Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Серологическая диагностика кори в период элиминации.

На прсишх ¡п рипас a

I onop)\iiiia Марина Виморомна

í i i'ojioi нчкскля /in ииостшсл ico im i ß,.ni:iMio,i

)J[I1MIIII Vlllltl

14 01). 16 - luuiqii ojioi ii>i it имя; 110 101 ня N 00 !0 - iiiii.icMiiojuu iisi

Лшорсфсра! jiiici'i'piaiiiiii на сош'К'апне > >ieiu)ii ruiieini i. 111 i 11 ■.' 1: 11:1 mc\IIIIINIH'KII\ и,IM.

1\>ип|<-иа-До||>- 200S

003454190

На правах рукописи

Говорухина Марина Викторовна

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КОРИ

В ПЕРИОД ЭЛИМИНАЦИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.30 - эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону- 2008

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении Науки «Московский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им. НГГ. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Тихонова Нина Тимофеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук профессор

Юминова Надежда Васильевна Русакова Екатерина Владимировна

Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение Науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « »_ 2008 г. в « » часов на заседании специализированного диссертационного совета Д 208.046.02. при Федеральном Государственном Учреждении Науки «Московский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им. Н.Г. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125 212. г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно- исследовательский институт зпидемиологии и микробиологии» им. Н Г. Габричевского Роспотребнадзора

Автореферат разослан « »_2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на повсеместное использование живых коревых вакцин, корь все еще остается одной из причин детской смертности не только в развивающихся, но и индустриально развитых странах. По оценке ПОЗ, в 2004 году было зарегистрировано более 29 ООО случаев этой инфекции, а в 2003 году корь могла явиться причиной 4 850 смертельных исходов в Европейском регионе. С целью снижения ущерба от кори чешре района ВОЗ, и шм числе Европейский, объявили элиминацию кори приоритетной задачей здравоохранения.

Положительные и стабильные изменения в динамике развития эпидемического процесса кори в России, неуклонное повышение охвата вакцинацией и ревакцинацией высокоэффективной отечественной живой коревой вакциной (ЖКВ) из штамма Л-16 позволили разработать Программу ликвидации кори в России к 2010 году и приступить к ее реализации (приказ Минздрава РФ от 19.08.2002г. №270).

В настоящее время наблюдается выраженное снижение заболеваемости корью в Российской Федерации. Однако, показатель заболеваемости корью все еще превышает регламентированный ВОЗ критерий элиминации - менее I случая кори на миллион жителей. Так, интенсивный показатель заболеваемости корью в России составил 1,78 на 100 тыс. населения в 2004; 6,32 - в 2005; 0,8 -в 2006 году против 0,12, или 1,2 случая на 1 млн. жителей страны в 2007 году (Онищенко Г.Г., 2007; Тихонова Н.Т. и соавторами, 2005,2006, 2007).

До настоящего времени продолжают регистрироваться вспышки кори, в том числе в 2007 году в Нижнем Новгороде (25 случаев), Владивостоке (11 случаев), Красноярске (10 случаев), характеризующиеся разной степенью интенсивности и распространенности, а также наличием импортного источника инфекции: из Узбекистана случаи завезены в Нижний Новгород, из Китая - во Владивосток и Красноярск (Онищенко Г.Г.,2008).

До сих пор в РФ имеются регионы (республики Северного Кавказа, г. Москва, г. Благовещенск, Алтайский и Красноярский края), в которых в силу различных причин (интенсивная миграция населения, недостаточно высокий уровень охвата населения прививками и т.п.) возможна активизация эпидемического процесса кори и сохранение вспышечной заболеваемости (Онищенко Г.Г., 2005).

Теоретические и практические аспекты борьбы с корью обобщены в работах отечественных и зарубежных специалистов (Тарос Л.Ю. и соавт., 1969, 1975; Попов В.Ф., 2002; Юминова Н.В. и соавт., 2003; Тихонова Н.Т. и соавт., 2005 и др.; Hinman A.R. et al., 1979; Bellini W.J. et al., 1996; Spika J S. et al., 2005 и др.). Однако, многие вопросы до последнего времени оставались полностью не изученными. Так, постановка коревого диагноза, в основном, осуществлялась только на основе клинических данных, что приводило к диагностическим ошибкам. Только в редких случаях, как правило, в научных целях, применяли лабораторные методы обследования больных. При этом использовали разные реакции (реакцию радиального гемолиза (РРГ), реакцию иммунофлуоресцен-ции (РИФ), лектин-нейраминидазный тест (J1HT), реакцию торможения гемагг-лютинации (РТГА), реакцию пассивной гемагглютинации (РППк), реакцию нейтрализации (РН) и др.), различные диагностические препараты с разной сте-

пенью специфичности и чувствительности, что нередко приводило к получению трудно сопоставимых результатов В то же время, достижение элиминации кори требует получения сопоставимых объективных данных о заболеваемости корью и напряженности противокоревого «коллективного» иммунитета в различных регионах, что диктует необходимость унификации методических подходов к реализации Программы. Особую актуальность приобретает этот вопрос в Российской Федерации, где регистрируется достаточно высокий уровень заболеваемости краснухой.

Поэтапное выполнение задач Программы приводит к изменению эпидпро-цесса кори и диктует необходимость совершенствования эпиднадзора за этой инфекцией, в том числе с помощью лабораторных методов исследования. Серологическое обследование разных категорий лиц с подозрением на заболевание корыо позволяет получить данные об истинной заболеваемости корью в регионе и в ряде случаев подтвердить отсутствие случаев указанной инфекции на данной территории.

Поскольку задача элиминации кори может быть решена только при высоком охвате населения прививками высокоактивной коревой вакциной, важным аспектом является серологический мониторинг напряженности поствакцинального иммунитета в разные сроки после вакцинации. Тем более, что в условиях „ спорадической заболеваемости, когда циркуляция вируса кори незначительна, влияние бустер-эффекта, как одного из предполагаемых ранее механизмов сохранения поствакцинального иммунитета, ограничено. Немаловажное значение имеет также выявление с помощью лабораторных методов исследования групп риска заболевания корью.

Одним из практически важных вопросов являлась апробация альтернативного сыворотке крови метода исследования «сухой капли» крови («CK») (Taylor M.B. с соавторами, 1996; De Swart с соавторами, 2001; Riddel М. С соавторами. 2002), направленного на упрощение серологического обследования населения трудно доступных регионов.

Цель исследования: совершенствование тактики серологической диагностики кори в период ее элиминации, в том числе на основе оценки диагностической значимости некоторых иммуноферментных тест-систем и апробации нового метода сбора и доставки серологического материала.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику лабораторного подтверждения кори на территории ЮФО в предэлиминационный период (1998-2001 ir.) и на этапах ее элиминации (2003-2006 гг.) для выявления процента диагностических ошибок и обоснования тактики обязательного лабораторного подтверждения каждого случая с подозрением на корь.

2. На разных этапах выполнения Программы элиминации кори обследовать различные кон^ингенты лиц с подозрением на корь и другими экзантем-ными заболеваниями с целью определения на территории истинного уровня заболеваемости корыо; изучить этиологическую структуру случаев с подозрением на корь, определить долю разных вирусных экзантем (краснуха, ЦМВИ, ВЭБ и нарвовирусная В19 инфекции) и составить перечень заболеваний, «маскирующих» корь.

3 Оценить диагностическую значимость новых иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи и выявления специфических IgG к вирусам

кори и краснухи в сравнении с препаратами производства «Dade Behring»; дать предложения по их применению.

4. Адаптировать альтернативный метод забора серологического материала «сухая капля» для лабораторного подтверждения диагноза кори и краснухи и внедрить его в систему зпиднадзора.

Научная новизна

- Впервые в условиях региона обоснована стратегия обязательного лабораторного .подтверждения каждого случая кори в период элиминации заболевания. С помощью обязательною лаборагорною подшерждения каждою случая с подозрением на корь и обследования лиц с другими экзантемными заболеваниями получены объективные данные об истинной заболеваемости корью в регионе;

- Изучена этиологическая структура «коренодобных» заболеваний в регионе и определены доли некоторых вирусных экзантем (краснуха, ЦМВИ, ВЭБ и парвовирус В19 инфекции и др.);составлен примерный перечень заболеваний, «маскирующих» корь на территории ЮФО и продемонстрирована целесообразность использования его в системе зпиднадзора за корью в период спорадической заболеваемости; выявлена степень распространенности парво-вирусной В 19-инфекций среди населения Ростовской области

- Впервые в практических условиях получены данные,свидетельствующие о целесообразности применения метода "сухой капли" крови для лабораторного подтверждения клинического диагноза при проведении серодиагностики кори и краснухи;

- Получены данные о диагностической значимости ряда отечественных ИФА тест-систем для серологических исследований на корь и краснуху в сравнении с препаратами фирмы «Dade Behring» (Германия), широко используемыми в европейской коревой/краснушной лабораторной сети ВОЗ для верификации диагноза в условиях спорадической заболеваемости. Продемонстрирована возможность использования в современных условиях ТС «ЭКОлаб IgM-краснуха», для определения противокраснушных IgG - ТС производства ЗАО «Вектор Бест», НПО «Диагностические системы» и ЗАО «ЭКОлаб».

Практическая значимость

Усовершенствована тактика серологической диагностики кори в период ее элиминации. Оценена диагностическая значимость некоторых иммунофер-ментных тест-систем и нового метода сбора и доставки исследуемого материала для серологической диагностики, что позволило рекомендовать их для использования в работе органов практического здравоохранения.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследований внедрены в работу практического здравоохранения и использованы при подготовке нормативных и методических документов:

- ежегодных информационных писем по выполнению Программы ликвидации кори в ЮФО (4-03-46/1523 от 11.06.2004г., 4-03-46/298 от 23 03 2005г., 08/4358 от 22.05.2006г., 08/4416 от 30 03.07г., 08-67-02/9360 от 27 06 08г.);

- ежегодных информационных писем по выполнению Программ ликвидации кори в Ростовской области (04-3-49/2915 от 22.06.2006г, 08-7683 от 07.06.07г., 04-3-81 от 20.05.08г.);

- методическою письма «Об обследовании больных с подозрением на корь методом «сухой капли»», подготовленного для территорий ЮФО (08/4170 от 21.07.03г.),

- регионального плана мероприятий по реализации второго этапа Программы ликвидации кори в РФ на 2005-2007 годы (08/7571 от 14.10.2005г.),

- ежегодных информационных сборниках статистических и аналитических материалов «Анализ деятельности микробиологических лабораторий Госсанэпиднадзора в Ростовской области по ведомственной отчетности ф. 6-96 (вирусологические исследования)», оперативных письмах, подготовленных для территорий ЮФО, государственных докладов о санитарно-эпидемиологической обстановке в Ростовской области и мерах по ее стабилизации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.В условиях низкой заболеваемости корью серодиагностика кори и краснухи является необходимой составляющей эпиднадзора, позволяющей минимизировать ошибки при постановке клинического диагноза, выявить истинное число случаев кори, получить обоснованные доказательства спорадического характера заболеваемости или отсутствия случаев кори.

2. При спорадической заболеваемости корью необходим обязательный сероэпидемиологический мониторинг кореподобных заболеваний с составлением их примерного перечня, который будет меняться в зависимости от эпидемической ситуации, складывающейся в регионе в отношении той или иной инфекции. Систематическое обследование больных с лихорадкой и папулезной сыпью направлено на получение объективных данных о заболеваемости корью в регионе.

3.Для реализации Программы ликвидации кори и предупреждения СВК/ВКИ в Российской Федерации целесообразно рекомендовать использование отечественных ИФА тест-систем, которые по специфичности и чувствительности не уступают зарубежным аналогам, при обязательном использовании внутреннего контроля.

4. Метод «сухой капли» крови может быть использован для серологического подтверждения клинического диагноза кори и краснухи в работе органов практического здравоохранения, особенно в трудно доступных регионах страны.

Апробация материалов диссертации состоялась на совместном заседании секций Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотреб-надзора «Общая и прикладная иммунология» и «Эпидемиология, микробиология и клиника инфекционных болезней» 20 октября 2008 г.

Результаты исследований доложены и обсуждены на: о национальных совещаниях ВОЗ - г. Ростов-на-Дону, 2002; г. Азов, 2003;

I. Пермь, 2004; С-11етербург, 2006; о совещаниях национальной лабораторной сети - г. Москва, 2006, 2007; о научно-практической конференции, посвященной 145-летию со дня рождения Г.Н. Габричевского, 2005; о региональных совещаниях ВОЗ - г. Ессентуки, 2005; г. Ростов-на-Дону, 2006; о научно-практической конференции, г. Геленджик, 2005; о IX Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов, паразитологов -г. Москва, 2007;

о областных совещаниях (2004, 2005, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка используемой литературы, включающего. 143 источника, в том числе 86 отечественных и 57 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 39 таблицами и 12 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Работа выполнялась на базе лаборатории прикладной иммунохимии ФГУН МНИИЭИМ им. Г.Н.Габричевского и вирусологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области» на материалах, полученных в 2003-2006 гг. в ЮФО с участием специалистов (эпидемиологов и вирусологов) службы Роспотребнадзора всех территорий ЮФО, а именно: Республик - Адыгея, Дагестан, Карачаево-Черкессия, Кабардино-Балкария, Калмыкия, Ингушетия, Северная Осетия-Алания, областей - Ростовской, Волгоградской, Астраханской и краев - Ставропольского и Краснодарского.

Анализ результатов проводили с учетом заболеваемости в разные периоды обследования: предэлиминационный период (1998-2002 гг.), первый (20032004гг.) и второй (2005-2006 гг.) этапы реализации Программы, в которые показатель заболеваемости на 100 тыс. населения соответственно составлял 4,20,4; 2,29- 1,78 и 0,32-0,8.

Объем и объекты исследования различались в зависимости от поставленных задач, представлены в таблице 1.

t Распределение контингентов обследованных по годам и направительным

клиническим диагнозам представлено в таблицах 2 и 3.

Параллельные исследования сыворотки крови от больных с подозрением на краснуху и от здоровых лиц проводили на протяжении трех лет (2003-2006 гг.) на ТС «ЭКОлаб-Краснуха-/^Л/» и «Beding Enzygnost Anti-Rubella virus IgM» с использованием разных серий препаратов (9 серий).

Сравнительные испытания ТС разных производителей для определения IgM и IgG к вирусу краснухи и IgG к вирусу кори осуществляли путем одномоментного параллельного тестирования сыворотки крови от лиц с подозрением на краснуху с использованием одного оборудования и одним оператором.

Полевые испытания метода «сухой капли» в сравнении с сывороткой крови («золотой стандарт») были проведены в 2004-2006 годах путем параллельного тестирования материала от 66 больных с подозрением на корь и краснуху.

Таблица 1

Структура исследований и количество исследованных проб биоматерпала в зависимости от поставленных задач

Группы обследованных пациентов Количество проб

в соответствии с задачами исследования

Задача Определение процента диагностических ошибок и динамики лабораторного подтверждения кори в 2003-2006 годах

Лица с клиническим диагнозом «корь» и «корь'» 2718 (1057 и 1661)

Лица с клиническим диагнозом «краснуха» и «краснуха?» 585 (204 и 381)

Лица с другими «кореподобными» заболеваниями 240

Задача выявление истинного уровня заболеваемости корью и определение перечня заболеваний, «маскирующих» корь, на 2-ом этапе реализации Программы ликвидации кори еЮФО

Больные с экзантемой и лихорадкой 546

Задача изучение структуры экзантемных заболеваний на втором этапе реализации Программы ликвидации кори в ЮФО

Больные с лихорадкой и экзантемой некоревой и некраснушной природы 164

Задача Изучение распространения парвовируса В19

Здоровые взрослые и дети 182

Задача Сравнительная оценка диагностического потенциала тест-систем для опреде-

ления lgM-краснуха , lgG-краснуха и lgG-корь

1) Сопоставление ИФА-тест-систем «ЭколаЫдМ-краснуха» и «Behring Enzygnost Anti-Rubella virus IqM»

Лица с подозрением на краснуху 76

2) Сопоставление ИФА-тест-систем для определения lgM-краснуха фирм тор-Бест», «Meddens» и «Dade Behring» «ЭКОлаб», «Век-

Лица с подозрением на краснуху 84

3) Сопоставление ИФА-тест-систем для определения IgG к вирусу краснухи производства «Вектор-Бест», «Диагностические системы», «ЭКОлаб» и «Dade Behring»

Больные с подозрением на краснуху и здоровые лица I 76

4) Сопоставление ИФА-тест-систем для определения IgG к вирусу кори производства «Вектор-Бест», «МБС» « «Dade Behring»

Больные с подозрением на корь и здоровые лица | 59

Задача Апробация метода «сухой капли» для верификации диагноза кори и краснухи с целью оценки возможности его применения в практике реализации Программы

Больные с подозрением на корь и краснуху | 66

Таблица 2

Распределение конгпнгентов обследованных больных по годам

Количество Год Всего

2003 2004 2005 2006

проб 1642 1660 416 492 4210

больных 1016 1642 408 477 3543

Таблица 3

Распределение контингентов обследованных больных по первичным'клиническим диагнозам

Клинический диагноз Корь Корь"? Краснуха Краснуха'' Другие Всего

Количество больных 1057 1661 204 381 240 3543

Методы исследования и диагностические препараты.

В работе использовали серологический, эпидемиологический и статистический методы исследования.

Для серологических исследований использовали иммуноферментный анализ (ИФА) в различных модификациях - двухстадийный непрямой метод, метод «захвата» в соответствии со стандартными процедурами, рекомендованными ВОЗ .(Руководства ВОЗ по лабораторной диагностике кори, 1999,2006).

Результаты ИФА регистрировали на спектрофотометре Мультискан производства фирмы «Labsystems» (Финляндия) на двух пли одной длине волны (450/620 нм или 450 нм) в соответствии с инструкциями к диагностическим наборам, а учет и оценку всех результатов ИФА проводили с использованием компьютерных программ.

В работе были использованы следующие ИФ тест-системы :

- «Beding Enzygnost Anti-Measles (Anti-Rubella) virus Ig M test», производства «Dade Behring», Германия;

- «Beriing Enzygnost Anti-Rubella virus IgG test» производства «Dade Behring», Германия;

- «Векто-корь-IgG» производства ЗАО «Вектор-Бест»;

- «ICopb-IgG-ДС» для количественного определения антител класса G к вирусу кори производства ЗАО «Медико-биологический Союз»;

- «Эколаб-IgM-Kpacnyxa» производства ЗАО «Эколаб», Электрогорск;

- «Эколаб- lgG-краснуха» производства ЗАО «Эколаб»;

- «Векто-Rubella-lgM» производства ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск;

- «Meddens Rubella IgM m-capture Comfort EIA», производства «Meddens Diagnostics», Германия;

- «Векто-Rubella-IgG» производства ЗАО «Вектор-Бест»;

„ - «Kpacnyxa-IgG-ДС» производства ЗАО «Диагностические системы», Нижний Новгород;

- «Parvo В19 IgM-EIA medac», «Medac Diagvostika», производства фирмы «Seiken», Япония;

- «Parvo В19 IgG medac», «Medac Diagvostika», производства «Seiken», Япония;

- «Epstein-Barr Virus IgM (EBV IgM)» производства Humen GmbH, Германия;

- «Векто ЦМВ IgM» производства ЗАО «Вектор-Бест»,

- тест-системы для определения IgM к вирусу Л311 производства НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, Москва.

Для апробации метода «сухой капли» забор крови у больных осуществляли двумя способами: из вены - для традиционного метода исследования с использованием сыворотки крови, из пальца - для исследования методом «сухой капли» в соответствии с методикой, описанной Taylor M.B. с соавторами (1996), De Swart с соавторами (2001), Riddel М. с соавторами (2002)

Данные, полученные в работе, обрабатывали принятыми в подобных исследованиях методами математической статистики. При этом bq всех случаях, где было необходимо, вычисляли средние величины «М», среднее квадратичное отклонение «оо» и ошибку средней величины «т». Достоверность раз-

линий результатов исследования устанавливали путем вычисления показателя достоверности «I» На основании величины «1» и числа наблюдений «п» по таблице СтькД&ента и Вилкоксона определяли вероятность различий «Р». Различие расценивалось как достоверное при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Серологическая диагностика кори и других экзаитемных заболеваний на территории ЮФО. Анализ состояния лабораторной диагностики кори в ЮФО в предэлиминационный период (1998-2002 гг.) показал, что использование лабораторных методов исследования носило ограниченный характер, и, следовательно, показатели заболеваемости корью в исследуемый период основывались только на клинических данных. Так, удельный вес случаев кори с лабораторным подтверждением за анализируемый период (табл. 4) колебался от 4,7 до 15,6% и составил, в среднем за четыре года, 9,0%, что ниже среднего по стране показателя (15%).

Таблица 4

Результаты лабораторного подтверждения случаев кори на территориях ЮФО в предэлнминацнонный период (1998-2001гг.)

Год Число случаев кори (абс) Число лабора-торно обследованных лиц Из них с лабораторным подтверждением % лабораторно подтвержденной кори от общего числа случаев кори

абс % абс %

1998 380 142 37,4 18 12,7 4,7

1999 276 98 35,5 43 43,9 15,6

2000 162, 60 37,0 13 35,1 8,0

2001 108 82 75,9 9 11,0 8,3

Всего 926 382 41,3 83 21,7 9,0

При сопоставлении прививочного анамнеза лиц с клиническим диагнозом «корь» в 2001 и 2003 годах было установлено, что введение в 2003 году обязательного лабораторного подтверждения кори с помощью ИФА привело к снижению среди них доли ревакцинированных с 31 до 14,5% и переболевших корью ранее - с 4,5 до 0,5%.

Таким образом, введение обязательного лабораторного подтверждения кори с использованием единых методических подходов и стандартных высокочувствительных и высокоспецифичных иммуноферментных тест-систем, принятых в глобалыюймтабораторной сети ВОЗ, впервые дало возможность получать объективные данные о заболеваемости в регионе.

Важность обязательного серологического обследования каждого случая кори подтверждалась также результатами сопоставления клинических диагнозов и лабораторных результатов обследования, проведенных в 2003-2004гг (2658 чел) и в 2005-2006 гг. (885 чел) Несмотря на то, что сопоставляемые периоды различались по уровню заболеваемости корью (соответственно 2,29 -1,78

и 0,32- 0,8 на 100 тыс. населения), в оба периода было выявило значительное количество диагностических ошибок (рис. 1), свидетельствующих о гипердиагностике кори. Расхождения клинических и лабораторных данных при диагностике кори составляли 19,4% и 20%; при краснухе - 1,6% и 10,7%; мри «других экзантемных заболеваниях» - 17,8 и 30,7%, соответственно.

Анализ динамики выявления серологически подтвержденной кори, проведенный за 2003-2006 гг. внутри групп больных с различными клиническими диагнозами, выявил уменьшение доли этой инфекции ""у лиц с диагнозами «корь» и «корь?» в 6,2 раза (с 83,7 до 13,6%), «краснуха» и «краснуха?» - в 17,3 раза (с 19,0 до 1,1%), «другими экзантемными заболеваниями» - в 22,6 раза (с 63,2 до 2,8%) практически на всех территориях ЮФО.

Удельный вес краснушной инфекции, напротив, увеличился: среди пациентов с диагнозами «корь» и «корь?» в 18,7 раза (с 1,7 до 3 1,8%), с диагнозами «краснуха» и «краснуха?» - в 2,4 раза (с 26,2 до 63,0%), с «другими экзантемными заболеваниями» - в 6,5 раза (с 0 до 6,5%).

Доля нерасшифрованных экзантем также увеличилась в группах больных с диагнозом «корь» в 3,7 раза (с 14,6 до 54,6%) и больных с «другими» экзантемами - в 2,5 раза (с 36,8 до 90,7%). Среди пациентов с диагнозом «краснуха», наоборот, отмечено снижение в 1,5 раза (с 54,8 до 36,0%) удельного веса лиц с отрицательным результатом, что указывает на более успешнук) постановку этого диагноза клиницистами.

По клиническим данным

93,5%

5,1% Краснуха

2003- 2004 гг.

п = 2658

Другие

По лабораторным данным Корь 74,1%

19,2%

6,7% Краснуха

2005- 2006 гг. п = 885

По клиническим данным По лабораторным данным

Другие Другие

экзантемы экзантемы

Рис. 1 Сопоставление этиологической структуры экзантемных заболеваний по клиническим и лабораторным данным

Полученные данные свидетельствуют о том, что на этапе элиминации кори существенно возрастает роль лабораторного компонента в системе эпидемиологического надзора. Обследование подозрительных на корь больных (выявление специфических ^М-антител) позволяет обеспечить регистрацию лабора-торно верифицированных случаев кори.

В то же время нельзя не учитывать, что тенденция снижения процента лабораторного подтверждения кори среди различных клинических диагнозов связана также с изменением характера эпидемиологического надзора за корью в период элиминации, когда был введен активный поиск больных корью среди лиц с сыпью и температурой из расчета 2 на 100 ООО населения. Активное выявление случаев кори при обследовании больных с другими клиническими диагнозами изменило этиологическую структуру случаев с подозрением на корь (рис. 2), позволило изучить истинное распространение коревой инфекции и получить объективные данные о спорадическом уровне заболеваемости корью на всех территориях ЮФО.

Годы

Рис 2 Изменение этиопогической структуры экзантемных заболеваний (%) на территории ЮФО в 2003-2006 гг по данным лабораторных исследований

При обследовании больных с подозрением на корь в 2004 году диагноз кори был лабораторно подтвержден в 1968 случаях (74,1%), краснухи - в 178 (6,7%), отрицательные результаты на корь и краснуху получены в 512 случаях (19,2%) (рис. 3). В 2006 году структура лабораторных диагнозов стала выглядеть следующим образом: корь - 55 случаев (6,2%), краснуха - 354 (40,0%) и «нерасшифрованные» экзантемы - 476 (53,8%) (рис. 3).

%

100

—•— Корь

Краснуха

Другие экзантемы

2003 2004 2005 2006

% 100

Корь Краснуха Другие п - 2658 экзантемы

Рис. 3. Этиологическая структура экзантемных заболеваний в ЮФО на 1-м (2003-2004 гг.) и 2-м (2005-2006гг.) этапах ПЭКпо данным лабораторных исследований

Случаи кори были выявлены не только среди лиц с подозрением на корь, но и среди больных с другими экзантемными заболеваниями, в результате активного лабораторного поиска. Однако процент находок был незначителен и составил 1,7% (9 больных из 546), что подтвердило спорадический уровень заболеваемости корью в ЮФО в 2005-2006гг. (табл. 5).

Таблица 5

Результаты обследования лиц с экзантемными заболеваниями на территории ЮФО (август 2005-2006 гг.)

Всего обследовано Из них лабораторно подтвержден диагноз, абс. %

Корь Краснуха

2005 2006 2005 2006 2005 2006

Лихорадящие больные с экзантемой 164 382 3 (в т.ч. 1-пвр*) 1,8 6 (в т.ч.2-Г1Вр) 1,6 35 21,3 184 48,2

Всего 546 9 (в т.ч. 3 - пвр) 1,7 219 40,1

Примечание: *пвр - поствакцинальная реакция

Для организации и внедрения в практику активного эпиднадзора за коре-подобными заболеваниями в ЮФО был не только изучен их истинный уровень распространения, но и определен примерный перечень заболеваний, «маскирующих» корь.

Анализ первичных клинических диагнозов (табл. 6.) показал, что за весь период наблюдений наиболее часто на исследование направлялись сыворотки больных краснухой (67,2% от общего числа «экзантемных» заболеваний), на втором месте были аллергодерматозы (аллергический дерматит, утопический дерматит и токсикодермия) сопровождающиеся сыпью (13,6%). Па третьем

месте из направленных для исключения кори диагнозов оказались «ОРВИ» (6,3%), а далее, по убывающей, - «инфекционный мононуклеоз» (2,4%), «сыпь неясного генеза» (2,2%), «скарлатина» (1,6%).

Перечень первичных диагнозов в 2005 и 2006 годах практически не менялся. Вместе с тем. наблюдалось увеличение доли обследуемых с диагнозом «краснуха» с 48,2% в 2005 году до 75,4% в 2006 при сохранении процента выявления случаев кори на том же уровне (1,3 и 1,1, соответственно).

В результате исследований специфические 1§М к вирусу кори были выявлены у больных с диагнозом «краснуха» в 1,1%, «ОРВИ» - в 5,9%, «инфекционный мононуклеоз» - в 7,7%, «иерсиниоз» - в 1 случае, что указывает на необходимость усиленного наблюдения за определенными инфекционными заболеваниями на территории ЮФО при уменьшении среди обследованных доли больных краснухой.

Известно, что корь может маскироваться под многими клиническими диагнозами, перечень которых различается в зависимости от региона.

В результате работы была установлена примерная этиологическая структура основных «кореподобных» заболеваний вирусной природы в ЮФО: ЦМВ-(8,7%±2,1), ВЭБ- (5,4%±1,7), парвовирус В19 (8,2%±2,0) -инфекции, ЛЗН (2.7%±1,2) (табл. 7). На долю указанных инфекций пришлось 25%±3,2 обследуемых экзантем с отрицательным результатом, как на корь, так и на краснуху. Этиологически нерасшифрованными остались 75,0% случаев. Эти заболевания могли быть вызваны другими этиологическими агентами, такими, например, как энтеровирусы, стрептококки, риккетсии, различные аллергены, включая лекарственные, и т.д.

Таблица 7

Эиюлогнческая структура других экзантемных инфекцнй у пациентов с отрицательными результатами на корь и краснуху (2005-2006 гг.)

Число Количество случаев с результатом

обсле-следо- Показатель положительным отрицательным

Год дован-ванных ПИЦ ВЭБ ЦМВ ПарвоВ19 ЛЗН Всего Всего

2005 90 абс 6 4 4 1 17 73

% 6,7±2,6 4,4±2,2 4,4±2,2 1,1±1,1 18,9±4,1 81,1 ±4,1

2006 94 абс 4 12 11 4 31- 63

У.'" 4,3±2,1 12,8±3,4 11,7±3,3 4,3±2,1 33,0±4,8 67,0±4,8

Всего 184 абс 10 ■ 16 15 5 46 138

% 5,4±1,7 8,7+2,1 8,2±2,0 2,7±1,2 25,0±3,2 75,0±3,2

Таблица 6

Результаты лабораторного исследования больных с заболеваниями, сопровождающимися лихорадкой и экзантемной сыпью на территории ЮФО (август 2005г. - 2006г.)

Первичный клинический диагноз Показатели Всего случаев' Результаты2

lg М корь « 1д М краснуха (+) Отрицательные на корь и краснуху

Краснуха Абс 367 4 (в т ч 2 -пвр") 209 154 (15*)

% 67,2 1.1 56,9 42,0

Аллергодерма-тозы Абс 74 0 7 67 (14*)

% 13,6 0 9,5 90,5

ОРВИ Абс 34 2 0 32 (16*)

% 6,3 5,9 0 94,1

Инфекционный мононуклеоз Абс 13 1 1 11

% 2,4 7,7 7,7 84,6

Сыпь неясного генеза Абс 12 0 0 12(1')

% 2,2 0 0 100

Скарлатина Абс 9 0 2 7

% 1,6 0 22,2 77,8

Коревая краснуха Абс 6 0 ' 0 6

% 1,1 0 0 100

Ветряная оспа Абс 2 0 0 2

Аденовирусная инфекция Абс «в 2 0 0 2

Инфекционная эритема , Абс 1 0 0 1

ЦМВИ Абс 1 0 0 1

Энтеровирусная инфекция Абс 1 0 0 1

ПВР Абс 1 1 0 0

Другие (иерси-ниоз, ПА, ЛЗН, вирусный гепатит и прочие) Абс 23 1 (иерсиниоз) 0 22 (3*)

% 4,2 4,3 0 95,7

Всего Абс 546 9(втч 3-пвр) 219 318(49*)

% 100 1,7±0,54 40,1 58,2±2,0

Примечания * - случаи, не исследованные на краснуху, ** пвр - поствакшшапьная реакция, 1 - в этой колонке % от «всего», 2 - в колонках «результаты» % - от числа случаев с направительным диагнозом в строке

Таким образом, исследования показали наличие на территории ЮФО как широко известных экзантемных заболеваний, так и «новых» и вновь возникающих инфекций таких, например, как лихорадка Западного Нила (ЛЗН). Примерный перечень заболеваний, «маскирующих» корь и требующих активного зпиднадзора на территориях ЮФО, выглядит следующим образом: краснуха, ОРВИ с экзантемой, ЦМВИ, иерсиниоз, парвовирус В19 и ВЭБ-инфекции, ЛЗН.

В результате проведенных исследований установлены изменения структуры экзан темных заболеваний на территории ЮФО в 2005 и 2006 годах (рис. 4).

2005 г. (п = 408) 2006 Г. (п = 477)

9,1 р" Корь Краснуха (3,8

34,81^4:5 А« ,, : 144,4

2,41 ЦМВ р.? „

з,б 0 ВЭБ 3 2,2

2,4 0 Парвовирус В19 16,1

0,6 ЛЗН 3 2,2

1 Др. экзантемы .¡34,6

-1-Г-1-1- -1-1-Т-1-1-

%60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60%

Рис. 4 Этиологическая структура (%) экзантемных заболеваний в ЮФО на втором этапе ПЭК (2005 - 2006).

Гак, в 2005 году вирусы, являющиеся этиологическими факторами экзантемных заболеваний, были представлены возбудителями кори (9,1%±1,4), краснухи (34,8%±2,3), ЦМВ- (2,4%±0,75), ВЭБ- (3,6%±0,9), парвовирус-В19 (2,4%±0,75) инфекции, ЛЗН (0,6%±0,38). Другие, не идентифицированные нами, агенты составили 47,1%±2,5.

В 2006г. удельный вес перечисленных инфекций составил, соответственно, 3,8±0,87; 44,4±2,3; 6,7±1,14; 2,2±0,67; 6,1±1,1 и 2,2±0,67, других -34,6%±2,17.

По-видимому, следует ожидать, что структура экзантемных заболеваний и в дальнейшем будет меняться в зависимости от интенсивности циркуляции разных возбудителей, что демонстрирует необходимость продолжения начатой работы для определения группы самых распространенных экзантемных инфекций, требующих особого внимания эпидемиологов и вирусологов при достижении элиминации кори в регионе.

Анализ возрастного состава лиц с кореподобными заболеваниями показал (табл. 8), что среди детей до 14 лет доминирующую этиологическую роль играли герпесвирусы (ВЭБ и ЦМВ) и парвовирус В19 - 70,0%; 81,3% и 60,0%, соответственно.

Среди взрослых контингентов заболевания, вызванные указанными вирусами, получили меньшее распространение, однако все случаи верификации диагноза ЛЗН (5) приходились на данную возрастную категорию (табл. 8).

Таблица 8

Возрастная структура экзантсмных инфекции среди лиц с oíрннательным результатом на корь н краснуху (2005 - 2006 ir.)

Возраст Число обследован- Количество случаев с положительным результатом, абс /%

ных лиц ВЭБ ЦМВИ ПВ В19 ЛЗН

0-1 36 2 4 1 0

2-3 26 2 2 3 0

4-5 16 1 2 2 0

6-7 12 1 3 1 0

8-14 31 1 2 2 0

Итого, дети 121 7 13 9 0

65,8% 70,0% 81,3% 60,0%

15-25 36 1 0 2 0

Старше 25 27 2 3 4 5 100%

Всего 184 10 16 15 5

Следовательно, уровень заболеваемости экзантемными инфекциями может также различаться в разных возрастных группах и не соответствовать возрастному распределению, характерному для коревой инфекции.

При изучении этиологической структуры экзантем в ЮФО было выявлено наличие инфекционной эритемы, вызванной парвовирусом В19, в 2,4%±0,75 случаев в 2005 и в 6,1% ±1,1 случаев - в 2006 году.

С целью получения дополнительных данных о широте распространения парвовирус В19-инфекции в ЮФО, проведено изучение состояния иммунитета к указанному возбудителю у здоровых лиц разного возраста Ростовской области (табл. 9).

Таблица 9

Результаты изучения гуморального иммунитета к парвовирусу В19 в РО

Возрастные группы г!»- Количество обследованных лиц Из них с наличием антител к ПВ В19

абс %

3-4 года 38 4 10,5±4,9

9- 10 лет 44 5 11,4±4,8

15-17 лет 72 24 33,3±5,5

23 - 25 лет 28 16 57,1±9,5

Всего 182 49 26,913,3

Специфические к ПВ В19 были выявлены во всех возрастных группах: среди 3-4-х и 9-10-летних детей с одинаковой частотой - 10,5±4,9 и 11,4%±4,8, соответственно; среди подростков 15-17 лет - 33,3%±5,5; молодых людей 2325 лет - 57,1%±9,5. Общее число серопозитивных к ПВ В19 лиц составило 26,9%±3,3.

Полученные данные свидетельствуют об умеренном, по сравнению с дру-

гимн территориями (Цвиркун О.В. и др., 2003), распространении парвовирус В19-инфекции на территории Ростовской области во всех возрастных группах населения. По мере увеличения возраста наблюдается рост числа лиц со специфическими IgG-антителами. Таким образом, можно сделать вывод о более интенсивной циркуляции парвовируса среди детей старше 10 лет, подростков и молодых людей до 25 лет. Учитывая, что специфические антитела класса G в обследованной старшей возрастной группе (23-25 лет) определялись лишь в 57,1%, в ближайшее время можно ожидать увеличения доли парвовирус В19 инфекции в этиологической структуре экзантем, как среди детей, так и среди взрослых. Данное предположение уже подтвердилось увеличением доли ПВ В19 инфекции в этиологической структуре экзантемных заболеваний в ЮФО, обследуемых в рамках реализации Программы, - с 2,4% в 2005 году до 6,1% в 2006.

Наметившийся подъем заболеваемости ПВ В19 инфекцией потребует дополнительных усилий по активации эпиднадзора не только за корью, но и за «кореподобными» инфекциями, с обязательным применением лабораторных методов для верификации диагнозов с целью предотвращения гипер- и гиподи-агностики кори и краснухи, особенно среди беременных с сыпью, составляющих группу риска по указанным заболеваниям. Это, в свбю очередь, потребует наличия на отечественном рынке качественных диагностических тест-систем, отвечающих международным стандартам и позволяющих получать достоверные результаты.

Сравнительная оценка новых иммуноферментных тест-систем для диагностики корн и краснухи. В настоящее время в Европейском регионе в рамках программы элиминации кори используется только ИФ тест-системы фирмы«Оас1е Behring» (Германия), принятые ВОЗ за стандарт и поступающие в Россию в рамках гуманитарной помощи, что делает весьма актуальным поиск отечественных тест-систем, не уступающих'ijo чувствительности и специфич- ^ поста используемой тест-системе.

Для ЮФО, как и для России в целом, имеющей высокий уровень заболеваемости краснухой, особый интерес представляет поиск новых отечественных иммуноферментных тест-систем для определения противокраснушных IgM.

При проведенных нами сравнительных исследованиях результаты, близкие к показателям референс-диагностикума «Berling Enzygnost Anti-Rubella virus IgM» производства «Dade Behring» (Германия), показали все испытанные ТС -«ЭКОлаб-Краснуха-IgM» ЗАО «ЭКОлаб» (г.Электрогорск), «Векто-Рубелла-IgM-стрип» ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) и «Meddens» (Германия). Однако 100% совпадения, как по положительным, так и по отрицательным результатам, продемонстрировала только «ЭКОлаб-Краснуха-lgM» (табл. 10).

Кроме того, трехлетние параллельные исследования сывороток крови с помощью ТС ЗАО «ЭКОлаб» в сравнении с «Dade Behring» продемонстрировали высокий процент совпадения как положительных, так и отрицательных результатов - 95 и 94 соответственно, при общем проценте совпадения результатов - 94,4. Следует отметить стандартность выпускаемых серий препарата (испытано 9 серий) на протяжении всего периода наблюдений (табл.11).

Таблица 10

Сравнительная оценка диагностического потенциала тест-систем для определения к вирусу краснухи

«Berling Enzygnost Anti-Rubella virus 1дМ» <t Векто-Рубелла-lgM-стрип» «Meddens» «ЭКОпаб-Краснуха-1дМ»

1дМ-краснуха-положительные сыворотки п = 54 54 54 54 54

совпадение, % 100 100 100 100

1дМ-краснуха-отрицательные сыворотки п = 30 30 28 (2 ложных) 28 (2 ложных) 30

совпадение, % 100 93,3 93,3 100

Коэффициент корреляции (ОП) - 0,83±0,04 0,82±0,04 0,97±0,01

Таблица 11

Результаты параллельного тестирования сывороток крови на тест-системах «ЭКОлэб-IgM-Kpacnyxa» и «Berling Enzygnost Anti-Rubella virus Ig М» (2004 - 2006 гг.)

«ЭКОлаб-1дМ-краснуха» п=76 «Berling Enzygnost Anti-Rubella virus Ig М» n=76

Позитивные Негативные Сомнительные

Позитивные в 36 2 3

Негативные 2 31 2

Всего п = 71 38 4 33 5

совпадение положйУельных результатов 95,0% - -

совпадение отрицательных результатов - 94,0% -

общее совпадение результатов 94,4%

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования иммуноферментной тест-системы «ЭКОлаб-Краснуха-^М» производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск) для верификации диагноза краснухи в рамках осуществления Программы элиминации кори и СВК/ВКИ на территории РФ.

Качество лабораторной работы в рамках Программы элиминации кори напрямую зависит от качества тест-систем, используемых не только для ранней, но и для ретроспективной диагностики и изучения иммунитета к кори и краснухе.

Испытания отечественных иммуноферментных тест-систем для определения противокоревых/противокраснушных IgG в сравнении с препаратами производства «Dade Behring», принятыми за эталон, показали, что для диагностики и изучения иммунитета к вирусу краснухи одинаково успешно могут быть использованы отечественные тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест», НПО «Диагностические системы» и ЗАО «ЭКОлаб» (табл. 12).

При сравнении ТС для'определения IgG к вирусу кори были получены значительные расхождения результатов испытанных препаратов с эталоном: у диагностикума фирмы «Вектор-Бест» - по положительным результатам ( 86,0%±4,6), у «МБС» - по отрицательным (69,2%±6,2) (табл. 12).

Таблица 12

Сравнительная оценка диагностического потенциала тест-систем для определения к вирусам корн и краснухи

Производители Общее кол-во образцов Общее совпадение, % Совпадение, % Коэффициент корреляции (ОП)

положит отрицат,

для определения G антител к вирусу кЬри

«Dade Behring» 56 - 100,0 100,0

ЗАО «МБС» 56 92,9 100,0 39,2 0,69 ±0,15

Вектор-Бест 56 89,3 86,0 100,0 0,61 ±0,19

для определения G антител к вирусу краснухи

«Dade Behring» 76 - 100,0 100,0

«Вектор-Бест» 76 100,0 100,0 100,0 0,78 ±0,19

«Диагностические системы» 76 100,0 100,0 100,0 0,79 ±0,19

«ЭКОлаб» 76 100,0 100,0 г, 100,0 0,77 ±0,16

Полученные результаты продемонстрировали возможность получения разноречивых данных при проведении сероэпидемиологических исследований по кори при использовании разных тест-систем, что диктует необходимость стандартизации диагностических наборов, используемых для этих.

Кроме того, необходимо отметить, что ИФА тест-система для определения противокоревых Ig G фирмы «Dade Behring», выбранная в качестве эталона в этом исследовании, не обладает 100% чувствительностью и специфичностью. Поэтому с целью полной оценки иммуноферментных препаратов для определения IgG к вирусу кори желательно получить дополнительные данные сравнения указанных диагностических наборов с реакцией нейтрализации, являющейся «золотым стандартом» для оценки гуморального противокоревого иммунитета.

Таким образом, для проведения лабораторного контроля противокоревого иммунитета необходимо продолжить исследования по поиску качественных отечественных ТС, стабильно обеспечивающих достоверные результаты.

Сравнительная оценка определения Ig М к вирусам корн и краснухи в сыворотке крови и цельной высушенной крови («сухая капля»). Традиционным при серодиагностике кори и краснухи, является исследование сыворотки, полученной из венозной крови, что не всегда воспринимается населением с энтузиазмом.

В литературе (Taylor M.B. с соавторами, 1996; De Swart с соавторами, 2001; Riddel М. С соавторами, 2002) был описан альтернативный подход, который может быть полезным при выполнении программы контроля коревой инфекции, - использование образцов высушенной крови из пальца или пятки (методика «сухой капли»). Указанный метод имеет, по мнению зарубежных исследователей, ряд преимуществ: возможность забора крови из пальца (пятки), транспортирования без условий «холодовой цепи» (почтой), хранения до 15 дней даже при комнатной температуре.

Прежде, чем рекомендовать внедрение сухой капли крови для обнаружения специфических противокоревых (противокраснушных) антител класса М в практику работы лабораторной сети, ВОЗ проводила широкомасштабные испытания в ряде стран мира, в том числе в Южном Федеральном округе РФ.

В ходе полевых испытаний; проведенных на территории ЮФО, был получен высокий процент совпадения результатов как по кори, так и по краснухе (92,4% и 95,5%, соответственно), а также высокие показатели специфичности (93,5% по кори и по краснухе) и чувствительности (100%) метода «сухая капля» по сравнению с сывороткой крови, что соответствует данным ВОЗ но другим регионам (табл. 13).

Таблица 13

Результаты параллельного исследования IgM к вирусам кори и краснухи в «сухой капле»/сыворотке крови с использованием ИФА ТС («Dade Behring»)

Нозология Корь Краснуха

Место исследования Кот Д Ивуар, Уганда, Турция РФ (ЮФО) Турция РФ (ЮФО)

Число парных образцов 841 66 65 66

Совпадение, % 88,1 -98,6 92,4 84,6 95,5

Чувствительность, % 99,4- 100 100,0 97,2 100,0

Специфичность, % 91,4-100,0 93,5 100,0 97,2

Основные расхождения (7 из 8 - 87,5%) были зарегистрированы на I рапицс отрицательных и сомнительных результатов и только в одном случае (12.5%) при исследовании «СК» отмечался «переход» из сомнительною при исследовании сыворотки результата в положительный.

Сравнение концентраций специфических '^М (показатель оптической плотности с коррекцией (ОПхКФ)) показало высокую степень корреляции при исследовании сыворотки и «сухой капли», как на 1§М-корь (коэффициент Пирсона г = 0,951 (р < 0,00001); р < 0,05), так и на ^М-краснуха (г = 0.911 (р < 0,00001); р< 0,05) (табл. 14).

Таблица 14

Результаты сравнительных испытаний сыворотки и «сухой капли», полученные по оригинальной методике ВО) (1 ч. 30 мин.) (п=66)

Показатель Корь Краснуха

сыворотка «сухая капля» сыворотка «сухая капля»

Средние значения, М±т 0,053 ±0,015 0,078±0,017 0,41 ±0,062 0,49±0,088

р между группами 0,0000008 0,052

Коэффициент корреляции 0,951 (р<0,00001) 0,911 (р<0,00001)

Корреляционное уравнение Y=0.023+1.040*x Y=-0.036+1.27*x

В целом, среднее значение (ОПхКФ), полученное при исследовании «сухой капли» по сравнению с сывороткой, было выше, как поди кори (0,078±0,017 и 0,053 ± 0,015, соответственно), так и при краснухе (0,49±0,088 и 0,41±0,062, соответственно). Причем, по кори эти различия были статистически значимы и, следовательно, связаны с самой методикой проведения исследования (по I Стыоденту р = 0,0000008; по Вилкоксону р = 0,00000 (р<0,05). Сравнение результатов по краснухе не показало статистически значимых отличий (по I критерию Стьюдента р = 0,052; по критерию Вилкоксона р = 0,093698 (р>0,05). Это указывает на ведущую роль случайного фактора, который маскирует систематические причины, связанные1 в том числе, с характеристиками тест-системы, использованной для данного исследования.

Более высокое среднее значение (ОП*КФ), полученное при исследовании «сухой капли» с использованием оригинальной методики, можно было объяснить увеличением в 1,5 раза времени инкубации для «сухой капли» (1ч. 30 мин.) по сравнению с сывороткой (1ч.). •

Однако наша попытка модифицировать методику ВОЗ при исследовании «СК» путем уменьшения времени экспозиции не привела к сближению сравниваемых результатов (табл. 15) и позволила прийти к следующим выводам:

1) время экспозиции (1ч. 30 мин.), предложенное в оригинальной методике, является оптимальным для «сухой капли»;

2) для получения более близких результатов (ОП*КФ) при исследовании «СК» в сравнении с сывороткой крови следует искать другие подходы.

Одним из таких подходов, на наш взгляд, является введение поправочного коэффициента при использовании «сухой капли» для исследования на ^М-корь. Для выявления 1§М-краснуха, учитывая более низкую воспроизводимость результатов, введение такого поправочного коэффициента не представляется возможным.

Для простоты интерпретации результатов исследования сывороток, поправочные коэффициенты ввели в значения пороговых величин для отрицательных, сомнительных и положительных результатов. При введении для интерпретации результатов новых, скорректированных, пороговых уровней

(<0,127-отрицательный результат; от 0,127 до 0,231 - сомнительный резулмат; >0.231 - положительный результат), полученных методом «сухая капля», процент совпадения результатов по кори увеличился с 92,4 до 95,5 (табл. 16).

Таблица 15

Результаты сравнительных испытаний сыворотки и «сухой капли», полученные по модифицированной методике (1 ч. 15 мин.) (п - 22)

Показатель Корь Краснуха

сыворотка «сухая капля» сыворотка «сухая капля»

Средние значения, М±т 0,041±0,0154 0,079±0,019 0,66±0,099 0,4610,074

р между группами 0,000014 0,0033

Коэффициент корреляции 0,941 (р<0,00001) 0,811 (р<0.00001)

Корреляционное уравнение У=0.031+1.16*х У=-0.064+0.60*х

Таблица 16

Влияние введения корректировки пороговых уровнен на результат исследований

Интерпретация Значения Разница с эталоном

сыворотка «сухая капля»

нескорректированные скорректированные нескорректированные скорректированные

Отрицательный <0,1 <0,1 <0,127 4 из 62 2 из 62

результат (п = 62) (л = 58) (п = 60)

Сомнительный от 0,4° до 0,2 от 0,1 до 0,2 от 0,127 до 1 из 1 1 из 1

результат , (п = 1) (п = 0) СМ II О-с.

Положительный 0ц2 и выше 0,2 и выше >0,231 0 из 3 0 из 3

результат (п = 3) (п = 3) (п = 3)

Совпадения, % - - - 92,4 95,0

Влияние случайных факторов на результаты измерений оценивали по среднеквадратичному отклонению попарной разности результатов эталонной методики и «сухой капли» после коррекции результатов «сухой капли» посредством введения поправочных коэффициентов (как указывалось выше) для компенсации систематической погрешности: 5=(Е(х1 — у1)2)/п, где х и у - показатели, измеренные методами «сухая капля» и «сыворотка». Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что роль случайных факторов при выявлении противокоревых антител приблизительно на порядок меньше, чем при выявлении антител к вирусу краснухи. Стандартная и модифицированная методики в данном аспекте показывают и в случае кори и в случае краснухи сходные результаты.

Таким образом, полевые испытания метода «сухая капля» для определения Ig М к вирусам кори и краснухи продемонстрировали:

1) высокие показатели специфичности (93,5% - по кори и 97,2% - по краснухе), чувствительности (100% как по кори, так и по краснухе) и совпадения результатов (92,4% - по кори и 95,5% %- по краснухе). Расхождения зафиксированы только на границе отрицательных и сомнительных результатов;

2) высокую воспроизводимость и устойчивость к модификации методики «CK» при исследовании на IgM к вирусу кори, что позволило изменить границы юн проведении оценки резулыагов с помощью поправочных коэффициентов. Введение поправочного коэффициента увеличило процент совпадения результатов с 92,4% до 95,5%.

3) более низкую, по сравнению с корью, воспроизводимость и надежность результатов при исследовании на краснуху, что не дает возможности в данном случае использовать поправочные коэффициенты.

В целом, результаты полевых испытаний метода CK на территории ЮФО показывают возможность широкого применения данного "метода для диагностики кори и краснухи. \ >

ВЫВОДЫ

1. Серологическое подтверждение каждого случая кЬри в условиях элиминации этой инфекции является обязательным мероприятием эпидемиологического надзора, так как способствует снижению частоты клинических диагностических ошибок и позволяет получить объективные доказательства достижения спорадического уровня заболеваемости корью в регионе.

2. Продемонстрирована необходимость наблюдения за структурой экзан-темных заболеваний для успешного контроля за распространением коревой инфекции в регионе на примере ЮФО, так как случаи кори могут маскироваться среди следующих заболеваний сопровождающихся пятнисто-папулезной сыпью и лихорадкой: краснуха, ОРВИ с сыпью, ЦМВИ, иерсиниоз, ПВ В19,ВЭБ, ЛЗН.

3. Показан высокий процент совпадения результатов иммуноферментных тест-систем «ЭКОлаб-Краснуха-IgM», «ЭКОлаб-Краснуха- IgG», (Электро-горск), «Векто-Краснуха-IgG» (Новосибирск), «Kpacnyxa-lgG-ДС» (Нижний Новгород) с препаратами производства «Dade Behring» (Германия), что позволяет использовать отечественные тест-системы для проведения серологических исследований в рамках Программы ликвидации кори, наряду с рекомендованными ВОЗ.

4. Апробирован в полевых условиях метод «сухой капли» для серологического подтверждения кори и краснухи. Установлено, что метод может быть применен для диагностики кори и краснухи.

5. Предложен поправочный коэффициент при оценке пороговых значений оптической плотности, введение которого позволило увеличить процент совпадения результатов исследований на корь, полученных эталонным методом (сыворотка крови) и методом «сухой капли» с 92,4% до 95,5%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Определение иммунологического статуса женщин детородною возраста в эпидемиологическом надзоре за коревой инфекцией / Говорухина М.В., Зыкова Т.А., Асмолова Н.Ю., Дмитриевский Е.В. // Научные труды НИИ гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана под редакцией академика РАМН А.И.Потапова «Региональные проблемы охраны окружающей среды и здоровья населения». - Ростов-на-Дону, 1997.-С. 156- 157.

2. О состоянии заболеваемости коревой инфекцией и результатах серологическою мониторинга в Ростовской области / Кондратенко Т.А., Швагер М.М., Говорухина М.В., Зыкова Т.А., Мазрухо Т.В., Асмолова НЛО. // Материалы 7 Съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов, часть 1. - Москва, 1997.-С.129-130.

3. Проблемы и перспективы ликвидации кори в Южном Федеральном округе / Айдинов Г.Т., Швагер М.М., Сароян Ю.Д., Говорухина М.В., Зыкова Т.А. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2003.-№ 1.-С. 14-16.

4. Роль лабораторного подтверждения кори и краснухи в период элиминации кори в ЮФО / Говорухина М.В., Тихонова Н.Т. // Материалы ЮжноРоссийской научно-практическОй конференции к 85-летнему Юбилею Кубанской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России» - Ростов-на-Дону- Краснодар - 2005. - С.42-44.

5. О роли лабораторной службы в эпидемиологическом надзоре за корью и другими экзантемными заболеваниями в Южном Федеральном округе / Говорухина М.В., Тихонова Н.Т. // Сборник научных трудов к 145-летию со дня рождения Г.Н.Габричевского «Теоретические и практические аспекты элиминации кори». - Москва, 2005. - С.39 - 42.

6. Некоторые особенности краснушной инфекции на современном этапе в Ростовской области / Cqлoвьeв М.Ю., Ковалев Е.В., Рыжков В.Ю., Сароян Ю.Д , Говорухина М.В. // Сборник научных трудов к 145-летию со дня рождения Г.Н.Габричевского «Теоретические и практические аспекты элиминации кори» - Москва, 2005. 128-130.

7. Роль лабораторного подтверждения кори и краснухи в период элиминации кори в ЮФО / Говорухина М.В., Тихонова Н.Т. //«Эпидемиология и вакцинопрофилактика» - Москва, 2006. -№1. - С. 17-20.

8. Опыт использования в ЮФО метода «сухая капля» для выявления ашшел к вирусам кори и краснухи / Говорухина М.В., Тихонова Н.Т., МамаеваГ.А . ШвагерМ.М., ЗыковаТ.А., КудряЕ.В., РыжковВ.Ю., Сароян Ю.Д. // «Акт)шп>-нь[с вопросы инфекционной патологии Юга России» - Роств-на-Доиу- Краснодар, 2006. - С. 33-35.

9. Реализация программы ликвидации кори в ЮФО / Кондратенко Т.А.. Лет ифо-ва И.А., Рыжков В.Ю., Сароян Ю.Д., Говорухина М.В. // Сборник научных трудов, посвященных юбилею кафедры эпидемиологии «Региональные проблемы окружающей среды, здоровья населения и санитарно-эпидемиологического благополучия», выпуск 2. - Ростов-на-Дону. 2006. -

С. 41-43.

10. Современное состояние диагностики синдрома врожденной краснухи / Айди-

но» Г .Т., Говорухина М.В., Зыкова Т.А., Кудря Е.В., Асмолова Н.Ю., Мазрухо Т.В., 1ивагер М.М., Ковалев Е.В., Сароян Ю.Д., Морозова Н.В., Туева О.Н. // Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летню кафедры детских инфекционных болезней Ростовского Государственного Медицинского Университета «Актуальные проблемы инфекционной патологии у детей». - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 6-9.

11. Проблемы лабораторной диагностики синдрома врожденной краснухи / Айдинов Г.Т., Говорухина М.В., Зыкова Т.А., Кудря Е.В., Асмолова Н.Ю., Мазрухо Т.В., Швагер М.М., Ковалев Е.В., Сароян Ю.Д. // Сборник научных трудов, посвященных юбилею кафедры эпидемиологии «Региональные проблемы окружающей среды, здоровья населения и санитарно-эпидемиологического благополучия», выпуск 2. - Ростов-на-Дону, 2006. - С.47-49.

12. О результатах изучения этиологической структуры «кореподобных» заболеваний на втором этапе осуществления программы элиминации кори в ЮФЮ / Говорухина М.В., Айдинов Г.Т., Швагер М.М., Зыкова Т.А., Кудря Е.В. // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов,Т. 2.-Москва, 2007.-С. 143-144.

13. Перспективы элиминации кори - в Российской Федерации к 2010г. / Тихонова Н.Т., Мамаева Т.А., Герасимова А.Г., Шульга'С.В., Говорухина М.В. // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Т. 2. - Москва, 2007. - С.172.

Список условных обозначений

АГ - антиген РПГА - реакция пассивной

гемагглютинации

ВКИ - врожденная краснушная РРЦ - Ростовский региональ-

инфекция г ный центр

ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр CBK - синдром врожденной

краснухи

ЖКВ - живая коревая вакцина «CK» - сухая капля

ИФ - иммуноферментный тс - тест-система

ИФА - иммуноферментный анализ ФЦ - Федеральный центр

ЛЗН - лихорадка Западного Нила цмв - цитомегаловирус

011 - оптическая плотность цмви - цитомегаловирусная

ПВ В19 - парвовирус В19 инфекция

ПК - персональный компьютер ЮФО - Южный Федеральный

ПЭК - Программа элиминации кори округ

Ig - иммуноглобулин

РО - Ростовская область RF - абсорбент ревматоидного

фактора

Актуальность темы

Положительные и стабильные изменения в динамике развития эпидемического процесса кори в России, повсеместное и неуклонное повышение охвата вакцинацией и ревакцинацией высокоэффективной отечественной живой коревой вакциной (ЖКВ) из штамма Л-16 позволили разработать Национальную Программу ликвидации кори в Российской Федерации к 2010 году и приступить к ее реализации [55].

Одним из основных принципов ликвидации кори является эффективный эпидемиологический надзор за корью и другими зкзантемными заболеваниями, предусматривающий полное и активное выявление всех случаев кори и их обязательное лабораторное подтверждение.

По мнению В.Л. Черкасского [81], основная сложность в реализации программы «видится, прежде всего, в проблеме организации и проведении эпиднадзора за кореподобными случаями, а также в создании системы мониторинга за состоянием коллективного иммунитета и свойствами циркулирующих штаммов вируса кори».

В РФ, несмотря на очевидные успехи Национальной Программы ликвидации кори к 2010 году, показатель заболеваемости корью все еще остается высоким. Так, в 2004 году зарегистрировано 2558 случаев кори, в 2005 -454, в 2006 - 1147, в 2007 - 173, а за 6 мес. 2008 года - 20 [14,71,73-76]. Интенсивный показатель заболеваемости составил 1,78 в 2004 году; 0,32 в 2005; 0,8 в 2006 против 0,12 на 100 тыс. населения или 1,2 случая на 1 млн. жителей страны в 2007 году и 0,014 за 6 мес. 2008 года. [73-76,48-50]. По рекомендации экспертов ВОЗ, показателем элиминации кори в стране является уровень заболеваемости менее 1 случая кори на миллион населения [30,83,119,133]. В то время как в 50% европейских стран в течение длительного периода времени регистрируется стабильно низкий уровень заболеваемости корью, число случаев кори в России все еще превышает показатель менее 1 случая на 1 миллион населения [83]. Кроме того, в РФ до сих пор остаются территории (республики Северного Кавказа, включая Чеченскую Республику, г. Москва, г. Благовещенск, Алтайский и Красноярский край и др.), на которых в силу различных причин сохраняются условия, способствующие активизации эпидемического процесса кори [46]. До сих пор, регистрируются вспышки кори, в том числе в Нижнем Новгороде (25 случаев), Владивостоке (11 случаев), Красноярске (10 случаев), характеризующиеся разной степенью интенсивности и распространенности и наличием импортного источника инфекции: из Узбекистана случаи завезены в Нижний Новгород, из Китая - во Владивосток [50]. Все вышесказанное демонстрирует необходимость повышения внимания к реализации Программы ликвидации кори, в том числе к поддержанию высокого уровня охвата населения прививками, совершенствованию эпиднадзора за корью, выявлению групп и территорий риска заболеваемости и т.д.

Решение перечисленных задач невозможно без лабораторной поддержки, призванной обеспечивать Программу объективными данными по слежению за циркуляцией вируса и за изменениями в группах восприимчивых лиц. С этой целью была создана единая лабораторная сеть, основными задачами которой являются [37,57,58,106]:

- мониторинг и верификация заболеваемости и трансмиссии вирусов;

- мониторинг восприимчивости популяции;

- участие в исследовании поствакцинальных реакций.

По мере реализации Программы, с учетом эпидситуации, территориальных и национальных особенностей, задачи лабораторий будут, безусловно, меняться, что потребует принятия своевременных и адекватных мер по совершенствованию тактики и методов лабораторных исследований в целом по стране и на отдельных административных территориях, в частности. Данное исследование обобщает опыт работы лабораторной службы на 1-м (2002 -2004гг.) и 2-м (2005-2006гг.) этапах реализации Программы ликвидации кори на примере ЮФО для оптимизации серологической диагностики кори в период ее элиминации.

Необходимо отметить, что за годы активной специфической профилактики кори и краснухи роль лабораторных исследований существенно увеличилась. Это связано, в том числе, с наличием атипичных и субклинических форм указанных заболеваний, при которых наблюдается сокращение инкубационного периода, уменьшение выраженности симптомов интоксикации, видоизменение характера сыпи и т.п. [16, 41, 42, 43, 77]. Особенно сложен диагноз кори у ранее вакцинированных лиц со стертой формой инфекции, а также и в случаях появления сыпи в ответ на введение живой коревой вакцины [87]. Все это затрудняет постановку диагноза на основании только клинических проявлений и значительно усложняет дифференциальную диагностику кори и других экзантемных заболеваний, особенно краснухи, что может привести к значительному числу клинических ошибок. Это положение хорошо иллюстрируют данные литературы [24,52,53,67,69]. В тоже время некоторые авторы (Казанцев А.П.) отмечают высокий процент (83,3) подтверждения клинического диагноза кори среди взрослых, поступающих в стационар [25,26].

В связи с этим возникла необходимость изучить процент клинических ошибок на различных этапах осуществления Программы ликвидации кори на территории ЮФО с целью получения объективных данных о распространении кори, получения доказательств значимости серодиагностики и для обоснования тактики обязательного лабораторного подтверждения каждого случая с подозрением на корь.

Представляется весьма актуальным научно обосновать необходимость внедрения в практику здравоохранения дифференциальной лабораторной диагностики различных экзантемных заболеваний для предотвращения гипо-и гипердиагностики кори, в том числе с применением серологических методов.

В условиях спорадической заболеваемости чрезвычайно важно разработать методику определения истинной распространенности кори на конкретной территории. Лабораторное обследование больных корью и лиц с подозрением на эту инфекцию позволяет получить дополнительные данные, которые могут явиться основанием для создания протокола лабораторного обследования разных контингентов лиц с целью выявления истинного числа больных корью на данной территории, а также представить список экзантемных заболеваний, под маской которых наиболее часто скрывается корь. В настоящее время представление о том, какие экзантемные заболевания могут маскировать корь, основывается только на определенном сходстве клинических проявлений.

До принятия Программы ликвидации кори использование лабораторных методов носило ограниченный характер. В настоящее время лабораторные исследования и, прежде всего, их диагностическое направление, являются важной и обязательной составляющей системы надзора за инфекцией. При этом впервые в России для верификации диагноза кори и краснухи используются единые методические подходы, стандартные высокочувствительные и высокоспецифичные диагностические ИФА тест-системы, принятые в глобальной лабораторной сети ВОЗ, что, безусловно, направлено на получение новой объективной информации о циркуляции вируса.

Несмотря на чрезвычайную важность обязательного лабораторного подтверждения каждого случая кори в условиях спорадической заболеваемости, в России практически отсутствуют иммуноферментные тест-системы для выявления коревых и сопоставимые по специфичности и чувствительности с зарубежными аналогами, используемыми в европейской лабораторной сети. Необходимость получения сопоставимых лабораторных данных в процессе осуществления Программы ликвидации кори в Европейском регионе потребовало от ЕРБ ВОЗ осуществлять поставку в Россию в рамках гуманитарной помощи диагностических коревых/краснушных тест-систем фирмы «Dade Behring» (Германия), используемых при реализации Программы во всех европейских странах. Тщательный подробный анализ результатов использования этих тест-систем в России в настоящее время отсутствует, также как и подбор наиболее специфичных отечественных диагностических ИФА тест-систем, особенно для верификации краснухи. Тем более, что поставки зарубежных тест-систем весьма ограничены в силу высокой стоимости препарата.

В связи с этим, весьма актуально подобрать адекватные отечественные тест-системы, пригодные для исследования материала от больных корью и краснухой, и не уступающие по специфичности и чувствительности зарубежным аналогам.

Серологическое обследование каждого больного с подозрением на корь нередко вызывает трудности из-за сложности доставки сывороток из отдаленных, трудно доступных регионов, тем более при соблюдении «холодовых» условий транспортирования материала.

В последние годы появились данные о возможности использовать для диагностических исследований метод «сухой капли» крови («CK») [95,102,108,127,128]. Однако прежде чем рекомендовать внедрение метода «CK» для лабораторного подтверждения диагнозов кори и краснухи ВОЗ проводит широкомасштабные исследования на местах, в том числе и в России, на территории Южного Федерального округа.

Внедрение метода «CK» для выявления антител класса М к вирусам кори и краснухи в ЮФО является особенно актуальным, так как именно для указанного региона РФ характерно наличие труднодоступных высокогорных регионов, жаркий климат и широко представленные национальные и религиозные различия. В связи с этим одной из задач диссертационной работы явилось получение объективных убедительных данных, позволяющих в скором будущем перейти практическому здравоохранению на новый метод забора крови - «СК».

Таким образом, изложенное выше свидетельствует о том, что проблема совершенствования серодиагностики для оптимизации лабораторного надзора за корью и краснухой в период осуществления Программы ликвидации кори является весьма актуальной. К настоящему времени назрела необходимость обобщения полученных лабораторных данных и приобретенного опыта для улучшения работы лабораторной сети на разных этапах Программы.

Все вышеизложенное определило цель исследования: совершенствование тактики серологической диагностики кори в период ее элиминации, в том числе на основе оценки диагностической значимости некоторых имму-ноферментных тест-систем и апробации нового метода сбора и доставки серологического материала. Работа выполнялась в Южном Федеральном округе в рамках Программы ликвидации кори в РФ к 2010 г.

Достижение этой цели потребовало решения следующих задач:

1. Изучить динамику лабораторного подтверждения кори на территории ЮФО в предэлиминационный период (1998-2001 гг.) и на этапах элиминации (2003-2006 гг.) для выявления процента диагностических ошибок и обоснования тактики обязательного лабораторного подтверждения каждого случая с подозрением на корь.

2. На разных этапах выполнения Программы ликвидации кори обследовать различные контингенты лиц с подозрением на корь и другими экзан-темными заболеваниями с целью определения на территории истинного уровня заболеваемости корью; изучить этиологическую структуру случаев с подозрением на корь, определить долю разных вирусных экзантем (краснуxa, ЦМВИ, ВЭБ и парвовирусная В19 инфекции) и составить перечень заболеваний, «маскирующих» корь.

3. Оценить диагностическую значимость новых иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи и выявления специфических IgG к вирусам кори и краснухи в сравнении с препаратами производства «Dade Behring»; дать предложения по их применению.

4. Адаптировать альтернативный метод забора серологического материала «сухая капля» для лабораторного подтверждения диагноза кори и краснухи и внедрить его в систему эпиднадзора.

Научная значимость

- Впервые в условиях региона обоснована стратегия обязательного лабораторного подтверждения каждого случая кори в период элиминации заболевания. С помощью обязательного лабораторного подтверждения каждого случая с подозрением на корь и обследования лиц с другими экзантем-ными заболеваниями получены объективные данные об истинной заболеваемости корью в регионе;

- Изучена этиологическая структура «кореподобных» заболеваний в регионе и определены доли некоторых вирусных экзантем (краснуха, ЦМВИ, ВЭБ и парвовирус В19 инфекции и др.); составлен примерный перечень заболеваний, «маскирующих» корь на территории ЮФО и продемонстрирована целесообразность использования его в системе эпиднадзора за корью в период спорадической заболеваемости; установлена степень распространенности парвовирусной В 19-инфекций среди населения Ростовской области;

- Впервые в практических условиях получены данные, свидетельствующие о целесообразности применения метода "сухой капли" крови для лабораторного подтверждения клинического диагноза при проведении серодиагностики кори и краснухи;

- Получены данные о диагностической значимости ряда отечественных

ИФА тест-систем для серологических исследований на корь и краснуху в сравнении с препаратами фирмы «Dade Behring» (Германия), широко используемыми в европейской коревой/краснушной лабораторной сети ВОЗ для верификации диагноза в условиях спорадической заболеваемости. Продемонстрирована возможность использования в современных условиях ТС «ЭКОлаб IgM-краснуха», для определения противокраснушных IgG - ТС ЗАО «Вектор Бест», НПО «Диагностические системы» и ЗАО «ЭКОлаб».

Практическая значимость

Усовершенствована тактика серологической диагностики кори в период ее элиминации. Оценена диагностическая значимость некоторых имму-ноферментных тест-систем и нового метод сбора и доставки исследуемого материала для серологической диагностики, что позволило рекомендовать их для использования в работе органов практического здравоохранения.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследований внедрены в работу практического здравоохранения и использованы при подготовке нормативных и методических документов:

- ежегодных информационных писем по выполнению Программы ликвидации кори в ЮФО (4-03-46/1523 от 11.06.2004г., 4-03-46/298 от 23.03.2005г., 08/4358 от 22.05.2006г., 08/4416 от 30.03.07г., 08-67-02/9360 от 27.06.08г.);

- ежегодных информационных писем по выполнению Программы ликвидации кори в Ростовской области (04-3-49/2915 от 22.06.2006г., 08-7683 от 07.06.07г., 04-3-81 от 20.05.08г.);

- методического письма «Об обследовании больных с подозрением на корь методом «сухой капли»», подготовленного для территорий ЮФО (08/4170 от 21.07.05г.);

- регионального плана мероприятий по реализации второго этапа Программы ликвидации кори в РФ на 2005-2007 годы (08/7571 от 14.10.2005г.);

- ежегодных информационных сборниках статистических и аналитических материалов «Анализ деятельности микробиологических лабораторий Госсанэпиднадзора в Ростовской области по ведомственной отчетности ф. 6-96 (вирусологические исследования)», оперативных письмах, подготовленных для территорий ЮФО, государственных докладов о санитарно-эпидемиологической обстановке в Ростовской области и мерах по ее стабилизации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях низкой заболеваемости корью серодиагностика кори и краснухи является необходимой составляющей эпиднадзора, позволяющей минимизировать ошибки при постановке клинического диагноза, выявить истинное число случаев кори, получить обоснованные доказательства спорадического характера заболеваемости или отсутствия случаев кори.

2. При спорадической заболеваемости корью необходим обязательный сероэпидемиологический мониторинг кореподобных заболеваний с составлением их примерного перечня, который будет меняться в зависимости от эпидемической ситуации, складывающейся в регионе в отношении той или иной инфекции. Систематическое обследование больных с лихорадкой и папулезной сыпью направлено на получение объективных данных о заболеваемости корью в регионе.

3.Для реализации Программы элиминации кори и предупреждения СВК/ВКИ в Российской Федерации целесообразно рекомендовать использование отечественных ИФА тест-систем, которые по специфичности и чувствительности не уступают зарубежным аналогам, при обязательном использовании внутреннего контроля.

4. Метод «сухой капли» крови может быть использован для серологического подтверждения клинического диагноза кори и краснухи в работе органов практического здравоохранения, особенно в трудно доступных регионах страны.

Апробация материалов диссертации состоялась на совместном заседании секций Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Рос-потребнадзора «Общая и прикладная иммунология» и «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных болезней» 20 октября 2008 г. Результаты исследований доложены и обсуждены на: национальных совещаниях ВОЗ - г. Ростов-на-Дону, 2002; г. Азов, 2003; г. Пермь, 2004; С-Петербург, 2006; совещаниях национальной лабораторной сети - г. Москва, 2006, 2007; научно-практической конференции, посвященной 145-летию со дня рождения Г.Н.Габричевского, 2005; региональных совещаниях ВОЗ - 2005; 2006; научно-практической конференции в г. Геленджик, 2005; IX. Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов, паразитологов - г. Москва, 2007; областных совещаниях (2004, 2005, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 3 из которых - в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка используемой литературы, включающего 143 источника, в том числе 86 отечественных и 57 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 39 таблицами и 12 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Серологическое подтверждение каждого случая кори в условиях элиминации этой инфекции является обязательным мероприятием эпидемиологического надзора, так как способствует снижению частоты клинических диагностических ошибок и позволяет получить объективные доказательства достижения спорадического уровня заболеваемости корью в регионе.

2. Продемонстрирована необходимость наблюдения за структурой эк-зантемных заболеваний для успешного контроля за распространением коревой инфекции в регионе на примере ЮФО, так как случаи кори могут маскироваться среди следующих заболеваний сопровождающихся пятнисто-папулезной сыпью и лихорадкой: краснуха, ОРВИ с сыпью, ЦМВИ, иерси-ниоз, ПВ В19, ВЭБ, ЛЗН.

3. Показан высокий процент совпадения результатов иммунофермент-ных тест-систем «ЭКОлаб-Краснуха-IgM», «ЭКОлаб-Краснуха- IgG», (Элек-трогорск), «Векто-Краснуха-IgG» (Новосибирск), «KpacHyxa-IgG-ДС» (Нижний Новгород) с препаратами производства «Dade Behring» (Германия), что позволяет использовать отечественные тест-системы для проведения серологических исследований в рамках Программы ликвидации кори, наряду с рекомендованными ВОЗ.

4. Апробирован в полевых условиях метод «сухой капли» для серологического подтверждения кори и краснухи. Установлено, что метод может быть применен для диагностики кори и краснухи.

5. Предложен поправочный коэффициент при оценке пороговых значений оптической плотности, введение которого позволило увеличить процент совпадения результатов исследований на корь, полученных эталонным методом (сыворотка крови) и методом «сухой капли» с 92,4% до 95,5%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наличие ряда теоретических (существование единственного антигенного варианта возбудителя, формирование пожизненного иммунитета после перенесенной инфекции, циркуляция вируса кори исключительно в человеческой популяции (строгий антропоноз), отсутствие носительства в открытой форме) и практических (высокоэффективная живая коревая вакцина) предпосылок позволили Всемирной Организации Здравоохранения разработать и внедрять во всемирном масштабе Программу ликвидации кори.

В 2002 году Россия также включилась в реализацию этого проекта ВОЗ и разработала свою национальную Программу, утвержденную приказом МЗ РФ №270 от 19.08.2002г. [55].

Одним из важнейших условий, необходимых для элиминации кори, является наличие действенного эпидемиологического надзора. С реализацией Программы и достижением спорадического уровня заболеваемости корью значимость эпиднадзора не только за корью, но и кореподобными заболеваниями резко возрастает. Такой надзор невозможен без наличия полной и достоверной информации о заболеваемости корью, состоянии противокоревого иммунитета в разных возрастных группах и сведений о циркуляции возбудителя. Этой информацией эпидемиологов обеспечивает лабораторная сеть, роль и значение которой в реализации Программы сложно переоценить.

Необходимо совершенствование системы лабораторного контроля эффективности эпидемиологического надзора за корью на каждом этапе осуществления Программы ликвидации кори, включающей установление истинного уровня заболеваемости и определение процента клинических ошибок при диагностике кори; уточнение перечня экзантемных заболеваний, «маскирующих» корь; подбор наиболее качественных отечественных диагностических иммуноферментных тест-систем для диагностики кори (краснухи) и для изучения коллективного иммунитета при этих инфекциях; внедрение альтернативных методов забора материала.

Проведенный анализ состояния лабораторной диагностики кори в ЮФО в предэлиминационный период (1998-2002 гг.) показал, что использование лабораторных методов диагностики кори носило ограниченный характер, а, следовательно, данные о заболеваемости этой инфекцией до начала реализации Программы ликвидации кори могли иметь относительный характер и не соответствовать реальному состоянию дел.

Так, удельный вес случаев с лабораторным подтверждением за анали-. зируемый период колебался от 4,7% до 15,6% и составил, в среднем за четыре года, 9,0%, что ниже среднего по стране показателя (15%). При сопоставлении прививочного анамнеза лиц с клиническим диагнозом «корь» в 2001 и 2003 годах было установлено, что введение в 2003 году обязательного лабораторного подтверждения кори с помощью ИФА привело к снижению доли среди заболевших ревакцинированных с 31 до 14,5%, а переболевших корью ранее — с 4,5 до 0,5%.

С началом реализации Программы в ЮФО лабораторные методы диагностики кори стали обязательной составляющей в системе надзора за этой сложной инфекцией. Впервые для серологического подтверждения диагноза кори и краснухи были использованы единые методические подходы и стандартные высокочувствительные и высокоспецифичные диагностические имму-ноферментные тест-системы, используемые в глобальной лабораторной сети ВОЗ. Это позволило получить достоверные лабораторные данные для Программы.

Проведенное сопоставление клинических и лабораторных диагнозов показало значительное количество диагностических ошибок при постановке клинических диагнозов на всех этапах осуществления Программы ликвидации кори в ЮФО, что доказало важность обязательного серологического подтверждения каждого случая кори.

Так в ЮФО, расхождения в клинических и лабораторных диагнозах «корь» составили на первом этапе реализации Программы 19,4%, на втором - 20%; «краснуха» — 1,1 и 10,7%; в «других экзантемных заболеваниях» — 17,8 и 30,7%, соответственно. Полученные результаты согласуются с данными O.A. Подонюк с соавторами (2006), В.Ф. Попова (2002), Н.Т. Тихоновой с соавторами (2004), которые демонстрируют трудность клинической диагностики кори даже в период подъема заболеваемости [52,53,69].

Процент диагностических ошибок при постановке клинических диагнозов в 2003-2006 гг. колебался при кори от 16,3 до 86,4; при краснухе - от 73,8 до 37,0; при других экзантемах - от 63,2 до 9,3, что подтверждает необходимость проведения обязательного лабораторного обследования для верификации диагнозов кори и краснухи.

Анализ доли серологического подтверждения кори и краснухи, проведенный в динамике (2003 - 2006) среди различных клинических диагнозов, а именно «корь», «корь?», «краснуха», «краснуха?» и других «кореподоб-ных» заболеваний показал существенное уменьшение удельного веса лабо-раторно подтвержденной кори из общего числа обследованных во всех анализируемых группах. Так, в эти годы удельный вес коревой инфекции в структуре обследованных лиц с диагнозами «корь» и «корь?» снизился в 6,2 раза (с 83,7 до 13,6%), с диагнозами «краснуха» и «краснуха?» - в 17,3 раза (с 19,0 до 1,1%), с «другими экзантемными заболеваниями» - в 22,6 раза (с 63,2 до 2,8%). Данная закономерность прослеживалась практически на всех территориях ЮФО.

В тот же период, удельный вес краснушной инфекции, напротив, увеличился: среди лиц с диагнозами «корь» и «корь?» в 18,7 раза (с 1,7 до 31,8%), с диагнозами «краснуха» и «краснуха?» - в 2,4 раза (с 26,2 до 63,0%), с «другими экзантемными заболеваниями» - в 6,5 раза (с 0 до 6,5%).

Доля нерасшифрованных заболеваний, сопровождающихся пятнисто-папулезной сыпью также увеличилась в группах больных с диагнозом «корь» в 3,7 раза (с 14,6 до 54,6%) и больных с «другими» экзантемами - в 2,5 раза (с 36,8 до 90,7%). Среди больных с диагнозом «краснуха», наоборот, отмечено снижение в 1,5 раза (с 54,8 до 36,0%) удельного веса лиц с отрицательным результатом, как на корь, так и на краснуху, что указывает на более успешную постановку этого диагноза клиницистами.

Тенденция снижения процента лабораторного подтверждения кори среди различных клинических диагнозов говорит не столько об увеличении числа клинических ошибок, сколько об изменении этиологической структуры случаев с подозрением на корь в ЮФО, что является благоприятным прогностическим признаком и доказательством успеха реализации Программы ликвидации кори на всех территориях ЮФО.

Обязательное лабораторное обследование всех лиц с подозрением на корь позволило изучить истинное распространение коревой инфекции на втором этапе Программы и получить объективные данные о спорадическом уровне заболеваемости корью.

При обследовании больных с подозрением на корь в 2004 году (на первом этапе Программы) лабораторно диагноз кори был подтвержден в 1968 случаях (74,1%), краснухи - в 178 (6,7%), отрицательные результаты на корь и краснуху были получены в 512 случаях (19,2%).

В 2006 году (на втором этапе Программы) структура лабораторных диагнозов стала выглядеть следующим образом: корь - 55 случаев (6,2%), краснуха - 354 (40,0%) и «нерасшифрованные» экзантемы - 476 (53,8%).

Случаи кори были выявлены не только среди лиц с подозрением на корь, но и среди больных с другими экзантемными заболеваниями в результате активного лабораторного поиска. Однако процент находок был незначителен и составил 1,7% - 9 больных из 546, что подтвердило спорадический уровень заболеваемости корью в ЮФО на втором этапе Программы.

Для организации и проведения активного эпиднадзора за кореподоб-ными заболеваниями на 2-м этапе реализации Программы ликвидации кори в ЮФО важно было не только изучить их истинный уровень распространения, но и определить примерный перечень заболеваний «маскирующих» корь.

Анализ первичных клинических диагнозов показал, что за весь период наблюдений наиболее часто на обследование направлялись больные с краснухой (67,2% от общего числа «экзантемных» заболеваний), на втором месте были аллергодерматозы (аллергический дерматит, атопический дерматит и токсикодермия) сопровождающиеся сыпью (13,6%). На третьем месте из направленных для исключения кори диагнозов оказались «ОРВИ» (6,3%), а далее, по убывающей, - «инфекционный мононуклеоз» (2,4%), «сыпь неясного генеза» (2,2%), «скарлатина» (1,6%). Наши результаты соответствуют данным М.А.Бичуриной с соавторами (2005), согласно которым больные с диагнозом «краснуха» составили в разные годы от 48,8 до 60,0%, а с «аллергической сыпью» - от 13,6 до 16,8%) [8]. Перечень первичных диагнозов в

2005 и 2006 годах практически не менялся. Однако наблюдалось увеличение доли обследуемых с диагнозом «краснуха» с 48,2% в 2005 году до 75,4% в

2006 при сохранении процента выявления случаев кори на том же уровне (1,3 и 1,1 соответственно). Это указывает на необходимость уменьшения в структуре обследуемых удельного веса пациентов с клиническим диагнозом «краснуха» и увеличения лиц с «другими экзантемами» с расширением перечня инфекций, требующих дифференциации с корью при помощи лабораторных методов.

Результаты исследований выявили ^ М к вирусу кори у больных с диагнозом «краснуха» в 1,1%, «ОРВИ с пятнисто- папулезной сыпью» - в 5,9%, инфекционный мононуклеоз - в 7,7%, «иерсиниоз» - в 1 случае, что указывает на необходимость усиленного наблюдения за данными инфекциями на территории ЮФО.

Вместе с тем, данные М.А. Бичуриной и соавторами (2005), полученные в ходе реализации «пилотного» проекта ВОЗ на территории СевероЗападного округа РФ показали возможность обнаружения случаев кори не только у больных с первичным диагнозом «краснуха?», но и с аллергической сыпью, псевдотуберкулезом и скарлатиной [8]. Приведенные данные свидетельствуют о том, что корь может маскироваться под различными клиническими диагнозами, которые будут различаться в каждом регионе.

В результате работы была установлена примерная этиологическая структура основных «кореподобных» заболеваний вирусной природы: ЦМВ - (5,4%), ВЭБ - (5,4%), парвовирус-В 19 (8,2%) инфекций, ЛЗН (2,7%). На долю указанных инфекций пришлось 25% обследуемых экзантем с отрицательным результатом, как на корь, так и на краснуху. Этиологически нерасшифрованными остались 75,0% случаев. Эти заболевания могли быть вызваны другими этиологическими агентами, такими, например, как энтерови-русы, стрептококки, риккетсии, различные аллергены, включая лекарственные, и т.д.

Таким образом, исследования показали наличие на территории ЮФО как широко известных экзантемных заболеваний, так и «новых» » и вновь возникающих инфекций таких, например, как лихорадка Западного Нила (ЛЗН). Примерный перечень заболеваний, «маскирующих» корь и требующих наблюдения выглядит следующим образом: краснуха, ОРВИ с экзантемой, ЦМВИ, иерсиниоз, парвовирус В19 и ВЭБ-инфекции и лихорадка Западного Нила. Однако, при организации активного эпиднадзора за заболеваниями, сопровождающимися лихорадкой и пятнисто-папулезной сыпью не следует ограничиваться только указанными диагнозами, так как случаи кори могут маскировать и другие болезни как инфекционной, так и не инфекционной природы.

Полученные нами результаты отличаются от данных исследований, проведенных М. Ramsay (2005) в Европе, где наиболее распространенными возбудителями заболеваний, сопровождающихся сыпью и лихорадкой, являлись парвовирус В19, стрептококки группы А, энтеровирусы, аденовирусы и стрептококки группы С. На долю этих инфекций пришлось от трети до половины всех кореподобных случаев [124]. Кроме того, результаты исследований (Ramsay M., Reacher M., 2002) указывают, что этиологическая структура экзантемных заболеваний среди детей в Великобритании выглядела следующим образом: парвовирус В19 -17%, стрептококк группы А - 15%, вирус герпеса человеческого типа 6 - 6%, энтеровирус - 5%, аденовирус -4%, стрептококк группы С - 3%; случаев кори и краснухи зарегистрировано не было [123] .

Такие расхождения в данных соответствуют мнению, что уровень кореподобных заболеваний может различаться как между странами, так и внутри страны, в зависимости от эпидемиологии той или иной инфекции.

В результате проведенных исследований было установлено изменение структуры экзантемных заболеваний в 2005 и 2006 годах на территории ЮФО.

Так, в 2005 году вирусы, являющиеся этиологическими факторами экзантемных заболеваний, были представлены возбудителями кори (9,1%), краснухи (34,8%), ЦМВ (2,4%), ВЭБ (3,6%), парвовирус-В19 (2,4%) инфекций, J13H (0,6%); другие, неидентифицированные , агенты составили 47,1%.

В 2006 г. удельный вес перечисленных инфекций составил, соответственно, 3,8; 44,4; 6,7; 2,2; 6,1 и 2,2%, других - 34,6%.

По-видимому, следует ожидать, что структура заболеваний, сопровождающихся пятнисто-папулезной сыпью и лихорадкой и в дальнейшем будет меняться в зависимости от интенсивности циркуляции разных возбудителей. Необходимо продолжение работы по определению группы самых распространенных экзантемных инфекций, требующих особого внимания клиницистов, эпидемиологов и вирусологов для реализации Программы ликвидации кори в различных регионах РФ.

Анализ возрастного состава лиц с кореподобными заболеваниями показал, что среди детей до 14 лет доминирующую этиологическую роль играли герпесвирусы (ВЭБ и ЦМВ) и парвовирус В19 - 70,0%; 81,3% и 60,0%, соответственно.

Среди взрослых контингентов заболевания, вызванные указанными вирусами, получили меньшее распространение, однако все случаи верификации диагноза JI3H (5) пришлись на данную возрастную категорию.

Данные зарубежных исследователей (Ramsay M., 2005, Великобритания) также показывают, что большинство случаев подозрения на корь и краснуху приходится на долю детей в возрасте 1-4 лет, но при этом менее чем 5% этих случаев подтверждается как корь и менее 1% - как краснуха [124].

Таким образом, заболеваемость экзантемными заболеваниями может также отличаться в разных возрастных группах и не соответствовать возрастному распределению, характерному для коревой инфекции.

При изучении этиологической структуры экзантем в ЮФО было выявлено наличие инфекционной эритемы, вызванной парвовирусом В19 в 2,4% случаев в 2005 году и в 6,1% случаев - в 2006.

С целью получения дополнительных данных о широте распространения парвовирус В19-инфекции в ЮФО на примере Ростовской области, проведено изучение состояния иммунитета к указанному возбудителю у здоровых лиц разного возраста.

Специфические IgG к ПВ В19 были определены во всех возрастных группах: среди 3-4-х и 9-10-летних детей с одинаковой частотой - в 10,5 и 11,4%, соответственно; среди подростков 15-17 лет - в 33,3%; молодых людей 23-25 лет - в 57,1%. Общее число серопозитивных к ПВ В19 лиц составило 26,9%.

Полученные данные [80] свидетельствуют об умеренном, по сравнению с другими территориями, распространении парвовирус В19-инфекции на территории Ростовской области во всех возрастных группах населения с накоплением числа иммунных лиц по мере увеличения возраста, и позволяют сделать вывод о более интенсивной циркуляции вируса среди детей старше 10 лет, подростков и молодых людей до 25 лет. Учитывая, что специфические антитела класса G в обследованной старшей возрастной группе (23-25 лет) определялись лишь в 57,1%, в ближайшее время можно ожидать увеличения доли парвовирус В19 инфекции в этиологической структуре экзантем, как среди детей, так и среди взрослых. Данное предположение уже подтвердилось увеличением доли ПВ В19 инфекции в этиологической структуре экзантемных заболеваний в ЮФО с 2,4% в 2005 году до 6,1% в 2006.

Наметившийся подъем заболеваемости ПВ В19 инфекцией потребует дополнительных усилий по активизации эпиднадзора не только за корью, но и за «кореподобными» инфекциями, с обязательным применением лабораторных методов для верификации диагнозов с целью недопущения гипер- и гиподиагностики кори и краснухи, особенно среди беременных с сыпью, составляющих группу риска по указанным заболеваниям. Это, в свою очередь, потребует наличия на отечественном рынке качественных диагностических тест-систем, отвечающих международным стандартам и позволяющих получать достоверные результаты.

Проблема наличия адекватных тест-систем для исследования материала больного стоит сейчас особенно остро, т.к. ВОЗ ставит перед странами- участниками Программы ликвидации кори задачу обеспечения диагностическими препаратами, разработанными на местах, с последующей их оценкой в лабораторной сети. Диагностические наборы «Dade Behring» были отобраны ВОЗ на основании результатов параллельных испытаний различных ИФА тест-систем, в частности, таких как: Glark, Gull, PanBio и Light Disgnostics (Samuel Ratnam, Graham Tipples с соавторами, 2000) - для выявления М-антител к вирусу кори, а также Meddens, Denka Seiken, Wampole, Captia, Sigma, Abbot Axsym (Graham Tipples, Rasool Hamkar с соавторами, 2003) -для выявления М-антител к вирусу краснухи [126,138]. Аналогичные исследования были проделаны в отношении ИФА-ТС для определения IgG к вирусам кори и краснухи (Samuel Ratnam, Veerabhadra Cadag с соавторами, 1995; и др.) [125].

Особый интерес для ЮФО, как и для России в целом, имеющей высокий уровень заболеваемости краснухой, представляет поиск новых отечественных иммуноферментных тест-систем для определения противокраснуш-ных IgM. В работах, проведенных Т.А. Мамаевой (2005) и Е.В. Самойлович (2005) по сравнению ТС «МБС» (Новосибирск) и «Вектор-Бест» (Новосибирск) с контрольным тестом «Enzygnost Anti-Rubella virus Ig M» фирмы Dade Behring (Германия) было показано наличие ложноотрицательных результатов на ТС первого производителя и ложноположительных - второго [37,19]. О наличии ложноположительных результатов на IgM-краснуха на ТС «Вектор-Бест» указывают данные С.Г. Марданлы и С.Г. Кирпичниковой (2005) [38].

Проведенные исследования по сравнению ТС «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» ЗАО «ЭКОлаб» (Электрогорск), «Векто-Рубелла-^М-стрип» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Meddens» (Германия) показали результаты, близкие к показателям референс-препарата производства Dade Behring, однако лучший - 100% совпадения, как по положительным, так и по отрицательным результатам - продемонстрировала «ЭКОлаб-Краснуха-IgM». Кроме того, трехлетние параллельные исследования серологического материала на ТС ЗАО «ЭКОлаб» в сравнении с «Dade Behring» продемонстрировали высокие показатели чувствительности - 95%, специфичности — 94% и процента совпадения результатов 94,4 и их стабильность на протяжении всего периода наблюдений, указывающую на стандартность выпускаемых серий препарата.

Это согласуется с данными разработчиков «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» С.Г. Марданлы и С.Г. Кирпичниковой (2005), указывающими на высокие качественные характеристики препарата, не уступающего «Abbot» (Швейцария) -признанному лидеру в разработке и производстве иммуноферментных ТС [38].

Для практического использования немаловажными являются и другие достоинства испытуемого препарата: время анализа меньше, чем у большинства ИФА тест-систем (1 час 45 мин.); возможность использования всех без исключения лунок каждого стрипа; все компоненты, кроме концентрата отмывающего раствора, готовы к использованию; все реагенты имеют разную окраску и соответствующую маркировку; в набор введен блокирующий раствор для устранения ревматоидного фактора, интерференции IgG и анти-нуклеазных антител в образце.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования иммуноферментной тест-системы «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» производства ЗАО «ЭКОлаб» (Электрогорск) для верификации диагноза краснухи в рамках осуществления Программы ликвидации кори на территории РФ.

Качество лабораторной работы в рамках Программы ликвидации кори напрямую зависит от качества тест-систем, используемых не только для Ранней диагностики, но и для ретроспективной диагностики и изучения коллективного и индивидуального иммунитета к кори и краснухе.

Проведенные сравнительные испытания отечественных иммуноферментных тест-систем для определения противокоревых/противокраснушных IgG с «Dade Behring», принятой за стандарт, показали, что для изучения иммунитета к вирусу краснухи одинаково успешно могут быть использованы отечественные тест-системы производства ЗАО «Вектор Бест», НПО «Диагностические системы» и ЗАО «ЭКОлаб».

При сравнении препаратов для определения IgG к вирусу кори были получены значительные расхождения результатов испытуемых препаратов с тест-системой сравнения: у диагностикума фирмы «Вектор-Бест» — по положительным результатам (процент совпадения - 86,0), у «МБС» - по отрицательным ( процент совпадения — 69,2). Полученные результаты продемонстрировали возможность получения разноречивых данных при проведении сероэпидемиологических исследований по кори при использовании разных тест-систем, что диктует необходимость стандартизации диагностических наборов, используемых для этих целей.

Кроме того, необходимо отметить, что ИФА тест-система для определения противокоревых Ig G фирмы «Dade Behring», выбранная в качестве эталона в этом исследовании, не обладает 100% чувствительностью и специфичностью. Поэтому с целью оценки иммуноферментных препаратов для определения IgG к вирусу кори желательно получить дополнительные данные сравнения указанных диагностических наборов с реакцией нейтрализации, являющейся «золотым стандартом» для оценки гуморального противо-коревого иммунитета.

Таким образом, для проведения лабораторного контроля противоко-ревого иммунитета необходимо продолжить исследования по поиску качественных отечественных ТС, стабильно обеспечивающих достоверные результаты.

Традиционным при серодиагностике кори и краснухи, принятым за «золотой стандарт», является исследование сыворотки, полученной из крови, забранной из вены, что не всегда воспринимается с энтузиазмом.

В литературе (Taylor M.B. с соавторами, 1996; De Swart с соавторами, 2001; Riddel М. С соавторами, 2002) был описан альтернативный подход, который может быть полезным при выполнении программы контроля коревой инфекции, — использование образцов высушенной крови из пальца или пятки (методика «сухой капли») [102,127,128]. Указанный метод имеет, по мнению зарубежных исследователей, ряд преимуществ: возможность забора крови из пальца (пятки), транспортирования без условий «холодовой цепи», хранения до 15 дней даже при комнатной температуре.

Указанные преимущества весьма существенны для России с ее огромной территорией, разнообразными климатическими, религиозными и национальными особенностями. Кроме того, образцы высушенной крови можно использовать для обнаружения вирусного генома с помощью ОТ-ПЦР [102]. Это предоставляет дополнительные возможности для изучения вируса и выявления антител в одной и той же пробе, а также дает возможность охватить лабораторным обследованием большее число подозрительных на корь случаев.

Наряду с очевидными преимуществами метод «CK» имеет и такие недостатки, как инвазивность и ограниченный объем элюата для подтверждения и дифференциальной диагностики. Поэтому, прежде чем рекомендовать его внедрение для обнаружения специфических противокоревых (противо-краснушных) антител класса М в практику работы лабораторной сети, ВОЗ проводила широкомасштабные испытания в ряде стран мира Турция, Уганда, КотД'Ивуар, в результате которых был выявлен высокий процент совпадения результатов определения противокоревых и противокраснушных антител классов М и G в образцах на фильтровальной крови и сыворотке крови (88,1-98,6 и 84,6- соответственно) [56].

По данным Michaela A.Riddell с соавторами. (2003), проводившими испытания «сухой капли» («CK») для определения антител класса G к вирусу кори у австралийских школьников, чувствительность и специфичность указанного метода, по сравнению с сывороткой крови, составили 98,4% и 97,2%, соответственно [128]. Аналогичные результаты были получены при использовании «СК» для изучения популяционного и индивидуального иммунитета Chakravarti A. Rawat D, Yaday S. (2003) в Индии: чувствительность - 100%, специфичность - 90% [95]. При этом следует отметить, что в испытаниях использовались различные коммерческие тест-системы: в первом случае — «Dade Berhing» (Германия), во втором - «Melotec S.A.» (Испания), что, несомненно, влияет на результаты исследований.

Авторами «СК» было предложено использование указанного метода и для верификации диагноза кори/краснухи, при этом показана возможность длительного хранения (до 24 месяцев) серологического материала при температуре +4°С с сохранением чувствительности 90,2% и специфичности 98,8% [127]. В ходе полевых испытаний, проведенных на территории ЮФО были получены высокий процент совпадения результатов как по кори, так и по краснухе (92,4% и 95,5%, соответственно), а также высокие показатели специфичности (93,5% по кори и 97,2% по краснухе) и чувствительности (100%) метода «сухая капля» по сравнению с сывороткой крови, что соответствует данным ВОЗ по другим регионам.

Основные расхождения (7 из 8 - 87,5%) были зарегистрированы на границе отрицательных и сомнительных результатов и только в одном случае (12,5%) при исследовании «СК» отмечался «переход» из сомнительного по сыворотке результата - в положительный.

Сравнение концентраций Ig класса М (показатель оптической плотности с коррекцией (ОПхКФ)) показало высокую степень корреляции при исследовании сыворотки и «сухой капли», как на IgM-корь (коэффициент Пирсона г = 0,951 (р < 0,00001); р < 0,05), так и на IgM-краснуха (г = 0,911 (р < 0,00001); р< 0,05).

В целом, среднее значение (ОПхКФ), полученное при исследовании «сухой капли» по сравнению с сывороткой, было выше, как при кори (0,078±0,017 и 0,053 ± 0,0153, соответственно), так и при краснухе

0,49±0,088 и 0,41±0,062, соответственно). Причем, по кори эти различия были статистически значимы и, следовательно, связаны с самой методикой проведения исследования (по Стьюденту р = 0,0000008; по Вилкоксону р = 0,00000 (р<0,05). Сравнение результатов по краснухе не показало статистически значимых отличий (по X критерию Стьюдента р = 0,052; по критерию Вилкоксона р = 0,093698 (р>0,05). Это указывает на ведущую роль случайного фактора, который маскирует систематические причины, связанные, в том числе, с характеристиками тест-системы, использованной для данного исследования.

Более высокое среднее значение (ОПхКФ), полученное при исследовании «сухой капли» с использованием оригинальной методики ВОЗ можно объяснить увеличением в 1,5 раза времени инкубации для «сухой капли» (1ч. 30 мин.) по сравнению с сывороткой (1ч.).

С учетом вышеизложенного, для приведения в соответствие показателей (ОПхКФ) для сыворотки и «СК» мы решили модифицировать методику ВОЗ путем уменьшения времени инкубации с 1ч. 30 мин. до 1ч. 15 мин. В модифицированном варианте исследовали 22 парных образца.

Среднее значение (ОПхКФ) для «сухой капли» по сравнению с сывороткой в модифицированном варианте метода для кори осталось выше (0,079 ± 0,0190 и 0,041±0,0154, соответственно), а для краснухи стало ниже (0,46±0,074 и 0,66±0,099, соответственно). Причем, по кори эти различия оставались, а по краснухе — перешли - в статистически значимые (по критерию Стьюдента, X: р=0,000014 и р=0,0033, соответственно; по критерию Вилкоксона р=0,000061; (р<0,05) и р=0,037 (р<0,05), соответственно).

Степень корреляции между величинами (ОПхКФ), полученными при исследовании сыворотки и «сухой капли» в модифицированной методике оставалась сильной (в пределах 0,7 - 1,0), как на ^М-корь (коэффициент Пирсона г = 0,941 (р<0,00001)), так и на ^М-краснуха (г=0,811 (р<0,00001)).

В корреляционных уравнениях коэффициент перед аргументом (х) относительно оригинальной методики по кори практически не изменился (1,16 против 1,04) и, по-прежнему, был близок к единице. По краснухе (0,60) — он очень далек от единицы и от значения (1,27), полученного в немодифициро-ванной (оригинальной) методике. Полученные результаты позволили прийти к следующим выводам:

1) время экспозиции (1ч. 30 мин.), предложенное в оригинальной методике ВОЗ, является оптимальным для «сухой капли»;

2) для получения более близких результатов (ОПхКФ) при исследовании «СК» в сравнении с эталоном - сывороткой крови - следует искать другие подходы.

Одним из таких подходов, на наш взгляд, является введение поправочного коэффициента при использовании «сухой капли» для исследований на корь. Для краснухи, учитывая более низкую воспроизводимость результатов, введение такого поправочного коэффициента не представляется возможным.

Для расчета поправочного коэффициента рассуждали следующим образом: сравнивая результаты (ОПхКФ) по кори, полученные двумя различными методами, мы можем ожидать вклад случайных и систематических погрешностей на сам результат сравнения. Случайные погрешности характеризуют воспроизводимость результатов, систематические - разность методик. Эта систематическая разность отражается в значениях коэффициентов корреляционного уравнения. Умножая значения, полученные по сыворотке на 1,040, и прибавляя 0,023, получаем ряд чисел, которые можем сопоставить со значениями, полученными при исследовании «сухой капли». Результат сравнения по критерию Стьюдента и критерию Вилкоксона дает сходный результат р=0,89 и р=0,52 (р>0,05, т.е. разница в показателях статистически незначима). Это означает, что если результаты, полученные по «сухой капле», будут пересчитаны по приведенным формулам, то получится результат, статистически не отличающийся от эталонного (сыворотка).

Проводя аналогичные манипуляции с модифицированной методикой, мы получаем для кори сходные результаты: р=0,91 и р=0,90. Более того, если результаты по модифицированной методике обработаем по формуле, полученной для «сухой капли» (У=0.023+1.040*х), и сравним со значениями эталона (сыворотки), то получим р=0,055, что выше порога статистической значимости.

Можно сделать выводы, что для увеличения процента совпадения результатов (ОПхКФ) на М-корь по «сухой капле» и сыворотке крови целесообразно использовать поправочные коэффициенты. Поправочные коэффициенты для простоты интерпретации результатов ввели в значения пороговых уровней для отрицательных, сомнительных и положительных сывороток (значений). При введении для интерпретации результатов новых, скорректированных, пороговых уровней (<0Д27-отрицательный результат; от 0,127 до 0,231 - сомнительный результат; >0,231 -положительный результат), полученных методом «сухая капля», процент совпадения результатов по кори увеличился с 92,4 до 95,5. Поправочные коэффициенты могут быть уточнены при увеличении количества исследований, особенно с положительными значениями.

Влияние случайных факторов на результаты измерений по различным методикам можно оценить по среднеквадратичному отклонению попарной разности результатов эталонной методики и «сухой капли» после коррекции результатов «сухой капли» посредством введения поправочных коэффициентов (как указывалось выше) для компенсации систематической погрешности:

8 = Шх1-у1)2)/11, где х и у - показатели, измеренные методами «сухая капля» и «сыворотка».

Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что роль случайных факторов для кори приблизительно на порядок меньше, чем для краснухи. Стандартная и модифицированная методики в данном аспекте показывают и в случае кори и в случае краснухи сходные результаты.

Таким образом, полевые испытания метода «сухая капля» для определения ^Мк вирусам кори и краснухи продемонстрировали:

1) высокие показатели специфичности (93,5% - по кори и 91,2% — по краснухе), чувствительности (100%) как по кори, так и по краснухе) и процента совпадения результатов (92,4% - по кори и 95,5% % - по краснухе). Расхождения зафиксированы только на границе отрицательных и сомнительных результатов;

2) высокую воспроизводимость и устойчивость к модификации методики «СК» при исследовании на корь, что позволило изменить границы зон проведения оценки результатов с помощью поправочных коэффициентов. Введение поправочного коэффициента увеличило процент совпадения результатов с 92,4% до 95,5%.

3) Более низкую, по сравнению с корью, воспроизводимость и надежность результатов при исследовании на краснуху, что не дает возможности в данном случае использовать поправочные коэффициенты. Так, в связи с большим разбросом данных, уровень статистической значимости разницы в значениях показателей, измеренных по сыворотке и «сухой капле», был невысок (р=0,037; (р<0,05)), при том, что в корреляционном уравнении У=-0.036+1.27*х коэффициент перед аргументом (1,27) значительно отличался от 1. При модификации методики измерений, мы получили корреляционную зависимость У=-0.064+0.60*х, при которой коэффициент перед аргументом (0,60) был далек от 1 и от значения, полученного в немодифицированной (оригинальной) методике. В целом, результаты полевых испытаний метода СК на территории ЮФО показывают возможность широкого применения данного метода для реализации ПЭК в РФ.