Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Роль ПЦР-диагностики в проблеме верификации диагноза краснухи
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.01.09
Автореферат диссертации по медицине на тему Роль ПЦР-диагностики в проблеме верификации диагноза краснухи
На правах рукописи
Дарвина Ольга Валерьевна
Роль ПЦР - диагностики в проблеме верификации диагноза
краснухи
14.01.09 - инфекционные болезни
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2011
2 4 [у;др 20(1
4841338
Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственны Медицинский Университет имени И.М.Сеченова
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор
Волчкова Елена Васильевна
Кандидат медицинских наук
Чуланов
Владимир Петрович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник
Ермак
Татьяна Никифоровна
Доктор медицинских наук, профессор
Погорельская Лидия Васильевна
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский Университет Дружб' Народов»
заседании диссертационного совета
Московского Государственного Медицинского Университета имен И.М.Сеченова Росздрава (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, дом 8,стр.2).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиоте ПМГМУ им. И.М.Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, до 49).
Защита диссертации состоится
Автореферат разослан
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор
Волчкова Елена Васильевн
Актуальность темы диссертации
Широкая распространенность вируса краснухи, высокая восприимчивость человека, преимущественное поражение детей, подростков и молодых взрослых, в том числе женщин детородного возраста, риск возникновения врожденных патологий при инфицировании беременных, определяют значение своевременной диагностики краснухи как актуальную проблему для здравоохранения многих стран мира.
Согласно программе Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), краснуха отнесена к числу нозологии, ликвидация которых возможна в ближайшем будущем. Региональный комитет ВОЗ для Европы признал элиминацию краснухи и предотвращение случаев врожденной краснушной инфекции приоритетной задачей программы "Здоровье для всех в XXI веке", а так же Стратегического плана Европейского региона ВОЗ 2005-2010 гг.
Известно, что симптомокомплекс, характерный для краснухи (полилимфаденопатия, синдром сыпи) может наблюдаться при заболеваниях, вызванных другими возбудителями, такими как вирус кори, парвовирус В19, аденовирусы, энтеровирусы. Инаппарантная форма краснухи среди взрослых составляет более чем 50% от всех случаев заболевания, при этом во время беременности доля этой формы достигает 75-80%. Учитывая разнообразие и неспецифичность клинических проявлений краснухи, наличие острых и стертых форм заболевания, повсеместную распространенность, риск возникновения врождённой патологии плода, своевременная, доступная лабораторная диагностика данного заболевания приобретает особое значение.
Традиционно первостепенную роль в лабораторной диагностике краснухи отводят серологическим методам, направленным на обнаружение специфических антител, в частности иммуноферментному анализу (ИФА). Но данные методы получили распространение преимущественно в акушерской практике. Причём, первичное инфицирование определяется путем выявления вирусоспецифических антител класса ^М, сероконверсии или 4-кратного и
более увеличения титра антител класса IgG в парных сыворотке периферической крови. Для уточнения срока давности развития инфекционног процесса, дифференциации первичной инфекции от вторичной, проводите определение авидности антител класса IgG к антигенам вируса краснухи Однако при анализе результатов тестирования часто возникают затруднения расшифровке полученных данных. Это может быть обусловлено парадоксальн ранним появлением краснушных антител класса IgG, возможность длительного персистирования антител класса IgM в периферической крови течение многих месяцев и даже лет (особенно после вакцинации), а такж наличием перекрестных, неспецифических реакций. В этих ситуациях различных диагностических и научно-исследовательских центрах развиты стран мира в качестве подтверждающего теста успешно применяютс молекулярно-биологические методы (ПЦР), направленные на прямо обнаружение РНК вируса краснухи (Rubella virus) .
Необходимость улучшения клинической и лабораторной диагностик заболевания краснухой становится всё более значимой, учитыв изменяющиеся условия окружающей среды, полиморфизм клинически, проявлений краснухи, трудности в дифференциально-диагностическом поиске Наиболее перспективным является применение на практике молекулярно генетических методов диагностики и, прежде всего полимеразной цепно реакции, которая позволяет выявлять наличие РНК вируса краснухи с первы дней острого периода заболевания. Количество исследований, посвященны изучению характера клинико-лабораторных проявлений краснухи зависимости от стадии инфекционного процесса у взрослых пациентов в наше стране очень ограничено. Нуждается также в уточнении диагностическа значимость при краснухе специфических методов ИФА и ПЦР диагностики н различных стадиях инфекционного процесса.
Всё это определяет актуальность изучения роли ПЦР-диагностики верификации и ранней постановке диагноза краснухи, что позволи
своевременно выявлять, изолировать больных и предпринимать необходимые меры профилактики.
Цель исследования: изучение у больных краснухой в разные сроки заболевания информационной значимости выявления РНК Rubella virus методом ПЦР в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки) в сопоставлении с рутинными серологическими методами исследования.
В соответствии с целью работы были сформулированы следующие задачи.
Задачи исследования:
1.Изучить у больных краснухой в динамике инфекционного процесса в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки) наличие РНК Rubella virus по данным молекулярно-генетического исследования (ПЦР).
2.Исследовать продолжительность персистенции вируса краснухи в различных биологических средах организма в динамике заболевания.
3.Изучить динамику серологических маркеров у больных краснухой (антитела класса IgM и IgG, авидности антител класса IgG ) на различных этапах заболевания.
4.Определить диагностическую значимость серологической и ПЦР диагностики (выявление РНК Rubella virus) у больных краснухой в различные периоды инфекционного процесса в биологических средах организма.
5.Проанализировать клинические и лабораторные данные у больных краснухой в сопоставлении с данными серологических и молекулярно-генетических (ПЦР) исследований на различных этапах заболевания.
Научная новизна.
Впервые методом ПЦР у больных краснухой определена длительность персистенции вируса краснухи в различных биологических средах организма
(плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазок из ротоглотки и носоглотки).
Доказана информативность выявления РНК Rubella virus в слюн больных методом ПЦР по сравнению с аналогичными исследованиями плазме, лейкоцитах периферической крови, мазках из ротоглотки и носоглотки больных краснухой, что носит приоритетный характер.
Установлено, что диагностическая концентрация РНК вируса краснух! определяется в слюне уже с 1 дня появления сыпи и сохраняется до 10 дня, в т время как в плазме и лейкоцитах периферической крови данная концентраци сохраняется только до 6 дня после появления сыпи, что позволяет по новом взглянуть на эпидемиологические особенности распространения вирус краснухи.
Впервые, на основании комплексных исследований, установлено, чт метод ПЦР может использоваться для верификации диагноза краснухи н ранних стадиях заболевания (1-2 сутки от появления сыпи) и пр диагностически неясных случаях.
Практическая значимость.
На основании полученных результатов можно рекомендовать дл своевременной диагностики в раннем периоде заболевания краснухо использовать информативный и неинвазивный метод лабораторно диагностики - исследование слюны на выявление РНК Rubella viru молекулярно-генетическим методом (ПЦР).
Для дифференциального диагноза первичного инфицирования вирусо краснухи от перенесенного ранее заболевания, учитывая вероятност парадоксально раннего появления антител к вирусу краснухи класса IgG возможной длительной персистенции антител класса IgM можно рекомендоват определение авидности антител класса IgG для уточнения давност заболевания, что позволяет дифференцировать первичную инфекцию о перенесенной.
Проведенное исследование позволило установить сроки оптимального применения серологических и ПЦР методов для верификации диагноза краснухи.
Полученные результаты исследования позволяют рекомендовать использование ПЦР диагностики для верификации диагноза краснухи в практике врачей инфекционистов, врачей детских учреждений, а также акушеров - гинекологов.
Основные положения, выносимые на защиту диссертации.
1. Результаты молекулярно-генетического исследования у больных краснухой позволили выявить наличие РНК вируса краснухи в различных биологических материалах (плазме, клетках крови (лейкоциты периферической крови), слюне и мазках из ротоглотки и носоглотки) но наиболее продолжительно и с большей достоверностью в слюне.
2. Установлено, что выявление РНК Rubella virus в слюне возможно с 1по 10 день от появления сыпи, тогда как в плазме и лейкоцитах до 6 дня.
3. Выявлено, что диагностика краснухи методом ПЦР наиболее значима в первые 2 суток после появления сыпи, а значение серодиагностики растет после 2 дня от появления сыпи.
4. Результаты комплексного исследования больных краснухой позволили подтвердить значимость определение авидности антител класса IgG для установления давности инфекционного процесса.
Результаты внедрения в практику.
Результаты проведенного исследования и практические рекомендации используются на кафедре инфекционных болезней ПМГМУ им. И.М.Сеченова и ЦНИИЭ Роспотребнадзора города Москвы. Результаты исследования внедрены в лечебную деятельность инфекционных отделений инфекционной клинической больницы №2 г. Москвы
Апробация диссертации.
Апробация работы состоялась 3 июня 2010 г. на заседании кафедры инфекционных болезней медико-профилактического факультета ПМГМУ имени И.М. Сеченова.
Материалы диссертационной работы были доложены на заседании московского общества врачей-инфекционистов (11 мая 2010 года, ИКБ №1, г. Москва).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 3 научных работы.
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав по материалам исследования, заключение, выводы и практические рекомендации. Диссертация изложена на 135 листах машинописного текста. Библиографический указатель содержит 122 источника литературы (47 отечественных и 75 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 27 рисунками, 3 фотографиями.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Набор материала проводился с 24.05.2006 по 10.07.2007 года на баз боксовых отделений инфекционной клинической больницы №2 г. Москвы.
Критериями включения в исследования являлось наличие входног диагноза краснухи при поступлении в ИКБ №2 или наличи симптомокомплекса клинических признаков схожих с клиническим проявлениями краснухи на момент поступления в ИКБ № 2.
В рамках данной работы всего обследовано 87 (100%) человек, из них 7 мужчин (85%) и 13 женщин (15%). По возрасту, пациенты распределялис следующим образом: от 14 до 17 лет - 13 человек, от 18 до 23 лет - 69 человек от 24 до 29 лет - 4 человека и 1 больной в возрасте 42 лет.
Первоначально при поступлении в ИКБ № 2 все пациенты были разделены на 2 группы. I группа - 62 (71,3%) пациента, поступили в ИКБ № 2 с входным диагнозом краснуха. Остальные 25 (28,7%) обследованных больных поступили в стационар с различными направительными диагнозами и составили II группу.
Госпитализация больных в стационар осуществлялась с 1 по 4 день болезни, в большинстве случаев с 1 по 2 день, т.е. с момента появления первых клинических симптомов (сыпь, лихорадка различной степени выраженности, лимфаденопатия). В первый день болезни было госпитализировано 39 (45%) пациентов, на 2 день болезни госпитализировано 34 (39%) пациентов, на 3 день болезни 9 (10%) пациентов, на 4 день болезни 4 (5%) пациентов. На 5 день болезни был госпитализирован 1 пациент.
Больные наблюдались в периоде разгара заболевания, что совпадало с поступлением в стационар; ранней реконвалесценции (первый день нормальной температуры и/или исчезновение сыпи), перед выпиской из стационара, что соответствовало клиническому выздоровлению. Динамическое наблюдение и сбор клинического материала проводили трехкратно на первый, третий и пятый дни госпитализации. При этом первому дню госпитализации (период разгара заболевания) соответствовали 1-5 дни от момента появления сыпи, третьему дню (период ранней реконвалесценции) — 3-8 дни, пятому (клиническое выздоровление) — 5-10.
Пациентам проводились лабораторные исследования на базе клинической, биохимической и серологической лабораторий ИКБ № 2 по общепринятым методикам: развернутый клинический анализ крови (гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, лейкоцитарная формула и СОЭ), клинический анализ мочи, биохимические исследования (билирубин, ACT, АЛТ), RW, ВИЧ.
На базе лаборатории молекулярных методов отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии (ОМДиЭ) ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора г.
Москвы всем больным в динамике заболевания были проведены серологические и молекулярно-генетическис исследования методом ПЦР. Идентификацию РНК вируса краснухи в образцах плазмы и лейкоцитов периферической крови, слюны, мазков из носо- и ротоглотки проводили методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов анализа в режиме реального времени. Для тестирования использовали набор реагентов "АмплиСенс® Rubella virus — FL", разработанный в ФГУН "ЦНИИЭ" Роспотребнадзора (Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05501). Аналитическая чувствительность — 400 копий РНК вируса краснухи в мл, аналитическая специфичность — 100%.
Дополнительно мазок из носа, мазок из ротоглотки, пробы слюны и плазмы тестировались на ДНК парвовируса В19 (В19), ДНК вируса герпеса VI типа (HHV6), ДНК цитомегаловируса (CMV), ДНК вируса Эпштейна-Барр (EBV) методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени. Исследования проводились на тест-системах производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора: «АмплиСенс® Parvovirus В19 -FL», «АмплиСенс® CMV/EBV/HHV6-FL».
Серологические исследования, направленные на выявление специфических антител к антигенам Rubella virus классов IgM (качественное), IgG (количественное) и определение индекса авидности выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого использовали коммерческие ИФА тест-системы производства "Diagnostic systems Laboratories", INC (CILIA) и "Euroimmun AG" (Германия).
Дополнительно сыворотки крови всех больных были исследованы на наличие антител к антигенам кори, эпидемического паротита и парвовируса В19 классов IgM (качественным) и IgG (количественным) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), с помощью коммерческих ИФА тест-систем производства "Diagnostic systems Laboratories", INC (CILIA) и Biotrin, (Ирландия).
Исследования методом ПЦР диагностики на наличие вирусов краснухи, В19, HHV6, CMV, EBV, серологическое обследование на корь, эпидемический паротит, проводилось больным однократно при поступлении.
Клинические и лабораторные показатели регистрировались в специально разработанной карте и обрабатывались на персональном компьютере с использованием пакета программ Microsoft Excell (2003) корпорации Microsoft. При значительных колебаниях значений внутри групп указывалась медиана и стандартное отклонение (М ±s). Частотные признаки (число лиц с наличием или отсутствием признака) выражались в процентах.
Результаты исследования и их обсуждение.
Диагностика РНК Rubella virus методом ПЦР в различных биологических средах (в плазме, клетках крови - лейкоцитах периферической крови, в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки) в различных сочетаниях проводилась всем 87 (100%) обследованных нами больных.
В результате полного комплексного обследования в I группе (62 пациента) больных окончательный диагноз краснухи был подтвержден у 60 пациентов на основании клинико-анамнестических и специфических лабораторных тестов (положительной ПЦР и серологических реакций). На основании клинико-лабораторных данных и отрицательных данных ПЦР к Rubella virus диагноз краснухи отвергнут у 2 пациентов и поставлен другой диагноз: ОРВИ - без лабораторного подтверждения.
Во II группе больных (25 больных) после получения результатов ПЦР диагностики и данных специфических серологических реакций диагноз краснуха был окончательно поставлен у 16 пациентов, остальным 9 больным выставлены другие диагнозы: корь- 2 больным с лабораторным подтверждением; аденовирусная инфекция - 1 больной, ОРВИ -5 пациентам, Скарлатина - 1 пациент (всем больным без лабораторного подтверждения).
В результате проведенного комплексного клинико-лабораторного обследования диагноз краснухи из 87 (100%) обследованных больных был поставлен 76 (87%) пациентам.
Окончательно в исследование вошли 76 больных (64 мужчины и 12 женщин), у которых в результате комплексных молекулярно-генетических и специфических серологических реакций был подтвержден диагноз краснухи. Больные распределились по возрасту следующим образом: группа от 14 до 17 лет - 12 больных (15%), от 18 до 23лет - 60 больных (79%), от 24 до 29 лет -3 больных и 1 больная в возрасте 42 лет. Самую большую группу составили лица в возрасте от 18 до 23 лет. Средний возраст пациентов составил 19,5 лет.
Среди клинических симптомов, выраженных в периоде разгара заболевания, лихорадка была у 57 (75%) пациентов, полилимфоаденопатия и сыпь у 76 (100%) больных, заложенность носа у 72 (82%), боль в горле - 45 (60%) пациентов, налеты в ротоглотке- 1 больного, увеличение глоточных миндалин у 20 (26%) больных, гепатомегапия у 2, артлалгии у 6 пациентов, катаральные явления у 67 (88%)больных, энантема у 12 (16%) больных. Гиперемия лица - симптом «красного лица» или «симптом пощечин» общепризнанный симптом патогномоничный для В19 всего лишь у 5 больных, инъекция сосудов склер у 57(75%) больных.
Таким образом, клиническая картина наших больных в целом соответствует общепринятым представлениям о течении заболевания краснухой.
У 62 (81%) больных краснухой в периоде разгара заболевания в клиническом анализе крови уровень лейкоцитов был в пределах нормы. Наблюдалось небольшое снижение числа лейкоцитов у 9 (12%) пациентов, умеренный лейкоцитоз имел место у 5 (7%) пациентов. Среднее значение уровня лейкоцитов соответствовал норме - 5,7 кл ±2,25 кл х 109/л (M±s). По нашим наблюдениям, у большинства пациентов, 52 (70%) из 76(100%) больных, уровень лимфоцитов был в пределах нормы. Лимфоцитоз установлен у 12
(15%) больных. Среднее значение лимфоцитов в периферической крови составило 27±10,06 % (Mis), моноцитов 8±3,443 % (Mis). Ускорение СОЭ было выявлено у 4 пациентов, достигнув максимального значения 24 мм/ч у 1 больного. Следовательно, у большинства больных краснухой в периоде разгара заболевания гематологические показатели остаются в пределах нормы. В анализе мочи отмечалась незначительная альбуминурия, лейкоцитурия и микрогематурия. В дальнейшем все показатели нормализовались.
По данным зарубежных авторов, ПЦР диагностика на выявление РНК Rubella virus, рекомендуется с 1 до 4 суток с момента появления сыпи, в сыворотке крови, мазках из ротоглотки, в слюне, причём отсутствуют данные по преимуществам присущим тем или иным способам выявления. Данных по продолжительности выявления РНК R. virus в различных биологических средах организма в доступной отечественной литературе мы не нашли. Для решения вопроса об информационной значимости выявления РНК Rubella virus методом ПЦР в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки) в сопоставлении с рутинными серологическими методами исследования проведено соответствующее обследование 76 больных с краснухой.
В результате молекулярно-генетических исследований (ПЦР) биологических образцов больных краснухой с 1 по 4 день после появления сыпи, РНК вируса краснухи определялась в плазме, лейкоцитах периферической крови, в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки с различной частотой, но наибольший процент выявления РНК Rubella virus у обследованных был в слюне(76%), сохраняясь на высоком уровне до 4 дня от появления сыпи. Тогда как наименьший процент обнаружения РНК Rubella virus был определен в плазме(19%) и лейкоцитах(17%) периферической крови, (таб. №1)
Таблица №1.
Результаты молекулярно-генетических исследований биологических образцов от _больных краснухой с 1 по 4 день после появления сыпи._
Вид биологического образца 1-4 день
Количество обследованных больных (п) Количество проб Количество положительных проб % положительных проб
Лейкоциты 29 41* 7 17**
Плазма 65 86* 17 19**
Слюна 71 96* 73 76**
Мазок из ротоглотки 72 97* 41 42**
Мазок из носоглотки 55 79* 40 50**
"примечание - часть больных обследовалась двукратно. ** примечание - указаны пробы с подтвержденным наличием РНК Rubella virus
Аналогичных исследований в отечественной литературе мы не встретили.
Таким образом, можно сделать вывод, что при сравнении результатов ПЦР диагностики на наличие РНК Rubella virus в различных биологических средах (плазма крови, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из рото- и носоглотки) исследование слюны на выявление РНК Rubella virus методом ПЦР достаточно информативно. Представленные данные позволяют рекомендовать использование слюны как наиболее информативного биологического материала для подтверждения наличия РНК Rubella virus методом ПЦР, с целью подтверждения клинического диагноза краснуха в ранние сроки заболевания.
Молекулярно-генетических исследования (ПЦР) биологических образцов больных краснухой с 5 по 10 день после появления сыпи подтвердили наличие РНК Rubella virus в плазме, лейкоцитах периферической крови, в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки с различной частотой, но наиболее продолжительно и у большинства из обследованных вирус краснухи выявлялся в слюне (31%). Тогда как наименьший процент обнаружения РНК Rubella virus был установлен в плазме (2%) и лейкоцитах (6%) периферической крови. Наличие РНК Rubella virus в слюне подтверждалось до 10 дня после появления сыпи. Таким образом, определение РНК вируса краснухи в слюне методом ПЦР позволяет раскрыть
эпидемиологические особенности распространения вируса краснухи в папуляции. (таб.№2).
Таблица №2
Результаты молекулярпо-генетических исследований биологических образцов больных _краснухой с 5 по 10 день после появления сыпи._
Вид биологического образца 5-10 день
Количество больных (п) Количество проб Количество положительных проб % положительных проб
Лейкоциты 23 32* 2 6**
Плазма 70 112* 2 2**
Слюна 71 115* 36 31**
Мазок из ротоглотки 67 106* 16 15**
Мазок из носоглотки 55 88* 12 13**
♦примечание - часть больных обследовалась двукратно. ** примечание - указаны пробы с подтвержденным наличием РНК Rubella virus
Молекулярно-генетические исследования (метод ПЦР) биологических
образцов больных краснухой с 11 по 12 день после появления сыпи дали отрицательный результат, что подтвердило продолжительность персистенции РНК вируса краснухи в различных биологических материалах не позже 10 дня после появления сыпи.
Исследование слюны методом ПЦР с 1 по 12 день с момента появления сыпи у больных краснухой выявило, что наиболее большой процент выявления РНК Rubella virus приходится на первые 3 дня синдрома сыпи (до 100% ), далее прослеживается тенденция к его уменьшению (таб. №3, рис. №1.)
Таблица №3
Результаты молекулярно-геиетического исследования слюны у больных краснухой на _наличие РНК вируса краснухи с 1 по 12 день от появления сыпи._
Дни от появления сыпи
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Количество 2 41 30 33 25 28 28 23 9 3 1 2
больных
% 100 85 81 60 52 35 21 17 11 6 0 0
положительных
результатов
I
-i Рис1. Результаты молекулярно-генетического исследования (ПЦР) слюны у больны;
краснухой на наличие РНК Rubella virus с I по 12 день после появления сыпи.
Анализ частоты обнаружения РНК вируса краснухи в различном клиническом материале при помощи ПЦР в разные сроки заболевания показал что наиболее информативным в первые четыре дня с момента появления сыпи (период разгара заболевания) оказалось выявление РНК R. virus в слюне Следует отметить, что с пятого дня после появления сыпи частота обнаружени РНК вируса краснухи значительно снижалась во всех типах клинического материала. Полученные данные не противоречат результатам многолетию исследований отечественных и зарубежных авторов, подтверждающих то, чтс, вирус краснухи с наибольшей вероятностью может быть выявлен из образцов собранных впервые 3-5 дней от момента появления сыпи.
Í
Проведенный анализ результатов данного исследования свидетельствуем о том, что применение молекулярно-биологических методов (ПЦР), направленных на выявление РНК Rubella virus в различном клиническое материале (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из hoco- ¿ ротоглотки) позволяет в короткие сроки при однократном тестировании лабораторно подтвердить диагноз краснухи в первые дни заболевания.
120% 100% 80% 4
60% I
40% 20% 4 0%
HXL
1
5 7 Дни
11
□ % положительных проб на РНК Rubella
virus
Для решения поставленной задачи изучения динамики серологических маркеров у больных краснухой были проведены иммунологические тесты на определение специфических антител к вирусу краснухи классов IgM, IgG.
Антитела к антигенам Rubella virus класса IgM до 4 дня от появления сыпи были выявлены у 47 пациентов, количество положительных проб составило 59%, причём вирусоспецифические антитела этого класса присутствовали в сыворотке крови начиная со 2 дня болезни всего лишь у 11 человек. Антитела к антигенам R. virus класса IgG до 4 дня от появления сыпи были обнаружены у 38 пациентов начиная со 2 дня от появления сыпи, что составило 43% положительных проб (таб. №4).
Таблпца№4
Результаты серологических исследовании у больных краснухой на наличие специфических антител классов и ^вс 1 по 4 и с 5 по 10 день после появления __сыпи.
Специфические серологические реакции 1-4 день после появления сыпи
Количество обследованных больных Количество проб Количество положительных проб % положительных результатов
Антитела класса 69 92* 55 59
Антитела класса 180 71 94* 41 43
Специфические серологические реакции 5-10 день после появления сыпи
Количество обследованных больных Количество проб Количество положительных проб % положительных результатов
Антитела класса 68 115* 110 95
Антитела класса ДО 68 115* 105 91
♦примечание - часть больных обследовалась двукратно.
В результате проведенных исследований серологических маркеров у
больных краснухой с 5 по 10 день после появления сыпи антитела к антигенам Rubella virus класса IgM были определены у 65 пациентов, что составило 95% положительных проб. Антитела к антигенам Rubella virus класса IgG с 5 по 10 день от появления сыпи были установлены у 65 пациентов, что составило 91%
положительных проб, т.е. прослеживалась тенденция к нарастанию количеств положительных проб с одновременным ростом титра антител к антигенам R virus класса IgG (таб. №4).
Таким образом, диагностическое значение определени вирусоспецифических антител для подтверждения диагноза краснух увеличивается со сроком болезни.
При серологическом исследовании на антитела к антигенам вирус краснухи классов IgM и IgG с 11 по 12 день синдрома сыпи положительны результат достиг 100%. Следовательно, результаты наших исследовани показывают, что для верификации диагноза краснухи диагностическ значимость серологических методов исследования возрастает на поздни сроках заболевания краснухой.
Результаты серологических исследований сыворотки крови у больны краснухой на наличие специфических антител к антигенам Rubella virus класс IgM с 1 по 12 день от появления сыпи показали, что в первый день синдром сыпи антитела к антигенам R.virus класса IgM не определялись в 100% случаев Начиналось со 2 дня после появления сыпи количество положительных про увеличилось до 42%. К 5-6 суткам синдрома сыпи количество положительны проб, подтверждающих наличие специфических антител к антигенам R.viru класса IgM достигло 100% и в дальнейшем сохранялось на высоком уровне. П результатам серологических исследований сыворотки крови у больны краснухой на наличие специфических антител к антигенам Rubella virus класс IgG 1 по 12 день от появления сыпи мы видим, что количество положительны проб подтверждающих наличие специфических антител к антигенам R.viru класса IgG резко возрастает с 4-5 дня после появления сыпи, достиг максимальных значений к 7-8 дню, в дальнейшем сохраняясь на данном уровн (таб. №5, рис. №2, 3).
Таблица№5
Результаты серологических исследований сыворотки крови на наличие антител класса
^М у больных краснухой с 1 по 12 день от появления сыпи.
Дни от появления сыпи
1 2 3 4 5 6 7 8 9-12
Количество 2 34 24 32 23 29 25 24 14
больных
Количество 0 14 18 30 23 29 24 22 12
положительных
проб на 1дМ АТ
% 0 41 75 93 100 100 96 91 85
положительных
результатов
Дни от появления сыпи
1 2 3 4 5 6 7 8 9- 12
Количество 2 34 26 32 23 29 25 24 14
больных
Количество 0 12 10 22 18 26 24 24 14
положительных
проб на АТ
% 0 35 38 68 78 89 96 100 100
положительных
результатов
120% 100% 80% 60% 40% 20%
□ % положительных проб на 1дМ_
1 2 3 4 5 6 7
ДНИ
912
Рис.2. Результаты серологических исследований сыворотки крови на антитела к антигенам вируса краснухи класса ^М у больных краснухой с 1 по 12 день синдрома сыпи.
120% 100% 80% 60% 40% 20% 0%
1 2 3 4 5 6 7
□ % положительных проб на 1дО
912
Рис.3. Результаты серологических исследований сыворотки крови на антитела к антигенам вируса краснухи класса у больных краснухой с 1 по 12 день синдрома сыпи.
При проведении рутинных серологических исследований могут возникат сложности в расшифровке полученных данных и установлении стади инфекционного процесса. Учитывая возможность длительной персистенци специфических IgM после первичной инфекции, парадоксально ранне появление специфических антител класса IgG, для уточнения срока давност развития инфекционного процесса целесообразно определять авидность IgG антигенам вируса краснухи (ВОЗ 2005-07гг.). Нами также была определен авидность вирусоспецифических антител класса IgG. Антитела с низко авидностью (индекс авидности до 40%), позволяющие говорить об остро! инфекции были определены у 73 (87%) из 83 больных. Высокая авидност выявлена у 10 (12 %) пациентов, т.е. эти антитела носили анамнестически! характер и не имели отношения к данному заболеванию. Нами была выделен группа из 17 пациентов, у которых по результатам серологически исследований до 4 дня синдрома сыпи было подтверждено наличи специфических антител к Rubella virus класса IgG, тогда как специфически антитела к Rubella virus класса IgM выявлены не были. Для уточнения срок давности развития инфекционного процесса целесообразно было определит авидность антител к Rubella virus класса IgG. Проведенное нами исследовани индекса авидности показало наличие низкоавидных антител у 7 пациентов, чт может быть обусловлено редким парадоксально ранним появление краснушных антител класса IgG. Определение низкого индекса авидност позволило предположить острую стадию инфекционного процесса в данно группе больных. При дальнейших исследованиях методом ПЦР наличие РН Rubella virus было выявлено в 6 из 7 случаев. У одного пациента низкоавидными антителами, несмотря на отсутствие вирусной РНК, пр дальнейших исследованиях были выявлены специфические IgM на фон незначительного нарастания титра IgG, что позволило подтвердить диагно краснухи. Высокоавидные антитела были установлены в 10 тестируемы образцах и носили анамнестический характер, что совпало с отрицательным
данными молекулярно-генетического исследования и позволило снять диагноз краснухи.
Эффективность выявления вирусоспецифических антител классов IgM и IgG возрастает с увеличением временного интервала от момента появления сыпи. Это обусловлено особенностями развития гуморального иммунитета при краснушной инфекции, а также аналитической чувствительностью используемых ИФА-тестов. Полученные данные подтверждают рекомендации ВОЗ, указывающие на то, что ИФА-тесты, направленные на выявление вирусоспецифических антител класса IgM наиболее чувствительны в период с 4 по 28 день после появления сыпи. В первые 72 часа от момента появления сыпи до 50% исследований на IgM к вирусу краснухи могут давать ложноотрицательный результат.
При ретроспективном обследовании или позднем поступлении больных возможно обследование на наличие специфических антител к антигенам вируса краснухи класса IgM и IgG в сыворотке крови с одновременным определением авидности антител класса IgG.
Проведённые комплексные лабораторные исследования в динамике инфекционного процесса показали, что у больных краснухой в ранние сроки болезни — первые 3 дня с момента появления сыпи — наибольшее диагностическое значение имело выявление РНК Rubella virus в слюне, тогда как начиная с 4 дня эффективность обнаружения вирусной РНК снижалась, наряду с возрастанием значения определения вирусоспецифических антител к антигенам вируса краснухи классов IgM и IgG. Это подчеркивает целесообразность использования молекулярно-биологических методов (ПЦР) для диагностики краснухи в первые дни заболевания. Наибольшая частота выявления вируса в слюне, по сравнению с образцами плазмы и лейкоцитов крови, мазками из носо- и ротоглотки, простата забора данного биоматериала и отсутствие инвазивных медицинских манипуляций позволяет рекомендовать
именно слюну как оптимальный клинический материал для исследовани методом ПЦР на РНК Rubella virus, (рис. №4).
120%
—•—% положительных проб на РНК R. virus —% положительных проб на AT класса IgM к АГ R.virus % положительных проб на AT класса IgG к АГ R.virus
Рис.4. Сопоставление результатов выявления РНК Rubella virus (слюна) и антител антигенам R. Virus классов IgM и IgG (сыворотка крови) у больных краснухой в динамик инфекционного процесса.
Анализируя полученные данные результатов комплексны серологических и молекулярно-генетических исследований сыворотки крови слюны у больных краснухой в динамике инфекционного процесс установлено, что для лабораторного подтверждения диагноза краснухи первые дни заболевания целесообразно исследование слюны методом ПЦР н РНК Rubella virus. Комплексный подход к лабораторной диагностике краснух с применением молекулярно-биологических (ПЦР) и серологических (ИФА методов позволит своевременно верифицировать диагноз при поступлении стационар, а также уточнять сроки заболевания.
Следовательно, РНК Rubella virus методом ПЦР выявлялась в плазме клетках крови (лейкоцитах периферической крови), в слюне, мазке и ротоглотки и носоглотки с различной частотой, но наиболее продолжительно у большинства из обследованных вирус краснухи сохраняется в слюне, чт соответствует современным представлениям об особенностях циркуляци данного возбудителя в макроорганизме и позволяет ему сохраняться распространяться в человеческих популяциях.
выводы.
1. Методом ПЦР установлена персистенция РНК вируса краснухи в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки).
2. РНК Rubella virus выявлялась в различных биологических средах в зависимости от дня появления сыпи от 1 до 10 дня.
3. Наиболее раннее и продолжительное выявление РНК вируса краснухи наблюдалось в слюне пациентов (до 10 дня после появления сыпи), в то время как в плазме и клетках крови - только до б дня после появления сыпи.
4. Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) является основным методом для верификации диагноза краснухи в ранние сроки у диагностически неясных больных, учитывая полиморфизм клинических проявлений краснухи.
5. Специфические антитела к вирусу краснухи класса Ig M и IgG в сыворотке крови выявлялись начиная со 2 дня от появления сыпи на низком уровне, и в дальнейшем прослеживалась тенденция к нарастанию титра данных антител, достигая максимума к 5-6 суткам после появления сыпи.
6. В периоде разгара заболевания и периоде ранней реконвалесценции присутствие низкоавидных антител класса IgG могут в совокупности с другими маркерами использоваться для верификации диагноза краснухи, особенно в случае парадоксально рано появившихся антител клпсса Ig G и/или длительной персистенции антител класса Ig M.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
В диагностически неясных случаях у больных с симптомами краснухи целесообразно применять метод молекулярно-генетического исследования (ПЦР), который позволяет в короткие сроки при однократном исследовании подтвердить диагноз краснухи, особенно в случае проведения дифференциально-диагностического поиска. В раннем периоде заболевания краснухой можно использовать информативный и неинвазивный метод лабораторной диагностики - исследование слюны на наличие РНК Rubella viras
вместо серологических методов исследования. Для уточнения давност заболевания в случае дифференциально-диагностически неясных случае можно рекомендовать определение авидности антител класса чт
позволяет дифференцировать первичную инфекцию от перенесенной.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Дарвина О.В., Шипулина О.Ю., Литвинова О.Г., Чуланов В.П. Волчкова Е.В. Диагностические возможности ПЦР и специфически серологических методов в верификации диагноза краснухи. / Материалы Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням (Москв 30 марта- 1 апреля 2009г.)//Инфекционные болезни, Научно-практически журнал Национального научного общества инфекционистов, 2009, том приложение 1, стр.55.
2. Дарвина О.В., Шипулина О.Ю., Чуланов В.П., Литвинова О.Г. Иванова И.В., Алленов М.Н., Волчкова Е.В. Диагностические возможност ПЦР и специфических серологических методов в верификации диагноз краснухи. / Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса п инфекционным болезням (Москва, 29-31 марта 2010г.)//Инфекционны болезни, Научно-практический журнал Национального научного обществ инфекционистов, 2010, том 8, приложение 1, стр.88.
3. Домонова Э.А., Дарвина О.В., Шипулина О.Ю., Сафонова А.П. Шипулин Г.А., Литвинова О.Г., Бурчик М.А., Чуланов В.П., Волчкова Е.В Значение серологических и молекулярно-биологических методов диагностик краснухи.//Инфекционные болезни, Научно-практический журн Национального научного общества инфекционистов, 2010, том 8, №3, с.29-33.
Подписано в печать:07.02.11
Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 776 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru
Оглавление диссертации Дарвина, Ольга Валерьевна :: 2011 :: Москва
Введение
Актуальность темы.
Цель исследования.
Научная новизна.
Практическая значимость.
Апробация работы и внедрение в практику.
Часть I. Обзор литературы
Глава 1. Современные представления о эпидемиологии, этиологии и патогенезе краснухи.
1.1. Современное представление об этиологии и патогенезе краснухи.
1.2. Эпидемиологические особенности краснухи.
Глава 2. Клиническая и лабораторная диагностика различных форм краснухи.
2.1. Клинические проявления краснухи.
2.2. Возможные осложнения, прогноз и иммунопатогенез краснухи.
Глава 3. Клинико-лабораторная диагностика краснухи на различных этапах заболевания.
Часть И. Собственные наблюдения.
Глава 1. Материалы и методы исследования.
1.1. Объем исследования.
1.2. Специальные методы исследования.
1.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
1.2.2. Методы ИФА для определения специфических антител классов ^М и к антигену вируса краснухи.
1.2.3. Метод ИФА диагностики для определения авидности антител класса к антигенам вируса краснухи в сыворотке и плазме крови человека.
Глава 2. Клинико-лабораторная характеристика больных.
2.1. Общая характеристика обследованных больных I группы с направительным диагнозом краснуха.
2.2. Клинико-лабораторная характеристика больных I группы с направительным диагнозом краснуха в период разгара заболевания.
2.3. Общая характеристика обследованных больных II группы с различными направительными диагнозами.
2.4. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных II группы с различными направительными диагнозами в период разгара заболевания.
2.5. Сравнение результатов молекулярно - генетических методов (ПЦР) исследования направленных на выявление РНК Rubella virus в различном клиническом материале (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носо- и ротоглотки) и данных серологических исследований вирусоспецифических антител классов IgM и IgG 87 (100%) больных.
Глава 3. Анализ результатов молекулярно-генетического исследования методом ПЦР с данными обследования на специфические серологические маркеры у 76 больных краснухой в различные фазы инфекционного процесса.
3.1. Общая клинико - лабораторная характеристика 76 больных с подтвержденным в результате комплексных исследований диагнозом краснухи.
3. 2. Анализ результатов молекулярно-генетического исследования методом ПЦР и данных специфического серологического обследования на вирусоспецифические антитела классов IgM и IgG у 76 больных с подтвержденным диагнозом краснухи.
3.3. Роль молекулярно-генетического метода (ПЦР) в дифференциальной диагностике экзантемных инфекционных заболеваний.
Заключение диссертационного исследования на тему "Роль ПЦР-диагностики в проблеме верификации диагноза краснухи"
ВЫВОДЫ:
1. Методом ПЦР установлена персистенция РНК вируса краснухи в различных биологических средах (плазма, клетки крови (лейкоциты), слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки).
2. РНК вируса краснухи выявлялось в различных биологических средах в зависимости от дня появления сыпи, с 1 до 10 дня.
3. Наиболее раннее и продолжительное выявление РНК вируса краснухи наблюдалось в, слюне пациентов (до 10 дня после появления сыпи), в то время как в плазме и клетках крови - только до 6 дня после появления сыпи.
4. Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) является основным методом для верификации диагноза краснухи в ранние сроки у диагностически неясных больных, учитывая полиморфизм клинических проявлений краснухи.
5. Специфические антитела к вирусу краснухи класса Ig М и IgG в сыворотке крови выявлялись начиная со 2 дня от появления сыпи на низком уровне, и в дальнейшем прослеживалась тенденция к нарастанию титра данных антител, достигая максимума к 5-6 суткам после появления сыпи.
6. В периоде разгара заболевания и периоде ранней реконвалесценции присутствие низкоавидных антител класса IgG могут в совокупности с другими маркерами использоваться для верификации диагноза краснухи, особенно в случае парадоксально рано появившихся антител класса Ig G и/или длительной персистенции антител класса lg М.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
В диагностически неясных случаях у больных с симптомами краснухи целесообразно применять метод молекулярно-генетического исследования (ПЦР), который позволяет в короткие сроки при однократном исследовании подтвердить диагноз краснухи, особенно в случае проведения дифференциально-диагностического поиска. В раннем периоде заболевания краснухой можно использовать информативный и неинвазивный метод лабораторной диагностики - исследование слюны на наличие РНК Rubella virus вместо серологических методов исследования. Для уточнения давности заболевания в случае дифференциально-диагностически неясных случаев можно рекомендовать определение авидности антител класса IgG к антигенам R. virus , что позволяет дифференцировать первичную инфекцию от перенесенной.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Дарвина, Ольга Валерьевна
1. Анджапаридзе О.Г., Червонский Г.И. Краснуха.-М.:Медицина, 1975.
2. Билибин А.Ф. Семиотика и диагностика инфекционных болезней. -М.:Медгиз, 1950.-С.275.
3. Брико Н.И., Лыткина И.Н., Миронова В.Ф. и др. Проблема и перспективы профилактики краснухи, кори и паротита в Москве.// Лечащий врач. -2000. -№10. С.3-9.
4. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. - С.336.
5. Воробьев A.A., Быков A.C., Пашков Е.П. и др. Микробиология: Учебник для вузов. М.: Медицина, 1998. С. 261-262.
6. Гайдамович С .Я., Ткаченко A.B., Ларичев В.Ф. и др. Показатели гуморального иммунитета к вирусу краснухи у жителей Москвы в 1998-1999. // Иммунология.-С.26-29
7. Десятскова Р.Г. Вакцинопрофилактика краснухи // Вакцинация: Информ. бюллетень. ноябрь-декабрь.- 2004.
8. Десятскова Р.Г., Заргарьянц А.И., Степанов A.B., Зверев В.В. Авидность иммуноглобулина G к вирусу краснухи при поствакцинальном и постинфекционном иммунитете // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. 2007. - №4. - С.6-11.
9. Десятскова Р.Г., Мальцева H.H. Сероэпидемиологический надзор за постнатальной и врожденной краснухой // Биопрепараты. — 2001.-№ 2.- С.2-5.
10. Ю.Жданов В.М., Гайдамович С.Я., Логинова Н.В. Общая и частная вирусология: Т.2. М.: Медицина, 1982. - С.518.
11. Заргарьянц А.И., Селезнёва Т.С., Титова Н.С. и др. Актуальность вакцинопрофилактики краснухи // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2002. -№3.-С. 16-20.
12. Зверев В. В. Средства профилактики краснухи и их экономический эффект//Вакцинация: Информ. бюллетень.-1999.-№1 (январь февраль).-С.9
13. Зверев В.В., Десятскова Р.Г. Врожденная краснуха. // Вакцинация: Информ. бюллетень. 2004.- №6.
14. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для медицинских вузов.- СПб: Специальная литература, 2008.
15. П.Кузнецова Э.А., Гнетецкая В.А., Шипулина О.Ю. и др. Иммунологические и молекулярно-биологические методы диагностики краснухи у беременных женщин, плодов и новорожденных //Акушерство и гинекология. 2007. - №4. - С.37-40.
16. Лисукова Т.Е., Чекалина К.И. Краснуха и её профилактика // Клиническая медицина. -2000.- №2. С. 11-13.
17. Лаврентьева И.Н., Семериков В.В., Жебрун А.Б. Краснуха в России: изменчивость возбудителя в период вакцинопрофилактики инфекции// Микробиология.- №3.-С.26-31.
18. Малкова Е.М., Петрова И.Д., Смердова М.А. и др. Клинико-иммунологическая характеристика краснухи в западно-сибирском регионе// Микробиология.- 2007. №2. - С.44-48.
19. Носов С.Д. Инфекционные болезни у детей. -М.: Медицина, 1966. 22.0нищенко Г.Г. В рамках национального проекта «Здоровье»//
20. Пиксасова О.В., Гнетецкая В.А., Домоиова Э.А. и др. Молекулярная диагностика парвовируса В19 у беременных: Сб. трудов 6-й Всероссийской научно-практической: конференции с международным участием: Т. 3. М.,2007.-С. 339-343.
21. Покровский В.И., Пак С.Г., Бри ко H.H. и др. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник для вузов. Mi: Геотар-мед, 2004. С.813
22. Поляков В.Е., Смирнова Т.Н., Казакова С.И. и др. Краснушная инфекция в современных условиях //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004; - №1. - С.59-6 Г.
23. Поляков В.Е., Смирнова Т.Н., Казакова С.И. и др. Современная диагностика' и! специфическая профилактика' краснухи// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. - №5. - С.62-64.
24. Семенов В;М., Астапов A.A., Дмитраченко Т.И. Краснушная инфекция.-Минск.:Оракул, 1994. С.26т 107.
25. Смердова М.А., Гришаев М.П. Краснуха и её диагностика//Новости Вектор-Бест. 2002: - №1(23).
26. Скрипченко Е.Ю., Тимченко В.Н., Гузева В.И. Краснушная инфекция в системе «Мать-плод-ребенок».// Детские инфекции. 2009. - №4.- С.58-63.
27. Таточенко В.К. Политика ВОЗ в отношении вакцинации против краснухи //Вакцинация: Информ. бюл-нь. 1999. - №1.
28. Тюников Г.И., Петров B.C., МалковаЕ.М. Клинические особенности и иммунный ответ при краснушной инфекции в условиях крупного промышленного города// Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2007. -№4. С.27-30.
29. Учайкин В.Ф., Деконенко Е.П., Мартыненко И.Н. Патогенез краснушного энцефалита у детей // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001, №2. - С.28-30.
30. Фисенко Ю.Ю., Фисенко В.А., Тихонова Н.Т. Краснуха: клинико-иммунологический аспект // Педиатрия. 2000г. - №6. - С.91-94.
31. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. М.: Медицина, 1995.
32. Шувалова Е.П., Змушко Е.И. синдромальная диагностика инфекционных заболеваний. СПб.: Питер, 2001.- С.312.
33. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. Лекции по инфекционным болезням: В 2-х т. М., 1999.
34. Юминова Н.В. Диагностика краснухи в Российской Федерации// Вакцинация: Информ. бюллетень. -2004,- № ноябрь декабрь.
35. Элиминация кори и краснухи и предупреждение врожденной краснушной инфекции: Стратегический план Европейского региона ВОЗ 2005-2010 гг. Копенгаген, 2005; 31.
36. Руководство ВОЗ по лабораторной диагностике кори и краснухи. Вторая редакция. Женева, 2007. С. 115.
37. Extract of Regional Committee document of Health 21. EUR/RC 48/10 (extract) 5 November 1998.
38. Abemathy E., Cabezas C. Confirmation of rubella within 4 days of rash onset: comparison of rubella virus RNA detection in oral fluid with immunoglobulin M detection in serum or oral fluid // J. Clin. Microbiol. 2009.-N47(1). - P. 182-188.
39. Akingbade D., Cohen B.J., Brown D.W. Detection of low-avidity immunoglobulin G in oral fluid samples: new approach for rubella diagnosis and surveillance // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - N10(1). - P.189-190.
40. Alonso A., Distefano A., Carlino O. et al. Exanthematous outbreak caused by human parvovirus В19 in a school in Banderalo, Argentina.// Rev. Argent. Microbiol. -2003. № 35(3). P.171-174.
41. Andrade J.Q., Bunduki V., Curti S.P. et al. Rubella in pregnancy: intrauterine transmission and perinatal outcome during a Brazilian epidemic // J. Clin. Virol. -2006. № 35(3).- P.285-291.
42. Banatvala J.E., Brown D.W. Rubella //Lancet. 2004. - V.363 (9415). -P.1127-1137.
43. Bosma T.J., Corbett K.M., Eckstein M.B. et al. Use of PCR for prenatal and postnatal diagnosis of congenital rubella // J. Clin. Microbiol. 1995. -N33(11).-P.2881-2887.
44. Bosma T.J., Corbett K.M., O'Shea S. et al. PCR for detection of rubella virus RNA in clinical samples//J.Clin. Microbiol-1995. N33(5). - P. 1075-1079.
45. Cooray S., Warrener L., Jin L. Improved RT-PCR for diagnosis and epidemiological surveillance of rubella.// J. Clin. Virol. 2006. -№.35. P.73-80.
46. Date M., Gondoh M., Kato S. et al. A case of rubella encephalitis: rubella virus genome was detected in the cerebrospinal fluid by polymerase chain reaction // No To Hattatsu. 1995.- N27(4). - P.286-290.
47. Denne C., Kleines M., Dieckhöfer A. et al. Intrathecal synthesis of antiviral antibodies in pediatric patients // Eur. J. Paediatr. Neurol. 2007,- №11(1).-P.29-34.
48. Eggerding F.A., Peters J., Lee R.K. Detection of rubella virus gene sequences by enzymatic amplification and direct sequencing of amplified DNA// J. Clin. Microbiol.- 1991.- №29(5).- P.945-952.
49. Eichler R., Prostko J., Fischer C. et al. Evaluation of the new ARCHITECT Rubella IgM assay. //J. Clin. Virol. 2007.- №39(3). -P. 182-187.
50. Hamkar R., Jalilvand S., Abdolbaghi M.H. et al. Distinguishing between primary infection and reinfection with rubella vaccine virus by IgG avidity assay in pregnant women // East Mediterr. Health J. 2009. - N15(1). - P.94-103.
51. Hamkar R., Jalilvand S., Mokhtari-Azad T. et al. Assessment of IgM enzyme immunoassay and IgG avidity assay for distinguishing between primary and secondary immune response to rubella vaccine // J. Virol. Methods. 2005. -N130(1-2). P.59-65.
52. Hamkar R., Jalilvand S., Mokhtari-Azad T. et al. Evaluation of immunity against rubella in Iranian after mass campaign for measles-rubella vaccination on December 2003//Am. J. Infect.Control.-2006.-N34(9). -P.588-592.
53. Hofmann J., Kortung M., Pustowoit B. Persistent fetal rubella vaccine virus infection following inadvertent vaccination during early pregnancy //J. Med. Virol. 2000. - N61(1). - P.155-158.
54. Hofmann J., Liebert U.G. Significance of avidity and immunoblot analysis for rubella IgM-positive serum samples in pregnant women. // J, Virol. Methods.- 2005. № 130(1-2). -P. 66-71.
55. Ho-Terry L., Terry G.M., Londesborough P. Diagnosis of foetal rubella virus infection by polymerase chain reaction.// J. Gen. Virol. -1990.- №71(Pt 7).-P.1607-1611.
56. Jin L., Thomas B. Application of molecular and serological assays to case based investigations of rubella and congenital rubella syndrome // J. Med. Virol. -2007. N79(7). - P.1017-1024.
57. Jin L., Vyse A., Brown D. W. G. The role of RT-PCR assay of oral fluid for diagnosis and surveillance of measles, mumps and rubella// Bulletin of the World Health Organization 2002. № 80(1). -P. 76-77.
58. Katow S. Rubella virus genome diagnosis during pregnancy and mechanism of congenital rubella// Intervirology.- 1998.- №41(4-5). P.163-169.
59. Kaneko M., Sameshima H., Ikenoue T. et al. Rubella outbreak on Tokunoshima Island in 2004: serological and epidemiological analysis of pregnant women with rubella //J. Obstet. Gynaecol. Res. 2006. - N32(5). - P.461-467.
60. Karapanagiotidis T., Riddell. M., Kelly H. Detection of rubella immunoglobulin M from dried venous blood spots using a commercial enzyme immunoassay //Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005.- №53(2).- P. 107-111.
61. Korhonen M.H., Brunstein J., Haario H. et al. new method with general diagnostic utility for the calculation of immunoglobulin G avidity.// Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999.№ 6(5).- P.725-728.
62. Labouret N., Cecille A., Wendling M.J. et al. Prenatal diagnosis of viral infections. A two year study in Strasbourg.// Pathol. Biol. (Paris).- 1999. -№47(5).- P.526-530.
63. Macé M., Cointe D., Six C. et al. Assessment of the diagnostic value of RT-PCR on amniotic fluid for prenatal diagnosis of congenital rubella infection // Pathol. Biol. (Paris).- 2004.-N52(9). -P.540-543.
64. Boyd A.S. Laboratory testing in patients with morbilliform viral eruptions.//Dermatol. Clin. 1994.- №12(1). -P. 69-82.
65. Marret H., Golfier F., Di Maio M. et al. Rubella in pregnancy. Management and prevention// Presse Med. 1999.- № 28(38).- P.2117-2122.
66. Medici M.C., Martinelli M., Albonetti V. et al. Evaluation of rubella virus immunoglobulin G (IgG) and IgM assays with the new Vidia instrument// J. Clin. Microbiol. 2008. - № 46(5). - P. 1847-1849.
67. Mosquera Mdel M., de Ory F., Moreno M. et al. Simultaneous detection of measles virus, rubella virus, and parvovirus B19 by using multiplex PCR // J. Clin. Microbiol. -2002. N40(1). - P.l 11-116.
68. Mosquera Mdel M., Sanz J.C., Echevarría J.E. et al. Diagnostic performance of specific IgM detection and genomic amplification in rubella // Enferm Infecc Microbiol. Clin.- 2006. N24(4). - P.251-253.
69. Mubareka S., Richards H., Gray M. et al. Evaluation of commercial rubella immunoglobulin G avidity assays // J. Clin. Microbiol. 2007. - N45(1). -P.231-233.
70. Murphy J., Bustin S.A. Reliability of real-time reverse-transcription PCR in clinical diagnostics: gold standard or substandard? // Expert Rev. Mol. Diagn. -2009.-N9(2).-P. 187-97.
71. Nakayama T. Laboratory diagnosis of measles and rubella infection.// Vaccine. 2009. - №27(24). - P. 3228-9.
72. Nedeljkovic J., Jovanovic Т., Oker-Blom C. Maturation of IgG avidity to individual rubella virus structural proteins // J. Clin. Virol. 2001. - N22(1). -P.47-54.
73. Patou G., Ayliffe U. Evaluation of commercial enzyme linked immunosorbent assay for detection of B19 parvovirus IgM and IgG // J. Clin. Pathol. 1991. - N44(10). - P.831-834.
74. Plotkin S.A., Oreinstein W.A. (пер. с англ. Логинова А.В.) Вакцинация против краснухи, опыт применения // Вакцинация: Информ. бюллетень. -1999.- № 1 (январь-февраль).
75. Pu X., Zhang D. Development and clinical trial of fluorescence real time PCR to detect rubella virus // Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. -2007. -№24(6).-P. 1352-1356.
76. Rajasundari T.A., Chandrasekar K., Vijayalakshmi P. Immune status of health care personnel & post vaccination analysis of immunity against rubella in an eye hospital.// Indian J. Med. Res. 2006. -N124(5). - C.553-8.
77. Reef S.E., Frey T.K., Theall K. et al. The changing epidemiology of rubella in the 1990s: on the verge of elimination and new challenges for control and prevention // J.A.M.A. 2002. - N 287(4). - P.464-472.
78. Revello M.G., Sarasini A., Baldanti F. et al. Use of reverse-transcription polymerase chain reaction for detection of rubella virus RNA in cell cultures inoculated with clinical samples // New Microbiol. 1997. - N20(3). -P. 197-206.
79. Revello M.G., Baldanti F., Sarasini A. et al. Prenatal diagnosis of rubella virus infection by direct detection and semiquantitation of viral RNA in clinical samples by reverse transcription-PCR//J.Clin.Microbiol.-1997.-N35(3).-P.708-713.
80. Ruokonen P.C., Metzner S., Ucer A. et al. Intraocular antibody synthesis against rubella virus and other microorganisms in Fuchs' heterochromic cyclitis.//Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2010.- №248(4).-P.565-571.
81. Sanz J.C., Mosquera M., Ramos B. et al. Assessment of RNA amplification by multiplex RT-PCR and IgM detection by indirect and capture ELISAs for the diagnosis of measles and rubella // APMIS. -2010.- №118(3).-P.203-209.
82. Seno A., Tada J., Matsuura H. et al. Congenital rubella syndrome with rubella virus-associated generalized brownish macules, indurated erythemas, papules, and pigmentation// J. Dermatol. 1994.-№21(5). - P. 323-328.
83. Segondy M., Boulot P. RT-PCR in the prenatal diagnosis of rubella. Report of 2 cases// J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. (Paris). 1998. -№ 27(7). -P.708-713.
84. Schalk J.A., de Vries C.G., Jongen P.M. Potency estimation of measles, mumps and rubella trivalent vaccines with quantitative PCR infectivity assay.//Biologicals. -2005.- №33(2).- C.71-79.
85. Shyamala G., Malathi J., Moses Y.S. et al. Nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of rubella virus in clinical specimens// Indian J. Med. Res. -. 2007. -№ 125(1). P.73-78.
86. Tanemura M., Suzumori K., Yagami Y. et al. Diagnosis of fetal rubella infection with reverse transcription and nested polymerase chain reaction: a study of 34 cases diagnosed in fetuses // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996.- N174(2). - P.578-582.
87. Thant K.Z., Myint T.T., Shwe T.N. et al. Active surveillance for congenital rubella syndrome in Yangon, Myanmar.// Bull. World Health Organ. -2006.-№84(1).-P.12-20.
88. Thomas H.I., Barrett E., Hesketh L.M. et al. Simultaneous IgM reactivity by EIA against more than one virus in measles, parvovirus B19 and rubella infection // J. Clin. Virol. 1999. - N14(2). - P.107-118.
89. Thomas H.I., Aird H.C. Maintenance of high-avidity rubella-specific IgG antibody and titres in recent HIV seroconvertors and in patients progressing to the AIDS-related complex and AIDS// J. Med. Virol.-1999.- №58(3). P.273-279.
90. Ushida M., Katow S., Furukawa S. Congenital rubella syndrome due to infection after maternal antibody conversion with vaccine// Jpn. J. Infect. Dis.-2003.-№56(2).-P. 68-69
91. Vauloup-Fellous C., Ursulet-Diser J., Grangeot-Keros L. Development of a rapid and convenient method for determination of rubella virusspecific immunoglobulin G avidity // Clin. Vaccine Immunol.-2007.-Nl4(11).-P.1416-1419.
92. Vauloup-Fellous C., Grangeot-Keros L, Humoral immune response after primary rubella vims infection and after vaccination // Clin. Vaccine Immunol. 2007. - N14(5). - P.644-647.
93. Vyse A J, Jin L. An RT-PCR assay using oral fluid samples to detect rubella virus genome for epidemiological* surveillance // Mol. Cell'Probes. 2002,-N16(2).-P. 93-97.
94. Wilson K.M., Di Camillo C., Doughty L. et al. Humoral immune response to primary rubella virus infection // Clin. Vaccine Immunol. 2006. -N13(3). - P.380-386.
95. Xue Y.L., Wang Z.Y., Wang X.F. Molecular epidemiological study on rubella virus// Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi.- 2004. -№18(4). P.337-340.
96. Yu'B.B., Feng Y., Xu C.P. Simultaneous detection of measles and rubella virus by multiplex real-time RT-PCR with an internal control// Bing Du Xue Bao. -2010.- № 26(2).- P. 109-114.
97. Zhao L.H., Ma Y.Y., Wang H. et al. Establishment and application of a TaqMan real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction assay for rubella virus RNA // Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghai). 2006.-, N38(10). -P.731-736.
98. Zhao L., Ma Y., Zhao S. et al. Armored RNA as positive control and standard for quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction assay for rubella virus.// Arch. Virol.-2007.-№152(1).-C.219-24.
99. Zheng F., Du J., Hu Y. A study of rubella virus infection during pregnancy.// Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi.- 2002.-№ 37(7). P.391-394.
100. Zhu Z., Xu W., Abernathy E.S. et al. Comparison of four methods using throat swabs to confirm rubella virus infection// J. Clin. Microbiol. -2007.-№45(9).-P .2847-2852.