Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Оценка функции семафорина Sema4D/ CD100 и его рецептора CD72 при ремиттирующем рассеянном склерозе

9 15-14/667

На правах рукописи

ДАНЧЕНКО ИРИНА ЮРЬЕВНА

ОЦЕНКА ФУНКЦИИ СЕМАФОРИНА 8ЕМА40/С0100 И ЕГО РЕЦЕПТОРА СЭ72 ПРИ РЕМИТТИРУЮЩЕМ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ .

14.01.11 - нервные болезни 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2015

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ректор - д.м.н., профессор И.П. Корюкина).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России Байдина Татьяна Витальевна

доктор биологических наук,ведущий научный

сотрудник ИЭГМ УрО РАН Куклииа Елена Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа Бахтиярова Клара Закиевна

доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровья населения», г. Пермь Долгих Олег Владимирович

Ведущая организация — Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой Российской академии наук, г. Санкт-Петербург

Защита состоится « ¿Ту^У^2015 года в

часов на заседании диссертационного совета ХД 208.067.01 при ГБОУ ВПО «ПГМУ имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «ПГМУ имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России (г. Пермь, ул. Петропавловская, 26) и на сайте www.psma.ru, с авторефератом можно ознакомиться на сайтах www.vak.ed.gov.ru,www.psma.ru.

Автореферат разослан « 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Мудрова Ольга Александровна

Р0ССИЙСКА5 ГОСУДАРСТВЕН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РАБ ^^отш

Актуальность исследования. Ускоряющиеся темпы развития неврологии и иммунологии приводят к открытию новых компонентов иммунной системы, участвующих в патогенезе рассеянного склероза (PC) - частой причины инвалидизации лиц молодого трудоспособного возраста [Бойко А.Н. [и др.], 2009; Столяров И.Д., 2010; Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н., 2010]. Учитывая, что начало патогенеза PC происходит, как правило, на периферии, а не в центральной нервной системе (ЦНС), воздействие именно на этот первичный процесс может приостановить последующее развитие заболевания и улучшить качество жизни пациентов, способствуя разработке препаратов, изменяющих течение рассеянного склероза (ПИТРС). Ремитгирующий PC представляет наибольший интерес для поиска новых терапевтических подходов.

В качестве одного из возможных звеньев иммунопатологии PC можно рассматривать белковые молекулы семейства семафоринов и их рецепторы [Kumanogoh A., Marukawa S., Suzuki К. et al., 2002; Koda T., Okuno T., Takata K. et al., 2014]. В первую очередь это относится к семафорину IV класса Sema4D, известному также как CD 100 (CD - the Cluster of Differentiation, молекулы дифференцировки лимфоидных клеток).

Имеется ряд данных, указывающих на участие Sema4D в развитии PC. Так, 8ета40-дефицитные мыши устойчивы к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, модели PC у животных [Kumanogoh A., Suzuki К., Ch'ng Е. et al., 2002]. Повышенные уровни Sema4D определяются на поверхности Т-лимфоцитов и в сыворотке крови человека при другом демиелинизирующем заболевании - HTLV1-ассоциированной миелопатии [Giraudon P., Vincent P., Vuaillat С. et al., 2004]. Кроме того, в экспериментах in vitro показана способность Sema4D вызывать апоптоз незрелых олигодендроцитов - клеток, играющих ключевую роль в миелинизации нервных волокон [Giraudon P., Vincent P., Vuaillat С. et al., 2004].

Интерес к данному семафорину обусловлен его иммунным происхождением: Sema4D широко представлен на клетках иммунной системы, преимущественно - на Т-лимфоцитах, и способен за счет протеолитического отщепления переходить из мембранной формы в растворимую, не теряя при этом биологической активности [Wang X., Kumanogoh A., Watanabe С. et al. et al., 2001]. Синтезируясь иммуноцитами, Sema4D реализует свои эффекты как в иммунной системе, так и в ЦНС, используя для этого разные типы рецепторов: в нервной системе преимущественно Plexin-Bl [Tamagnone L., Artigiani S., Chen H., 1999], a в иммунной - CD72 [Kumanogoh A., Kikutani H., 2001].

Участие молекулы CD72 в реализации эффектов семафорина заслуживает особого внимания в связи с исследуемой патологией. Данная молекула представлена преимущественно на В-лимфоцитах и в свободном состоянии служит негативным регулятором В-клеточной активации, а

связывание Sema4D отменяет негативную регуляцию, что, теоретически, должно вести к гиперактивации клеток [Kumanogoh A., Watanabe С., Lee I. et al., 2000]. Между тем, В-лимфоциты, согласно современным представлениям, непосредственно участвуют в патогенезе PC, более того - истощение их популяции рассматривается как перспективная стратегия лечения данного заболевания [Евдошенко Е.П., 2013; Braley Т.J., Segal В.М., 2013].

Изложенные выше факты указывают на высокую актуальность изучения вовлеченности семафорина Sema4D в иммунные реакции пациентов с ремитгирующим PC.

Цель исследования - изучить значение экспрессии семафорина IV класса Sema4D (CD 100) и рецептора для Sema4D, CD72 в иммунной системе для механизмов повреждения при рассеянном склерозе, а также роль Sema4D-CD72-3aBHCHMoro сигнала в контроле функций иммунных клеток при данной патологии.

Задачи исследования:

1. Дать всестороннюю характеристику группы пациентов с ремитгирующим течением рассеянного склероза, не получавших иммуномодулирующей терапии, с балльной оценкой клинических и нейропсихологических особенностей для дальнейшего сопоставления с ними результатов лабораторных исследований иммунологических показателей.

2. Оценить экспрессию мембран-связанной формы семафорина Sema4D/ CD 100 различными субпопуляциями Т-лимфоцитов у пациентов с рассеянным склерозом ex vivo и в культуре (in vitro), в условиях поликлональной активации клеток.

3. Определить уровень растворимой формы семафорина Sema 4D/ CD 100 (sSema4D) в плазме крови пациентов с рассеянным склерозом и в культуре Т-лимфоцитов.

4. Определить экспрессию рецептора для семафорина Sema4D/ CD 100, CD72, В-лимфрцитами (CD19+ клетками) пациентов с рассеянным склерозом.

5. Оценить роль Sema4D-CD72-3aBHCHMoro сигнала в регуляции функций В-лимфоцитов при рассеянном склерозе, в частности, синтеза ключевых про- и противовоспалительных цитокинов В-лимфоцитами.

6. Провести клинико-иммунологическое сопоставление полученных данных.

Научная новизна исследования

Методом клинико-иммунологического сопоставления доказано участие новых иммунных механизмов в каскаде повреждающих реакций при рассеянном склерозе. Впервые показано, что ремиттирующий PC ассоциирован с повышенной экспрессией семафорина Sema4D/CD100 в иммунной системе. Впервые установлено повышение уровня экспрессии мембранного Sema4D/CD100 интактными Т-лимфоцитами ex vivo у пациентов с PC, а также показано ее изменение в ответ на поликлональную активацию Т-лимфоцитов: повышение на начальных стадиях культивирования и сниже-

ние при длительном культивировании. Впервые обнаружено повышение экспрессии растворимой формы семафорина в плазме крови пациентов с PC, а также в супернатантах Т-клеточных культур. Новыми являются данные по экспрессии рецептора для Sema4D/CD100, CD72, В-лимфоцитами пациентов с PC и участию Sema4D-CD72-3aBHCHMoro сигнала в регуляции функции этих клеток, в частности, продукции В-лимфоцитами основных про- и противовоспалительных цитокинов.

Обнаружено, что повышение уровня экспрессии семафорина Sema4D/CD100 характерно для пациентов с PC и не зависит от стадии заболевания, его продолжительности и уровня инвалидизации, и не связано с нейропсихологическими особенностями пациентов и результатами когнитивного тестирования.

Доказано, что мембранная и растворимая форма семафорина Sema4D участвуют в повреждающих процессах при PC, так как их показатели коррелируют с клиническими характеристиками заболевания: с компонентами EDSS и показателями, отражающими воспалительный компонент заболевания (меньшей длительностью заболевания и активностью демиели-низирующего процесса по данным нейровизуализации).

Практическая значимость работы

Проведенное комплексное исследование вовлеченности семафорина Sema4D/CD100 в патогенез PC позволяет подтвердить целесообразность использования данной молекулы в качестве возможной мишени при терапии данного заболевания, что требует дальнейших масштабных исследований с применением соответствующих моноклональных антител.

Результаты исследования показывают участие Sema4D-CD72-зависимого сигнала в контроле В-клеточной активности у наивных пациентов с ремитгирующим PC и свидетельствуют о вкладе семафорина в гиперактивацию В-клеточного звена иммунитета, также играющего негативную роль в патогенезе PC у таких пациентов.

Выявление повышенного уровня растворимой формы семафорина Sema4D/CD100 у пациентов с PC указывает на его возможное участие в демиелинизирующем процессе, учитывая данные литературы о патологическом действии растворимого семафорина на выживаемость олигодендро-цитов in vitro [Giraudon P., Vincent P., Vuaillat C. et al., 2004].

Положения, выносимые на защиту

1. Клинические и нейровизуализационные особенности наивных пациентов с ремитгирующим рассеянным склерозом ассоциированы с повышенной экспрессией семафорина Sema4D/CD100 (мембранной и растворимой формы) в иммунной системе.

2. У пациентов с рассеянным склерозом в ремиссию Т-лимфоциты в культуре демонстрируют повышенный уровень экспрессии Sema4D/

CD100 на мембране, но в то же время более интенсивное отщепление от мембраны в ответ на активацию клетки, что может отражать процессы, имеющие место на периферии и в центральной нервной системе. 3. При рассеянном склерозе снижена экспрессия рецептора для Sema4D/ CD100, CD72, на В-лимфоцитах периферической крови, а связывание его с семафорином регулирует функции В-клеток, изменяя профиль синтезируемых цитокинов в направлении провоспапительных факторов, что может быть одним из механизмов гиперактивации В-клеточного звена и развития нейровоспаления, характерных для данной патологии.

Личный вклад диссертанта в исследование. Этапы исследования, включая формирование групп пациентов, клиническое и нейропсихоло-гическое обследование лиц с подтвержденным диагнозом «Рассеянный склероз» выполнены лично автором. Диссертантом сформирована база данных и выполнена статистическая обработка результатов исследования. Иммунологические исследования выполнены в Лаборатории иммунорегуляции ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (г. Пермь). Автор выражает благодарность научному сотруднику Лаборатории иммунорегуляции, к.б.н. И.В. Некрасовой за помощь в работе.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 7 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Работа поддержана Федеральной целевой программой Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект № 12-П-4-1019) и грантом РФФИ (проект № 14-04-96007).

Апробация работы. Основные положения диссертации отражены в докладах на VI Сибирской межрегиональной научно-практической конференции "Рассеянный склероз и другие аутоиммунные заболевания нервной системы" (2013г., г. Новосибирск), XIX Всероссийской конференции "Ней-роиммунология. Рассеянный склероз" (2013г., г. Санкт-Петербург), городской научной конференции "Аутоиммунитет в норме и патологии" (2013 г., г. Пермь). Материалы диссертации изложены на Научной сессии ПГМА, посвященной 90-летию со дня рождения профессора Я.С. Циммермана (2013г., г. Пермь), Объединенном Иммунологическом Форуме (2013 г., г. Нижний Новгород), Российском научном форуме на Урале с международным участием «Актуальные вопросы фундаментальной медицины» (2014 г., г. Екатеринбург).

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практическую работу ГБУЗ Пермского края «Ордена «Знак Почета» Пермская краевая клиническая больница». Теоретические положения используются в программах обучения на кафедре неврологии имени В.П. Первушина ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация представляет рукопись на русском языке объемом 175 страниц машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 206 источников, в том числе 32 отечественных и 174 иностранных. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей, 24 рисунками, 4 клиническими примерами.

Настоящее исследование проведено в период с 2011-го по 2014 г.г. в условиях Пермского краевого центра рассеянного склероза на лечебной базе поликлиники ГБУЗ Пермского края «Ордена «Знак Почета» Пермская краевая клиническая больница». Лабораторные исследования проводили в Лаборатории иммунорегуляции ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (г. Пермь).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование было открытым, одномоментным, контролируемым. Общая совокупность обследуемых составила 76 человек, из которых 52 человека являлись наивными (не получавшими ПИТРС) пациентами с ре-миттирующим типом течения PC (41 чел. - в стадии ремиссии и 11 чел. - в стадии обострения) и 24 - здоровыми донорами (ЗД). Среди пациентов с PC было 35 женщин (67,3%) и 17 мужчин (32,7%), в соотношении 2,1:1, в возрасте от 18 до 55 лет.

Достоверный диагноз PC основывался на критериях McDonald [Polman С.Н., Reingold S.C., Edan G., 2005]. Диагноз PC был подтвержден магнитно-резонансной томографией (MPT) головного мозга на томографе мощностью 1,5 Тесла. Последняя МРТ головного мозга проводилась в диапазоне от 1 до 1061 дней, медиана 95 (65; 149) дней, перед клинико-лабораторным обследованием пациентов, при этом в стадии ремиссии - в диапазоне от 14 до 1061 дней, медиана 104 (81;152) дня, в стадии обострения -от 1 до 146 дней, медиана 5 (4;21) дней, р=0,000. Определение рецидивирующе-ремитгирующего типа течения PC проводилось по принятым критериям [Lublin F.D., Reingold S.C., 1996].

Пациентам с PC была проведена оценка уровня инвалидизации по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale) [Kurtzke J.F., 1983]. Превалирующими вариантами дебюта у пациентов являлись сенсорные нарушения (25%) и ретробульбарный неврит (17%). Клиническая характеристика пациентов с ремиттирующим PC представлена в табл. 1.

Таблица 1

Клиническая характеристика пациентов с рассеянным склерозом;

Показатели Пациенты с рассеянным склерозом (п=52)

Возраст на момент обследования (лет) Ж/М 29,00 (24,00; 37,50) 30.00 (23,00;39,00)/ 27,00 (24,00;36,00)

Пол (п) (Ж/М) 35/17

Возраст дебюта РС (лет) 25,00 (20,00;29,50)

Длительность первой ремиссии (мес.) 13,50 (6,00;48,00)

Количество обострений 2,50 (2,00;3,00)

Продолжительность заболевания (лет) 2,25 (1,00:6,50)

ЕОБв 2,50 (2,00:4,00)

Скорость прогрессировала 0,43 (о,зо;1,оо)

У пациентов, обследованных вне обострения, длительность ремиссии составила 117 (78;243) дней до момента забора крови. У пациентов, обследованных в стадию обострения, продолжительность периода от проявления симптомов обострения РС до забора образцов крови варьировала в промежутке от 5 до 74 дней, медиана 30 (15;30). Пациенты в стадии обострения отличались от пациентов в стадии ремиссии меньшей длительностью первой ремиссии, меньшей продолжительностью заболевания, большим баллом ЕОБЗ (табл. 2).

Таблица 2

Клиническая характеристика пациентов в стадии ремиссии и

Показатели Пациенты с рассеянным склерозом (п=52) р

в стадии ремиссии (п=41) в стадии обострения (п=11)

Возраст на момент обследо-вания (лет)Ж/М 30,0 (24,0:38,0) 30,5 (24,0:39,0)/ 27,0 (24,0:38,0) 26,0 (23,0;37,0) 26,0 (22,0:37,0)/ 25,5 (24,0:31,0) 0,452 0,541/ 0,651

Возраст дебюта РС (лег) Ж/М 26,0 (20,0:29,0) 26,5 (20,0:29,0)/ 24,0 (20,0:34,0) 24,0(21,0:37,0) 25,0(21,0:37,0)/ 24,0 (22,0;31,0) 0,500 0,636/ 0,544

Длительность первой ремиссии (мес.) 21,0(12,0:60,0) 6,0 (2,0;12,0) 0,007*

Количество обострений 3,0 (2,0:4,0) 2,0 (2,0;3,0) 0,520

Продолжительность заболевания (лет) 4,0(1,5:8,0) 1,0(0,5:2,5) 0,005*

БОвв 2,0(1,5:3,5) 3,0 (2,0;4,5) 0,036*

Здесь и далее: * - значимые различия между группами

Принципиальный вклад в различие в степени инвалидизации данных подгрупп пациентов (табл. 2) внесли выраженность сенсорных расстройств (р=0,014) и ограничений в ходьбе (показатель FS8, «Передвижение», Ambulation score) (р=0,028).

Для дальнейшего сопоставления клинических и иммунологических данных нами были выделены следующие группы из обследованных 52-х пациентов (табл. 3).

Таблица 3

Распределение пациентов с рассеянным склерозом по группам

Выделенные группы градации показателей Пациенты с рассеянным склерозом,п

1 18-30 28

Возраст (лет) 2 31-40 17

3 41-55 7

Дебют РС (лет) 1 16-29 39

2 >30 13

Длительность первой ремиссии (лет) 1 < 1 29

2 1-5 12

3 >5 II

Длительность заболевания (лет) 1 <2 26

2 2-5 11

3 >5 15

1 1,5-2,0 24

ЕОББ (балл) 2 2,5-3,5 13

3 4,0-5,5 15

Скорость 1 <0,25 6

прогрессирования 2 0,25-0,75 16

(для 33-х пациентов) 3 >0,75 11

Пол Женский 37

Мужской 17

Стадия заболевания Ремиссия 41

Обострение И

При оценке скорости прогрессирования в подсчет не были включены пациенты в стадии ремиссии с длительностью заболевания год и менее (п=8) и пациенты в периоде экзацербации болезни (n=l 1) ввиду получения в противном случае необоснованно высоких показателей [Rist J.M., Franklin R.J.M., 2010].

Психометрическое тестирование включало следующие шкалы: госпитальная шкала тревоги и депрессии (Hospital Anxiety and Depression Scale) для оценки аффективных расстройств, шкала MFI-20 (Mutidimensional Fatigue Inventory) для определения усталости, шкала MSIS-29 (Multiple Sclerosis Impact Scale) для оценки влияния заболевания на физическое и психическое состояние (для пациентов с PC), опросник FAMS (Functional Assessment of Multiple Sclerosis, Функциональная оценка PC) для оценки качества жизни (для пациентов с PC).

Тестирование когнитивных функций подразумевало слуховой тест на сложение в заданном темпе PASAT-3 (Paced Auditory Serial Addition Test).

В иммунологическом исследовании использовали гепаринизиро-ванную венозную кровь, из которой выделяли плазму и мононуклеарные клетки периферической крови.

Алгоритм лабораторных исследований представлен на рис. 1.

Кровь (1,5 мл) центрифугирование 3000 обомни., 10 мин.

Центрифугирование крови в градиенте плотпости фиколлз-всрографина

Выделение моиопуклеарных клеток периферической кровн

Оценка экспрессии CD72 (рецептора для Sema4D) в популяции В-лимфоцнтов (CDI9+ клеток)

_-

( Ex vivo

у.

Оценка жснрссснн Scma4I)/C 1)100 в субиопуляцпях CD3+CD4+. CD3+CD8+ Т-лимфоцитов**

In vitro Культивирование

cd'" k.iciok в течение 1ч./18 ч. - в спонтанном иариангс - на фоне активации (ФМА)

Оценка роли Sema4D-fD72-cnrnaia в контроле активности В-лимфоиитов (синтеза ци гокипов TNF-a, LT-a, IL-I0)

Uuilm Культивирование CD 19+ клеток течение 48 ч. в спонганлом варианте - на фоне активации (ФМА. нономннин) на фоне блокады Хста41)-СТ)72-сипша

Отбор суцсрншаншв I К-часовых

Определение уровня растворимого sSema4D

(ИФА) пиначе** я супериататпах 18-часииых клеточных культур:

- в спонтанном варианте

- на фоне активации (ФМА. иономицин)

Рисунок 1. Алгоритм лабораторных исследований.

Примечание: ** - исследования, проведенные у пациентов в стадии обострения рассеянного склероза -

Важным критерием исключения явилось наличие в анамнезе системного воздействия кортикостероидов в течение как минимум 30 дней до взятия образцов периферической крови, учитывая их возможное иммунодепрессивное воздействие на клеточное звено иммунной системы [Sellebjerg F., Christiansen М., Jensen J., Frederiksen J.L., 2000].

У пациентов в стадии обострения (экзацербации) рассеянного склероза, обследованных нами на завершающем этапе нашего исследования, мы оценили только 2 иммунологических показателя - экспрессию семафорина Sema4D/CD100 на Т-лимфоцитах периферической крови ex vivo и уровень растворимого семафорина (sSema4D - soluble Sema4D) в плазме крови.

Выделенные мононуклеарные клетки периферической крови использовали для оценки экспрессии (присутствия молекулы на мембране) Sema4D ex vivo - Т-лимфоцитами, для чего применяли субпопуляционные маркеры CD3, а также CD4/CD8, которые определяют основные функциональные субпопуляции лимфоцитов. Также выделяли не Т-клеточную субпопуляцию CD3" лимфоцитов, включавшую B-клетки, естественные киллеры и моноциты. Для анализа использовали моноклональные антитела к каждой из мембранных молекул (CD3, CD4 или CD8, CD 100), меченые разными флу-орохромными метками. Анализ проводили на проточном цитометре. Оценивали процент CDlOO-позитивных клеток в клеточной субпопуляции и среднюю интенсивность их свечения (Mean Fluorescence Intensity, MFI, условные единицы - у.е.), отражающую численность (плотность) молекул на мембране клетки.

Для оценки возможных изменений в экспрессии Sema4D Т-лимфоцитами в условиях иммунного ответа мы определяли ее в культуре - в спонтанном варианте (в полной питательной среде) и в услвиях активации. Клетки культивировали в течение 1 часа и 18 часов с использованием форболлмиристатацетата (ФМА), исходя из данных установочных экспериментов. По окончании культивирования определяли экспрессию Sema4D на мембране в общей популяции Т-лимфоцитов (CD3+ клеток). Оценивали процент CDlOO-позитивных клеток в клеточной субпопуляции и среднюю интенсивность их свечения.

Уровень растворимого Sema4D (sSema4D) оценивали в плазме крови и супернатантах клеточных культур (спонтанный вариант и вариант с активатором), полученных по окончании 18-часового культивирования Т-лимфоцитов, иммуноферментным методом.

Экспрессию рецептора для Sema4D - CD72 - В-лимфоцитами определяли ex vivo в суспензии мононуклеарных клеток периферической крови. Для этого использовали клеточный маркер CD19+. Оценивали процент С072-позитивных клеток в популяции CD19+ клеток и среднюю интенсивность их свечения.

Для оценки влияния Sema4D на B-лимфоциты их культивировали в течение 48 часов в присутствии Т-клеток в спонтанном варианте, на фоне активации (с использованием форболмиристатацетата и иономицина), а также на фоне блокады 8ета40-С072-сигнала (отдельно проводили блокаду Sema4D и отдельно — блокаду его рецептора CD72). Изучали экспрессию 2-х провоспалительных цитокинов (TNF-a - фактор некроза опухоли альфа и LT-a - лимфотоксин-альфа) и одного противовоспалительного (1L-10 -интерлейкин-10) в CD19+ клетках. Оценивали процент клеток, несущих цитокин.

Статистические методы, применяемые в исследовании

Статистическая обработка данных исследования проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoftlnc., USA). Описательные характеристики количественных признаков представлены в виде медианы с верхней и нижней квартилью - Ме (LQ;UQ) или (Ме; LQ-UQ). Сравнительный анализ данных в 2-х независимых группах выполнен с использованием U критерия Манна-Уитни. При сравнении частот бинарных качественных признаков в двух независимых группах использованы критерий у2 и точный критерий Фишера. При сравнении 2-х зависимых групп использован критерий Вилкоксона. При сравнении количественных показателей в трех независимых группах проведен дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису. Корреляционный анализ произведен с использованием рангового коэффициента Спирмена (R). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. При значении р меньше 0,001 производили указание в формате р=0,000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клиническая характеристика пациентов с PC Особенности нейровизуализационных данных в обследованной группе

Активность PC по данным МРТ головного мозга была выявлена у 20 чел. Медиана контрастируемых очагов составила 1 (0;4), при этом она отличалась в группах ремиссии 0,5 (0;2,0) и обострения 4,0 (2,0; 10,0), р=0,026, с преобладанием у последней. Преимущественный тип накопления контрастного препарата - изолированный диффузный.

Результаты тестирования когнитивных функций

Количество правильных ответов в трехсекундном слуховом тесте на сложение в заданном темпе PASAT-3 в группе пациентов с PC (п=39) составило 44,0 (37,0;53,0), в то время как в группе контроля (п=12) - 49,0 (45,5;52,0), без значимых отличий (р=0,209). Не выявлены отличия в выполнении этого теста пациентами с PC в зависимости от пола (р=0,522), занятости (р=0,223) и выделенных клинических характеристик пациентов, а также стадии заболевания.

Результаты психометрического тестирования

У пациентов с РС (п=40) отмечен уровень тревоги на уровне субклинической, что превышает таковой у ЗД (п=12) (р=0,004) (табл. 4).

Таблица 4

Результаты психометрического тестирования пациентов с рассеянным

склерозом и здоровых доно| юв; Ме (ЬО;иО)

Показатели (баллы) Пациенты с рассеянным склерозом Здоровые доноры Р

Госпитальная шкала тревоги и депрессии тревога 7,5 (5,0; 10,0) (п=40) 4,5 (2,5;5,0) (п-12) 0,004*

депрессия 4,5 (2,0;7,0) (п=40) 3,5 (3,0;6,0) (п=12) 0,541

МИ-20 общая астения 11,0(8,5; 15,5) (п=40) 11,0(9,5; 13,0) (п=12) 0,578

физическая астения 11,0 (8,0; 13,0) (п=40) 8,0 (7,0;11,0) (п=12) 0,221

снижение мотиваций 9,0 (8,0; 12,5) (п=40) 10,0 (9,0; 11,5) (п=12) 0,947

пониженная активность 11,0 (5,5; 14,5) (п=40) 12,0 (8,0; 13,0) (п=12) 0,844

психическая астения 8,5 (5,5; 11,5) (п=40) 7,0 (5,0;12,0) (п=12) 0,585

общий балл 53,0 (35,0;68,0) (п=40) 52,5(45,0;53,5) (п=12) 0,551

Тревога преобладала у пациентов с большей выраженностью степени инвалидизации. Показатели депрессии не различались в группах, выделенных по возрасту (р=0,835) и продолжительности заболевания (0,226) по критерию Краскел-Уоллиса. Были выражены отличия в уровне депрессии между пациентами со степенью инвалидизации <2 баллов (3,0; 1,0-6,0) и > 4 баллов (7,5;4,0-9,0), р=0,014.

Как и в случае с показателем депрессии, не отмечено различий по шкалам теста \lFI-20 в группах пациентов с РС и ЗД (табл. 4). Выявлены положительные корреляции показателя «Физическая астения» шкалы МР1-20 с возрастом пациентов (11=0,357, р=0,023), количеством обострений (11=0,408, р=0,008).

Пациенты имели большие показатели по шкале влияния РС \1SIS-29 в старших возрастных группах и при возрастании продолжительности заболевания и балла ЕОББ. Как физическая (Я=0,556, р=0,000), так и психическая (11=0,500, р=0,001) составляющая теста М818-29, а также общий балл по данной шкале (11=0,555, р=0,000) имели положительную корреляционную связь с количеством обострений.

Медиана значения общего показателя качества жизни по селективной для пациентов с РС шкале РАМ8 составила 131 (110;151) балл при

максимально возможном значении 176 баллов, без отличий между группами ремиссии (п=31) и обострения (п=8) (р=0,573).

Пациенты, находившиеся на момент выполнения психометрического тестирования в стадии клинической ремиссии или экзацербации PC, не имели отличий в баллах по всем четырем нейропсихологическим опросникам и тесту PASAT-3.

Оценка роли Sema4D/CD100 в контроле функции иммунокомпетентных клеток при рассеянном склерозе Экспрессия семафорит Sema4D/CD100 Т-лимфоцитами ex vivo у пациентов с рассеянным склерозом и здоровых доноров

Т-лимфоциты конститутивно экспрессируют маркер CD100 как в группе пациентов с PC, так и в группе ЗД. Однако уровень экспрессии Sema4D на Т-лимфоцитах - средняя интенсивность свечения (Mean Fluorescence Intensity, MFI) - значимо превалировал в субпопуляциях клеток у пациентов с PC (п=37) в сравнении со ЗД (n=20): CD3+4+ (р=0,000), CD3+8+ (р=0,000), CD3 (р=0,003) (рис. 2).

î ?

X _

а £

о cl

о. о

О X

ч о

со ri

Рисунок 2. Уровень экспрессии семафорина Sema4D/CD100 (Mean Fluorence lntencity, MFI) в субпопуляциях мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с рассеянным склерозом и здоровых доноров: a) CD3+4+, б) CD3+8+, в) CD3"; Me (LQ;UQ).

Не было обнаружено отличий в уровне экспрессии Sema4D в группах пациентов с PC, разделенных нами по возрасту, возрасту дебюта, длительности заболевания, величине уровня инвалидизации по шкале EDSS и скорости прогрессирования, а также полу и стадии заболевания. Значимых отличий по уровню экспрессии Sema4D в субпопуляциях мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с PC в стадии ремиссии (п=27) и экзацербации (п=10) нами также не было установлено, что предполагает отсутствие зависимости экспрессии Sema4D от стадии демиелинизирующего процесса. Не установлено и тендерных отличий по уровню экпрессии Sema4D на мембране лимфоцитов.

Обнаружена прямая корреляционная связь между процентом CD100+ клеток в субпопуляции CD3+CD4+ лимфоцитов и значением FS2 (функции ствола мозга) шкалы EDSS (R=0,418, р=0,010), FS7 когнитивных функций (R=0,351, р=0,033), значением FS8 передвижения (R=0,338, р=0,041), а также между уровнем экспрессии Sema4D/ CD100 на CD3" клетках и значением FS2 стволовых функций (R=0,406, р=0,014).

Экспрессия семафорина Sema4D/CD100 интактными и активированными Т-лимфоцитами (CD3+ клетками) в обследуемых

группах in vitro

В группах ЗД (п=9) и пациентов с PC (п=10) было отмечено повышение уровня экспрессии Sema4D при культивировании CD3+ клеток в течение 1 часа (график 1-2-3 на рис. 3 и рис. 4) и его снижение (более интенсивное при PC) при культивировании на протяжении 18 часов (график 1-4-5 на рис. 3 и рис. 4).

•^►—интактный вариант

(1,2,3) НВ"эктивированный вариант (1,4,5)

1=Ех vivo

2=1-часовая интактная культура

3=18-часовая интактная культура

4=1-часовая активированная культура 5=18-часовая активированная культура

Рисунок 3. Уровень экспрессии семафорина Sema4D/CD100 для интактных и активированных Т-лимфоцитов здоровых доноров (п=9) в культуре в зависимости от длительности культивирования; (Me). Pi-2—0,893, pi_3=0,008*, р2-з=0,225, рм=0,043*, р,.5=0,028*, Р4.5=0,068, Р2-4=0,043*, Рз.5=0,012»

' ф'-'Интактный вариант

(1,2,3) чя~ активированный вариант( 1,4,5)

1=Ех vivo

2=1-часовая интактная культура

3=18-часовая интактная культура

4=1-часовая активированная культура 5=18-часовая активированная культура

Рисунок 4. Уровень экспрессии семафорина Sema4D/CD100 для интактных и активированных Т-лимфоцитов пациентов с рассеянным склерозом (п=10) в культуре в зависимости от длительности культивирования; (Ме). р,.2=0,169, р 1-з=0,009*, р„=0,022*, рм=0,013*, р,.5=0,005*, р4.5=0,005*, р2-4=0,017*, Рз-5=0,005*

При РС в отличие от ЗД отмечен более значимый интервал снижения уровня экспрессии Sema4D/CD100 на мембране CD3+ клеток в условиях активации 18-часовых клеточных культур в сравнении с показателем 1-часовых клеточных культур (рис. 3 и рис. 4, график 4-5, р=0,007) и для 18-часовых клеточных культур в сравнении с показателем ex vivo (рис. 3 и рис. 4, график 1-5, р=0,000). При этом у пациентов с РС показатели уровня экспрессии Sema4D/CD100 на мембране CD3+ клеток были статистически значимо выше в сравнении с таковыми в группе ЗД на большинстве этапов культивирования (табл. 5).

Таблица 5

Сравнительные данные по уровню экспрессии 8ета4ШСОЮО для СЭЗ+ клеток при разной длительности культивирования в обследуемых _группах; Ме (Ь(3;11(3)__

Этапы культивирования Пациенты с рассеянным склерозом в стации ремиссии (п=10) Здоровые доноры (п=9) Р

Ex vivo CD100*B CD3* (MFI), у.е. 183,0 (114.0;235,0) 121,0 (93,7;139,0) 0,015*

Культивирование интактных Т-лимфоцитов (1 ч.) CD 100* в CD3* (MFI), у.е. 196,0(168,0:227,0) 119,0 (95,2:123,0) 0,010*

Культивирование интактных Т-лимфоцитов (18 ч.) CD 100* в CD3* (MFI), у.е. 237,5(181,0:276,0) 142,0 (111,0:152,0) 0,002*

Культивирование Т-лимфоцитов, активированных ФМА (1 ч.) CD 100* в CD3* (MFI), у.е. 260,5 (162,0:283,0) 137,0 (135,0:141,0) 0,020*

Культивирование Т-лимфоцитов, активированных ФМА (18 ч.) CD 100* в CD3* (MFI), у.е. 70,3 (41,0:79,4) 97,5 (91,5:109,5) 0,055

Уровень растворимого семафорина (sSema4D) в плазме крови и культуре фракционированных Т-лимфоцитов (CD3+ клеток) Уровень растворимого Sema4D (sSema4D) в плазме крови был повышен как у пациентов с PC (п=21) (р=0,012), так и отдельно у пациентов в стадии ремиссии (п=14) (р=0,031) и обострения (п=7) (р=0,018), в сравнении с группой ЗД (п=7) (рис. 5).

40,5*(2,3)

■ Пациенты с рассеянным склерозом в стадии ремиссии

■ Здоровые доноры

Плазма Супернатант Супернатант 18-часовой 18-часовой интактной активированной культуры

культуры

Рисунок 5. Уровень растворимого семафорина ($8ета40) в плазме крови и супернатантах клеточных культур у пациентов в стадии ремиссии РС и здоровых доноров; (Ме, нг/мл)

(1)- р<0,05 при сравнении уровня з8ета40 в супернатантах 18-часовой культуры интактных Т-лимфоцитов с его уровнем в плазме, критерий Вилкоксона

(2)- р<0,05 при сравнении уровня 8Бета40 в активированном и спонтанном варианте супернатанта 18-часовой клеточной культуры, критерий Вилкоксона

(3)- р<0,05 при сравнении уровня $8ета40 в активированном варианте супернатанта 18-часовой клеточной культуры с его уровнем в плазме, критерий Вилкоксона

*- р<0,05 в сравнении со здоровыми донорами, критерий Манна-Уитни

Однако отличий по уровню $8еша40 в плазме между группами пациентов, находящихся в стадии ремиссии (4,62 (2,92-5,88), п=14) и обострения (7,08 (3,37-9,63), п=7), выявлено не было (р=0,371). Не выявлено зависимости уровня БЗетаДО в плазме от клинических характеристик пациентов.

Уровень 58ета40 в супернатантах клеточных культур был оценен нами для пациентов в стадии ремиссии РС. У пациентов с РС (п=15) и ЗД (п=14) уровень з8ета40 в супернатантах 18-часовых клеточных культур (и активированного, и спонтанного вариантов) значимо возрастал в сравнении с его уровнем в плазме (рис. 5), преобладая при РС в активированном варианте супернатанта 18^часовых клеточных культур в сравнении со ЗД (рис. 5).

Нарастание уровня sSema4D в условиях культивирования у пациентов с PC согласуется с обнаруженным нами ранее повышенным уровнем экспрессии мембранного Sema4D (рис. 2): большие уровни мембранного семафорина должны, теоретически, приводить к более выраженному повышению sSema4D в условиях клеточной активации. Точно так же это согласуется с выявленным снижением у пациентов с PC уровня экспрессии Sema4D на мембране в ходе 18-часового культивирования лимфоцитов (рис. 4), учитывая данные о слущивании Sema4D с мембраны с переходом в растворимую форму [Wang X., Kumanogoh A., Watanabe С. et al., 2001].

Для пациентов в стадии ремиссии PC (п=14) отмечена обратная корреляция между уровнем sSema4D в плазме и продолжительностью болезни (R=-0,567, р=0,035), что согласуется с преобладанием воспалительного компонента (демиелинизации) на ранних этапах заболевания [Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2011].

Для группы пациентов с обострением PC (п=7) прослежена прямая корреляция между уровнем sSema4D в плазме и количеством контрасти-руемых очагов в головном мозге (R=0,900, р=0,037), что также представляется логичным с учетом усиления воспаления и демиелинизации в ЦНС в стадии обострения PC [Шмидт Т.Е., 2006].

Оценка экспрессии рецептора для Sema4D/CDl00 - CD72 - Ii-лимфоцитами (CD 19* клетками) пациентов с рассеянным склерозом в

стадии ремиссии Нами обнаружено значимое снижение процента С072-позитивных CD19+клеток у пациентов с PC в сравнении со ЗД (табл. 6).

Таблица 6

Доля B-лимфоцитов, несущих рецептор CD72, и показатели уровня

экспрессии CD72 в сравниваемых группах; Me (LQ;UQ)

Показатели Пациенты с рассеянным склерозом в стадии ремиссии Здоровые доноры Р

Доля B-лимфоцитов (CD19* клеток) в суспензии МПК (%) 17,3 (14,1;23,5) п=24 9,4(7,9,10,9) п=15 0,000*

Экспрессия CD72 в популяции CD 19* клеток Доля СЭ19+ клеток, несущих рецептор СБ72 (%) 43,7 (36,4,47,8) п=24 82,0 (72,0,83,0) п=13 0,000*

Уровень экспрессии СБ72 в популяции СБ19+ клеткок (у е.) 49,7 (40,7;77,2) п=20 68,9 (57,4,92,0) 11=15 0,121

Также у пациентов с РС значимо повышено процентное содержание В-лимфоцитов (% СБ19+ клеток) в периферической крови по сравнению с ЗД (табл. 6). Известно, что С072 является негативным регулятором функции В-клеток [А<1асЫ Т., Р1аБ\утке1 Н., Уакига Н. е! а1., 1998], а связывание 5ета40 с рецептором СБ72 отменяет негативное действие СБ72 на В-кле-точную активацию [Китапо£оЬ А., КНиКаш Н., 2004]. Таким образом, установленное ранее в нашем исследовании повышение уровня экспрессии семафорина 8еша4Б интактными Т-лимфоцитами в периферической крови пациентов с РС в сравнении со ЗД (рис. 2) также указывает на возможное участие семафорина в гиперактивации В-лимфоцитов у наших пациентов.

Синтез ключевых про- и противовоспалительных цитокинов В-лимфоцитами у пациентов в стадии ремиссии рассеянного

склероза

Нами исследован профиль цитокинов, синтезируемых В-лимфоцитами при их культивировании (48 ч.) в присутствии Т-клеток. В спонтанном варианте (в эксперименте без использования активатора клеток) В-клетки ЗД синтезируют значимо меньшие количества провоспалительных цитокинов, ТМ^-а и ЬТ-а, в сравнении с группой пациентов с РС (р=0,003 и р=0,00Г соответственно) и большее количество противовоспалительного цитокина 1Ь-10 (р=0,001) (табл. 7).

Таблица 7

Экспрессия цитокинов ТОТ-а, ЬТ-а, 1Ь-10 С019+клетками (процент цитокин-позитивных клеток в популяции) периферической крови в _сравниваемых группах; Ме (Ь<3;Ц(3)_

Показатели Пациенты с рассеянным склерозом в стадии ремиссии (п=М) Здоровые доноры (п=П)

Данные для клеточной культуры 48 ч. (спонтанный вариант) ТЫИ-а % 7,52 (6,0; 10,0) 2,3 (1,5;4,0)

ЬТ-а % 13,02 (9,0; 19,0) 4,0 (2,0;7,0)

1Ь-10 % 3,02 (2,5,4,0) 8,0 (5,0; 10,0)

Данные для клеточной культуры 48 ч. (активация ФМА+иономицин) ЮТ-а % 27,01'2 (20,0;36,0) 16,0' (14,0;24,0)

ЬТ-а % 43,0' (23,0;67,0) 30,0' (21,0,39,0)

1Ь-10 % 5,0' (3,0,7,0) 5,0 (2,2;25,0)

I- р<0,05 в сравнении со спонтанным вариантом

2- р<0,05 в сравнении со здоровыми донорами

Нами установлено изменение профиля всех исследуемых цитокинов, синтезируемых В-лимфоцитами, в условиях активирования клеток у пациентов с PC (табл. 7): увеличение процента В-клеток, содержащих исследуемые цитокины TNF-a (р=0,003), LT-a (р=0,003), IL-10 (р=0,040). Причем в активированном варианте процент клеток, несущих цитокин, преобладал у пациентов с PC только для одного провоспалительного цитокина — фактора некроза опухоли-альфа (р= 0,015).

В условиях блокады 8ета40-С072-сигнала также происходили изменения профиля цитокинов в сравнении со спонтанным вариантом без ингибитора у пациентов с PC: снижение процента В-клеток, продуцирующих TNF-a (р=0,004 при блокаде Sema4D и р=0,006 при блокаде CD72) и LT-a ( р=0,017 при блокаде Sema4D и р=0,004 при блокаде CD72 ) (рис. 6).

45

S

3"

s

£ 40 S

5

6

35 30

» ¡25

S

S 15

10 5 О

Данные без На фоне блокады На фоне блокады

ингибитора Sema4D CD72

Условия экспрессии цитокинов

KTNF-альфэ M LT-альфа IL-10

Рисунок 6. Изменение профиля цитокинов, продуцируемых CD 19* клетками, на фоне блокады Sema4D-CD72 сигнала у пациентов с рассеянным склерозом в стадии ремиссии.

Здесь: * - р<0,05 в сравнении с вариантом без применения ингибитора для соответствующего цитокина.

Это предполагает участие семафорина Sema4D в активации В-клеточ-ного звена при PC при взаимодействии с рецептором CD72, в индукции синтеза провоспалительных цитокинов. Что касается противовоспалительного цитокина IL-10, то увеличение доли В-клеток, продуцирующих данный цитоцин, происходило на фоне блокады Sema4D (р=0,008).

В целом, показанное в работе повышение экспрессии Sema4D в иммунной системе при PC позволяет предложить как минимум два механизма участия семафорина в патогенезе данного заболевания. С одной стороны, учитывая, что Sema4D способен вызывать апоптоз незрелых нейронов и олигодендроцитов [Giraudon P., Vincent P., Vuaillat С. et al., 2004], у пациен-

tob с PC он, по-видимому, оказывает непосредственное поражающее действие на нервные ткани, причем эффекты эти обеспечиваются как растворимым семафорином, проникающим через нарушенный при PC гематоэнце-фалический барьер, так и мембранным, за счет инфильтрации ЦНС Т-лимфоцитами и их активации в ответ на аутоантигены. С другой стороны, поскольку мембранный Sema4D может выступать не только в качестве ли-ганда, но и как рецептор, проводя сигнал в саму Т-клетку, причем сигнал костимулирующий [Kumanogoh А., Suzuki К., Ch'ng Е. et al., 2002], усиление его экспрессии при PC способствует, очевидно, повышенной активации Т-лимфоцитов, в том числе аутоспецифичных Т-клеток - как во вторичных лимфоидных органах, так и в ЦНС. На основании полученных в нашем исследовании данных можно представить роль семафорина Sema4D в иммунной системе в виде схемы (рис. 7).

Иммунная система здорового донора

Иммунная система пациента с рассеянным склерозом

Гиперактивация В-лимфоцитов Т синтеза провоспалительных цитокинов 4- синтеза противовоспалительных цитокинов

Рисунок 7. Гипотетическая схема воздействия семафорина 8ета40/С0100 на клетки иммунной системы здоровых доноров и пациентов с рассеянным склерозом.

_ Sema4D —

Т-лимфоцит (CD3*)

I

_ sSema4D

ВЫВОДЫ

1. Наивные пациенты с ремитгирующим типом течения рассеянного склероза характеризуются легкой степенью инвалидизации по шкале EDSS и умеренной скоростью прогрессирования заболевания, повышенным уровнем тревожности на уровне субклинической в сравнении со здоровыми донорами и не имеют отличий с данной группой по результатам когнитивного тестирования, при этом результаты нейропсихологического и когнитивного тестирования не различаются в стадии ремиссии и обострения, а нейровизу-лизационная активность заболевания преобладает при экзацербации рассеянного склероза.

2. Пациенты с ремитгирующим рассеянным склерозом как в стадию ремиссии, так и в стадию обострения имеют повышенный уровень экспрессии семафорина Sema4D/CD100 на мембране Т-лимфоцитов (CD3+CD4+/ CD3+CD8+ клеток) при оценке ex vivo, а также демонстрируют более интенсивное отщепление этой молекулы от мембраны в случае активации клеток в культуре (показано на примере пациентов в стадии ремиссии заболевания), что может иметь место in vivo при ответе Т-лимфоцитов на антиген как в иммунной системе, так и в центральной нервной системе при данной патологии.

3. Уровень растворимого семафорина (sSema4D) повышен в плазме крови у пациентов с ремитгирующим рассеянным склерозом как в стадии ремиссии, так и в стадии обострения, и более интенсивно возрастает в условиях активации клеток в культуре (показано на примере пациентов в стадии ремиссии заболевания).

4. У пациентов с ремитгирующим типом течения рассеянного склероза снижена экспрессия рецептора для Sema4D/CD100, CD72, на мембране В-лимфоцитов (CD19+ клеток) в стадии ремиссии, что, учитывая негативную роль молекулы CD72 в активации В-клеток, может быть одним из механизмов их гиперактивации при данной патологии.

5. Sema4D-CD72-3aBHCHMbiñ сигнал задействован в контроле продукции цитокинов В-лимфоцитами, индуцируя у пациентов в стадии ремиссии рассеянного склероза синтез провоспапительных цитокинов и препятствуя синтезу противовоспалительных цитокинов, что, учитывая интенсивную инфильтрацию В-клетками центральной нервной системы при данной патологии, по-видимому, вносит вклад в развитие нейровоспаления и демиелини-зацию нервных волокон.

6. Уровень экспрессии мембранной формы семафорина Sema4D/

+ + +

CD 100 и процент CD 100 клеток в субпопуляции CD3 СЕМ лимфоцитов ассоциирован со значением FS2 стволовых функций, а концентрация растворимого семафорина (sSema4D) в плазме крови имеет обратную корреляци-

онную связь с продолжительностью заболевания у пациентов с рассеянным склерозом в стадии ремиссии и прямую - с количеством контрастируемых очагов в головном мозге у пациентов с рассеянным склерозом в стадии обострения, что доказывает участие семафорина 8ета40/С0100 в патогенезе заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведенное комплексное фундаментальное исследование вовлеченности семафорина Sema4D/CD100 в патогенез ремитгирующего рассеянного склероза указывает на целесообразность использования этого маркера в качестве мишени при терапии данного заболевания и требует дальнейших исследований с применением соответствующих моноклональных антител.

2. При решении вопроса о применении aHTH-Sema4D-npenapaTOB (в перспективе) необходимо учитывать эффекты семафорина не только в центральной нервной системе, но и в иммунной системе пациентов с ремиттирующим рассеянным склерозом.

3. Врачам-неврологам, занимающимся лечением пациентов с ремиттирующим рассеянным склерозом, необходимо учитывать гиперактивацию В-клеточного звена иммунной системы данных пациентов для назначения адекватной патогенетической терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности экспрессии Т-лимфоцитами CD100 при ремиттирую-щем рассеянном склерозе / Е.М. Куклина, Т.В. Байдина, И.Ю. Данченко, И.В. Некрасова // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2012. - № 5 (42). - С. 50-52 (из перечня ВАК).

2. Экспрессия CD100/CD72 лимфоцитами периферической крови пациентов с рассеянным склерозом / Е.М. Куклина, Т.В. Байдина, И.Ю. Данченко и др. // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Том 7 (16), Номер 2-3, Апрель-Сентябрь. - С. 233 (из перечня ВАК).

3. Экспрессия семафорина CD100 на лимфоцитах периферической крови пациентов с ремиттирующим течением рассеянного склероза / Т.Н. Трушникова, Т.В. Байдина, И.Ю. Данченко и др. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, Рассеянный склероз, выпуск 2. - 2013. -Том 113, № 10. - С. 47-51 (из перечня ВАК).

4. Семафорин Sema4D в иммунной системе при рассеянном склерозе / Е.М. Куклина, Т.В. Байдина, И.Ю. Данченко, И.В. Некрасова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Том 157, № 2. - С. 198-201 (из перечня ВАК).

5. Куклина, Е.М. Исследование функций B-лимфоцитов, несвязанных с продукцией антител, при рассеянном склерозе / Е.М. Куклина, Т.В. Бай-дина, И.Ю. Данченко // Российский иммунологический журнал. - 2014. -Том 8 (17), № 3. - С. 545-547 (из перечня ВАК).

6. Уровень растворимого Sema4D у пациентов с рассеянным склерозом /Е.М. Куклина, И.В. Некрасова, И.Ю. Данченко и др. // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Том 8 (17), № 3. - С. 547-550 (из перечня ВАК).

7. Роль Sema4D/CD72-3aBHCMMoro сигнала в регуляции активности В-лимфоцитов при рассеянном склерозе / Е.М. Куклина, И.В. Некрасова, Т.В. Байдина, И.Ю. Данченко // Доклады академии наук. - 2014. - Т. 458, № 3. -С. 359-362 (из перечня ВАК).

8. Оценка значения экспрессии семафорина CD 100 лимфоцитами периферической крови и функции рецептора CD 72 в популяции С019+-клеток в стадию ремиссии при рассеянном склерозе / Т.В. Байдина, И.Ю. Данченко, Т.Н. Трушникова и др. // «Рассеянный склероз и другие аутоиммунные заболевания нервной системы», Материалы VI Сибирской межрегиональной научно-практической конференции. ГБОУ ВПО Новосибирский Государственный Медицинский Университет. РФ. - 2013. - С. 12-20.

9. Изучение экспрессии семафорина CD 100 на лимфоцитах периферической крови пациентов с рассеянным склерозом / И.Ю. Данченко, Т.Н. Трушникова, Е.М. Куклина, И.В. Некрасова // Научная сессия Пермской государственной медицинской академии имени академика Е.А. Вагнера, посвященная 90-летию со дня рождения профессора Я.С. Циммермана: сборник научных работ молодых ученых / ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России. Пермь. - 2013. - 139 с. - С. 36-39.

10. Вовлечение семафорина SEMA4D в демиелинизирующее поражение нервной системы / И.Ю. Данченко, Т.В. Байдина, Т.Н. Трушникова, Е.М. Куклина // «Практическая медицина», Неврология. Рассеянный склероз, специальный выпуск. - 2013. - № 1-1 (68) - С. 51-53.

11. Исследование семафорина CD 100 при ремитгирующем рассеянном склерозе / И.Ю. Данченко, Т.В. Байдина, Т.Н. Трушникова и др. // Нейроиммунология. - 2013. - Том XI, №1-2. - С. 43-44.

12. Features of Sema4D/CD72 expression in immune system in multiple sclerosis / E.M. Kuklina, T.V. Baidina, I. Y. Danchenko, I.V. Nekrasova // 15TH INTERNATIONAL CONGRESS OF IMMUNO-LOGY, MILAN, ITALY. BOOK OF ABSTRACTS. - 2013. - August 22-27. - P. 767.

13. Данченко, И.Ю. Семафорин Sema4D в стадию ремиссии и обострения при рассеянном склерозе / И.Ю. Данченко // «Неврология сегодня и завтра». «Кафедре неврологии и нейрохирургии Кировской государственной медицинской академии XXV лет». Сборник научно-исследовательских

работ Межрегиональной научной конференции неврологов, нейрохирургов, детских неврологов и психиатров. Киров. - 2014. - С. 34-40. 14. Данченко, И.Ю. Изучение иммунных взаимодействий CD100-CD72 при рассеянном склерозе / И.Ю. Данченко // Нейроиммунология. — 2015. — Том XII,№1-2.-С. 31-32.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЗД — здоровые доноры

МРТ — магнитно-резонансная томография

ПИТРС — препараты, изменяющие течение рассеянного склероза

PC — рассеянный склероз

ЦНС — центральная нервная система

CD — The Cluster of Differentiation, молекулы дифференцировки лимфоидных клеток

EDSS — Expanded Disability Status Scale, расширенная шкала инвалидизации Курцке

FAMS — Functional Assessment of Multiple Sclerosis, функциональная оценка

рассеянного склероза

IL — interleukin, интерлейкин

LT-a — lymphotoxin-alpha, лимфотоксин-альфа

MFI — Mean Fluorence Intencity, средняя интенсивность свечения

MFI-20 — Mutidimensional Fatigue Inventory, шкапа субъективной оценки астении

MSIS-29 — Multiple Sclerosis Impact Scale, шкапа влияния рассеянного склероза

PASAT-3 — Paced Auditory Serial Addition Test, слуховой трехсекундный тест на

сложение в заданном темпе

Sema4D — semaphorin, семафорин IV класса, известный также как CD 10 sSema4D — soluble Sema4D, растворимая форма семафорина Sema4 TNF-a — tumor necrosis factor-a, фактор некроза опухоли-альфа

ДАНЧЕНКО ИРИНА ЮРЬЕВНА

ОЦЕНКА ФУНКЦИИ СЕМАФОРИНА SEMA4D/CD100 И ЕГО РЕЦЕПТОРА CD72 ПРИ РЕМИТТИРУЮЩЕМ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ

14.01.11 - нервные болезни 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Автореферат напечатан по решению диссертационного совета Д 208.067.01 от 21.07.2015 ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России

Подписано в печать 21.07.2015 г. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Заказ № 7296. Тираж 100 экз.

Отпечатано в «ИД «Типография купца Тарасова», г. Пермь, ул. Пушкина, 27. Тел.: 212-44-53,212-94-96. E-mail: domtarasova@inbox.ru

2015673231

2015673231