Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Критерии активности патологического процесса при рассеянном склерозе по результатам исследования регуляторных Т-клеток.

На правах рукописи

ЕЛИСЕЕВА ДАРЬЯ ДМИТРИЕВНА

КРИТЕРИИ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Специальность: 14.01.11 - Нервные болезни

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

2 ИЮН 2011

Москва 2011

4848588

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Завалишин Игорь Алексеевич;

доктор медицинских наук, профессор Быковская Светлана Нюневна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Бойко Алексей Николаевич;

доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоитс5^^^^р2011 года —часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.006.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НЦН РАМН по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.

Автореферат разослан JfPJ? 2011 года

Ученый секретарь

Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций Д 001.006.01,

кандидат медицинских наук Е.В. Гнедовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Рассеянный склероз (PC) - распространенное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое поражает в основном лиц молодого возраста и почти неизбежно приводит на определенной стадии своего развития к инвалидизации [Compston A., Coles А., 2002].

В основе патогенеза PC лежит аутоиммунный процесс, который выражается в активации, дифференцировке и пролиферации Т-клеток, имеющих специфические рецепторы к компонентам миелина, т.е. в образовании аутореактивных Т-клеток, индуцирующих развитие демиелинизирующего процесса. Причем, ведущая роль в развитии иммунопатологического процесса при PC принадлежит популяции CD4+ Т-клеток. Считается, что CD4* Т-лимфоциты первыми встречаются с антигеном и приобретают свойства эффекторных миелин-специфических клеток [Delgado S., Sheremata W.A., 2006; Hemmer В. et at., 2002].

Активация Т-клеток происходит при взаимодействии соответствующего рецептора Т-лимфоцита и аутоантигена, связанного с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, который экспрессируется на антиген-презентирующих (АПК) клетках, после чего происходит пролиферация и дифференцировка аутореактивных Т-клеток. В результате Т-лимфоциты приобретают аутоагрессивные свойства. На следующем этапе происходит проникновение активированных Т-лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в ЦНС и их взаимодействие с антигенами собственного миелина, в результате развивается воспалительный процесс, который приводит к повреждению миелина головного и спинного мозга.

По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний связано не только с дифференцировкой, пролиферацией и активацией эффекторных Т-клеток, но и с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам [Mills К.Н. et al., 2004].

Ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют регуляторные Т-клетки с фенотипом CD4+CD25*Foxp3+ (Т per). Т per в норме составляют 3-5 % от

з

общего числа CD4T Т-клеток в периферической крови и лимфоидных тканях. Т per созревают в тимусе и на 3-4 день неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоидные органы [Sakaguchi S. et al., 1995].

У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение количества и нарушение функции Т per. Так, дефект Т per показан у больных системной красной волчанкой [Lyssik E.Y. et al., 2007], сахарным диабетом 1 типа [Dejaco С. et al., 2006], псориазом [Sugiyama н. et al., 2005], ревматоидным артритом [Pohlers D. et al., 2007].

Проведенные в настоящее время исследования показали, что имеется возможность увеличить количество Т per, выделенных из крови пациента, культивированием их в условиях ex vivo [Selvaraj R.K., Geiger T.L., 2008; Allan S.E. et al., 2008]. При этом, полученные культивированием Т per высоко стабильны, долго живущие, обладают супрессорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны и введение этих клеток пациенту с целью восстановления Т per в крови больного до уровня нормы может стать инструментом коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях [Peters J.H. et al., 2008; Thornton A.M. el., 2010].

Проведены пилотные испытания по введению аугологичных культивированных Т per больным системной красной волчанкой [Lyssik Е. Y. et al., 2007], диабетом 1-го типа [Godebu Е., Summers-Torres D. et al., 2008], пациентам с реакции трансплантант-против хозяина после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [Корсунский И.А. и соавт., 2008; Riley J.L. et al., 2009]. При этом, получено достоверное увеличение количества Т per в периферической крови этих больных, которое коррелировало с улучшением клинических показателей и не вызывало побочных реакций у больных.

В последнее время появились работы, посвящённые изучению роли Т per в патогенезе рассеянного склероза [Haas J. et al., 2005, 2007; Venken К. et al„ 2007, 2008,2010; FegerU. C. et al., 2007].

Установлено, что T per играют определенную роль в нарушении регуляторных механизмов в аугоиммунитете, приводящих к развитию и прогрессированию PC. В то же время, результаты исследований количества н функциональной активности при PC отличаются значительной разноречивостью,

что обусловлено недостаточностью сопоставлений количества и функциональной активности Т per с клинической картиной заболевания. Помимо этого, в настоящее время имеются лишь единичные описания результатов культивирования Т per больных PC, а попыток использования Т per в терапевтических целях при этом заболевании не проводилось.

В связи с вышеизложенным были сформулированы цели и задачи исследования.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение роли регуляторных Т-клеток CD4*CD25+Foxp3* в патогенезе рассеянного склероза. Задачи исследования;

1. Исследовать состояние клеточного иммунитета больных ремитирующим PC путем изучения содержания основных субпопуляций лимфоцитов (фенотипы CD3*, CD4+, CD8", CD 16*56", CD19*) на различных этапах заболевания.

2. Изучить количество регуляторных T-кпеток CD4+CD25TFoxp3+ в крови больных PC в зависимости от стадии заболевания (обострение, ремиссия), длительности и тяжести его течения.

3. Изучить функциональную активность Т per у больных PC в стадии обострения и ремиссии.

4. Провести культишгроваиие аутологичных Т per, выделенных из крови больных PC, с целью получения линий этих клеток (индукция Т per ex vivo) и сравнить их фенотипические и функциональные характеристики с нативными Т per.

5. Выполнить введение выращенных ex vivo регуляторных Т-клеток CD4"CD25*Foxp3" для коррекции иммунных нарушений у больных PC, от которых эти клетки были получены.

Научная новизиа. Впервые исследовано количество и функциональная активность регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных PC в зависимости от стадии заболевания. При этом, установлены значимые корреляции стадии демиелинизирующего процесса с количеством Т per. Проведено культивирование аутологичных Т per путем их индукции ex vivo и доказана идентичность культивированных и нативных клеток. Впервые выполнено введение выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток с целью коррекции иммунных

нарушений у больных PC. Выявлено, что введение таких аутологичных клеток больным приводит к увеличению содержания Т per в крови и хорошо переносится пациентами, и может в дальнейшем рассматриваться как новый подход к терапии этого заболевания.

Практическая и теоретическая значимость работы. На основании проведенного исследования расширены представления о взаимосвязи количественного и функционального дефекта регуляторных Т-клеток в механизмах формирования иммунопатологического процесса при PC, что имеет значение для понимания роли регуляторных механизмов в патогенезе этого заболевания. Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение в плане диагностического показателя наступающего обострения PC при снижении количества Т per и формирования ремиссии заболевания при повышении числа этих клеток в крови больных. Выявлено, что регуляторные Т-клетки CD4^CD25+Foxp3* можно выделить из периферической крови больного и вырастить в лабораторных условиях достаточное количество клеток, которое может компенсировать их дефицит в организме и соответственно применяться для коррекции иммунных нарушений при PC. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммунофенотипическое исследование крови больных PC выявило дисбаланс CD4* и CD8"1' Т-клеток за счет повышения количества CD8+Т-клеток.

2. Выявлено снижение количества Т per в крови больных PC в целом по группе. Установлено, что в стадии обострения PC количество Т per значительно снижено, а переход в стадию ремиссии заболевания характеризуется ростом их числа.

3. Отмечено снижение функциональной активности Т per, выделенных из периферической крови больных PC, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.

4. Установлена обратная зависимость между количеством Т per и степенью инвалидгаации и длительностью PC, что является отражением степени активности иммунопатологического процесса

5. В результате культивирования аутологичных Т per больных количество этих клеток увеличивается в десятки раз. При этом, культивированные Т per по

фенотипическим и функциональным характеристикам идентичны нативиым. Введение выращенных ex vivo аутологичных Т per больным PC позволяет повысить уровень Т per в крови больных и не вызывает побочных эффектов. Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, Н, III, V, VI неврологических, нейрореанимационного и научно-консультативного отделений, отделения лучевой диагностики, лабораторий нейрохимии, гемореологии и гемостаза, эпидемиологии и профилактики заболеваний нервной системы, клинической нейрофизиологии и патоморфологии Научного центра неврологии РАМН 06 апреля 2011 г.

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на: заседании XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2009 г.), IX Международном конгрессе «Новые направления иммуносупрессии и иммунотерапии" (Женева, 2010 г.), Совете молодых ученых НЦН РАМН (Москва, 2011 г.), V Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз: 30 лет спустя» (Новосибирск 2011 г.), V Международной конференции по иммунологической регуляции (Давос, 2011г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики пациентов и методов исследования, главы, посвященной результатам, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 199 источников, из них 11 отечественных и 188 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика больных В настоящей работе представлены результаты клинико-иммунологического исследования, в том числе, определение количества регуляторных Т-клеток CD4*CD25~Foxp3* (Т per), у 50 больных с достоверным диагнозом PC. 19 пациентов из этой группы изучены в динамике, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии. 10 больным PC проведено исследование функциональной

активности Т per в смешанной культуре лимфоцитов. Выращено 5 клеточных линий CD4+ Т-клеток 5 больных PC и 3 здоровых доноров для индукции ex vivo (культивирования) регуляторных Т-клеток CD4"CD25*rFoxp3~. Проведено подкожное введете выращенных ex vivo (культивированных) Т per 5 больным PC.

Клиническое обследование бальных проводилось в 6-ом неврологическом отделении НЦН РАМН, руководитель отделения - профессор И. А. Завалиашн.

У больных была детально изучена клиническая картина заболевания с использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса, проведена магнитно-резонансная томография (МРТ) головного и/или спинного мозга. Все 50 пациентов, включенных в исследование, имели достоверный диагноз ремитирующего PC, согласно диагностическим критериям Poser С.М. (1998г) и McDonald W.I. (2005г.). Группа пациентов состояла из больных PC: в стадии ремиссии - 31 человек, в стадии обострения - 19 человек. Среди обследованных лиц преобладали женщины в соотношении 1:2,3. Возраст больных варьировал от 19 до 56 лет. Тяжесть неврологического дефицита оценивалась с использованием расширенной шкалы инвалидизации EDSS (The Expanded Disability Status Scale), которая у больных в стадии обострения PC находилась в пределах от 1,0 до 5,0, в стадии ремиссии PC от 1,0 до 2,5 баллов. У 19 больных в стадии обострения болезни, были взяты образцы крови в динамике, т.е. как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания. Этим больным, до забора крови для определения иммунофенотипического состава крови, проведены неврологический осмотр, при котором выявлено нарастание или появление новой неврологической симптоматики и МРТ головного и/или спинного мозга, позволяющая выявить активные очаги демиелинизации. После выявления обострения процесса больным проводилась пульс-терапия метилпреднизолоном (суммарная доза 3000 - 5000 мг). Повторное взятие крови осуществлялось спустя не менее 4-х недель после окончания гормональной терапии. У пациентов, изученных в динамике в стадии обострения и в стадии ремиссии, средний возраст составил 34,9±9,76 лет (25-56), балл по шкале EDSS находился в пределах от 1,5 - 5,0, в стадии ремиссии степень выраженности неврологического дефицита у этих больных составила 1,55±0,57 [1,0;3,0] баллов.

У всех 50 больных была проведена оценка периода от момента постановки диагноза PC до начала исследования. В целом по группе длительность PC варьировала от 3 до 207 месяцев. Выделено 2 группы больных по длительности течения PC. Первую группу составили 28 больных, страдающих PC менее 36 месяцев, вторую - 22 больных, страдающих PC более 36 месяцев. При этом, средняя длительность заболевания в первой и второй группах была равна 15,29 ±11,12 (3-35) и 110,5±51,17 (44-208) месяцев, соотаетственно.

В качестве контрольной группы исследован иммунофенотип крови 21 здорового донора, соответствующих больным по возрастному и половому составу. Среди здоровых лиц, преобладали женщины 1:1,63. Возраст доноров находился в пределах от 19 до 57 лет.

Определение функциональной активности Т per проведено 10 больным PC, из них 7 пациентам в стадии обострения и 3 - в стадии ремиссии. Среди них 7 женщин и 3 мужчин. Возраст этих больных PC варьировал от 24 до 39 лет.

Группа больных PC, у которых были взяты образцы крови для культивирования аутологичных Т per и последующего их подкожного введения состояла из 5 человек. Данная группа больных состояла из 4 женщин и 1 мужчины, возраст пациентов составил от 26 до 37 лет, средний балл по шкале EDSS был равен 2,9 [2,5±3,0].

Протоколы диссертационного исследования «Критерии активности патологического процесса при рассеянном склерозе по результатам исследования регуляторных Т-клеток» и клинического исследования «Иммунокоррегирующая терапия ремитирующего рассеянного склероза путем введения выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток CD4~CD25+Foxp3*» были одобрены Локальным Этическим Комитетом НЦН РАМН. Протокол №9/08 от 25 июня 2008 года. Все пациенты дали согласие на участие в исследовании, подписав информированное согласие.

Методы исследований

Исследование иммунофенотипического состава крови, в том числе определение количества регуляторных Т-клеток CD4"CD25'Foxp3" больных PC и здоровых доноров, проводилось с использованием метода проточной цитометрии

на базе лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии НЦН РАМН, руководитель - профессор А.А. Болдырев.

Все измерения проводились на проточном цитометре FACS Calibur(tm) (BD Biosciences). Для оценки количества клеток CD3 , CD8"1", CD4+, CD4'CD25r, CD 19+, CD!6+CD56 в мононуклеарной фракции, клеточную суспензию окрашивали соотвестнукицими антителами. Оценка экспрессии поверхностных маркеров проводилась в соответствии с протоколом, разработанным производителем набора антител BD Multitest IMK. Kit(tm) (BD Biosciences, США). Процентное содержание позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывалось при помощи программного обеспечения MACSQuantify(tm) (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Выделение регуляторных Т-клеток CD4*CD25~Foxp3T из периферической крови больных рассеянным склерозом осуществлялось инкубацией CD4 CD25+ Т-клеток с РЕ-мечеными анти-человеческими антителами к FoxP3, клон РСН101 (eBioscience, США).

Определение функциональной активности и культивирование регуляторных Т-клеток CD4~CD25"Foxp3~ проводилось на базе Отдела клеточных технологий и регенеративной медицины ГОУ ВПО РГМУ, руководитель отдела - профессор С.Н. Быковская.

Данный метод включал забор 40 мл периферической крови у испытуемого, выделение субпопуляций регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов и АПК донора, окраску эффекторных Т-лимфоцитов витальным красителем карбоксифлуоресцеин сукцинимидштовым эфиром (Carboxyfluorescein succinimidyl ester - CFSE) и пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов (mixed lymphocyte reaction - MLR), которая оценивается по редукции внутриклеточного красителя CFSE методом проточной цитометрии.

Для культивирования Т per применяли среду RPMI-1640, содержащую феноловый красный, L-глутамин и 25мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5-10% аутолотичной сыворотки и 1% раствора пенициллин-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли интерлейкин (ИЛ) - 2 (ИЛ-2, R&D Systems, Великобритания), мышиные моноклоиальные антитела к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, РФ) и мышиные моноклоиальные антитела к человеческому рецептору CD28 (BD

Pharmingen, США). Клетки культивировали во флаконах 25 см2 или 75 см2 в С02-инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% С02. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 дня. Время культивирования составляло от 5-8 дней. Далее оценивались фенотипические характеристики (экспрессии маркеров) и экспансия (увеличение количества) Т per после культивирования с помощью проточной цитометрии, и изучалась супрессорная активность нативных и индуцированных ех vivo Т per.

На 7-12Й день культивирования клетки концентрировали, подсчитывали количество живых клеток в гемоцитометре и отмывали центрифугированием в 50 мл конических стерильных пробирках в фосфатном солевом буферном растворе без Са2+ и Mg2+ в течение 10 мин при 300 g. Осадок разводили в 2-3 мл стерильного физиологического раствора или 6% раствора полиглюкина и сразу набирали в стерильный одноразовый шприц, который помещали в стерильную упаковку и в специальный контейнер для переноса клеток, который незамедлительно транспортировался в НЦН РАМН.

После доставки в 6-ое неврологическое отделение НЦН РАМН, клетки немедленно вводили пациенту подкожно, в область передней брюшной стенки. После введения клеток пациент находился на стационарном лечении в 6-ом неврологическом отделении НЦН РАМН в течение 2-х недель. В течение последующего года наблюдение за пациентами осуществлялось в амбулаторном порядке, с явкой на осмотр 1 раз в 3 месяца.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США) для персонального компьютера. Для нормально распределенных признаков вычислялось среднее значение и стандартное отклонение, результаты представлены в виде т±6. При выполнении описательной статистики для количественных признаков, распределение которых не подчинялось законам нормального распределения, вычислялись медиана и интерквартильный размах - нижний 25% и верхний 75%-ный интервалы. Результаты представлены в виде медианы (нижний квартиль (LQ)=; верхний квартиль (UQ)=). Сравнение двух независимых групп по одному признаку для количественных, качественных, порядковых и номинальных признаков проводилось с помощью критерия Мапна-Уитни. Взаимосвязь двух

признаков анализировалась при помощи корреляционного анализа по Спирмену, с вычислением коэффициента корреляции R. Порог статистической значимости (р) был установлен на уровне 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что в целом по группе больных PC имело место статистически значимое снижение уровня иммунологического регуляторного индекса (ИРИ) -CD4+/CD8+ (р=0,04) (табл. 1).

Таблица 1

Иммунофенотип периферической крови больных PC в целом по группе больных

Больные PC i Доноры H P 1-й

Количество (п) n=50 n=21

CD3+ 70,95 ±8,19 [52,20;88,701 72,52 ± 7,79 f(61,30;84,30] 0,58

CD8+ 25,75 ±7,83 [11,09;51,25] 22,70 ± 4,77 fl4,50;28,88] 0,19

CD4+ 42,18 ±9,42 [19,70;64,06] 46,67 ±7,15 [34,94;55,01] 0,07

CD4+/CD8+ 1,83 ± 0,88 [0,40;5,78] 2,18 ±0,72 [1,29;3,66] 0,04*

CD19+ 9,83 ± 3,94 [2,60;19,78] 11,89 ±6,72 [5,41;29,13] 0,48

CD16+CD56+ 17,01 ± 7,53 [3,20;34,90] 13,72 ± 5,84 f6,24;25,001 0,15

«*»- статистически значимые отклонения

При динамическом исследовании иммунофенотипа крови 19 больных PC в стадии обострения и ремиссии выявлено достоверное повышение количества CD8+ T-кпеток (р=0,007) по сравнению с количеством этих клеток в стадии ремиссии, что обусловило снижение ИРИ (р=0,04) у этой группы пациентов. Ремиссия же PC ассоциировалась со снижением числа эффекторных Т-лимфоцитов (CD4+, CD8*), причем, в большей степени CD8+ Т-клеток. Кроме того, иммунограмма больных PC в стадии ремиссии характеризовалась достоверным снижением содержания В-лимфоцитов (р=0,009) (табл. 2).

Таблица 2

Иммунофенотип периферической крови больных PC, обследованных в динамике

Обострение PC i Ремиссия РСц Доноры P in

Количество (n) n=19 n=19 n=21

CD3+ 70,84 ± 833 [55,80;82,90] 6936 ± 8,92 [48,10;81,80] 72,52 ± 7,79 [(61,30:84,30] 0,67

CD8+ 26,59 ± 4,62 ж [20,60;36,20] 21,83 ±531 I [13,67:33,701 * 22,70 ± 4,77 [14,50:28,881 0,007*

CD4+ 42,58 ±8,61 [30,23:59,12] 39,98 ± 8,90 [21,30;54,701 46,67 ± 7,15 [34,94:55,01] 0,43

CD4+/CD8+ 1,61 ±0,43 1 [1,20;2,80] 1,86 ±0,36 f [1,30:2,80] 2,18 ±0,72 [1,29;3,66] 0,02*

CDI9+ 11,76 ±3,79 + [4,80;19,301 T 8,37 ±4,29 > [3,45:16,501 ▼ 11,89 ±6,72 [5,41;29,13] 0,009*

CD16+CD56+ 19,07 ± 7,32 [8,50;34,90] 16,92 ± 11,87 [3,20:37,67] 13,72 ± 5,84 [6,24;25,00] 0,22

«*»- статистически значимые отклонения

Таким образом, в исследовании выявлено, что процентное содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD4+ и CD8+ маркеры и обладающих эффекторными свойствами, и, соответственно, способностью атаковать миелин в целом по группе больных PC не отклонялось от нормальных показателей. Однако, имело место снижение показателя ИРИ, который отражает соотношение популяций этих Т-клеток. Снижение ИРИ у больных PC может быть обусловлено дисбалансом этих клеток вследствие несущественного уменьшения процентного содержания CD4+ Т-клеток и увеличения числа CD8+ Т-клеток. При обострении PC отмечалось преобладание CD8+ Т-клеток и еще в большей степени снижался показатель ИРИ. В стадии ремиссии PC наблюдалось уменьшение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD4+ и CD8+, причем, в большей степени последних, что приводило к нормализации ИРИ.

Следующим этапом нашей работы явилась идентификация субпопуляции регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+, характерными маркёрами которых, являются постоянная экспрессия на мембране клетки альфа-цепи рецептора ИЛ-2 (1L2R) CD25+ высокой афинности и экспрессия продукта гена Foxp3, который кодирует дифференцировку и функциональную активность этих клеток [Nakamura К.., Kitani A., Strober W., 2001].

В результате исследования установлено, что содержание Т per в периферической крови больных PC в целом по группе составило 1,38±0,86% [0,19;4,40], у доноров - 3,56±1,53% [1,86;6,07], что указывает на достоверно значимое снижение количества Т per у больных (р=0,0001).

При сравнении содержания Т per в периферической крови больных PC в

стадии ремиссии (1,37±0,90% [0,2;4,4]) и в стадии обострения (0,88±0,45%

13

[0,19; 1,90]) заболевания наблюдалось достоверное отличие числа этих клеток (р=0,03) (рис. 1).

8

Ш ремиссий PC Ш обострение PC

*р<0,05

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 пациенты

Рис. 1. Увеличение содержания регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных PC в стадии ремиссии

Таким образом, по нашим данным, в крови больных PC выявлено достоверное снижение количества Т per независимо от стадии заболевания. Однако, обращает на себя внимание, что в большей степени содержание Т per снижено при обострении аутоиммунного процесса. Аналогичные данные получены в работах других авторов [Haas J. et al., 2007; Venken К. et al., 2007, 2008, 2010; Jean M. Fletcher et al., 2009]. Причиной данного обстоятельства может быть увеличенная продукция провоспалительных цитокинов активированными CD41 Т-клетками, которые угнетают как образование Т per на периферии, так и повреждают уже существующие клетки. Помимо этого, может наблюдаться цитотоксическое действие CD8+ Т-клеток. Venken К., с соавт. (2008) связывают наличие малого числа Т per в крови больных PC со снижением уровня экспрессии гена Foxp3 на периферических Т per, в результате чего нарушается образование этих клеток, а Т per, циркулирующие в крови, подвергаются повреждающему действию эффекторных клеток.

При динамическом анализе периферической крови 19 больных в стадии обострения и в стадии ремиссии PC получено достоверное повышение количества

T per с 0,88±0,45% [0,19;1,90] до 2,57±1,52% [0,63;5,50] (р=0,00003), которое не достигало уровня здоровых лиц (3,56 ± 1,53% [1,86;6,07]) (р=0,04).

Таким образом, установлено, что при переходе заболевания в фазу ремиссии отмечается увеличение числа Т per в крови больных PC. Такие результаты получены впервые, т.к. ранее не проводилось подобных исследований у одних и тех же больных PC в динамике. Следует отметить, что некоторыми исследователями продемонстрирован дефицит Т per в крови больных в стадии обострения [Viglietta V. et al., 2004; Venken К. et al., 2007, 2008], причем, основной причиной низкого количества Т per в обострении PC, по их мнению, является миграция этих клеток с периферии в участки демиелинизации, что объясняется выявлением количественного преобладания Т per в ЦСЖ больных, особенно в период обострения процесса [Venken К. et al., 2008; Feger U. et al., 2007; Haas J et al., 2005]. Увеличение количества T per в крови больных PC в стадии ремиссии заболевания может быть связано с тем, что в дополнение к натуральным Т per, образующимся в тимусе, прибавляются индуцированные на периферии Т per. Эти клетки образуются из CD4+ Т-клеток, примированных антигеном. Необходимым условием для появления индуцированных Т per является присутствие трансформирующего фактора ростар (Transforming growth factor beta - TGFp) При этом индуцированные Т per обладают таким же фенотипом и функциями как и натуральные.

В процессе сопоставления выраженности неврологического дефицита, который в группе больных PC в целом составил 2,84±1,26 [1,0-5,5] баллов со средним содержанием Т per (1,38±0,86% [0,19;4,40]) в периферической крови этих пациентов, выявляется обратная корреляция (г=-0,7175), т.е., чем больше выражена интенсивность неврологических симптомов, которая является отражением активности иммунопатологического процесса, тем меньшее количество Т per определяется в крови больных (рис. 2).

О

6

°

"в"--!.'"' ■. в ••< ■ - 0 ■ .. о ■ -8. -■■-о ■ • ■ ■. i ....." о 8 ..... '- .о '--Q. "■• -о ' - о"--.. о

о 1 2 з 4 5 6

EDSS 95% confidence|

Рис. 2. Обратная корреляция между степенью инвалидизации (баллы) по шкале EDSS и количеством Т per в периферической крови больных PC

В группе больных PC, обследованных в динамике, получено подтверждение

этих результатов. Так, при обострении PC балл инвалидизации по шкале EDSS

составил 3,08±1,12 [1,5;5,0], при этом количество Т per было равно 0,88±0,45

[0,19; 1,90], в стадии же ремиссии содержание Т per возросло до 2,57±1,52

[0,63;5,50]% и, соответственно, уменьшилась степень выраженности

неврологического дефицита (1,55±0,57 [1,0;3,0] балла).

Выявленная в работе корреляционная зависимость между степенью

неврологического дефицита и количеством Т per в крови больных PC, вероятно,

вторичная, т.к. является проявлением активности иммунопатологических

нарушений. Иными словами, распространенность демиелинизирующего

повреждения в ЦНС зависит от пролиферативной и функциональной активности

миелин-специфических Т-клеток. Соответственно, более агрессивное течение

аутоиммунного процесса опосредует вовлечение большего объема белого вещества

головного и/или спинного мозга, что в большинстве случаев отражается в

клинической картине заболевания. У больных PC, обследованных в динамике и

получавших гормональную терапию, мы получили ту же взаимосвязь. Стадия

обострения характеризуется появлением новой или усугублением имеющейся

неврологической симптоматики, что, как мы показали, ассоциируется с

дисбалансом аутоагрессивных CD4 и CD8 Т -клеток, вследствие дефицита

16

активированных CD4+ Т-клеток, экспрессирующих CD25+, и активной пролиферацией цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), в результате чего, вероятно, происходит угнетение циркулирующих в крови Т per. В стадии ремиссии происходит снижение степени тяжести клинических проявлений, что ассоциируется с увеличением Т-клеток, секретирующих провоспалительные цитокины, и стимуляцией образования Т per.

Средняя длительность заболевания в группе больных PC составила 57,58±58,68 [3;207] месяцев. При анализе количества Т per в крови пациентов PC в зависимости от длительности заболевания получена обратная корреляционная зависимость (г=-0,6891), т.е. у длительно болеющих пациентов в периферической крови содержится меньшее число Т per (рис. 3).

Correlation: г а -6891

5.0 ---1-.-.-.-.-.-г-.-.-.-

4.0

3.5 °

й 2,5

0,0 -■-■-■-'-■-■---1- --■ "■ --

-20 О 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

длительность PC | о.. 95% confidence]

Рис. 3. Обратная корреляция между количеством регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в периферической крови больных и длительностью PC

Для уточнения этого результата, мы разделили больных PC на 2 группы: у лиц, болеющих меньше 36 (15,11±11,20 [3;35]) месяцев количество Т per составило 1,94±0,75% [0,6;4,4], в то время как в группе пациентов, болеющих более 36 (106,83±51,73 [44;207]) месяцев - 0,72±0,37% [0,19; 1,8]. Получена статистически достоверная разница в содержании Т per между этими группами больных (р=0,0001).

Таким образом, установлено, что содержание Т per в крови больных PC обратно пропорционально длительности заболевания, что, вероятно, связано с истощением регуляторных механизмов при длительно существующем аутоиммунном процессе. Эти данные подчеркивают влияние повторяющихся эпизодов активации аутореактивных клеток на иммунорегуляторное звено иммунитета

Помимо уменьшения количества Т per в крови, также важную роль в развитии иммунопатологического процесса при PC играют нарушения функциональной (супрессорной) активность этих клеток, т.е. способность Т per подавлять пролиферацию эффекторных CD4+ Т-клеток.

Нами исследована супрессорная активность Т per, выделенныех из периферической крови 7 больных PC в стадии обострения, 3 больных - в стадии ремиссии и 5 здоровых доноров.

Установлено, достоверное снижение функциональной активности Т per у больных PC как в стадии обострения (55,94±7,76% [48,90;69,60]) (р=0,004), так и в стадии ремиссии (65,20±4,92% [59,70;69,20]) (р=0,02) по сравнению с группой здоровых доноров (86,92±4,41% [79,7;91,2]). Статистически значимого отличия супрессорной активности Т per на разных стадиях аутоиммунного процесса при PC не получено (р=0,14).

Для определения супрессорного влияния Т per на эффекторные клетки рассчитывают индекс пролиферации (ИП), который представляет собой способность CD4+Т-клеток пролиферировать в отсутствии и в присутствии Т per.

Так, при определении ИП CD4+ Т-клеток в отсутствии Т per, статистически достоверные отличия наблюдались между группой доноров и больными PC как в стадии обострения (р=0,004), так и больными в стадии ремиссии (р=0,025). При сравнении значения ИП CD4+ Т-клеток на разных стадиях заболевания отмечалось статистически значимое его повышение у больных PC в стадии обострения (р=0,03).

При инкубации CD4+ Т-клеток с Т per получены достоверные различия между группой доноров и группой больных как в стадии обострения (р=0,004), так и в стадии ремиссии (р=0,025) (табл. 3).

Таблица 3

Индекс пролиферации CD4* Т-лимфоцитов и CD4* Т-лимфоцитов, инкубированных с Т per.

Пролиферативный индекс Обострение PC О) Ремиссия PC (2) Доноры (3) Р

CD4+ 1,74±0,10 [1,59;1,91] 1,56±0,05 [1,52;1,61] 0,82±0,14 [0,61;0,96] *р,.2=0,03 *Р1-з=0,004 *рг.3=0,025

CD4+/T per 0,75±0,10 [0,61 ;0,89] 0,77±0,08 [0,69;0,85] 0,16±0,04 [0,1;0,21] р..2=0,23 *ры=0,004 *Рг-з=0,025

«*» - статистически значимые отклонения

Таким образом, установлено, что способность к пролиферации CD4"" Т-лимфоцитов значительно выше у больных PC, причем, в большей степени в стадии обострения заболевания. При инкубации CD4~ Т-клеток с Т per наблюдалось подавление активности эффекторных Т-лимфоцитов, за счет проявления Т per супрессорных свойств. Однако, у больных PC эта способность значительно снижена по сравнению с донорами и не зависит от стадии заболевания.

В настоящее время установлена возможность выделения и индукции ex vivo больших количеств Т per [Hoffmann P. et al., 2004; Battaglia M. et al., 2006; Lyssik E. Y. et al, 2007; Godebu E., Summers-Torres D. et al., 2008; Thornton A.M. et al., 2010].

Считается, что полученные ex vivo (культивированные) T per высоко стабильны, долго живущие, обладают супрессорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны. Эти клетки можно размножить без потери функции и ввести в периферические участки тела с уверенностью, что они будут мигрировать в анатомический очаг воспаления [Allan S.E. et al., 2008]. В нашем исследовании индукция ex vivo Т per осуществлялась культивированием выделенных из суспензии мононуклеарных клеток (МНК) CD4+ Т-лимфоцитов s течение 6-7 дней с помощью их стимуляции анти-СОЗ и airni-CD28 в присутствии АПК и ИЛ-2. Мы располагали клеточными линиями CD4" Т-клето к 5 больных PC и 3 здоровых доноров.

В результате культивирования CD4+ Т-клеток больных и доноров получено увеличение количества регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ в десятки раз (табл. 4).

Таблица 4

Количество CD4^CD25*Foxp3* Т-клеток до и после культивирования у больных PC (А) и здоровых доноров (Б)

А.)

Количество клеток % Больные PC

До культивирования После культивирования 'Увеличение в п раз

CD4+CD25+Foxp3+ 1,10±0,48 [0,60; 1,80] 89,12±0,93 [87,9; 90,3] 95,08±41,80 [49,22; 149,5]

Б.)

Количество клеток % Доноры

До культивирования После культивирования 'Увеличение в п раз

CD4+CD25'Foxp3f 3,05±0,65 [2,50;3,77] 8943±0,85 [88,40;90,10] 30,03±5,92 [23,66;35,36]

кратность увеличения количества клеток после культивирования в течение 7 дней

С целью изучения супрессорной активности Т per после экспансии, мы сравнили способность культивированных и нативных Т per ингибировать пролиферацию клеток-мишений (CD4+) в смешанной культуре лимфоцитов.

Установлено, что у бальных PC супрессорная активность нативных (53,04±4,03% [48,2;56,8]) и культивированных Т per (55,04±4,6б% [50Д0;60,Ю]) достоверно не отличалась (р=0,94).

Таким образом, установлено, что выращенные ex vivo регуляторные Т-клетки CD4+CD25*Foxp3"' по фенотипическим и функциональным характеристикам полностью идентичны нативным Т per, выделенным из периферической крови больного, и их количество после экспансии возрастает в десятки раз

На основании, полученных нами результатов, мы предположили, что введение аугологичных (собственных) регуляторных T-кпеток CD4+CD25*Foxp3+ больным PC с целью восстановления количества этих клеток до уровня нормы может использоваться в качестве коррекции иммунных нарушений при этом заболевании.

Нами однократно проведено введение культивированных аутслогичных регуляторных Т-клеток CD4*CD25Toxp3~ пяти больным PC.

После введения выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток CD4'CD25~Foxp3+ у всех больных PC через 2 недели выявлено увеличение содержание этих клеток в периферической крови в среднем с 0,6±0,14% [0,4;0,8] до 1,4±0,44% [1,1; 1,9], (р=0,009) (табл. 5).

Таблица 5

Увеличение количества Т per в периферической крови больных PC через 2 недели после введения выращенных ex vivo Т per

Больные PC Кол-во Т per до введения, % Кол-во Т per введенных больным, х106 Кол-во Т per после трансплантации, %

М. 0,7 355 1,1

Т. 0,7 400 1,5

3. 0,4 273 1,1

ч. 0,4 250 1,4

п. 0,8 312 1,9

Таким образом, в результате пилотного исследования получено достоверное увеличение содержания Т per в крови больных PC после подкожного введения культивированных аутологичных Т per, что свидетельствует о возможности миграции этих клеток в кровь. Причем, у пациентов не наблюдалось никаких побочных реакций в ответ на инъекцию выращенных ex vivo Т per, как в первые дни, так и в течение последующих 12 месяцев наблюдения, что указывает на безопасность и потенциальную возможность применения культивированных аутологичных Т per в клинике для коррекции иммунных нарушений у больных PC.

Выводы:

1. Исследование иммунофенотипического состава крови больных PC выявило разнонаправленные изменения содержания CD4* и CD8" Т-лимфоцитов, что является отражением активности аутоиммунного процесса при этом заболевании.

2. Установлено снижение количества регуляторных Т-клеток с фенотипическими характеристиками CD4+CD25*Foxp3T в крови больных PC в целом по группе.

3. Выявлено, что больший количественный дефект Т per имеет место у больных в стадии обострения PC, а при переходе в стадию ремиссии число Т per возрастает.

4. Получено снижение супрессорной активности Т per больных PC как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.

5. Установлена обратная зависимость между количеством Т per в периферической крови больных и длительностью PC, а также между количеством Т per и тяжестью течения PC, что отражает степень активности аутоиммунного процесса.

6. Показано увеличение количества Т per в 30-90 раз с помощью их индукции ех vivo. Причем, культивированные Т per имеют фенотипические и функциональные характеристики нативных Т per.

7. В результате введения выращенных ex vivo аутологичных Т per больным PC наблюдается повышение уровня Т per в крови пациентов, при этом в течение 12-месячного периода наблюдения за больными после инъекции Т per не зарегистрировано побочных эффектов.

Практические рекомендации:

1. Снижение количества Т per можно использовать как диагностический критерий активности наступающего обострения, а повышение их количества рассматривать как прогностический тест формирования ремиссии

?.. Т per клетки CD4*CD25'tFoxp3+ можно выделить из периферической крови больного и вырастить в лабораторных условиях такое количество клеток, которое потенциально может компенсировать их дефицит в организме и, соответственно, использоваться с терапевтической целью

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишии ИА. Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+FoxP3+ при рассеянном склерозе II Нейроиммунология. - 2009. -Т. 7. - № 1. - С. 35 — 36.

2. Завалишин И.А., Елисеева Д.Д. Патогенетическая терапия рассеянного склероза // Лечащий врач. - 2009. - №9. - С. 43 - 46.

3. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишии И.А. Роль регуляторных Т-клеток в патогенезе рассеянного склероза II Жури Медицина критических состояний. - 2010. - № 5. - С. 18 - 23.

4. Елисеева Д.Д., Завалишин И.А., Быковская С.Н., Федорова Т.Н., Карандашов Е.Н., Трунова О.А. Регуляторные Т-клеткн CD4+CD25+Foxp3+ у больных ремитирующим рассеянным склерозом // Анналы клин, и эксперим. неврологии. - 2011, - Т. 5. - № 2. С. 9 -13.

5. Завалишин И.А., Переседова А.В., Стоила Н.И., Алексеева Н.С., Гулевская Т.С., Гурьянова О.Е., Арзуманяи Н.Ш., Елисеева Д.Д., Трифонова О.В., Брюхов В.В. Вопросы диагностики и лечения рассеянного склероза I/Жури неерол. и психиатрии им. С.СКорсакова. - 2011. - Т. 111. - № 6. - С. 88 - 95.

6. Завалишин И.А., Елисеева Д.Д. Лечение рассеянного склероза // Доктор.Ру. -2009,-№4.-С. 25-29.

7. D. Eliseeva, I. Zavalishin, Е. Lyssuk, Е. Karandashev, S. Bykovskaia. Pathological impairments of regulatory T cells CD4+CD25+Foxp3 in multiple sclerosis and injections of expanded ex vivo autologous T regs // Materials of 9th International Conference on New Trends in Immunosuppression and Immunotherapy, Geneva, Switzerland.-2010.-P. 37.

8. Елисеева Д.Д., Быковская C.H., Завалишин И.А. Регуляторные Т-клетки CD4"CD25^Foxp3T при ремитирующем рассеянном склерозе // Материалы V Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз: 30 лет спустя». Новосибирск. - 2011. - С. 53-58.

9. Eliseeva D., Lyssuk Е., Karandasbov Е., Zavalishin I., Bykovskaia S., Karaulov A. Expanded ex vivo regulatory T cells CD4"CD25^FOXP3+ (Tregs) can restore immune regulation in patients with remitting-relapsing multiple sclerosis (RR-MS) // Final Programme and Abstracts. V World Immune Regulation Meeting. Davos, Switzerland. -2011. P.67.

Условные сокращения:

АПК - антиген-презентируюгцие клетки

ИЛ - интерлейкин

ИП - индекс пролиферации

ИРИ - иммунологический регуляторный индекс

МНК - мононуклеарные клетки

МРТ - магнитно-резонансная томография

PC - рассеянный склероз

Т per - регуляторные Т- клетки CD4+CD25*Foxp3* ЦНС - центральная нервная система ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

CFSE - carboxyfluorescein succinimidyl ester (карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир)

EDSS - the Expanded Disability Status Scale (расширенная шкала инвалидизации) MLR - mixed lymphocyte reaction (смешанная культура лимфоцитов) TGFp - transforming growth factor beta (трансформирующий фактора роста^)

Подписано в печать 19.05.2011 г.

Заказ № 19 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Рассеянный склероз (PC) - распространенное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое поражает в основном лиц молодого возраста и почти неизбежно приводит на определенной стадии своего развития к инвалидизации. В настоящее время общепринятой остается теория о мультифакториальной этиологии PC, основанная на взаимодействии факторов внешней среды (вируса и/или другого патогена и географических факторов) и наследственной предрасположенности [Compston A., Coles А., 2002; Гусев Е.И., Бойко А.Н., 2007].

На настоящий момент концепция патогенеза PC включает выделение начальной воспалительной фазы, сопровождающейся демиелинизацией и фазы нейродегенерации [Hemmer В. et al., 2002; Neuhaus О. et al., 2003; Torkildsen O. et al., 2008].

Как известно CD4+ и CD8+ Т-клеткам принадлежит ведущая роль в развитии демиелинизирующего процесса при PC, что подтверждается их обнаружением в очагах повреждения и изменениями их содержания в крови и ЦСЖ больных [Chitnis Т., 2007; Sospedra M., Martin R., 2005].

Как продемонстрировано на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) ведущая роль в развитии аутоиммунного процесса при PC принадлежит популяции CD4 Т-клеток. Считается, что CD4 Т-лимфоциты первыми встречаются с антигеном и приобретают свойства эффекторных миелин-специфических клеток. Помимо этого, активированные CD4+ Т-клетки, вследствие продукции провоспалительных цитокинов, способствуют повышению проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), обуславливая, таким образом, один из важнейших звеньев патогенеза заболевания [Delgado S., Sheremata W.A., 2006; Hemmer В. et al., 2002].

Инициация иммунопатологических механизмов, а именно активация анэргичных, неактивных CD4+ Т-клеток происходит вне ЦНС при взаимодействии соответствующего рецептора Т-клетки и аутоантигена, связанного с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости (ГКГ- II) на антиген-презентирующих дендритных клетках, что способствует пролиферации Т-клеток [Frohman Е,М. et al., 2006]. После антиген-презентирования происходит дифференциация Т-лимфоцитов в Т-хелперы 1 и 2 типа (T-helper 1 and 2 - Thl и Th2), секретирующие про- и противовоспалительные цитокины соответственно. Тип Th определяется влиянием антигена, ко-стимуляции, а также цитокиновым профилем в окружающей среде [Dong С., Flavell R.A., 2000; Charo I.F., Ransohoff R., 2006]. Секреция провоспалительных цитокинов способствует активации других иммунных клеток — В-лифоцитов, макрофагов и других Т-клеток, что усиливает иммунный ответ [Yong V.W., 2002]. Кроме этого, цитокины данного профиля индуцируют экспрессию молекул адгезии.

Проникновение активированных CD4+ Т-клеток через ГЭБ в ЦНС осуществляется при участии хемокинов, молекул адгезии, протеаз и происходит в несколько этапов. На начальных этапах большее значение имеют хемокины, тогда как в дальнейшем взаимодействие различных типов молекул адгезии, экспрессирующихся, как на поверхности Т-лимфоцитов, так и на эндотелиальных клетках, способствуют миграции клеток через ГЭБ при участии матриксных метеллопротеиназ [Frohman Е.М., Racke М.К., Raine C.S., 2006].

В ЦНС происходит реактивация Т-клеток антиген-презентирующими клетками (АПК), в качестве которых выступают макрофаги и микроглия. Проникшие в ЦНС аутореактивные Т-клетки и вторично активированные макрофаги и микроглия также секретируют провоспалительные цитокины (интерферону (interferony - INFy), фактор некроза опухолиа (tumor necrosis factor - TNFa), лимфотоксин и др.), что еще в большей степени индуцирует и поддерживает воспалительные реакции и усиливает нарушения проницаемости ГЭБ. Активация иммунных реакций, включая макрофаги, В-лимфоциты с продукцией антител, приводит к разрушению миелиновой оболочки. Фагоцитоз поврежденных участков миелина макрофагами осуществляется при участии цитотоксических медиаторов, таких как TNFa, активных форм кислорода, метаболитов оксида азота [Hemmer В., Archelos J.J., Härtung Н-Р., 2002].

Иммуно-воспалительные изменения и демиелинизирующее поражение сопровождаются нейродегенеративным повреждением с гибелью аксонов, которое наблюдается уже на ранних стадиях заболевания и играет ключевую роль в прогрессировании PC и развитии необратимой инвалидизации пациентов [Compston A., Coles А., 2008].

В качестве вероятной причины непосредственной деструкции аксонов при PC рассматривается экспрессия на них молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости, что делает их уязвимыми к цитотоксическому влиянию CD8+ Т-лимфоцитов [McDole et al., 2006].

По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний связано не только с дифференцировкой, пролиферацией и активацией эффекторных клеток, но и с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и B-лимфоцитов к аутоантигенам [Mills К.Н. et al., 2004]. Поддержание иммунной толерантности опосредуется несколькими механизмами. Один из них связан с делецией аутореактивных клонов в тимусе за счет негативной селекции (центральная толерантность), а другой - с индукцией анергии периферических клонов аутореактивных Т-лимфоцитов (периферическая толерантность) [Gotter J., Kyewski В., 2004],

Т-клетки, обладающие способностью подавлять аутоантиген-специфическую пролиферацию и эффекторные функции аутореактивных лимфоцитов принадлежат к субпопуляции CD4+ Т-клеток [Baecher-Allan С., 2001]. При этом, ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют регуляторные Т-клетки с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ (Т per). Т per в норме составляют 5-10 % от общего числа CD4+ Т-клеток в тимусе, периферической крови и лимфоидных тканях. Т per созревают в тимусе и на 3-4 день неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоидные органы [Sakaguchi S. et al., 1995].

Характерными маркёрами Т per, которые позволяют идентифицировать эту небольшую субпопуляцию лимфоцитов, являются постоянная экспрессия на мембране клетки альфа-цепи рецептора интерлейкина 2 (interlekin 2 - IL-2) - CD25+ [Sanchez J., Casano J., Alvarez M.A. et al., 2004] и экспрессия продукта гена Foxp3, который кодирует их дифференцировку и функциональную активность [Hon S. et al., 2003, Fontenot J.D. et al., 2003].

T per играют важную роль в развитии различных типов иммунного ответа, включая иммунитет к аутоантигенам, трансплантатам, аллергенам, опухолям и инфекциям [Насонов Е.Л., Быковская С.Н., 2006, Takahashi Т.,1998, Shevach Е.М., 2001].

У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение количества Т per и нарушение их функции. Так, дефект Т per показан у больных системной красной волчанкой [Lyssik E.Y. et al.,2007], сахарным диабетом 1 типа [Dejaco С. et al., 2006], псориазом [Sugiyama Н. et al., 2005], ревматоидным артритом [Pohlers D.et al., 2007]. В последнее время появились работы, посвященные изучению роли Т per в патогенезе рассеянного склероза [Haas J. et al., 2005, 2007; Venken К. et al.,2007,2008, 2010; Feger U. С et al., 2007].

Проведенные в настоящее время исследования показали, что имеется возможность увеличить количество Т per, выделенных из крови пациента, культивированием их в условиях ex vivo [Selvaraj R.K., Geiger T.L., 2008; Allan S.E. et al., 2008]. При этом, полученные культивированием Т per высоко стабильны, долго живущие, обладают супрессорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны и введение этих клеток пациенту с целью восстановления Т per в крови больного до уровня нормы может стать инструментом коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях [Peters J.H. et al., 2008; Thornton A.M. el., 2010].

Проведены пилотные испытания по введению аутологичных культивированных Т per больным системной красной волчанкой [Lyssik Е. Y. et al., 2007], диабетом 1-го типа [Godebu Е., Summers-Torres D. et al., 2008], пациентам с реакции трансплантант-против хозяина после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [Корсунский И.А. и соавт., 2008; Riley J.L. et al., 2009]. При этом, получено достоверное увеличение количества Т per в периферической крови этих больных, которое коррелировало с улучшением клинических показателей и не вызывало побочных реакций у больных.

В последнее время появились работы, посвященные изучению роли Т per в патогенезе рассеянного склероза [Haas J. et al., 2005, 2007; Venken К. et al., 2007, 2008, 2010; Feger U. C. et al., 2007].

Установлено, что T per играют определенную роль в нарушении регуляторных механизмов в аутоиммунитете, приводящих к развитию и прогрессированию PC. В то же время, результаты исследований количества и функциональной активности при PC отличаются значительной разноречивостью, что обусловлено недостаточностью сопоставлений количества и функциональной активности Т per с клинической картиной заболевания. Помимо этого, в настоящее время имеются лишь единичные описания результатов культивирования Т per больных PC, а попыток использования Т per в терапевтических целях при этом заболевании не проводилось.

В связи с вышеизложенным были сформулированы цели и задачи исследования.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является изучение роли регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в патогенезе рассеянного склероза.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать состояние клеточного иммунитета больных ремитирующим

PC путем изучения содержания основных субпопуляций лимфоцитов фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD16+56+, CD19+) на различных этапах заболевания.

2. Изучить количество регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp31 в крови больных PC в зависимости от стадии заболевания (обострение, ремиссия), длительности и тяжести его течения.

3. Изучить функциональную активность Т per у больных PC в стадии обострения и ремиссии.

4. Провести культивирование аутологичных Т per, выделенных из крови больных PC, с целью получения линий этих клеток (индукция Т per ex vivo) и сравнить их фенотипические и функциональные характеристики с нативными Т per.

5. Выполнить введение выращенных ex vivo регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ для коррекции иммунных нарушений у больных PC, от которых эти клетки были получены.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые исследовано количество и функциональная активность регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных PC в зависимости от стадии заболевания. При этом, установлены значимые корреляции стадии демиелинизирующего процесса с количеством Т per. Проведено культивирование аутологичных Т per путем их индукции ex vivo и доказана идентичность культивированных и нативных клеток, выделенных из крови больного. Впервые выполнено введение выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток с целью коррекции иммунных нарушений у больных PC. Выявлено, что введение аутологичных (собственных) Т per больным приводит к увеличению содержания циркулирующих Т per в крови и хорошо переносится пациентами, и может в дальнейшем рассматриваться как потенциальный подход к терапии этого заболевания.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты проведенного исследования имеют значение в плане понимания роли регуляторных механизмов в патогенезе рассеянного склероза. Полученные данные расширяют существующие представления о взаимосвязи количественного и функционального дефекта регуляторных Т-клеток в механизмах формирования иммунопатологического процесса при этом заболевании.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Снижение количества и функциональной активности Т per можно использовать как диагностический показатель наступающего обострения, а повышение их количества рассматривать как прогностический тест формирования ремиссии, что может рассматриваться как новый диагностический критерий определения активности патологического процесса при PC.

Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+Foxp3+ можно выделить из периферической крови больного и вырастить в лабораторных условиях такое количество клеток, которое может компенсировать их дефицит в организме и соответственно в дальнейшем использоваться с терапевтической целью.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Иммунофенотипическое исследование крови больных PC выявило дисбаланс CD4+ и CD8' Т-клеток за счет повышения количества CD8+ Т-клеток.

2. Выявлено снижение количества Т per в крови больных PC в целом по группе. Установлено, что в стадии обострения PC количество Т per значительно снижено, а переход в стадию ремиссии заболевания характеризуется ростом их числа.

3. Отмечено снижение функциональной активности Т per, выделенных из периферической крови больных PC, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.

4. Установлена обратная зависимость между количеством Т per и степенью инвалидизации и длительностью PC, что является отражением степени активности иммунопатологического процесса.

5. В результате культивирования аутологичных Т per больных количество этих клеток увеличивается в десятки раз. При этом, культивированные Т per по фенотипическим и функциональным характеристикам идентичны нативным. Введение выращенных ex vivo аутологичных Т per больным PC позволяет повысить уровень Т per в крови больных и не вызывает побочных эффектов.

ВЫВОДЫ

1. Исследование иммунофенотипического состава крови больных PC выявило разнонаправленные изменения содержания CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, что является отражением активности аутоиммунного процесса при этом заболевании.

2. Установлено снижение количества регуляторных Т-клеток с фенотипическими характеристиками CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных PC в целом по группе.

3. Выявлено, что больший количественный дефект Т per имеет место у больных в стадии обострения PC, а при переходе в стадию ремиссии число Т per возрастает.

4. Получено снижение супрессорной активности Т per больных PC как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.

5. Установлена обратная зависимость между количеством Т per в периферической крови больных и длительностью PC, а также между количеством Т per и тяжестью течения PC, что отражает степень активности аутоиммунного процесса.

6. Показано увеличение количества Т per в 30-90 раз с помощью их индукции ex vivo. Причем, культивированные Т per имеют фенотипические и функциональные характеристики нативных Т per.

7. В результате введения выращенных ex vivo аутологичных Т per больным PC наблюдается повышение уровня Т per в крови пациентов, при этом в течение 12-месячного периода наблюдения за больными после инъекции Т per не зарегистрировано побочных эффектов.