лечение иматинибом, выявлены статистически значимые различия (р<0,01).

У рефрактерных к иматинибу пациентов медиана времени с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом составила 32,2 месяца (от 1 до 120 месяцев). В этой группе пациентов в поздней хронической фазе на момент начала терапии иматинибом находились 22 человека (62%), в ранней хронической фазе - 13 человек (38%). У больных с оптимальным ответом на терапию иматинибом медиана времени с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом составила 9,4 месяцев (от 1 до 39 месяцев). На момент начала терапии иматинибом 9 пациентов (23%) находились в поздней хронической фазе, 31 пациент (77%) в ранней хронической фазе.

Соотношение пациентов с интервалом времени более 24 месяцев с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом, и менее 24 месяцев, в группе пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом и группе пациентов рефрактерных к иматинибу имели

статистически значимые различия (р<0,01). Продолжительность периода от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом более 24 месяцев в группе рефрактерных к иматинибу пациентов наблюдалась у 18 пациентов (52%), менее 24 месяцев - у 17 пациентов (48%). Аналогичные показатели у больных ХМЛ с оптимальным ответом на терапию иматинибом были, соответственно, у троих пациентов (8%) и у 37 пациентов (92%) (табл. 3).

Таблица 3

Длительность периода от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом в группе рефрактерных к иматинибу пациентов и

пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом

группа пациентов медиана длительности от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом >24 месяцев от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом <24 месяцев от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом ПХФ на момент начала терапии иматинибом РХФ на момент начала терапии иматинибом

группа рефрактерных пациентов п=35 32,2 месяца 18 пациентов (52%) 17 пациентов (48%) 22 пациента (62%) 13 пациентов (38%)

группа пациентов с оптимальным ответом на терапию п=40 9,4 месяца 3 пациента (8%) 37 пациентов (92%) 9 пациентов (23%) 31 пациент (77%)

Р <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

Нами также была определена возможная роль предшествующей иматинибу терапии препаратами гидроксимочевины в формировании резистентности к иматинибу. Так, в группе пациентов рефрактерных к иматинибу медиана длительности предшествующей терапии гидреа составила 32,4 месяца (от 1 до 136 месяцев). Предшествующая терапия имела место у 34 пациентов (96,8%), а отсутствовала только у одного. Медиана продолжительности предшествующей терапии в группе пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом составила 8,2 месяцев (от 1 до 32 месяцев). Непосредственно с момента постановки диагноза 12 пациентов

(31%) получали иматиниб, а 28 пациентов (69%) имели предшествующую терапию. Статистический анализ показал, что длительность предшествующей иматинибу терапии в этих двух группах имеет статистически значимое различие (р<0,05). Однако сам факт терапии гидреа не определял развитие резистентности к лечению гливеком (р>0,05).

Таким образом, по результатам проведенного нами исследования длительность периода с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом и продолжительность предшествующей иматинибу терапии гидроксимочевиной играют существенную роль в развитии рефрактерности.

Анализ рефрактерности у пациентов с ХМЛ с мутациями гена ВС11-АВЬ и без мутаций. Ряд исследователей обнаружили связь между появлением мутаций гена ВСЛ-АВЬ и фазой заболевания, предшествующей иматинибу терапии, длительностью заболевания на момент начала терапии иматинибом (Вгапйич! Б. е1 а1., 2003; ДаЬЬоиг Е. е1 а1., 2006; Боуспш Б. ^ а1., 2006). В связи с этим в нашем исследовании проведен поиск возможной ассоциации таких факторов, как возраст, пол, фазы ХМЛ и ее длительности, особенности терапевтического режима (предшествующая иматинибу терапия, средняя суточная доза иматиниба, длительность терапии иматинибом) с появлением мутаций у рефрактерных к иматинибу пациентов.

По результатам выполненного исследования риск обнаружения мутаций у рефрактерных к иматинибу пациентов одинаков для мужчин и женщин и не связан с возрастом пациентов.

Проведенные исследования показали, что время с момента постановки диагноза ХМЛ до начала терапии иматинибом, длительность заболевания, факт наличия или отсутствия предшествующей иматинибу терапии, суточная доза иматиниба и длительность терапии не является фактором ассоциирующимся с появлением мутаций в группе рефрактерных к иматинибу пациентов (р>0,05).

Анализ мутаций гена ВСЯ-АВЬ резистентных к терапии иматинибом пациентов с ХМЛ. Мутационный анализ был проведен у 23 пациентов, мутации были обнаружены у 5 (21,7%) больных ХМЛ в

5 различных аминокислотных остатках (М244, Ь248, М351, Р359, Т315), двое пациентов имели компаунд мутации (М244У + М351Т , Ь248У + Р359С) (рис.2).

Ь248У М244У М351Т Т3151 Р359С

Рис. 2. Электрофореграмма обнаруженных мутаций

В проведенном нами исследовании мутационного профиля гена ВСЯ-АВЬ у рефрактерных к иматинибу пациентов мутации Р-петли (М244У, Ь248У) были обнаружены в 57% мутаций (п=4), мутация ТЗ151 в 14% (п=1), мутация М351Т - в 14% (п=1).

Результатом проведенного исследования стало обнаружение мутаций в положениях М244, Ь248, М351, Р359, Т315 у пяти рефрактерных к иматинибу пациентов.

Проведенные нами исследования показали, что мутации киназного домена гена ВСТАВЬ являются причиной первичной резистентности значительно реже, чем вторичной. Среди выявленных нами пациентов с первичной резистентностью превалировали больные ХМЛ с мутациями Р-петли (Т3151 и М351Т), что соответствовало частоте обнаружения этих мутаций среди вторично резистентных пациентов.

Известно, что выявленные нами мутации М244, Ь248, М351, Р359, (кроме Т315) приводят к невысокому уровню резистентности и являются частой причиной субоптимального ответа на терапию иматинибом. Однако у всех наблюдаемых пациентов с указанными мутациями отсутствовал какой-либо цитогенетический ответ на терапию иматинибом. В двух случаях это возможно объяснить наличием компаунд мутаций (М244У + М351Т, Ь248У + Р359С).

В двух других наблюдаемых случаях полное отсутствие цитогенетического ответа можно объяснить совокупностью дополнительных причин, усугубляющих резистентность, вызванную мутациями (пример обнаружения мутаций представлен на рис. 3).

Рис. 3. Динамика цитогенетического ответа и лабораторных показателей пациента с обнаруженными мутациями гена ВСИ-АВЬ

Сравнительный анализ определения первичной последовательности ДНК и кДНК. С целью повышения точности мутационного анализа в выявлении изменений нуклеотидной последовательности гена ВСЯ-АВЬ нами проведено сравнение эффективности определения первичной последовательности как с геномной ДНК, так и комплементарной кДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции РНК.

Результатом проведенного мутационного анализа кДНК стало обнаружение 7 мутаций (у двоих пациентов обнаружено по две мутации, у трех пациентов - по одной), а результатом проведенного мутационного исследования геномной ДНК - 5 мутаций (у одного пациента обнаружено две мутации, у троих пациентов - по одной). Определение первичной

последовательности кДНК более информативно в виду того, что на первом этапе выделяется тотальная РНК, в которой доля РНК гена BCR-ABL превалирует в связи с повышенной экспрессии этого гена в лейкозных клетках (Branford S., Hughes Т., 2006).

Также с целью повышения точности мутационного анализа в выявлении изменений нуклеотидной последовательности гена BCR-ABL нами проведено сравнение эффективности реакции определения первичной последовательности кДНК как прямой последовательности анализируемого участка, так и обратной. В результате выполненного исследования у трех пациентов результаты анализа прямой последовательности не совпали с результатами, полученными при анализе обратной последовательности.

Таким образом, для обнаружения мутаций гена BCR-ABL более эффективно использование кДНК. Проведенные нами исследования так же показали необходимость определения структуры ДНК анализируемого участка гена как прямой, так и обратной последовательности с целью повышения достоверности получаемых результатов.

ВЫВОДЫ

1. Применение количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, в сочетании со стандартным цитогенетическим исследованием, значительно повышает информативность и достоверность лабораторных критериев диагностики и оценки эффективности терапии хронического миелоидного лейкоза.

2. Определение уровня экспрессии гена BCR-ABL значительно повышает достоверность оценки минимальной остаточной болезни при терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом по сравнению с цитогенетическим исследованием. Установлено, что у 75% больных с полным цитогенетическим ответом отмечается персистирование опухолевого клона.

3. Результаты количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, выраженные в виде десятичного логарифма снижения экспрессии

(Alog) по отношению к базовому уровню, корелируют с результатами стандартного цитогенетического исследования в наиболее высокой степени (г=-0,83).

4. Снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL менее чем на 1 log по сравнению с базовым уровнем экспрессии свидетельствует о развитии резистентности к проводимому лечению иматинибом. Снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log относительно базового уровня ассоциируется с успешным ответом на проводимую терапию XMJI (р<0,05).

5. Развитие рефрактерности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом обусловлено началом терапии в позднюю хроническую фазу (более 12 месяцев с момента постановки диагноза) (р<0,01).

6. Мутации киназного домена гена BCR-ABL обнаруживаются у 21,7% пациентов с первичной резистентностью к терапии иматанибом и являются одним из значимых факторов в ее развитии. Среди обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL мутации Р-петли обнаруживаются в 57% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для мониторинга минимальной остаточной болезни в динамике оптимально производить исследование с помощью количественной ПЦР в реальном времени 1 раз в 3 месяца.

Стабильно высокий уровень и/или нарастание экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови в динамике, при полном цитогенетическом ответе, является показанием к проведению цитогенетического исследования для исключения развития цитогенетического рецидива; при этом также необходимо проводить обследование на предмет выявления мутаций киназного домена BCR-ABL для решения вопроса о возможном изменении тактики терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вельченко М.В. Предварительные результаты терапии Гливеком хронического миелолейкоза на юге России / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, М.В. Вельченко, Ю.В. Шатохин, Е.В. Бурнашев, C.B. Морданов // Материалы V Симпозиума "Биологические основы терапии онкологических заболеваний». -Москва, 2007. - С. 12.

2. Вельченко М.В. Анализ мутаций гена BCR-ABL киназного домена иматиниб резистентных пациентов с хроническим миелоидным лейкозом / С.И. Куцев, М.В. Вельченко, А.Н. Зельцер, C.B. Морданов, Ю.В. Шатохин, Е.В. Бурнашева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Высоко технологичные методы диагностики и лечения сердечно-сосудистых и эндокринных заболеваний». - Санкт-Петербург, 2007. -С. 269-270.

3. Вельченко М.В. Значение анализа мутаций гена BCR-ABL в оптимизации таргетной терапии хронического миелолейкоза / С.И. Куцев, М.В. Вельченко // Клиническая онкогематология. - 2008. - Т. 1. - №3. - С. 190199.

4. Вельченко М.В. Роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефрактерное™ к иматинибу у пациентов с хроническим миелолейкозом / С.И. Куцев, М.В. Вельченко, C.B. Морданов II Клиническая онкогематология. -2008,- Т. 1,- №4.-С. 303-309.

5. Вельченко М.В. Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ / С.И. Куцев, М.В. Вельченко, А.Н. Зельцер // Онкогематология. - 2008. - №4. - С. 17-25.

6. Вельченко М.В. Влияние концентрации иматиниба в плазме на достижение молекулярной ремиссии у больных хроническим миелолейкозом / С.И. Куцев, О.С. Оксенюк, М.В. Вельченко // Казан, мед. журнал. - 2009. -Т. 90.-Xg3.-C. 339-343.

7. Velchenko M. Mutation profile of BCR-ABL kinase domain in imatinib primary and secondary resistant chronic myeloid leukemia cases / S. Kutsev,

M. Velchenko, S. Mordanov // European Journal of Human Genetics. - 2008. -Vol. 16.-P. 212.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 1307. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Оглавление диссертации Вельченко, Мария Владимировна :: 2009 :: Ростов-на-Дону

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Молекулярно-генетические механизмы патогенеза хронического миелоидного лейкоза.

1.2. Молекулярно-генетические основы терапии хронического миелоидного лейкоза ингибиторами тирозинкиназ.

1.3. Молекулярно-генетическая диагностика и мониторинг эффективности терапии хронического миелоидного лейкоза ингибиторами тирозинкиназ

1.4. Молекулярно-генетические механизмы резистентности к терапии хронического миелоидного лейкоза ингибиторами тирозинкиназ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика пациентов.

2.2. Стандартное цитогенетическое исследование клеток костного мозга.

2.3. Количественная оценка экспрессии химерного онкогена BCR-ABL типа р210.

2.4. Определение первичной последовательности гена

BCR-ABL методом прямого ДНК секвенирования.

2.5. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Молекулярно-генетические исследования минимальной остаточной болезни у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом.

Глава 4. Анализ рефрактерности у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом.

Глава 5. Анализ рефрактерности у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом с мутациями гена BCR-ABL и без мутаций.

Глава 6. Анализ мутаций гена BCR-ABL у резистентных к терапии иматинибом пациентов с хроническим миелоидным лейкозом

Глава 7. Сравнительный анализ определения первичной последовательности ДНК и кДНК.

Введение диссертации по теме "Онкология", Вельченко, Мария Владимировна, автореферат

Актуальность исследования

Хронический миелоидный лейкоз (XMJI) - клональное миелопролиферативное заболевание, для которого характерна специфическая приобретенная генетическая аномалия — «филадельфийская хромосома» (Ph-хромосома). Ph-хромосома возникает в результате реципрокной транслокации между 9 и 22 хромосомами, образуя химерный онкоген BCR-ABL. На момент клинической и гематологической манифестации хронического миелоидного лейкоза обычно в костном мозге при цитогенетическом исследовании выявляется 95-100% Ph-положительных клеток (Kantarjian Н., Talpaz М., Giles F. et al., 2006; Branford S., 2007; Goldman J. M., 2007).

Дружкова Г.А. и соавт., 2005; Зарицкий А.Ю., Ломана Е.Г., Виноградова О.Ю. и соавт., 2007; Goldman J. М., 2007).

Несмотря на впечатляющие результаты терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом, у 15-20% пациентов отсутствует ответ на это лечение. Эту группу пациентов определяют как группу рефрактерных к терапии иматинибом пациентов (Shah N.P., 2007). Помимо этого, примерно 4% пациентов, получающих лечение иматинибом, ежегодно "теряют" ответ на эту терапию, что закономерно приводит к появлению клинико-гематологических признаков прогрессии XMJI. В настоящее время считают, что основной причиной потери ответа в 42% - 90% случаев являются мутации киназного домена гена BCR-ABL (Baccarani М., Saglio G., Goldman J., Hochhaus A., et al., 2006). Роль мутаций в развитии вторичной резистентности хорошо изучена, в то время как роль мутаций в развитии рефрактерности требует уточнения. Недостаточно изучена взаимосвязь между выявляемыми у больных хроническим миелоидным лейкозом мутациями и развитием рефрактерности к терапии.

Данные молекулярно-генетических исследований у больных хроническим миелоидным лейкозом, достигших цитогенетической ремиссии, показывают, что, несмотря на получение полного цитогенетического ответа, никогда не удается добиться полной эррадикации опухолевого клона клеток (Туркина А.Г., Челышева Е.Ю., 2004; Мисюрин А.В., Аксенова Е.В., Крутов А.А. и соавт., 2007). При этом у большинства больных сохраняется многолетняя клинико-гематологическая и цитогенетическая ремиссия заболевания, а у некоторых - развивается рецидив патологического процесса. Это позволяет предположить, что остаточная болезнь, определяемая по количеству BCR-ABL позитивных клеток, не является единственным прогностическим фактором, определяющим вероятность развития рецидива хронического миелоидного лейкоза и вторичной резистентности к терапии иматинибом. Вероятно, только сочетание определенного уровня опухолевых клеток с характером приобретенных мутаций гена BCR-ABL является решающим прогностическим фактором, определяющим эффективность терапии иматинибом.

Цель исследования

Оценить клинико-прогностическую значимость молекулярно-генетических исследований в диагностике хронического миелоидного лейкоза и детекции минимальной остаточной болезни, а так же — в анализе характера мутаций киназного домена гена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих лечение иматинибом.

Задачи исследования

4. Определить уровень экспрессии гена BCR-ABL характерный для развития рефрактерности и для оптимального ответа на проводимую терапию иматинибом.

6. Оценить вклад мутаций киназного домена гена BCR-ABL в формирование первичной резистентности у пациентов с хроническим миелолейкозом к терапии иматинибом.

Научная новизна исследования

Впервые на основе данных количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и данных цитогенетического исследования костного мозга произведена характеристика минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелоидным лейкозом, проживающих на юге России.

Сопоставлены различные способы выражения результатов количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и данные цитогенетических исследований костного мозга, оценена их клинико-прогностическая значимость.

Определены факторы, ассоциирующиеся с развитием рефрактерности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом.

Дана характеристика спектра и частоты мутаций гена BCR-ABL у рефрактерных к терапии иматинибом пациентов.

Практическая значимость

Установлено, что определение уровня экспрессии гена BCR-ABL значительно повышает достоверность оценки минимальной остаточной болезни при терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом. На основании сопоставления результатов цитогенетического исследования и метода количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени установлен прогностически значимый уровень экспрессии гена BCR-ABL для развития рефрактерности и уровень экспрессии, ассоциированный с успешным ответом на проводимую терапию хронического миелоидного лейкоза. Установлен наиболее информативный способ выражения результатов количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Определена значимость мутационного анализа гена BCR-ABL в оптимизации и индивидуализации терапии хронического миелоидного лейкоза.

Основное положение диссертации, выносимое на защиту

Целесообразность молекулярно-генетической диагностики и мониторинга терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом.

Апробация материалов исследования

Диссертация апробирована на совместной конференции кафедры гематологии и трансфузиологии ФПК и JLJLL1C РостГМУ и кафедры патологической анатомии, судебной медицины и генетики ФПК и ППС РостГМУ 5 мая 2009 года.

Высокотехнологичные методы диагностики и лечения сердечно-сосудистых и эндокринных заболеваний» (20-21 сентября 2007 года, г. Санкт-Петербург), на II ежегодной научно-практической конференции ЮФО «Диагностика и мониторинг эффективности терапии XMJI в ЮФО» (14 декабря 2007 года, г.Ростов-на-Дону), на XX Интернациональном Конгрессе генетиков (12-17 июля 2008 года, г. Берлин, Германия), на Европейском Конгрессе Генетиков 2008 (31 мая - 3 июня, 2008 год, г. Барселона, Испания), на III ежегодной научно-практической конференции ЮФО «Диагностика и мониторинг эффективности терапии XMJI в ЮФО» (13-14 декабря 2008 года, г.Кисловодск), на VI Симпозиуме с международным участием «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (29-31 января 2009 года, г. Москва).

Структура и объем диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Молекулярно-генетическая диагностика и мониторинг терапии хронического миелоидного лейкоза"

ВЫВОДЫ

3. Результаты количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, выраженные в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (Alog) по отношению к базовому уровню, корелируют с результатами стандартного цитогенетического исследования в наиболее высокой степени (г=-0,83).

6. Мутации киназного домена гена BCR-ABL обнаруживаются у 21,7%) пациентов с первичной резистентностью к терапии иматинибом и являются одним из значимых факторов в ее развитии. Среди обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL мутации Р-петли обнаруживаются в 57% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Стабильно высокий уровень и/или нарастание экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови в динамике при полном цитогенетическом ответе является показанием к проведению цитогенетического исследования для исключения развития цитогенетического рецидива. При этом также необходимо проводить обследование на предмет выявления мутаций киназного домена BCR-ABL для решения вопроса о возможном изменении тактики терапии.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Вельченко, Мария Владимировна

1. Домрачева Е.В., Захарова А.В., Асеева Е.А. Прогностическое значениедополнительных хромосомных аномалий при XMJI // Гематология и трансфузиология. 2005.- № 4.- С.37-42.

2. Дяченко Л.В., Захарова А.В., Асеева Е.А., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д.,

3. Водинская Л.А., Удовиченко А.И., Домрачева Е.В. Молекулярно-цитогенетический мониторинг различных режимов терапии у больных хроническим миелолейкозом // Терапевтический Архив 2004. — Т. 7. -№7.-С. 41-44.

4. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г. Перспективы фармакотерапии ХМЛ //

5. Эффективная фармакотерапия. — 2006. № 1. — С. 38-42.

6. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова О.Ю., Дружкова Г.А., Круглов

7. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова О.Ю., Дружкова Г.А.,

8. Круглов С.С., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. и др. Резистентность при терапии

9. Гливеком у больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации // Гематология и трансфузиология. — 2007.- №2.- С. 17-24.

10. Ломаиа Е.Г., Огородникова Ю.С., Мартынкевич И.С. и др. Прогностическиефакторы эффективности терапии Гливеком больных хроническим миелолейкозом // Вестник гематологии. — 2005.- Т. 1.- С. 14-21.

11. Ломаиа Е.Г. Клиническое значение мониторинга минимальной остаточнойболезни при хроническом миелолейкозе: Автореф. дис. . канд. мед. наук. С.-П.; 2007.

12. Мещеряков А.А. Гливек — патогенетическая терапия злокачественныхновообразований // Современная онкология. 2002: - Т. 4.- № 1. — С.123- 125.

13. Мисюрин А.В., Аксенова Е.В., Крутов А.А., Лукьяненко А.В., Финапгутина

14. Ю.П., Сучкова М.В., Тихонова В.В., Челышева Е.Ю., Солдатова И.Н., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза // Гематология и трансфузиология. 2007.- № 2.- С.35-40.

15. Монымалиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНКдиагностики в лабораторной службе. Часть 1 (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. 2000.- № 4,- С.25-32.

16. Монымалиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНКдиагностики в лабораторной службе. Часть 2 (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000.- № 5.- С.25-32.

17. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа1. Сфера, 2002. 305 е.

18. Семочкин С.В., Лория С.С., Курова Е.С., Трипутень Н.З., Туркина А.Г.,

19. Румянцев А.Г. Анализ качества жизни больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации на фоне терапии Гливеком // Современная онкология. 2002. - Т4.- №2. - С.67- 70.

20. Туркина А.Г. Ингибитор сигнальных путей STI571 (Signal Transductor1.hibitor)- новое направление в лечении хронического миелолейкоза // Современная онкология. 2001. - ТЗ.- №2. - С.46- 48.

21. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапии

22. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапиииматиниба мезилатом (Гливеком) в хронической фазе хронического миелолейкоза // Терапевтический Архив 2003. — Т. 75. - № 8. - С. 6267.

23. Туркина А.Г., Челышева Е.Ю. Цитогенетический и молекулярный ответ —ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+ хроническим миелолейкозом // Фарматека. 2004. - №18 (95). - С. 4853.

24. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А., Круглов С.С., Челышева

25. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А., Курова Е.С., Захарова Е.С.,

26. Хорошко Н.Д., Туркина А.Г. Хронический миелолейкоз; успехисовременного лечения и перспективы // Гематология и трансфузиология. 2001. - Т46. - №4. - С. 3-8.

27. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В., Захарова А.В. Раннеевыявление цитогенетического рецидива при динамическом исследовании уровня BCR-ABL транскрипта у больного хроническим миелолейкозом // Гематология и трансфузиология. — 2007.-№2.- С.50-51.

28. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В., Аксенова Е.В., Домрачева

29. Е.В., Захарова Е.С., Хорошко Н.Д. Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом: клиническое значение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Терапевтический Архив 2007. - № 4. - С. 49-53.

30. Челышева Е.Ю. Клиническое значение мониторинга минимальнойостаточной болезни при хроническом миелолейкозе: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М.; 2007.

31. Al-Ali Н.К., Heinrich М.С., Lange Т. et al. High incidence of BCR-ABL kinasedomain mutations and absence of mutations of the PDGFR and KIT activation loops in CML patients with secondary resistance to imatinib // Hematol J. 2004. - N5. - P55-60.

32. Anand M., Khorashad J., Marin D., et al. Varying response to escalating thedose of imatinib in patients with CML who "acquire" a BCR-ABLM244V mutant allele //Blood. 2006. - vol. 108. -N8. -P.2881-2882.

33. Azam M., Latek R.R., Daley G.Q. Mechanisms of autoinhibition and STI571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL // Cell. 2003. -N112.-P. 831-843.

34. Baccarani M., Saglio G., Goldman J., Hochhaus A., et al. Evolving concepts inthe management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet // Blood. — 2006. — vol. 108. -N6. -P.1809-1820.

35. Bolufer P., Sanz G.F., Barragan E. et al. Rapid quantitative detection of BCR

36. ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction using fluorescently labeled probes // Haematologica. 2000. - vol. 85. - N12. - P. 1248-1254.

37. Branford S., Rudzki Z., Hughes T. Monitoring chronic myeloid leukemia therapyby real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics // Br J Haematol. 1999. - N107. - P.587-599.

38. Branford S., Rudzki Z., Parkinson I. et al. Real-time quantitative PCR analysiscan be used as a primary screen to identify patients with CML treated with imatinib who have BCR-ABL kinase domain mutations // Blood. 2004. -Vol. 104. - N9. - P.2926-2932.

39. Branford S., Hughes T. Detection of BCR-ABL Mutations and Resistance

40. To Imatinib Mesylate // Myeloid Leukemia: Methods and Protocols. — 2006.-vol. 125.-P. 93-106.

41. Branford S. Chronic Myeloid Leukemia: Molecular Monitoring in Clinical

42. Practice // Hematology. 2007. - P.376 -383.

43. Bueno-da-Silva AE, Brumatti G, Russo FO, Green DR, Amarante-Mendes GP.

44. Bcr-Abl-mediated resistance to apoptosis is independent of constant tyrosine-kinase activity // Cell Death Differ. 2003. - N10. - P.592-598.

45. Campbell L.J., Patsouris C., Rayeroux K.C. et al. BCR-ABL amplification inchronic myelocytic leukemia blast crisis following imatinib mesylate administration // Cancer Genet Cytogenet. 2002. - N139. - P. 30-33.

46. Chu S, Holtz M, Gupta M, Bhatia R. BCR/ABL kinase inhibition by imatinibmesylate enhances MAP kinase activity in chronic myelogenous leukemia CD34+ cells // Blood. 2003. - N103. - P.3167-3174.

47. Corbin A.S., Buchdunger E., Pascal F., Druker B.J. Analysis of the structuralbasis of specificity of inhibition of the Abl kinase by STI571 // J Biol Chem. 2002. - Vol. 277. - N35. - P. 32214-32219.

48. Corbin A.S., La Rose P., Stoffregen E.P. et al. Several BCR-ABL kinase domainmutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib // Blood. 2003. - Vol.101. - N11. - P.4611-4614.

49. Cortes J., E. Jabbour E., Kantarjian H., et al. Dynamics of BCR-ABL kinasedomain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatmentwith multiple tyrosine kinase inhibitors // Blood. 2007. - vol. 110. - N12. -P.4005-4011.

50. Cowan-Jacob SW, Guez V, Fendrich G, et al. Imatinib (STI571) resistance inchronic myelogenous leukemia: molecular basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment // Mini Rev Med Chem. -2004. N4. - P.285-299.

51. Crossman L, Druker B, Deininger M. hOCT 1 and resistance to imatinib //

52. Blood. -2005. N106. - P. 1133-1134.

53. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. — 1987. — V.162, №1. P. 156-159.

54. Dai H., Marbach P., Lemaire M. et al. Distribution of STI-571 to the brain inlimited by P-glycoprotein-mediated efflux // J Pharmacol Exp Ther. — 2003. -N304. -P.1085-1092.

55. Deininger M.W., Goldman J.M., Melo J.V. The molecular biology of chronicmyeloid leukemia // Blood. -2000. N96. - P. 3343-3356.

56. Deininger M., Buchdunger E., Druker B. The development of imatinib as atherapeutic agent for chronic myeloid leukemia // Blood. 2005. - Vol. 105. - N 7. - P.2640-2653.

57. Doggrell S.A. BMS-354825: a novel drug with potential for the treatment ofimatinib- resistant chronic myeloid leukemia // Expert Opin Investig Drugs. -2005.-N14(1).-P.89-91.

58. Druker B.J., Talpaz M., Resta D.J. et al. Efficacy and safety of a specificinhibition of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. 2001. - N344. - P. 1031 -103 7.

59. Druker B.J., O'Brien S.G., Cortes J., Radich J. Chronic myelogenous leukemia //

60. Hematology. 2002. - P. 111-135.

61. Faderl S., Talpaz M., Estrov Z. et al. The biology of chronic myeloid leukemia //

62. N. Engl. J. Med. 1999. -N341. - P.164-172.

63. Gambacorti-Passerini C., Le Coutre P., Mologni L. et al. Inhibition of the ABLkinase activity blocks the proliferation of BCR-ABL+ leukemic cells and induces apoptosis //Blood Cells Mol. Dis. 1997. -N23. -P.380-384.

64. Gambacorti-Passerini C., Barni R., le Coutre P. et al. Role of alphal acidglycoprotein in the vivo resistance of human BCR-ABL(+)leukemic cells to the abl inhibitor STI571 // J. Natl. Cancer Inst.(Bethesda). 2000. - N92. -P. 1641-1650.

65. Gambacorti-Passerini C., Rossi F., Verga M. et al. Differences between in vivoand vitro sensitivity to imatinib of BCR/ABL(+) cells obtained from lieukemic patients // Blood Cells Mol. Dis. 2002. - N28. - P. 361-375.

66. Gambacorti-Passerini C., Zucchetti M., Russo D. et al. al acid glycoproteinbinds to imatinib(STI571) and substantially alters its pharmacokinetics in chronic myeloid leukemia patients // Clinical Cancer Research. 2003. -vol.9.-P.625-632.

67. Gambacorti-Passerini C., Gunby R.H., Piazza R. et al. Molecular mechanisms ofresistance to imatinib in Philadelphia chromosome positive leukemias // Lancet Oncol. 2003. - N4. - P.75-85.

68. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia-still a few questions // Exp Hematol.2004. -N32.-P.2-10.

69. Goldman J.M. Monitoring minimal residual desease in BCR-ABL-positivechronic myeloid leukemia in the imatinib era // Curr. Opin. Hemat. 2004. - N12. -P.33-39.

70. Goldman J., Gordon M. Why do chronic myelogenous leukemia stem cellssurvive allogeneic stem cell transplantation or imatinib: does it really matter? // Leuk Lymphoma. 2006. - N47(1). - P. 1-7.

71. Goldman J. M. How I treat chronic myeloid leukemia in the imatinib era //

72. Blood. 2007. - vol. 110. - N8. - P. 2828-2837.

73. Gorre M.E., Mohammed M., Ellwood K. et al. Clinical resistance to STI571cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification // Science. 2001. Vol.293. - P.876-880.

74. Gorre M.E., Sawyers C.L. Molecular mechanisms of resistance to STI571 inchronic myeloid leukemia // Curr. Opin. Hemat. 2002. - N9. - P.303-307.

75. Graham S.M., Jorgensen H.G., Allan E. et al. Primitive, quiescent, Philadelphiapositive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro // Blood. 2002. -N99. - P. 319-325.

76. Hochhaus A, Lin F, Reiter A at al. Quantification of residual disease in chronicmyelogenous leukemia patients on interferon-alpha therapy by competitive polymerase chain reaction // Blood. 1996. - N87. - P.l549-1555.

77. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S. et al. Molecular and chromosomalmechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy // Leukemia. 2002. - N16. -P.2190-2196.

78. Hofmann W.K., Jones L.S.,Lemp N.A. et al. Ph(+) acute lymphoblastic leukemiaresistant to the tyrosine kinase imatinibor STI571 has a unique BCR-ABL gene mutation // Blood. 2002. - N99. - P. 1860-1862.

79. Holyoake Т., Allan E.K., Grand F., et al. Combination therapies includingimatinib do not eradicate quiescent chronic myeloid leukaemia stem cells in vitro abstract. // Blood. 2003. - N102. - P.71a.

80. Hughes TP, Morgan GJ, Martiat P et al. Detection of residual leukemia afterbone marrow transplantation: role of PCR in predicting relapse // Blood. -1991.-N77.-P. 874-878.

81. Hughes Т., Branford S. Molecular monitoring of chronic myeloid leukemia //

82. Semin Hematol. 2003. - N40. - P.62-68.

83. Hughes Т., Kaeda J., Branford S. et al. Frequency of major molecular response toimatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia // N Engl J Med. 2003. - N349. - P. 1423—1432.

84. Hughes Т., Branford S. Molecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinicalmanagement in chronic myeloid leukemia // Blood. 2006. - N20. — P.29-41.

85. Jabbour E., Kantarjian H., Jones D., et al. Frequency and clinical significance of

86. BCR-ABL mutations in patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib mesylate // Leukemia. 2006. - N20. - P. 1767-1773.

87. Kabarowski J.H., Witte O.N. Consequences of BCR-ABL expression within thehematopoietic stem cell in chronic myeloid leukemia // Stem Cells. — 2000. -N18. -P. 399-408.

88. Kaeda S.A., Chase A., Goldman J.M. Cytogenetic and molecular monitoring ofresidual desease in chronic myeloid leukemia // Acta Hematol. 2002. -N107. — P.64-75.

89. Kantarjian H.M., Sawyers С., Hochhaus A. et al. Hematologic and cytogeneticresponses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia // N. Engl. J. Med. 2002. - N346. - P.645-652.

90. Kantarjian H.M., Tarpaz M. et al. Quantitative polymerase chain reactionmonitoring of BCR-ABL during therapy with imatinib mesylate (STI571:gleevec) in chronic phase chronic myelogenous leukemia // Clin Cancer Res.-2003. N9.-P. 160- 166.

91. Kantarjian H., O'Brien S., Cortes J. et al. Imatinib mesylate therapy improvessurvival in patients with newly diagnosed Philadelphia chromosome positive chronic myelogenous leukemia in the chronic phase // Cancer. -2003. N98. - P.2636-2642.

92. Kantarjian H., Talpaz M., Giles F., O'Brien S., Cortes J. New Insights into the

93. Pathophysiology of Chronic Myeloid Leukemia and Imatinib Resistance // Ann Intern Med. 2006. - N 145. - P. 913-923.

94. Kreil S., Muller C., Lahaye T. et al. Molecular and chromosomal mechanisms ofresistance in CML patients after STI571 (Glivec) therapy. American Society of Hematology, 43rd Annual Meeting, Orlando, Florida // Blood. -2001.-N98.-P. 435.

95. Kawasaki ES, Clark SS, Coyne NY et al. Diagnosis of chronic myelogenous andacute lymphocytic leukemias by detection of leukemia specific mRNA sequences amplified in vitro // Proc Nat Acad Sci USA. 1988. - N85. - P. 5698-5702.

96. Lange T, Niederwieser DW, Deininger MW. Residual disease in chronic myeloidleukemia after induction of molecular remission // N Engl J Med. — 2003. -N349. -P.1483-1484.

97. Lahaye T, Riehm B, Berger U at al. 4.5 year follow up of response and resistancein 300 patients with BCR-ABL positive leukemias treated with imatinib in a single center//Cancer.-2005. -N103.-P.1659-1669.

98. Lowenberg B. N. Minimal residual disease in chronic myeloid leukemia // Engl.

99. J. Med. 2003. - N349. -P.1399-1401.

100. Le Coutre P., Mologni L., Cleris L. et al. In vivo eradication of human BCR

101. ABL positive leukemia cells with an ABL kinase inhibitor // J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda). — 1999. —N91. -P.163-168.

102. Le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al. Induction of resistance to the

103. Abelson inhibitor STI571 in human leukemic cells through gene amplification //Blood. -2000. -N95. P. 1758-1766.

104. Li S, Hu Y, Swerdlow S et al. Targeting BCRABL kinase activity-independentsignaling pathways and leukemia stem cells is essential for curative therapy of Philadelphia chromosome positive (Ph+) leukemia Abstract. // Blood. -2005.-N 106.-P.592

105. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J. et al. Tyrosine kinase activity andtransformation potency of BCR-ABL oncogen products // Science. — 1990. -N247.-P. 1079- 1082.

106. McLean L.A., Gathmann I., Capdeville R. et al. Pharmacogenomic Analysis ofcytogenetic response in chronic myeloid leukemia patients treated with imatinib // Clinical Cancer Research. 2004. - vol.10. - P.155-165.

107. Mahon F.X., Deininger M.W., Schultheis B. et al. Selection and characterizationof BCR-ABL positive cell lines with differential sensitivity to the tyrosine kinase imatinibor STI571: diverse mechanisms of resistance // Blood. -2000.-N96.-P. 1070-1079.

108. Mahon F.X., Belloc F., Lagarde V., et al. MDR1 gene overexpression confersresistance to imatinib mesylate in leukemia cell line models // Blood. -2003.-N101.-P. 2368-2373.

109. Marin D., Marktel S. et al. Survival of patients with chronic phase chronicmyeloid leukemia after failed response to interferon-alfa // Lancet. 2003. -N362. - P.617-619.

110. Mauro M. J. Defining and Managing Imatinib Resistance // Hematology.2006.-P.346 -352.

111. Mayer B.J., Baltimore D. Mutagenic analysis of the roles of SH2 and SH3domains in regulation of the Abl tyrosinkinase // Mol. Cell. Biol. — 1994. — Vol.14.-P.2883.

112. Melo J. V., Hughes T. P. and Apperley J. F. Chronic Myeloid Leukemia //

113. Hematology. 2003. - P.346 -352.

114. Mensink E, van de Locht A. Quantitation of minimal residual disease in

115. Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia patients using real-time quantitative RT PCR // Br J Haematol. 1998. - N102. - P.768-774.

116. Merx K., Muller M.C. et al. Early reduction of BCR-ABL mRNA transcriptlevels predicts cytogenetic response in chronic phase CML patients treated with imatinib after failure of ilure of interferon alfa // Leukemia. — 2002. -N16. P.1579-1583.

117. Morgan GJ, Hughes T, Janssen JWG et al. Polymerase chain reaction fordetection of residual leukaemia // Lancet. 1989. - N1. - P. 928-929.

118. Mukai M., Che X.F., Furukawa T. et al. Reversal of the resistance to STI571 inhuman chronic myelogenous leukemia K562 cells // Cancer Sci. 2003. — N8.-P. 411-424.

119. Mutter M.C., Gattermann N., Lahaye T. et al. Dynamics of BCR-ABL mRNAexpression in first-line therapy of chronic myelogenous leukemia patientswith imatinib or interferon alfa/ara-C.// Leukemia. 2003. - N17. - P.2392-2400.

120. Nagar B, Hantschel O, Young MA, et al. Structural basis for the autoinhibitionof c-Abl tyrosine kinase // Cell. 2003. - N112. - P.859-871.

121. Nardi V., Azam M., Daley G.Q. Mechanisms and implications of imatinibresistance mutations in BCR-ABL // Curr Opin Hematol. 2004. - N11. -P.35-43.

122. Ohmine K., Nagai Т., Tarumoto T. et al. Analysis of gene expression profilesin an imatinib-resistant cell line, KCL22/SR // Steem Cells. 2003. - N21. -P.315- 321.

123. O'Hare Т., Eide C. A. and Deininger M. Bcr-Abl kinase domain mutations,drug resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia // Blood. -2007. vol. 110. - N7. - P. 2242-2249.

124. Preudhomme C., Revillion F., Merlat A. et al. Detection of BCR-ABLtranscripts in chronic myeloid leukemia (CML) using a 'real time' quantitative RT-PCR assay // Leukemia. 1999. - N13. - P. 957-964.

125. Ray A., Cowan-Jacob S ., Manley P. et al. Identification of BCR-ABL pointmutations conferring resistance to the Abl kinase inhibitor AMN107 (nilotinib) by a random mutagenesis study // Blood. 2007. - Vol. 109. -N11. -P.5011-5015.

126. Ricci C., Scappini В., Divoky V. et al. Mutation in the ATP-binding pocket ofthe BCR/ABL-positive cell line // Cancer Res. 2002. - N62. - P. 59955998.

127. Roche-Lestienne С, Lai JL, Darre S, Facon T, Preudhomme C. A mutationconferring resistance to imatinib at the time of diagnosis of chronic myelogenous leukemia // N Engl J Med. 2003. - N348. - P.2265-2266.

128. Roumiantsev S, Shah SP, Gorre ME, Nicoll J et al. Clinical resistance to thekinase inhibitor STI-571 in chronic myeloid leukemia by mutation of Tyr-253 in the Abl kinase domain P-loop // Proc Nat Acad Sci USA. 2002. -N99. — P. 10700-10705.

129. Rowley J.D. A new consistent chromosomal abnormality in chronicmyelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa banding.//Nature. 1973.- Vol.243. -P.290.

130. Ruibao R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronicmyelogenous leukemia // Cancer. 2005. - Vol.5. - P.172-183.

131. Sawyers C.L., Hochhaus A., Feldman E. et al. Imatinib induces hematologicand cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a Phase II study // BLOOD. 2002. -N99.-P. 3530-3539.

132. Schindler T, Bornmann W, Pellicena P, et al. Structural mechanism for STI571 inhibition of abelson tyrosine kinase // Science. 2000. - N 289. — P. 1938-1942.

133. Schiffer C. BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors for chronic myelogenousleukemia // N Engl J Med. 2007. - Vol. 357. - N3. - P. 258-265.

134. Shah N.P., Nicoll J.N., Nagar B. et al. Multiple kinase domain mutations conferpolyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia // Cancer Cell. -2002.-N2.-P.l 17-125.

135. Shah N.P., Sawyers C.L. Mechanisms of resistance to STI571 in Philadelphiachromosome associated leukemias // Oncogene. — 2003. — Vol. 22. — P. 7389—7395.

136. Shah N.P., Tran С., Lee F.Y. et al. Overriding imatinib resistance with a novel

137. ABL kinase inhibitor// Science. -2004. -N305. P. 399-401.

138. Shah N. P. Loss of Response to Imatinib: Mechanisms and Management //

139. Hematology. 2005. - P.246 -252.

140. Shah N. P. Medical Management of CML // Hematology. 2007. - P.371 -375.

141. Shet A.S., Jahagirdar B.N., Verfaillie C.M. Chronic myelogenous leukemia:mechanisms underlying disease progression // Leukemia. 2002. - Vol.16. -P. 1402.

142. Skaggs В., Gorre M., Ryvkin A. et al. Phosphorylation of the ATP-bindingloop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants // PNAS. -2006.-vol. 103. N51. -P.19466-19471.

143. Sorel N., Bonnet M.L., Guillier M. et al. Evidens of Abl- kinase domainmutations in highly purified primitive stem cell populations of patients with chronic myelogenous leukemia // Biochem Biophys Res Commun. 2004. -N323.-P. 728-730.

144. Talpaz M., Silver R.T., Druker В J. et al. Imatinib induces durable hematologicand cytogenetic responses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia: results of a Phase 2 study // BLOOD. 2002. - N99. -P. 1928-1937.

145. Tokarski J., Newitt J., Chang C. et al. The structure of Dasatinib (BMS-354825)bound to activated ABL kinase domain elucidates its inhibitory activity against imatinib-resistant ABL mutants // Cancer Research. — 2006. N 66. -P.5790-5797.

146. Verfaillie C.M. Biology of chronic myelogenous leukemia // Haematol. Oncol.

147. Clin. N. Am. 1998. - Vol.12. - N1. - P. 1-29.

148. Von Bubnoff N., Schneller F., Peschel C., Duyster J. BCR-ABL genemutations in relation to clinical resistance of Philadelphia chromosome positive leukemia to STI571: a prospective study // Lancet. 2002. - N359. -P.487- 491.

149. Wang L., Pearson K. et al. The early molecular response to imatinib predictscytogenetic and clinical outcome in chronic myeloid leukemia // Br J Haematol. 2003. - N120. - P.990-999.

150. Weisberg E.G., Griffin J.D. Mechanism of resistance to the ABL tyrosinekinase inhibitor STI571 in BCR-ABL-transformed hematopoietic cell lines // Blood. 2000. - N95. - P. 3498-3505.

151. Weisberg E.G., Griffin J.D. Resistance to imatinib (Glivec): update on clinicalmechanisms // Drug Resist. Updat. 2003. - N6. - P.231-238.

152. Weisberg E.G., Manley P.W., Breitenstein W. et al. Characterization of

153. AMN107, a selective inhibitor of native and mutant BCR-ABL // Cancer Cell.-2005.- N7(4).- P.399-410.

154. White D, Saunders V, Lyons AB, et al. In vitro sensitivity to imatinib-inducedinhibition of ABL kinase activity is predictive of molecular response in patients with de novo CML // Blood. 2005. - N106. - P.2520-2526.

155. Willis S., Lange Т., Demehri S. et al. High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy // Blood. 2005. - Vol. 106. -N6.-P.2128-2137.