Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль оксида азота и участие нейрональных стволовых клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и рассеянного склероза

На правах рукописи

Данилов Александр Игоревич

Роль оксида азота и участие нейрональных стволовых клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и рассеянного склероза

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.13 - нервные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт Петербург 2004

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии и в Центре Молекулярной Медицины Каролинского Института (Стокгольм, Швеция)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Васильев Андрей Глебович.

Научный консультант:

доктор медицинских наук доцент кафедры неврологии Каролинского Института (Стокгольм, Швеция) Лу Брундин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Тюкавин Александр Иванович;

доктор медицинских наук профессор Жулев Николай Михайлович

Ведущая организация:

Военно-медицинская академия имени СМ. Кирова

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.089.02 при ГОУДПО Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования по адресу: Санкт-Петербург, Заневский пр., д. 1/82.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Г.Н. Горбунов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассеянный склероз является самой частой неврологической причиной инвалидизации лиц трудоспособного возраста (25 -40 лет), за исключением травматических поражений (Lassman et al., 2001), что определяет актуальность его изучения. Рассеянный склероз является хроническим аутоиммунным заболеванием нервной системы, протекающим с поражением белого вещества головного и реже, спинного, мозга, что сопровождается образованием очагов воспаления и демиелинизации (Тгарр B.D. et al., 1999). Заболевание в типичных случаях характеризуется хроническим, рецидивирующе-ремиттирующим, течением с последующим вторичным прогрессированием, сопровождающимся накоплением органических неврологических нарушений. (Lassman H. et al., 2001) Основными чертами патоморфологии Р.С. являются наличие очагов демиелинизации, олигодендроцитарной гибели и аксональной дегенерации (Prineas and McDonald 1997), а так же наличие глиальных очагов. Полагают, что под воздействием инициирующего события, в роли которого могут выступать инфекционные (Steiner I., 2001), средовые и генетические (Compston A., et al 2002) факторы, происходит реактивация аутореактивных клонов преимущественно Т-лимфоцитов, нарушению гематоэнцефалического барьера с последующим развитием иммунно-опосредованного воспалением и демиелинизацией (Silber Е., ShariefM.K., 1999).

Несмотря на более чем вековую историю изучения проблемы, оценка степени активности воспалительно-демиелинизирующего процесса представляет серьёзную проблему. Диагностика осуществляется с помощью совокупности клинических критериев (Poser I983) а так же посредством магнитно резонансной томографии (М.Р.Т.). Наличие клинически не проявляющихся обострений, (Kraus J. et al., 2002), необходимость повторного динамического наблюдения с применением специальных контрастирующих методик MPT (Miller D.H., et al., 1996) затрудняет процесс диагностики и делает юиск лабораторных маркеров активности воспалительного процесса особенно актуальным. Среди всего многообразия эффекторных молекул, принимающих участие в повреждении олигодендроцитов, оксид азота играет особо важную роль. Являясь продуктом синтеза семейства синтетеаз оксида азота (NOS) из аминокислоты Л-аргинина, NO потенциально нейротокичен (Dawson et al., 1994), способен оказывать прямое токсическое действие на культивируемые олигодендроциты. Биоптаты больных рассеянным склерозом содержат повышенное содержание iNOS м РНК по сравнению с интактными зонами мозга (Bagasra О. et al., 1995), что позволяет считать продукты окисления NO перспективными кандидатами на роль индикаторов активности заболевания.

Совокупность эпидемиологических (частота встречаемости рассеянного склероза по данным ВОЗ составляет 1:1000 среди населения северной Европы) и этических причин послужила стимулом для изучения роли оксида азота в патогенезе аутоиммунных заболеваний нервной системы на экспериментальной модели рассеянного склероза - экспериментального,аухшшлунми! и^тэдгафало-миелита (Э.АЭ.), который развивается под воздейртайбм'ШиЭДЖахши восприимчивых видов животных различными

переносом CD4+T клеток (Ben Nun et al., 1981, Pattinelly et al., 1981) и проявляется параличами конечностей и хвоста, нарушениями зрения и атаксией. Способность ингибиторов NOS модулировать клиническое течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита известна с работ Koprowski (1993), однако механизм действия остается не известным. Известно (Cross et al., 1994, Zhao et al., 1996), что назначение аминогуанидина приводило к улучшению клинического течения экспериментального аутоимунного энцефаломиелита на мышах и крысах (Brenner et al., 1997, Zielasek et al., 1995). В то же время назначение N(omega) -nitro-L-arginine-methylester способствовало утяжелению заболевания и повышению летальности (Ruuls et al., 1996, Gold et al., 1997). Более того, назначение NMA PVG крысам привело к развитию тяжелого энцефаломиелита у животных, считавшихся полностью резистентным к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (Cowden et al., 1998, Willenborg et al., 1998). Следует так же отметить, что все упомянутые модели являются монофазными, со слабой выраженностью демиелинизации, а, следовательно, не вполне адекватными для изучения рассеянного склероза. Таким образом, изучение последствий назначения ингибиторов iNOS на крысах Dark Auguti, иммунизированных миелиновым олигодендроцитарным белком, представляется актуальным.

Поскольку мишенью аутоиммунно-опосредованного воспаления при рассеянном склерозе и экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите являются олигодендроциты, то изучение механизмов, лежащих в основе процессов ремиелинизации является.актуальным. В случае усиления процессов ремиели-зации возможно восстановить утраченные неврологические функции, предотвратить аксональное повреждение и прогрессирование неврологических симптомов. Присутствие ремиелинизации было доказано для многих экспериментальных моделей травматического и аутоиммунного повреждения (Bornstein М.В. and Raine C.S. 1969, Blakemore et al., 1974; Linington et al., 1988; Rodriguez et al., 1992; Reynolds and Wilkin, 1993; Carroll and Jennings, 1994), однако источники клеток - предшественников олигодендроцитов по прежнему неизвестны. Идентификация нейрональных стволовых клеток, как самоподдерживающейся, полипотентной популяции, способной дифференцироваться в астроциты, оли-годендроциты и нейроны, и реагирующей на повреждение Ц.Н.С. пролиферацией и миграцией, открывает новые возможности для изучения роли этих клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

Цель исследования - оценить роль оксида азота и участие нейрональных стволовых клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и рассеянного склероза.

Задачи:

1. Исследовать особенности системного метаболизма оксида азота в ходе течения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и у больных рассеянным склерозом, и, сопоставив динамику клинической картины заболевания с изменениями концентрацией продуктов окисления оксида азота в лик-

воре и сыворотки крови, выяснить, может ли содержание нитритов в ликворе и сыворотке крови служить индикатором активности воспалительного процесса..

2. Изучить влияние интравентрикулярного и системного введения ингибитора синтетазы оксида азота на клиническое течение и степень выраженности воспаления при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

3. Исследовать влияние ингибитора синтетазы оксида азота на степень выраженности Т-клеточного иммунного ответа в динамике экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

4. Оценить влияние ингибитора синтетазы оксида азота на В-клеточное звено иммунного ответа в динамике экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

5. Изучить реакции и изменения нейрональных стволовых клеток при развитии аутоимуно опосредованного воспаления и демиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Научная новизна работы. Продемонстрировано наличие корреляции между клинической картиной заболевания и концентрацией нитритов в ликворе от больных рассеянным склерозом.

На экспериментальной модели рассеянного склероза продемонстрирована возможность ослабления клинических проявлений экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита посредством интравентрикулярного и системного введения эфира нитрометиларгинина (L-NAME). Показано его влияние как противовоспалительного агента применительно к экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту. Впервые продемонстрировано влияния ингибиторов синтетазы оксида азота на специфический и неспецифический иммунный ответ. Изучены особенности метаболизма оксида азота на фоне перенесения Э.А.Э.

Исследована реакция нейрональных стволовых клеток на развитие очагов демиелинизации в спинном мозге при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Практическая значимость работы. Показана возможность использования продуктов окисления оксида азота в качестве лабораторного маркера активности воспалительно демиелинизирующего процесса у больных с рассеянным склерозом. Изучены последствия терапевтического использования ингибиторов синтетазы оксида азота на экспериментальной модели рассеянного склероза. Идентифицированы источники ремиелинизации при Э.А.Э., которыми являются нейрональные стволовые клетки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Продукты окисления оксида азота в ликворе являются маркером активности воспалительного процесса при рассеянном склерозе.

2. Интратекальное и системное назначение L-NAME приводит к ослаблению клинических проявлений экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита на крысах Dark Agouti, и подавлению процессов воспаления и демиелиниза-ции. Интратекальное и системное назначение NOS ингибиторов оказывает мо-

дулирующее влияние на интенсивность Т клеточного иммунного ответа, смещая баланс Thl/Th2 в сторону преобладания Th2 клеток.

3. В ответ на развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита происходит активация нейрональных стволовых клеток, которые пролифери-руют, мигрируют из внутренней стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации и дифференцируются в олигодендроциты, являясь эндо-геннным источником ремиелинизации.

4. В процессе миграции нейрональные стволовые клетки подвергаются прямой макрофагальной атаке, что может служить причиной незавершенной ре-миелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Личный вклад автора в проведенное исследование. В процессе работы автором самостоятельно выполнены: постановка задач, планирование и выполнение экспериментов; измерение продуктов окисления оксида азота в ликворе и сыворотке крови; статистическая обработка полученных данных; воспроизведение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита; стереотаксиче-ские инъекции и установка осмотических минипомп; секционная работа с последующим патоморфологическим анализом; иммуннофлуоресцентная и конфокальная микроскопия; анализ фактического материала полученного в процессе исследования, написание и оформление диссертации, формулирование выводов.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всемирном конгрессе в Праге «Second International conference in Biology, Chemistry and therapeutic Application ofNitric Oxide" в 2002 г. и на международной конференции в Санкт-Петербурге «Joint Research Training Program with Karolinska Institutet and St. Petersburg Medical Schools» в апреле 2003. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих международных медицинских журналах.

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационного исследования включены в учебную программу кафедры патофизиологии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 298 источников (из них 25 отечественных и 273 зарубежных источников). Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 19 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническую группу исследования составили 62 человека с клинически определенным рассеянным склерозом согласно критериям Позера (Poser 1983), которые имели повышение синтеза иммуноглобулинов класса IgG и олигокло-нальные полосы в ликворе (Kabat ЕА 1950), а так же выявляемую на МРТ

картину, характерную для демиелинизирующего заболевания Ц.Н.С. Все больные были обследованы по протоколу, включающему: длительность заболевания, тип течения (релапсирующе - ремитирующий, первично прогрессирующий, вторично прогрессирующий). С целью дальнейшего изучения больные были разделены на основании предполагаемой активности воспалительно демиелинизирующего процесса (Вгапёт Ь., й а1 1998). Активность заболевания была определена на основание клинического обследования больных согласно следующим критериям: «Обострение» (24 чел.) - прогрессирующее ухудшение неврологического статуса более чем на 1 единицу по шкале ЕБ88, симптомы которого возникли более чем за неделю до обследования и взятия образцов ли-квора и сыворотки крови. Пациенты со стабильным, в течение последнего месяца неврологическим статусом (17 чел), были оценены как находящиеся в ремиссии; пациенты с прогрессивно ухудшающимся в течении последнего года неврологическим статусом - как имеющие «прогрессирующую активность» (20 чел). Контрольную группу составили здоровые добровольцы, а так же пациенты с гипертезионной головной болью. Распределение больных по полу, возрасту, длительности тяжести заболевания представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение больных по полу, возрасту, длительности и тяжести заболевания

Группы Длительность М/Ж Возраст EDSS

Контрольная группа 3/ 11 40,0(27-58)

Гипертезионная головная боль 2/6 44,7 (26-66)

P.C." Обострение" 6,5 (0,25-19) 6/24 43,5(19-60) 4,0(1,0-7,5)

P.C." Ремиссия" 7(0,33-39) 5/17 40,0(31-67) 4,0(1,0-7,5)

Р.С."Прогрессирование " 12,5 (2-38) 10/20 56,0(36-76) 5,5(3,5-7,5)

Содержание нитратов и нитритов в ликворе и сыворотке крови измеряли при помощи капиллярного электрофореза (Leone A., 1994) (Hewlett-Packard Ltd, Waldron, Germany). Содержание нитротирозина, хлоротирозина определяли с помощью HPLC (Crow JP 1996)

Для индукции Э.А.Э. использовали рекомбинантный крысиный MOG (Amor S 1994). Иммунизации подверглись 50 крыс самок Dark Auguty в возрасте 8 недель весом 160-180 г. Э.А.Э. вызывали по методике, описанной Dahlman I. (1998). Животные были клинически оценены на наличие параличей и парезов по следующей шкале: 1- парез хвоста, 2 паралич хвоста и односторонний парез задней конечности, 3 полный паралич хвоста и паралич задних конечностей, 4-тетраплегия, 5- преморбидное состояние или смерть. На 8 день после иммунизации, была произведена установка осмотических минипомп (Azlet), соединенных с системой для внутрижелудочкового введения (Besong G 2002, содержащих L-NAME (Zielasek J. 1996) который вводился в дозе 0.016 мг (интравен-трнкулярно) и 0,032 мг/день (интравентрикулярно и системно). Контрольную

группу составили крысы, получавшие физ. p.p. а так же не подвергавшиеся оперативному вмешательству. По окончании эксперимента крысы были умерщвлены посредством интракардиальной перфузии фосфатным буфером с последующей перфузией 4% р-м параформальдегида с 04% пикриновой кислоты. После выделения головной и спинной мозга погружали в фиксирующий р-р. в течении 6 часов, в 15% р.-р. глюкозы в течение 24 часов и хранились при +4 в фосфатном буфере. Оценка воспалительных изменений и степени демиелини-зации была произведена на криостатных срезах толщиной 15цм, окрашенных гематоксилин - эозином и Luxfast Blue. Забор 200 u.1 крови осуществляли из хвостовой вены до начала эксперимента, на 8, 13, 32 день.

Титр специфических антител к иммунизирующему агенту (MOG) а так же фракций иммуноглобулинов определяли помощью иммуноферментного анализа. (ELISA) на базе тест системы Nunc, Roskilde, Denmark. (Jagodic M. 2001).

Определение степени активации Th 1 зависимого звена иммунной системы оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISPOT) на предмет синтеза интерферона гамма (INF у) спленоцитами, стимулированными рекомбинантным M.O.G. по методике Olsson Т. (1990).

Изучение нейрональных стволовых клеток как потенциальных источников ремиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите на крысах Dark Auguti. Эксперименты проводили на 40 крысах Dark Auguty возрасте 8 недель весом 160-180г. Эпендимоциты желудочковой системы были помечены посредством стереотаксической инъекции 20f.il 0,1% раствора Dil(l,l- dioctadecyl-6,6'-di (4-sulfbpentyl)-3,3,3',3'tetramethyIindbcarbb-cyanin, Molecular Probes) в D.M.S.O. в правый латеральный желудочек (Johansson C.B. et a!., 1999) По истечении 10 дней экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит вызывали интрадермальным введением M.O.G. содержащей эмульсии (Dahlman I., et al., 1998). Животные были клинически оценены на предмет наличия параличей и парезов по 5 бальной шкале. Начиная со дня начала клинических признаков Э.А.Э. крысы получали подкожно бромодезоксиуридин (BrdU) (Sigma) 100мг/кг в 9мг/мл растворе NaCl (Johansson СВ. et al., 1999). Животные наблюдались в течение 30 -40 дней, после чего были умерщвлены посредством ингаляционной анестезии в сочетании с интракардиальной перфузией. На криостатных срезах толщиной 15 и.м было произведено имуногисто-химическое окрашивание с первичными антителами (Кроличьи анти-GFAP 1:250 (Dako), Мышиные анти-Е01:200 (Serotec) Мышиные анти-О4 IgM, 1:20 (Boehringer-Mannheim), Мышиные анти-BrdU 1:200 (Dako)),°n вторичными антителами (Ослиные анти-мышиные CY2 1:200, (Jacksonlmmuno Research), Козлиные анти-мышиные IgM CY2 1:200 (Jacksonlmmuno Research), Козлиные ан-ти-кроличьи Alexa 488 1:500 (Molecular Probes) Срезы так же подвергались ок-

раске Гематоксилин Эозином и DAPI. Подсчет клеток окрашенных Dil производился посредством помещения центрального канала в центр поля зрения объектива при 40 кратном увеличении. Подсчет производился в радиусе 50fim от центра центрального канала. Конфокальная микроскопия выполнялась на Leica TCS SP. С целью выявления временных параметров активации нейрональных стволовых клеток часть животных были умерщвлены на 5, 10 и 40 день заболевания. Контрольную группу составили 5 не иммунизированных крыс.

Статистическую обработку осуществляли с помощью рангового аналога ANOVA теста Krusskal Vallis., а так же теста Манна-Уитни и непарного t-теста с использованием программы "Statistica 6.0 for Windows".

Эксперименты над животными проводились в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных используемых в экспериментальных целях (Директива 86/609/ЕЕС).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Продукты окисления оксида азота как маркеры активности воспалительного процесса при рассеянном склерозе

Исследование было проведено на 62 пациентах с клинически выраженным рассеянным склерозом. Было изучено содержания нитритов и нитратов, являющиеся основными продуктами окисления N0 в биологических средах в ликворе и сыворотке крови от больных с Р.С. (рис. 1).

Полученные данные свидетельствуют о повышение синтеза NO в Ц.Н.С. у больных с рассеянным склерозом по сравнению со здоровыми индивидуумами, что согласуется с данными литературы (Johnson et al., 1995; Yamashita et al., 1997; Brundin L et al., 1999, Svenningsson 1999, Giovannoni G. et al., 1998). Рассеянный склероз - хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся повышенным содержанием клеток, экспрессирующих mRNA цитокинов в сыворотке крови и в ликворе (Olsson Т. 1995), а так же гиперпродукцией про-воспалительных цитокинов, (TNFct и INFy) - индукторов iNOS.

Усиленный синтез NO, вероятно, является следствием гиперпродукции цитокинов в ходе хронического аутоиммунного воспаления. Поскольку концентрация нитритов в группе «Обострение» оказалась существенно выше таковой в группе «ремиссия», можно предположить повышенную интенсивность воспалительного процесса у данной группы больных, равно как и у больных в группе «Профессия». Повышенное содержание нитритов в группе «Ремиссия указывает на наличие непрекращающегося воспалительного процесса, не смотря на отсутствие выраженных клинических проявлений, что согласуется с данными МРТ о возможности субклинических обострений при Р.С. (Kraus et al., 2002).

сутствие выраженных клинических проявлении, что согласуется с данными МРТ о возможности субклинических обострении при Р.С. (Kraus et al., 2002).

Рис 1. Концентрация нитратов и нитритов ( цМ) в ликворе контрольной группы и групп больных рассеянным склерозом. По оси абсцисс - обследованные группы. По оси ординат - концентрация продуктов окисления N0 (цМ).

Обнаружение повышенной концентрации нитритов в группе «Прогрессия» явилось неожиданным в свете представлений о том, при прогрессировании Р.С. доминирующими в патогенезе являются аксональная дегенерация и атрофия, нежели воспаление (Steiman L. 2001). Повышенное содержание нитритов в группах "Ремиссия" и "Прогрессия" по сравнению с контрольной группой указывает на то, что воспалительный процесс при Р.С. максимально выражен в периоды обострения, не прекращается в периоды ремиссии и продолжается при вторичном прогрессировании заболевания, что было подтверждено в работе Асаг G., (2003), где высокое содержание нитрита в ликворе во время обострения коррелировало с присутствием активных очагов на М.Р.Т. Анализ содержания NOx в сыворотке периферической крови обследуемых групп больных показал, что концентрации нитритов и нитратов для групп « Ремиссия», «Прогрессия» и «Обострение» составлял 6.3 ± 2.1, 6.5 ± 0.4, 6.6 ± 0.3 цМ. и 33.2 ± 4.3, 41.5 ±, 31.4 ± 2.6 цМ, что соответствует нормальным значениям (Leone 1994). Сопоставление содержания нитритов в плазме и ликворе показало, что в группе «Обострение» содержание нитритов в ликворе превышает таковое в плазме, что указывает на интратекальный генез гиперпродукции NO.

ченных нами на клиническом материале (Danilov A.I. et al., 2003) о интрате-кальной гиперпродукции N0 при рассеянном склерозе, а так же, учитывая противоречивость литературных данных о последствиях применения ингибиторов N0 синтеза (Cross et al 1994, Zhao et al 1996, Ruuls et al 1996, Gold et al 1997), и отсутствие достоверных данных о фармакокинетике L-NAME, было проведено сравнительное исследование внутрижелудочкового и системного назначения ингибитора NOS крысам, переносящим Э.А.Э. Эфир нитрометиларгинина (L-NAME) назначался в дозе 0,016 и 0,032 мг/день в течение 28 дней начиная с 8 дня после иммунизации. Характеристика экспериментальных групп представлена в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика экспериментальных групп по степени тяжести, выраженности _воспаления, заболеваемости и смертности_

Экспериментальные группы Средний день начала Э.А.Э. Усредненная степень тяжести Средний суммарный балл Индекс воспаления Смертность Частота Э.А.Э.

Ко нтрол ьная (п= 14) 16±2,1 0,68±0,84 26,93±5,3 1,1 ±0,2 14% 99%

L-NAME 0,016 мг/день интравентрикул. (п=14) 15,2±3,7 0,88±0,97 28,50±7,52 1,0±0,15 14% 100%

L-NAME 0,032 мг/день интравентрикул. (п=14) 16,2±4,9 0,24±0,3 7,57±3,3 0,62±0,1 0% 78%

L-NAME 0,032 мг/день Подкожно (п=5) 16,2± 1,9 0,31 ±0,24 10,5±6,2 0,65±0.14 0% 100%

Средний суммарный балл вычислялся, как среднее значение суммарного клинического индекса для каждой экспериментальной группы, который рассчитывался, как сумма клинических индексов для каждого животного на протяжении всего периода наблюдения. Усредненная степень тяжести рассчитывалась как средний суммарный балл / кол-во дней, сопровождавшихся признаками Э.А.Э. для каждого животного. Индекс воспаления определялся как среднее кол-во периваскулярных инфильтратов, являющихся характерными па-томорфологическими особенностями Р.С. и Э.А.Э. (Dawson J.W. 1916), на 15 полных поперечных срезах спинного мозга для каждого животного (Lassman H. 1998) с последующим усреднением по группе.

Анализ полученных данных показал, что L-NAME назначенный в дозе 0,032мг/день интравентрикулярно способен значительно снижать частоту встречаемости, смертность от экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и его степень тяжести, вне зависимости от метода введения, а так же степень выраженности воспаления, что нашло свое отражение в индексе воспаления. Влияние L-NAME на клиническое течение Э.А.Э. проиллюстрировано на рис 2.

Рис 2. Влияние внутрижелудочкового назначения Ь-ЫЛМЕ на клиническое течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (По оси абсцисс дни наблюдения, по оси ординат усредненная клиническая оценка.)

Наблюдаемый эффект наиболее выражен при применении «эффективной» дозы (0,032 мг в день), проявляющийся менее выраженными признаками экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с сохранением релапси-руюицего ремитирующего характера течения. Полученные данные подтверждают терапевтический эффект от применения ингибиторов NOS на других моделях Э.А.Э (Cross 1994, Brenner 1997, Okuda 1998). Более выраженный клинический эффект наблюдался при внутрижелудочковом введении эфира нитромети-ларгинина, что свидетельствует о том основные патофизиологические эффекты N0 в ходе Э.А.Э. реализуются интратекально

Влияние внутрижелудочкового назначения ингибитора NOS L-NAME на Т клеточное звено иммунитета при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите

С целью выявления предполагаемого механизма действия L-NAME при Э.А.Э. проводилось определение способности Т клеток селезенки к синтезу INFy, что может являться косвенным показателем активации Т клеточного звена иммунного ответа (Olsson Т. 1990). Эксперимент проводили на двух группах животных, получавших L-NAME интратекально (п=5) и подкожно (п=5) (рис 3).

30 п

25-

rMOG ( L-NAME системно)

20«

□ rMOG ( L-NAME интравентрикулярно)

15«

10«

ИMOG 91-108 (L-NAME системно)

5-

ESîMOG 91-108 ( L-NAME интравентрикулярно)

0

Рис 3. Сравнение степени активации аутореактивных Т клеток с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISPOT). По оси абсцисс: группа 1 - периферическое назначение L-NAME, группа 2 - интратекальное назначение L-NAME. По оси ординат кол-во INF у секретирующих клеток на 3x106 клеток. Данные представлены как средние значения полученные с трип-ликатов, ± стандартная ошибка среднего.

Таким образом, степень активации ТЫ -зависимого компонента иммунной системы, в группе крыс получавших эфир нитрометиларгинина в эффективной дозе интратекально достоверно выше по сравнению с контрольной группой животных, получавших L-NAME в эффективной дозе подкожно, что свидетельствует об том, наблюдаемый терапевтический эффект не связан с подавлением специфического иммунного ответа.

Влияние внутрижелудочкового назначения ингибитора NOS L-NAME на состояние гуморального иммунного ответа на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

С целью оценки влияние L-NAME на В-клеточное звено иммунитета было проведено определение общего титра анти-MOG антител, а так же подклассов иммуноглобулинов (таблица 3).

Анализ полученных данных показывает, что уровень общего anti MOG IgG в контрольной группе и в группе, получавшей "неэффективную" дозу ин-тратекально, оказался идентичным. В то же время, L-NAME в рабочей дозе способен вызывать усиливать продукцию общего anti MOG IgG. Поскольку продукция специфических антител регулируется цитокиновым спектром, продуцируемым субпопуляциями Т клеток, баланс Thl/Th2 влияний определяет ' подтиповую принадлежность синтезируемых антител.

Таблица 3

Содержание анти-МОв антител в сыворотке крови на 32 день после иммунизации у экспериментальных групп животных.

Экспериментальные группы IgG общее IgGl Ig2b IgG 2с

Контрольная 0,49±0,33î l,05±0,38î 0,89±0,35 1,70±1,27

L-NAME 0,016 мг/день интравентрикулярно 0,53±0,17 1,20±0,24 1,01 ±0,14 2,16±1,05

L-NAME 0,032 мг/день интравентрикулярно 1,14±1,02 1,35±0,51 1,17±0,54 2,01±1,39

L-NAME 0,032 мг/день подкожно 1,61±1,3* 1,67±0,19% 0,90±0,55 2,39±1,37

Представлены средние величины в единицах оптической плотности ± стандартное отклонение. Показатели статистически значимо отличающиеся между собой, отмечены знаком % (Манн Уитни тест, р=0,01).

Анализ основных подклассов IgG показал, что усиление продукции антител у крыс, получавших L-NAME интравентрикулярно и подкожно происходило за счет подкласса IgGl. Иммуноглобулины подкласса IgGl синтезируется под влиянием цитокинов, продуцируемых Th2 клетками (IL 4, IL 5, IL 10,1L 12, TGFp) обладающих противовоспалительными функциями, применительно к Э.А.Э. (Svanborg et al., 1995, Liblau et al., 1995). Следовательно, назначение L-NAME в эффективной дозе во время индукционной фазы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (не зависимо от пути введения) вызывает либо активацию существующей популяции Th2 клеток или смещение баланса дифференцировки Т клеток в сторону преобладания Th2 клеток. Тенденция к более высокому содержанию общего IgG в группе крыс получавших подкожно L-NAME по сравнению с интравентрикулярным введением согласуется с данными по оценке Т клеточного иммунитета, (сниженная способность к продукции INF у может отражать функциональное доминирование Th2 клеток).

Влияние внутрижелудочкового назначения ингибитора NOS L-NAME на

системный метаболизм оксида азота в течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Учитывая полученные нами данные (Danilov et al., 2003) о том, что гиперпродукция N0 является преимущественно интратекальным процессом, не находящим своего отражения на содержание NOx в системном кровотоке, несомненный интерес представляет изучение системного метаболизма NO в динамике ЭАЭ. Известно, что повышенный уровень продуктов окисления N0 в ликворе коррелировал с клиническим течением экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. (Scott G. S. et al., 1996) на монофазных Э.А.Э. моделях. Принимая во внимание полученные нами данные о предполагаемом механизме действия эфира нитрометиларгинина, особую важность приобретает вопрос о подтверждении эффективности действия ингибитора в использованной

экспериментальной системе. С целью изучения системного метаболизма N0 при Э.А.Э. и влияния L-NAME на содержание продуктов окисления N0 в сыворотке был произведен анализ нитритов и нитратов посредством капиллярного электрофореза (рис 4).

Рис 4. Динамика содержания NOx в сыворотке крови экспериментальных групп животных в течение Э АЭ. (По оси абсцисс дни после иммунизации, по оси ординат концентрация NOx ( нитраты + нитраты ) в сыворотке крови (цМ)).

В динамике развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в сыворотке крови наблюдался волнообразный паттерн изменений NOx. Пик концентраций приходился на 8 день, т.е. предшествовал клиническим проявлениям энцефаломиелита с последующим снижением до исходных значений в период развернутого клинического обострения, что совпадает с данными (Boulleme A.I. et al., 2002) о повышении титра антител к S нитрозотиолам в индукционную фазу иммунного ответа. Поскольку основными источниками NO являются активированные макрофаги и микроглия, то повышенная продукция N0 в системном кровотоке в индукционную фазу иммунного ответа представляется закономерной, т.к. согласно современной концепции патогенеза Э.А.Э. активация клеток макрофагального ряда происходит на периферии и предшествует клиническим проявлениям. Нормализация содержание N0 в период развития клинических симптомов может является отражением завершения процессов миграции активированных N0 синтезирующих клеток в ЦНС.

НеПрональные стволовые клетки как потенциальный источник ремиели-низации при воспалительно демиелинизирующих заболеваниях нервной

системы

Целью данной серии исследований явилось определение возможной роли и последствий активации нейрональных стволовых клеток при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите, индуцируемом на крысах Dark Auguti (Storch M., et al., 1998, Kornek В. et al., 2000). Особенностью используемой Э.А.Э. модели является преимущественная локализация воспалительно де-

миелинизирующих очагов в цервикальном отделе спинного мозга, где и производился поиск очагов с помощью темнопольной микроскопии на свежих, последовательных поперечных срезах спинного мозга. Вследствие значительной разнородности очагов по размерам и форме полученных от разных животных для иммунофлуоресцентного окрашивания, а так же для количественной оценки были выбраны срезы, проходящие через середину очага. На срезах, полученных у контрольных животных и срезах спинного мозга, не содержащих ней-ровоспалительных очагов, Dil прокрашенные клетки выстилали внутреннюю стенку центрального канала и pia mater, не обнаруживая тенденцию к миграции. На срезах полученных из середины очага Dil меченые клетки были обнаружены как в сером веществе окружающим центральный канал, так и непосредственно в очаге интенсивного воспаления. С целью оценки пролифератив-ной способности нейрональных стволовых клеток крысы получали BrDu в течение 10 дней. Множество клеток инкорпорировавших BrDu были обнаружены вокруг центрального канала, атак же мигрирующими в очаг воспаления.

С целью выявления срока активации нейрональных стволовых клеток было произведено сравнение количества Dil меченых клеток в диаметре вокруг центра центрального канала на срезах, полученных от крыс на 5,10,20 день от начала ЭАЭ. с количеством клеток, которые могут быть обнаружены на срезах, полученных от контрольных животных, или на срезах, не имевших воспалительно демиелинизирующих очагов (рис. 5).

120 1

контроль ЭАЭ , вне ЭАЭ 5 день ЭАЭ 10 лень ЭАЭ20день очага

Рис 5. Количество клеток в диаметре 50 цт от центра центрального канала (увеличение 20х), мигрирующих по направлению к очагу воспаления расположенному в дорсальной колонне. Каждый столбик представляет среднее значение, полученное при анализе восьми репрезентативных поперечных срезов, проходящих через середину очага от двух животных в каждой группе. Контрольные срезы были получены от не иммунизированных животных, а также от

животных, перенесших ЭАЭ, но из участка спинного мозга, не содержащего очаг воспаления. На схеме поперечного среза спинного мозга показана область подсчета мигрирующих клеток.

Время, необходимое для активации нейрональных стволовых клеток составляет 10 дней, что гораздо медленнее, по сравнение с моделью травматического повреждения (Beattie M.S. et al., 1997) но совпадает по времени с появлением предшественников олигодендроцитов при Э.А.Э. (Di Bello et al., 1999). Множество клеток экспрессировавших О4 были обнаружены непосредственно в очаге демиелинизации. Некоторые Dil меченые клетки окрашивались положительно с GFAP, что указывает на возможность дифференцировки в сторону астроцитарной линии. Часть Dil меченых клеток была локализована совместно с ED1 экспрессирующими клетками макрофагальной природы, что указывает на то, что нейрональные стволовые клетки являются объектом макрофагальной атаки на пути их миграции при Э.А.Э.

Итак, на экспериментальной модели рассеянного склероза был продемонстрирован факт ремиелинизации из эндогенного пула эпендимальных клеток, являющимися основными источниками предшественников олигодендроцитов. Наличие потенциальной возможности для ремиелинизации подтверждает полученные ранее данные на экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите, вызываемом на морских свинках (Raine C.S. 1988), SJL/J мышах (Brown A. 1982) и крысах Lewis, а так же на химически индуцированных моделях демие-линизации (Reynolds R. 1996). Так же нами был продемонстрирован факт фагоцитоза предшественников олигодендроцитов макрофагами, что свидетельствует о том, что истощение популяции стволовых клеток может происходить во время обострения воспалительного процесса, связанного с миграцией аутореак-тивных энцефалитогенных Т клеток и активизацией клеток макрофагальной природы. Полученные нами данные о активации нейрональных стволовых клеток при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите, их миграции и дифференцировке получили свое подтверждение на другой Э.А.Э. модели -мышах линии C57BL6, иммунизированных M.O.G. (Nathalie Picard-Riera et al., 2002). Используя аналогичные экспериментальные подходы, авторы изучали реакцию нейрональных стволовых клеток при Э.А.Э. непосредственно в суб-вентрикулярной зоне, являющейся основным источником новообразованных нейронов. Примечательно, что в данной работе нейрональные стволовые клетки так же пролиферировали и мигрировали в очаги демиелинизации, расположенные в мозолистом теле, и дифференцировались в олигодендроциты, а так же в нейроны при миграции вдоль рострального миграционного пути.

ВЫВОДЫ

1. Измерение содержания нитритов в ликворе больных с рассеянным склерозом может служить индикатором (в дополнение к М.Р.Т. исследованию) активности воспалительного процесса, продолжающегося как в периоды клинической ремиссии, так и во время вторичного прогрессирования заболевания с максимальной интенсивностью в периоды обострения.

2. Ингибитор NOS эфир нитрометиларгинина (L-NAME) при системном и особенно внутрижелудочковом назначении в дозе 0,032 мг/день в индукционную фазу иммунного ответа экспериментального аутоиммунного энцефаломие-

лита, вызываемого иммунизацией крыс миелинивым олигодендроцитарным протеином, облегчает тяжесть течения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, достоверно снижая степень воспалительных изменений в Ц.Н.С.

3. Предполагаемый механизм противоспалительного действия внутрижелудочкового введения L-NAME не обусловлен подавлением Т клеточного звена иммунного ответа при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите; назначение L-NAME крысам, переносящим Э.А.Э., вызывает усиление гуморального ответа, проявляющегося повышенным синтезом анти-М.О G. антител.

4. Усиление синтеза специфических антител происходит вне зависимости от пути введения L-NAME, преимущественно за счет иммуноглобулинов класса IgG|, что свидетельствует о смещении баланса Thl/Th2 клеток в сторону преобладания Т хелперов 2 типа, за счет чего может подавляться развитие воспаления.

5. В ответ на развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита происходит активация нейрональных стволовых клеток, которые пролиферируют, мигрируют из стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации и дифференцируются в олигодендроциты, являясь эндогенным источником ремиелинизации.

6. Нейрональные стволовые клетки могут становиться объектом прямой макрофагальной атаки на пути их миграции из стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации, что может служить причиной незавершеннной ремиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение содержания нитритов в ликворе может использоваться в качестве индикатора активности воспалительного процесса у больных с рассеянным склерозом.

2. Рекомендуется проведение клинических испытаний у больных с рассеянным склерозом ингибиторов NOS, которые способны облегчать течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, угнетая воспалительные изменения в Ц.Н.С.

3. Рекомендуется проведение специальных экспериментальных и клинических исследований роли нейрональных стволовых клеток как источника ремиелинизации при рассеянном склерозе.

4. Результаты, полученные в данной работе, рекомендуется использовать в преподавании специальных разделов патофизиологии и невропатологии студентам медицинских ВУЗ'ов и слушателям факультетов последипломного образования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Данилов А.И. Определение содержания оксида азота-как признак постоянного воспалительного процесса при рассеянном склерозе / A.I. Danilov, М. Andersson, N. Bavand, N.P. Wiklund, T. Olsson, L. Brundin. Nitric oxide

metabolite determinations reveal continuous inflammation in multiple sclerosis // J. Neuroimmunol.-2003-Vol.36-P. 112-128.

2. Данилов А. И. Нейрональные Стволовые клетки как источник ремиелинизации при нейро-воспалительных расстройствах / L. Brundin, H. Brismar, A. 1. Danilov, T. Olsson, C.B. Johansson. Neural stem cells - a potential source for remyelination in neuroinflammatory disease // Brain Pathology — 2003 -Vol. 13-P. 322-328.

3. Данилов А.И. Роль оксида азота при рассеянном склерозе / A.I. Danilov, М. Andersson, N. Bavand, N.P. Wiklund, T. Olsson, L. Brundin. Nitric oxide metabolites in Multiple sclerosis // Nitric oxide; biology and chemistry — 2002 - Vol. 6. - N. 4 - P. 377-378.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

- 1,1 диоктадецил 6,6 ди 4 сульфопентил 3,3,3,3, тетраметилиндо-карбоцианин

- глиальный фибриллярный белок

- индуцибельная систетаза оксида азота

- миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин

- эфир N-нитро - метил - L-аргинина

- оксид азота

- Т-хелперы первого типа

- Т-хелперы второго типа

- экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

Dil

GFAP iNOS M0G L-NAME NO Th -1 Th -2 Э.А.Э.

Тип. «Издательский дом СПбМАПО». Зак. 791. Тираж 100 экз. Подписано в печать 16.03.04 г.

6416

Актуальность проблемы

Рассеянный склероз является самой частой неврологической причиной инвалидизации лиц трудоспособного возраста (25 -40 лет), за исключением травматических поражений. (Lassman et al., 2001, что определяет актуальность его изучения. Рассеянный склероз является хроническим аутоиммунным заболеванием нервной системы, протекающим с поражением белого вещества головного и реже, спинного, мозга, что сопровождается образованием очагов воспаления и демиелинизации (Trapp B.D. et al., 1999). Заболевание в типичных случаях характеризуется хроническим, рецидивирующе-ремиттирующим, течением с последующим вторичным прогрессированием, сопровождающимся накоплением органических неврологических нарушений. (Lassman H. et al., 2001) Основными чертами патоморфологии P.C. являются наличие очагов демиелинизации, олигодендроцитарной гибели и ак-сональной дегенерации (Prineas and McDonald 1997), а так же наличие гли-альных очагов. Полагают, что под воздействием инициирующего события, в роли которого могут выступать инфекционные (Steiner I., 2001), средовые и генетические (Compston A., et al 2002) факторы, происходит реактивация ау-тореактивных клонов преимущественно Т лимфоцитов, нарушению гемато-энцефалического барьера с последующим развитием иммунно-опосредованного воспалением и демиелинизацией (Silber Е., Sharief М.К., 1999).

Несмотря на более чем вековую историю изучения проблемы, оценка степени активности воспалительно-демиелинизирующего процесса представляет серьёзную проблему. Диагностика осуществляется с помощью совокупности клинических критериев (Poser 1983) а так же посредством магнитно резонансной томографии (М.Р.Т.). Наличие клинически не проявляющихся обострений, (Kraus J. et al., 2002), необходимость повторного динамического наблюдения с применением специальных контрастирующих методик MPT (Miller D.H., et al., 1996) затрудняет процесс диагностики и делает поиск лабораторных маркеров активности воспалительного процесса особенно актуальным. Среди всего многообразия эффекторных молекул, принимающих участие в повреждении олигодендроцитов, оксид азота играет особо важную роль. Являясь продуктом синтеза семейства синтетеаз оксида азота (NOS) из аминокислоты JI аргинина, N0 потенциально нейротокичен (Dawson et al., 1994), способен оказывать прямое токсическое действие на культивируемые олигодендроциты. Биоптаты больных рассеянным склерозом содержат повышенное содержание iNOS м РНК по сравнению с интактными зонами мозга (Bagasra О. et al., 1995), что позволяет считать продукты окисления NO перспективными кандидатами на роль индикаторов активности заболевания.

Совокупность эпидемиологических (частота встречаемости рассеянного склероза по данным ВОЗ составляет 1:1000 среди населения северной Европы) и этических причин послужила стимулом для изучения роли оксида азота в патогенезе аутоиммунных заболеваний нервной системы на экспериментальной модели рассеянного склероза - экспериментального аутоимунно-го энцефаломиелита (Э.А.Э.), который развивается под воздействием иммунизации восприимчивых видов животных различными антигенами (Wekerley et al., 1994) или переносом CD4+ Т клеток (Ben Nun et al., 1981, Pattinelly et al., 1981) и проявляется параличами конечностей и хвоста, нарушениями зрения и атаксией. Способность ингибиторов NOS модулировать клиническое течение экспериментального аутоимунного энцефаломиелита известна с работ Koprowski (1993), однако механизм действия остается не известным. Известно (Cross et al., 1994, Zhao et al., 1996), что назначение аминогуанидина приводило к улучшению клинического течения экспериментального аутоимунного энцефаломиелита на мышах и крысах (Brenner et al., 1997, Zielasek et al., 1995). В то же время назначение N(omega) -nitro-L- arginine-methylester способствовало утяжелению заболевания и повышению летальности (Ruuls et al., 1996, Gold et al., 1997). Более того, назначение NMA PVG крысам привело к развитию тяжелого энцефаломиелита у животных, считавшихся полностью резистентным к развитию экспериментального аутоимунного энцефаломиелита (Cowden et al., 1998, Willenborg et al., 1998). Следует так же отметить, что все упомянутые модели являются монофазными, со слабой выраженностью демиелинизации, а, следовательно, не вполне адекватными для изучения рассеянного склероза. Таким образом, изучение последствий назначения ингибиторов iNOS на крысах Dark Auguti, иммунизированных миелиновым олигодендроцитарным белком, представляется актуальным.

Поскольку мишенью аутоиммунно-опосредованного воспаления при рассеянном склерозе и Э.А.Э. являются олигодендроциты, то изучение механизмов, лежащих в основе процессов ремиелинизации является актуальным. В случае усиления процессов ремиелизации возможно восстановить утраченные неврологические функции, предотвратить аксональное повреждение и прогрессирование неврологических симптомов. Присутствие ремиелинизации было доказано для многих экспериментальных моделей травматического и аутоиммунного повреждения (Bornstein М.В. and Raine С.S. 1969, Blake-more et al., 1974; Linington et al., 1988; Rodriguez et al., 1992; Reynolds and Wilkin, 1993; Carroll and Jennings, 1994), однако источники клеток - предшественников олигодендроцитов попрежнему неизвестными. Идентификация нейрональных стволовых клеток, как самоподдерживающейся, полипотент-ной популяции, способной дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты и нейроны, и реагирующей на повреждение Ц.Н.С. пролиферацией и миграцией, открывает новые возможности для изучения роли этих клеток в патогенезе экспериментального аутоимунного энцефаломиелита.

Цели исследования:

1. Изучение возможности использования продуктов окисления оксида азота в качестве лабораторного маркера активности воспалительно де-миелинизирующего процесса при рассеянном склерозе.

2. Изучение возможности модулирования воспалительно-демиелинизирующего процесса с помощью ингибиторов синтетазы оксида азота на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

3. Изучение роли нейрональных стволовых клеток в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

Задачи:

1. Исследовать особенности системного метаболизма оксида азота в ходе течения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и у больных рассеянным склерозом, и, сопоставив динамику клинической картины заболевания с изменениями концентрацией продуктов окисления оксида азота в ликворе и сыворотки крови, выяснить, может ли содержание нитритов в ликворе и сыворотке крови служить индикатором активности воспалительного процесса.

2. Изучить влияние интравентрикулярного и системного введения ингибитора синтетазы оксида азота на клиническое течение и степень выраженности воспаления при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

3. Исследовать влияние ингибитора синтетазы оксида азота на степень выраженности Т-клеточного иммунного ответа в динамике экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

4. Изучить влияние ингибитора синтетазы оксида азота на В-клеточное звено иммунного ответа в динамике экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

5. Изучить реакции и изменения нейрональных стволовых клеток при развитии аутоимуно опосредованного воспаления и демиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Положения, выносимые на защиту:

1. Продукты окисления оксида азота в ликворе являются маркером активности воспалительного процесса при рассеянном склерозе.

2. Интратекальное и системное назначение L-NAME приводит к ослаблению клинических проявлений экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита на крысах Dark Agouti, и подавлению процессов воспаления. Интратекальное и системное назначение NOS ингибиторов оказывает модулирующее влияние на интенсивность Т клеточного иммунного ответа, смещая баланс Thl/Th2 в сторону преобладания Th2 клеток.

3. В ответ на развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита происходит активация нейрональных стволовых клеток, которые пролиферируют, мигрируют из внутренней стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации и дифференцируются в олиго-дендроциты, являясь эндогенным источником ремиелинизации.

4. В процессе миграции нейрональные стволовые клетки подвергаются прямой макрофагальной атаке, что может служить причиной незавершенной ремиелинизации при экспериментальном аутоимунном энцефаломиелите.

Научная новизна работы:

Продемонстрировано наличие корреляции между клинической картиной заболевания и концентрацией нитритов в ликворе от больных рассеянным склерозом.

На экспериментальной модели рассеянного склероза продемонстрирована возможность ослабления клинических проявлений экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита посредством интравентрикулярного и системного введения эфира нитрометиларгинина (L-NAME). Показано его влияние как противовоспалительного агента применительно к экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту.

Впервые продемонстрировано влияния ингибиторов синтетазы оксида азота на специфический и неспецифический иммунный ответ. Изучены особенности метаболизма оксида азота на фоне перенесения Э.А.Э.

Исследована реакция нейропальных стволовых клеток на развитие очагов демиелинизации в спинном мозге при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Научно-практическая значимость работы:

Показана возможность использования продуктов окисления оксида азота в качестве лабораторного маркера активности воспалительно демиелинизи-рующего процесса у больных с рассеянным склерозом. Изучены последствия терапевтического использования ингибиторов синтетазы оксида азота на экспериментальной модели рассеянного склероза. Идентифицированы источники ремиелинизации при Э.А.Э., которыми являются нейрональные стволовые клетки.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены на Международном конгрессе «Second International conference in Biology, Chemistry and therapeutic Application of Nitric Oxide".(Prague 2001)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы

1 .Danilov, A. I., Andersson, M., Bavand, N., Wiklund, N. P., Olsson, T. and Brun-din L. "Nitric oxide metabolite determinations reveal continuous inflammation in multiple sclerosis"// J. Neuroimmunol. - 2003 -Vol. 36 - P. 112 - 128.

2. Lou Brundin, Hjalmar Brismar, Alexandre I Danilov, Tomas Olsson and Clas B. Johansson "Neural stem cells - a potential source for remyelination in neuroin-flammatory disease" //."Brain Pathology" - 2003 - Vol. 13 - P. 322 - 328.

3. Danilov, A. I., Andersson, M., Bavand, N., Wiklund, N. P., Olsson, T. and Brundin L. "Nitric oxide metabolites in Multiple sclerosis" // "Nitric oxide ; biology and chemistry" - 2002 - Vol 6. - N. 4 - P. 377-378.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 298 источников (из них 25 отечественных и 273 зарубежных). Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 19 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Измерение содержания нитритов в ликворе больных с рассеянным склерозом может служить индикатором (в дополнение к М.Р.Т. исследованию) активности воспалительного процесса, продолжающегося как в периоды клинической ремиссии, так и во время вторичного прогрессирования заболевания с максимальной интенсивностью в периоды обострения.

2. Ингибитор NOS, эфир нитрометиларгинина (L-NAME) при системном и особенно внутрижелудочковом назначении в дозе 0,032 мг/день в индукционную фазу иммунного ответа экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, вызываемого иммунизацией крыс миелинивым олигодендроци-тарным протеином, облегчает тяжесть течения экспериментального аутои-мунного энцефаломиелита, достоверно снижая степень воспалительных изменений в Ц.Н.С.

3. Предполагаемый механизм противоспалительного действия внутрижелу-дочкового введения L-NAME не обусловлен подавлением Т клеточного звена иммунного ответа при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите; назначение L-NAME крысам, переносящим Э.А.Э., вызывает усиление гуморального ответа, проявляющегося повышенным синтезом анти-M.O.G. антител.

4. Усиление синтеза специфических антител происходит вне зависимости от пути введения L-NAME, преимущественно за счет иммуноглобулинов класса IgGi, что свидетельствует о смещении баланса Thl/Th2 клеток в сторону преобладания Т хелперов 2 типа, за счет чего может подавляться развитие воспаления.

5. В ответ на развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита происходит активация нейрональных стволовых клеток, которые пролифери-руют, мигрируют из внутренней стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации и дифференцируются в олигодендроциты, являясь эндогенным источником ремиелинизации.

6. Нейрональные стволовые клетки могут становиться объектом прямой мак-рофагальной атаки на пути их миграции из внутренней стенки центрального канала спинного мозга в очаги демиелинизации, что может служить причиной незавершеннной ремиелинизации при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите.

Глава IV Заключение и общие выводы

Как уже упоминалось в литературном обзоре, рассеянный склероз является аутоиммунно-опосредованным заболеванием, являющимся самой частой из неврологических причин, приводящих к инвалидизации лиц трудоспособного возраста, что определяет актуальность изучения аспектов патогенеза иммуно-опосредованного повреждения нервной ткани, а так же процессов регенерации. Согласно современным представлениям патогенез P.C. представляется гетерогенным, однако в конечном итоге приводящим к повреждению и гибели олиго-дендроцитов, аксональному повреждению и аксональной дегенерации. Среди всего многообразия механизмов повреждения олигодендроцитов, таких как, антитело опосредованная цитотоксичность (Genain et al.,., 1995), активация проте-аз системы апоптоза (Bonetti and Raine, 1997; Dowling et al.,., 1997a), прямое ци-тотоксическое действие IL-2, IL-6, TNF a INFy, секретируемых миелин специфическими T хелперами 1 типа (Brouckaert et al.,., 1993) и активированной мик-роглией (Martino G, 2000), важная роль отводится оксиду азота, как одному из молекул эффекторов. Обнаружение повышенной экспрессии iNOS mRNA в а так же нитротиротирозин содержащих клеток в очагах активной демиелиниза-ции (Bagasra О et al., 1995, Во et al., 1994, De Groot et al., 1997) a так же TNFot (Hofman et al., 1989) и INFy (Traugott U. и Lebon P; 1988), являющиеся мощными активаторами экспрессии iNOS, а так же ряд экспериментальных исследований, показавших способность к индукции iNOS и повышенной продукции N0 клеток микроглии (Hewett S.J. et al., 1993, Hooper D.C. et al., 1995), приводивших к цитотоксическому действие на олигоденодроциты и нейроны (Boje et al., 1992), привело к формированию концепции нитрозативно оксидативного стресса играющего важную роль в патогенезе P.C. Как уже обсуждалось в главе №3, основным непрямым способам изучения активности нитрозативного стресса у больных с P.C. является определения продуктов окисления оксида азота в лик-воре и сыворотке крови. Вследствие противоречивости литературных данных по этому вопросу нами было произведен анализ содержания нитратов, нитритов, тирозина, нитротирозина, хлортирозина и нитрогидроксифенил ацетиловой кислоты в ликворе больных P.C. Полученные нами данные убедительно показывают, что гиперпродукция-N0 в Ц.Н.С. происходит на всем протяжение заболевания, являясь максимально выраженной в периоды клинически выраженных обострений, умеренно выраженной в периоды неуклонного прогрессиро-вания, и наименее выраженной в периоды ремиссий, что позволяет использовать продукты окисления оксида азота в качестве суррогатного маркера активности заболевания. Полученные нами данные согласуются с данными Acar G. (Acar G. et al., 2003), где было убедительно показано, что высокое содержание нитрита в ликворе во время обострения коррелировало с присутствием активных очагов на МРТ, проведенном с использованием гадолиния.

Принимая во внимание данные, полученные на клиническом материале, несомненный интерес представляет изучение последствий подавления гиперпродукции оксида азота в условиях экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Как уже отмечалось в обзоре литературы, эффект от применения ингибиторов NOS на Э.А.Э. моделях весьма противоречив и разниться от полного подавления клинических и патоморфологических признаков Э.А.Э. (Cross et al., 1994, Okuda et al.,., 1995, Zhao et al.,., 1996, Scott et al., 1996, Brenner et al.,., 1997) до аггравации заболевания (Ruuls et al.,., 1996, Gold et al., 1997) и даже развития Э.А.Э. под влиянием ингибиторов NOS у видов грызунов, ранее считавшихся резистентными к индукции заболевания (Staykova M.A. et al., 2002). Совокупность экспериментальных данных привела к формированию гипотезы о том, что NO может обладать как патогенным, так и протективным действием при Э.А.Э. Так же обсуждается вопрос о том, что сам по себе NO обладает протективными свойствами, а весь спектр патогенных эффектов NO в Ц.Н.С. может быть обусловлен другими молекулами, в частности пероксинит-ритом, который является мощным оксидантом (Beckman et al., 1990). В то же время обсуждается вопрос о том, что гиперпродукция N0 обуславливает различные эффекты в динамике иммунного ответа при Э.А.Э., будучи патогенной в индукционную фазу, участвовать в механизмах протекции в фазу прогрессии заболевания (Okuda et al., 1998).

Настоящее исследование было выполнено на крысах породы Dark Agouti, иммунизированные M.O.G., как на модели, наиболее адекватно отражающей основные черты патоморфологии P.C., такие как наличие очагов иммунно опосредованного воспаления и демиелинизации, а так же релапсирующе ремитти-рующий паттерн заболевания. (Lassman H. et al., 1998). В проведенных нами экспериментах назначение неселективного ингибитора NOS L-NAME в дозе 0,00,032 мг/день приводило к значительному смягчению клинического течения Э.А.Э. как при системном, так и внутрижелудочковом назначении. Полученный эффект был связан со снижением интенсивности воспаления, что было верифицировано патоморфологически. Фармакологическая адекватность использования L-NAME была подтверждена путем измерения продуктов окисления NO сыворотке. Примечательно, что клинический эффект был более выражен при внутрижелудочковом назначении, по сравнению с системным. С целью оценки влияния назначения L-NAME в индукционную фазу иммунного ответа на степень активации Т клеточного звена иммунной системы, было проведено сравнение групп леченых системно и интравентрикулярно в отношении уровня4 продукции INFy стимулированными спленоцитами посредством метода ELISPOT (Olsson Т 1990). Полученные результаты свидетельствуют о том, что не смотря на более выраженный клинический эффект в группе, получавшей L-NAME интравентрикулярно, уровень продукции INFy был достоверно выше, по сравнению с группой получавшей L-NAME подкожно, что позволяет предположить, что наблюдаемый противовоспалительный эффект не связан с подавлением активности Т клеточного звена системного иммунного ответа. Учитывая полученные результаты, особый интерес представляет изучение влияние L-NAME на специфический гуморальный иммунный ответ, играющий важную роль в патогенезе развития демиелинизации как при P.C. (Storch МК 1998) так и при M.O.G. индуцированном Э.А.Э. (Lassmann H. et al., 1998). Изучение титра специфических анти-M.O.G. антител в динамике Э.А.Э. выявило, что независимо от пути введения назначение L-NAME в дозе 32мг/день приводило к усилению синтеза антител, а анализ типовой принадлежности показал, что усиление происходит в основном за счет иммуноглобулинов типа IgGl. Причем уровень синтеза был достоверно выше в группе крыс леченных системно. Общеизвестно, что иммуноглобулины подкласса IgGl синтезируется под влиянием цитоки-нов, продуцируемых Th2 клетками (IL 4, IL 5, IL 10, IL 12, TGFß) обладающих противовоспалительными функциями применительно к Э.А.Э. (Svanborg et al., 1995, Liblau et al., 1995). Следовательно, на основании полученных результатов можно предположить, что назначение L-NAME в индукционную фазу Э.А.Э. вызывает либо активацию существующей популяции Th2 клеток или смещение баланса дифференцировки Т клеток в сторону преобладания Th2 клеток. Тенденция к более высокому содержанию общего IgG в группе крыс получавших L-NAME подкожно по сравнению с интравентрикулярным введением согласуется с данными по оценке Т клеточного иммунитета. Представляется возможным, что сниженная способность к продукции INF у может отражать функциональное доминирование Th2 клеток в данной группе по сравнению с группой, получавшей ингибитор NOS интратекально. Полученные нами данные косвенно подтверждают роль N0, как фактора стимулирующего дифференцировку Thl, указывая на патогенность гиперпродукции N0 в индукционную фазу иммунного ответа при Э.А.Э., а так же несомненно требуют проведения ряда дополнительных исследований по изучению влияния L-NAME на спектр продуцируемых цитокинов в динамике Э.А.Э.

Другим аспектом патогенеза Э.А.Э. явившимся предметом нашего изучения стала проблема изучения реакции нейрональных стволовых клеток на ауто-иммуно опосредованное воспаление и демиелинизацию и идентификация их, как потенциальных источников ремиелинизации при Э.А.Э. Как уже неоднократно отмечалось в обзоре литературы, принципиальная возможность ремиелинизации при Р.С была доказана ещё Марбургом (Marburg О 1906), однако причины её несостоятельности остаются неизвестными. Наличие факта ремиелинизации было многократно подтверждено на различных экспериментальных моделях (Bornstein MB and Raine CS 1969, Blakemore 1974; Linington et al., 1988; Rodriguez et al., 1992, Reynolds and Wilkin, 1993; Carroll and Jennings, 1994), однако источник клеток предшественников олигодендроцитов до недавнего времени оставался неизвестным, а идентификация этих клеток осуществлялась с помощью иммуногистохимических маркеров, таких как GalC, NG2, PDGFa и 04. Идентификация клеток эпендимы, как популяции полипотентных нейрональных стволовых клеток (Johansson et al., 1999) позволило нам проследить судьбу этих клеток в динамике M.O.G. индуцированного Э.А.Э. Результаты проведенных экспериментов показали, что клетки эпендимального слоя, меченные липофильным красителем Dil, делятся, мигрируют из внутренней стенки центрального канала в очаги демиелинизации, расположенные в дорзальных канатиках. Причем максимальное количество мигрировавших клеток наблюдалось на 10 день после иммунизации, оставаясь стабильно высоким вплоть до 20 дня от начала эксперимента. Непосредственно в очаге воспаления нейрональ-ные стволовые клетки дифференцируются в олигодендроциты, являясь тем самым источником ремиелинизации при Э.А.Э. Обнаружение Dil меченых клеток, колокализованных с ED1 положительными клетками указывает на то, что нейрональные стволовые клетки могут являться объектом прямой макрофагальной атаки при Э.А.Э. Следует отметить, что полученные нами данные подтверждают исследования Nathalie Picard-Riera (Nathalie Picard-Riera et al., 2002), в которых был доказан факт пролиферации, миграции и дифференцировки в олигодендроциты нейрональных стволовых клеток, происходящих из субвен-трикулярной зоны, в очагах демиелинизации в мозолистом теле. Результаты нашей работы позволяют предположить, что нейрональные стволовые клетки обладают значительным миграционным потенциалом, способны реагировать на повреждение Ц.Н.С. пролиферацией и дифференцировкой, манипулирование которыми может являться одной из многообещающих терапевтических стратегий при лечении P.C. Одной из таких стратегий является трансплантация нейрональных стволовых клеток, которая в показала свою эффективность в экспериментальных условиях. Так в работе Pluchino, S. (Pluchino, S et al., 2003) син-генные нейрональные стволовые клетки, введенные внутрижелудочково и внутривенно мышам, переносящим Э.А.Э., были обнаружены в очагах демиелинизации, где они дифференцировались в олигодендроциты, способные мие-линизировать поврежденные аксоны, что сопровождалось снижением степени демиелизации и аксонального повреждения, что в свою очередь послужило причиной клинического и нейрофизиологического улучшения Э.А.Э. Примечательно, что вновь образовнные олигодендроциты были преимущественно донорского происхождения, в то время как количество олигодендроцитов, образованных из эндогенных источников было незначительно. Указанные данные совпадают с нашими, поскольку количество клеток, окрашенных Dil и экспрес-сирующих 04 антиген, обнаруженных на криостатных срезах спинного мозга, проходящих через середину очага демиелинизации было невелико. Таким образом, причина неспособности эндогенных стволовых клеток к эффективной ре-миелинизации остается неизвестной. Однако существующие на сегодняшний день экспериментальные данные позволяют предположить, что вероятными причинами, тормозящими дифференцировку стволовых клеток в очаге демиелинизации, могут являться недостаточность ростовых факторов, а так же молекулы - эффекторы, принимающие участие в повреждении олигодендроцитов. Так, например, назначение фибробластного ростового фактора (FGF2) переносящим M.O.G. индуцированный энцефаломиелит крысам приводило к клиническому улучшению и значительно увеличивало количество клеток предшественников олигодендроцитов (Ruffini 2001), обеспечивая усиление процессов ре-миелинизации и снижение степени аксонального повреждения. Токсические метаболиты в воспалительно демиелинизирующем очаге могут играть роль в повреждении клеток предшественников, в частности оксид азота и пероксинит-риты (Brosnan CF 1994).

Кроме того, оксид азота может являться фактором, отвечающим за прекращение клеточной пролиферации и начало клеточной дифференцировки. Так, например, в ходе эмбрионального развития крыс было показано, что усиление экспрессии NOS мРНК в Ц.Н.С. совпадает по времени с прекращением деления клеток предшественников и началом их дифференцировки (Bredt and Snyder, 1994). А в Ц.Н.С. взрослых мышей NOS позитивные нейроны располагаются в непосредственной близости от участков интенсивного нейрогенеза (Moreno-Lopez et al., 2000). Применение ингибитора NOS L-NAME в ходе эмбриогенеза головастика рода Xenopus приводило к увеличению количества пролифери-рующих клеток и увеличению количества вещества мозга, в то время как введение NO донора приводило к противоположному эффекту (Peunova N. et al.,

2001). Примечательно, что внутрижелудочковое введение L-NAME посредством осмотических минипомп здоровым крысам приводило к усилению процессов нейрогенеза в субвентрикулярной зоне и ростральном миграционном пути, источником которого являлись нейрональные стволовые клетки (Packer М et al.,

2002). Вопрос о том, в какой степени эффекты NO как регулятора пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, реализуются при Э.А.Э., а так же влияние L-NAME на пролиферацию, миграцию и дифференцировку нейрональных стволовых клеток, являющихся источниками ремиелинизации при ЭАЭ, остается неизученным, и требующим проведением дополнительных исследований.