Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль нейропептида галанина в регуляции памяти, обучения и и в патогенезе паркинсонического и эпилептического синдромов (экспериментальное исследование)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ

РГб ОД

- \ПР '9е]- На правах рукописи

I

СЕРВЕЦКИЙ КОНСТАНТИН ЛЕОНИДОВИЧ

РОЛЬ НЕЙРОПЕ1ГП1ДА ГАЛАНИНА В РЕГУЛЯЦИИ ПАМЯТИ, ОБУЧЕНИЯ И В ПАТОГЕНЕЗЕ ПАРКИНСОНИЧЕСКОГО И ЭПИЛЕПТИЧЕСКОГО СИНДРОМОВ

(Экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат •диссертации на соиасаяие ученой степени кандидата медицинских наук

- 1994

Работа выполнена на кафедрах нормальной физиологии и общей и клинической фармакологии Одесского медицинского института имени Н.И.Пирогова Ю Украины и в лаборатории общей патологии нервной системы Научно-исследовательского Института общей патологии и патофизиологии Российской АМН.

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор А.А.ШАНДРА,

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки и техники Украины В.И.КРЕСЮН

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук В.К.РЕШЕТНЯК доктор медицинских наук, профессор, член-корреспоадент Российской АМН И.В.ГАННУШШ

Ведущее учреждение

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится ",7/ " 1994 года в

Сов

часо!

на заседании специализированного совета шифр Д 001.03.01 при научно-исследовательском .институте общей патологии и патологическо* физиологи}! РАМН (125315, Москва, ул. Балтшкжая, 8).

к I» ,

-илртк 1994 года, ся

Автореферат разослан С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ■ медицинских наук

Л. Н. Скуратове«

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время важную роль в механизмах регуляции физиологических функций (вегетативные функции, память и обучение, сон-бодрствование4и др.), а также в развитии невропатологических синдромов (эпилепсия, паркинсонизм и др.), отводят эндогенным биоактивным пептидам (Olson А. et al., 1987, 1989; Ungar D., 1975; Wied R., 1988), осуществляющим влияние на активность классических нейромедиаторных систем (Hokfelt Т. et -ai., 1987) и/или непосредственно играющих роль нейромедиаторов. Предпосылкой к исследованию влияния биоактивных пептидов на деятельность ЦНС в условиях нормы и патологии является их идентификация в структурах ЦНС, а также специфических областей связывания (рецепторов) для них.

Открытый в 1983 году и впоследствие идентифицированный в ЦНС разных видов животных галанин стал объектом интенсивных исследований в плане его влияний на физиологические функции (Tatemöto К. et al., 1983; Fort J.E. et al., 1986; Bartfal T. et al., 1*992). Сосуществование галанина с ацетилхолином в специфических путях головного мозга, связанных с памятью и обучением, стало, в частности, предпосылкой для исследования вовлечения пептида в регуляции памяти и обучения (Crawely J.N., Wenk Ö.L., 1989; Bartfai Т. et al., 1992). Галанин оказывает тормозное влияние на процессы памяти и обучения, подавляя активность холинергической системы мозга, которая, как известно, играет важную роль в механизмах указанных физиологических функций (Бо-родкин B.C., Зайцев Ю.'в., 1987; Arrendash G. et al., 1989).

Сосуществование галанина с классическими нейротрансмиттерами, его широкая представленность в ЦНС, также как и наличие специфических областей связывания для пептида (Scotfitsch Q., Jacobowitz D.J., 1985; Scotfitsch G. et al., 1986; Land Т., 1989), предполагают его участие в регуляции и других функций ЦНС, вовлечение в другие нейро-патологические синдроми. Вместе с тем, подобные исследования как экспериментального, так и клинического характера, отсутствуют.

К числу нейропатологических синдромов, механизмы которых, с одной стороны, тесно связаны с нарушением интегративной деятельности мозга, а с другой, отражают в модельном плане комплексные механизмы взаимодействия структур ЦНС и различных нейромедиаторных/нейромоду-ляторных систем, относятся эпилептический и паркинсонический синдромы (Lee R.Ö., 1907; Majkowski J., 1989; Javoy-Agid F. et al., 1990).

■Изучение участия галанина и связанных с ним пептидов (активных фрагментов, производных) в указанных синдромах может внести вклад как в понимание новых закономерностей механизмов возникновения, течения и контроля этих нарушений, так и в понимание универсальных механизмов деятельности ЦНС в условиях патологии.

Цель работы. Исследование роли галанина в процессах 'обучения и памяти, а также в развитии эпилептического и паркинсонического синдромов, на экспериментальных моделях.

Основные задачи-исследования.

1. Изучить влияние галанина на процессы обучения и памяти.в условиях активного и пассивного избегания с отрицательным подкреплением, а также механизмы осуществления указанных эффектов с применением антагонистов классических нейромедиаторных систем.

2. Изучить влияние галанина на экспериментальные паркинсоничес-кие синдромы, вызываемые введением в хвостатые ядра крыс каиновой кислоты, системным применением резерпина и введением 6-ГДА в черную субстанцию, а также механизмы осуществления этих эффектов с применением антагонистов классических нейромедиаторных систем.

3. Изучить влияние галанина на судорожный киндлинг-синдром на различных стадиях формирования эпилептической активности и произвести поиск структур, вовлеченных в реализацию указанного эффекта галанина.

4. Выявить зависимость между структурой молекулы галанина и его активностью в условиях киндлинга с применением фрагментов молекулы пептида и его производных.

Научная новизна исследований. Впервые показано, что галанин угнетал процессы обучения и памяти в условиях тестов активного и пассивного избегания с отрицательным подкреплением. Проведенный нейро-фармакологический анализ позволил сделать вывод о вовлечении хсши-иергической, опиатергической систем и системы возбуждающих аминокислот в амнестические эффекты галанина.- Впервые показано, что внут-ристриарное введение галанина потенцирует проявления экспериментального паркинсонического синдрома, изучены и нейрофармакологичесте механизмы реализации пропаркиноонических эффектов галанина. Впервые

показано противосудорожное действие галанина в условиях фармакологического киндлинга, доказана ключевая роль гиппокампа в осуществлении противосудорожных эффектов пептида. Проведено исследование корреляции между структурой молекулы галанина и его антиконвульсивным эффектом.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные являются полезными для понимания участия пептидергических систем . ЦНС в регуляции ее деятельности в условиях нормы и патологии, механизмов центральных эффектов биоактивных пептидов, в частности, в регуляции мнестических функций, развитии и прекращении паркинсоничес-кого и эпилептического синдромов. Данные, полученные в настоящей работе, являются перспективными для разработки новых подходов и мето-, дов рационального и патогенетического лечения ряда заболеваний ЦНС (деменции при различных заболеваниях, паркинсонизма, эпилепсии) с применением активных производных галанина в качестве лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Введение галанина в Соковые желудочки мозга нарушает процессы обучения и памяти в тестах пассивного и активного избегания. В основе указанных эффектов галанина лежит его взаимодействие с центральными холинергической, опиатергической и глутамат/аспартатерги-ческой системами.

2. Введение галанина в хвостатые ядра крыс потенцировало поведенческие проявления паркинсонического синдрома, вызванного внут-ристриарным введением каиновой кислоты. Указанное действие галанина реализуется через активацию глутамат/аспартатреактивной, опиатергической и блокаду холинергической систем стриатума.

3. Введение галанина в структуры головного мозга оказывало противосудорожное действие в условиях пикротоксинового киндлинга. Ключевой структурой в реализации указанного эффекта галанина является центральный гиппокамп.

4. Необходимым и достаточным фрагментом галанина для осуществления его противосудорожного действия является С-концевой Фрагмент галанина 1-16.

5. Противоэпилептическоэ действие галанина блокировалось пред варительным введением антагониста галаниновых рецепторов М35.

Апробация работы. Результаты диссертации представлены на XX Международном конгрессе по эпилепсии (Норвегия, Осло, 1993), межлабораторной конференции лаборатории общей патологии нервной системы и лаборатории боли НИИ общей патологии и патологической физиологии РАМН (Москва, 1993), европейском конгрессе по деменции и депрессии (Австрия, Грац, 1994).

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов. Общий объем диссертации составляет 162 страницах машинописного текста, фактические данные иллюстрированы 30 рисунками и 4 таблицами. Указатель литературы.включает 179 источников, из них 157 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 200-300 г в условиях хронического эксперимента. Операционную подготовку животных и стереотаксические операции проводили согласно методикам, описанным в литературе (Буреш Я. и соавт., 1982). Послеоперационный период составлял 7-14 дней. Внутримозговые введения осуществляли в условиях свободного поведения при помощи ыикроинъек-тора. Животным контрольных групп вводили соответствующие растворители. Препараты вводили в объеме 2 мкл, со скоростью 0,5 мкл/мин.

Пассивное и активное избегание исследовали в звуко- и светоизо-лированной комнате в период времени между 12.00 и 16.00 ч. Для исследования активного избегания применяли методику избегания прыжком, используя стандартную аппаратуру, описанную в литературе (Буреш Я. и соавт., 1982). До начала обучения животных помещали в камеру на 2 мин. На следующий день животных вновь помещали в камеру, после чего наносили удар электрическим током (при помощи электростимулятора ЭСУ-2) частотой 50 Гц и длительностью импульсов 0,5 с, силой 1 мА, в течение 2 с. Удары током осуществляли 10 раз - в начале каждой минуты в течение 10 мин. Условным раздражителем служил свет электролампы мощностью 10 Вт, подаваемый за 5 с до нанесения безусловного раздражителя. Обучений животных по описанной методике проводили в течение

3 дней и сразу после обучения на 3-й день производили микрокнъекции пептидов. Далее исследовали характер сопротивления угасания условного рефлекса, для чего животных помещали в камеру сразу после микроинъекции (0 ч). затем через 3, 6 и 24 ч после введения пептидов и предъявляли условный стимул, не сопровождавшийся безусловным. Определяли число избеганий в ответ на 10 последовательных предъявлений условного стимула.

Исследование пассивного избегания осуществляли согласно описанным методикам с использованием стандартной аппаратуры (Буреш Я. и соавт., 1982). Перед началом обучения животных помещали внутрь камеры на 2 мин.' Затем животных размещали на освещенной площадке мордой от входа в камеру и регистрировали время захода в камеру. Максимальное время наблюдения составляло 300 с. После захода животных в камеру вход закрывали. Обучение производили в течение 2 дней (1-й день -2 раза, 2-й - 1 раз). Сразу после 3 сеанса обучения животным после входа в камеру наносили удар электрическим током (при помощи электростимулятора ЭСУ-2) частотой 5 Гц и длительностью импульсов 0,5 с, силой 0,4 мА, затем животных извлекали и производили инъекции препаратов. Животных тестировали через 24 и 48 ч после удара током, регистрируя время захода в камеру.

Для воспроизведения экспериментального паркинсонического синдрома использовали модель, предложенную Г.Н.Крыжановским и соавт. (1987). Через предварительно имплантированные проводящие канюли крысам билатерально в хвостатые ядра веодили раствор каиновой кислоты (Sigma, США) в дозе 100 нг (в отдельных опытах - 20 нг) в каждум структуру в 2 мкл раствора фосфатного буфера (рН-7,4). Раствор каиновой кислоты готовился непосредственно перед введением. Тестирование поведенческих изменений осуществляли непосредственно перед введением каиновой кислоты (контрольное наблюдение, обозначено далее как О ч), через 3 и 24 ч после микроинъекции. Регистрировали следующие показатели: инициация движения в "открытом поле", число пересеченных квадратов и вертикальных стоек в "открытом поле" за 2 мил наблюдения; мышечная ригидность; птоз. Оценку поведенческих наруше 1шй производили по принятым методикам. Микроинъекции галанина производили через 20 мин после введения каиновой кислоты в хвостатые ядра, в места предварительного введения каината.

В отдельных сериях опытов паркинсонический синдром воспроизводили трехкратным (1 раз в день) введением резерпина (Sigma, США) в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно (Буреш Я. и соавт.. 1982), либо введением введением 6-гвдрооксидофамина в чернуэ субстанцию (Johnsson G; et al., 1975; Bures J. et al., 1982; Longo V., 1983). Поведенческую оценку производили по описанной выше методике.

Блокаторы различных нейромедиаторов ЦНО вводили внутрибрюшинно за 20 мин до микроинъекции галанина. Применяли следующие препараты: антагонист М-холинорецепторов атропин, в дозе 1 мг/кг; антагонист возбуждаювдх аминокислот кетамин, в дозе 5 мг/кг; опиатный антагонист налоксон, в дозе 1 мг/кг. Животным соответствующих контрольных групп вводили 0,9 % раствор хлорида натрия (в контроле к налоксону -налоксон-плацебо).

Для осуществления киндлинга использовали методику, описанную ранее (Крыжановский Г.Н. и соавт., 1989; Мазарати A.M., 1990). Кинд-линг осуществляли при помощи 20 ежедневных однократных внутркбрюшинных введений пикротоксина (Sigma, США) первоначально в субконвульсивной дозе (1,5.мг/кг). Интенсивность судорог оценивали по принятой ординарной шкале (Крыжановский Г.Н. и соавт., 1989). Определяли число животных с судорожными проявлениями различных стадий судорожного синдрома. На следующий день после окончания формирования киндлинга животным по описанной выше методике имплантировали проводящие канюли в одну из мозговых структур. Через 7-10 дней после операций крысам вводили пикротоксин в дозе 1,5 мг/кг (контрольное введение). Через 24 ч животным производили микроинъекции препаратов и через 10-15 мин вновь вводили пикротоксин, регистрируя интенсивность судорожных проявлений. Крыс наблюдали в индивидуальных камерах размером 25x25 см в течение 6 мин после введения пикротоксина. С целью изучения влияния препаратов на развитие судорожного синдрома интактным крысам имплантировали в боковые желудочки мозга канюли и по окончании послеоперационного периода осуществляли повторные введения пикротоксина в дозе 1,5 мг/кг. Микроинъекции галанина осуществляли на 7-й, 15-й и 20-й дни киндлинга через 3 ч после внутрибрюшинной инъекции пикротоксина с последующим (через 24 ч после микроинъекции пептида) тестированием интенсивности судорожных реакций. Для изучения влияния галанина на сформированную в процессе киндлинга повышенную судорожную готовность крысам по окончании осуществления киндлинга имплантировали в боковые

желудочки мозга канюли. Через 7-10 дней производили микроинъекцию галанина, которую повторяли через 5 суток. Тестирующее введение пик-ротоксина осуществляли еще через 30 суток. По окончании экспериментов животных забивали передозировкой нембутала (100 мг/кг). Через проводящие канюли вводили 2 мкл раствора метиленового синего, мозг извлекали,замораживали и готовили фронтальные срезы толщиной 0,5 мм. Зоны микроинъекций сопоставляли с фотографиями соответствующих срезов из атласа Paxinos and Watson (1982). В дальнейшем учитывали результаты лишь для тех животных, у которых зоны введений соответствовали задаче эксперимента.

Все полученные результаты обрабатывали с помощью общепринятых в медико-биологических исследованиях методов статистического анализа при помощи персонального компьютера IBM PC/AT (Оливетти, Италия). Использовали следующие тесты: для интервальных шкал - 1-вариантнуы АНОВу с пост-хок тестом Ньюмана-Кулза, для ординарных шкал - ранговый метод Вилкоксона, тест Крушкалл-Валлиса с пост-хок тестом Манн-Уитни. Статистическую обработку осуществляли с помощью стандартных пакетов программ "Статистическая аналитическая система" (SAS, США), "Primer Biostatistics" (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

1. Влияние галанина на процессы памяти и обучения.

1.1. Влияние галанина на пассивное избегание. По окончании обучения без подачи электрического тока животные заходили в камеру через 5-30 с после размещения их у входа. При размещении у входа в камеру через 24 ч после подачи электрического тока животные контрольной группы осуществляли заход в течение 140-200 с после начала тестирования. Внутрижелудочковое введение галанина в дозе 200 нг не оказывало достоверного влияния на показатель пассивного избегания (Р>0,05). Аналогичное применение пептида в дозе 500 нг приводило к достоверному сокращению времени захода крыс в камеру, то есть к нарушению процесса извлечения навыка. Исследование характера поведения у животных через 24 ч после введения галанина в дозе 1000 нг не показало существенных отличий от исследуемого показателя у животных контрольной группы (Р>0,05). Локальное введение галанина билатераль но в вентральный гиппокамп в дозах 50 и 100 нг/сторону (но не 20 нг)

вызывало достоверное ухудшение памяти, выражавшееся в сокращении срока захода в камеру после удара электротоком; Таким образом, проведенные исследования показали, что внутрижелудочковое введение га-ланина вызывало доза-зависимое ухудшение- памяти в тесте пассивного избегания: введение пептида в дозах 200 и 1000 нг не влияло на поведение животных, в то время, как введение галанина в дозе 500 нг вызывало достоверное сокращение латентного периода захода в камеру. Причем, в реализации амнестических эффектов галанина в условиях пассивного избегания важную роль играет вентральный гиппокамп.

1.2. Влияние антагонистов некоторых нейромедиаторных систем ДНС на эффекты галанина в тесте пассивного избегания. В условиях внут-рибрюшинного введения атропина и внутрижелудочкового 0,9 Z раствора хлорида натрия после размещения крыс у входа в камеру через 24 ч после инъекций, Бремя захода было достоверно меньше, чем у животных контрольной группы (Р<0,05). После внутрижелудочкового введения галанина в дозе 50 нг на фоне внутрибрюшинного применения 0,9 X раствора хлорида натрия среднее значение изучавшегося показателя было также достоверно меньше, чем в контроле (Р<0,05). В условиях внутрибрюшинного введения атропина и внутрижелудочкового г.аланина время захода в камеру было достоверно меньше, чем у крыс контрольной группы, а также животных только с внутрибрюшинным введением атропина или микроинъекцией галанина (Р<0,05). Тестирование через 24 ч после удара электротоком и внутрибрюшинным введением налоксона с последующей внутрижелудочковой микроинъекцией 0,9 % раствора хлорида натрия свидетельствовало о том, что показатели избегания у животных этой группы не отличались от таковых контроля (с введением налоксона налоксо-на-плацебо, Р>0,05). В условиях внутрижелудочковой микроинъекции галанина на фоне внутрибрюшинного введения налсксона-плацебо время захода животных в камеру было достоверно метшим, чем у крыс контрольной группы (Р<0,05). После внутрибрюшинного введения налоксона И внутрижелудочковой микроинъекции галанина изучавшийся показатель был достоверно меньше, чем в контроле (Р<0,05), не отличаясь от такового у крыс с внутрижелудочковым введением галанина на фоне применения налоксона-плацебо (Р>0,05). Внутрибрюшинное введение кетамина в сочетании с внутрижелудочковой микроинъекцией 0,9 % раствора хлорида натрия не оказывало существенного влияния на характер пассивного избегания (Р>0,05). Внутрижелудочковое применение галанина на фоне

предварительного введения кетамина также не оказывало существенного влияния на изучавшиеся показатели (Р>0,05). Таким образом, проведенные исследования показали, что применение М-холинолитика атропина вызывало ухудшение обучения животных в тесте пассивного избегания и потенцировало амнестический эффект галанина. Опиатный антагонист на-локсон не влиял на характер поведения животных в тесте пассивного избегания также, как и на галанин-индуцированное ухудшение памяти в этом тесте. Неконкурентный антагонист возбуждающих аминокислот кета-мин, не оказывая влияния на процесс обучения животных, блокировал амнестическое действие галанина.

1.3. Влияние галанина на активное избегание. После окончания периода обучения активному избеганию у животных всех групп не было отмечено существенных различий в характере ответной реакции на предъявление условного стимула: крысы демонстрировали избегание в 8-10 из 10 последовательных попыток. Тестирование животных контрольной группы (внутрижелудочковое введение 0,9 X раствора NaCl), крыс с введением в боковой желудочек мозга галанина в дозе 200 нг (8 крыс), 500 нг (11 крыс) и 1000 нг (13 крыс) непосредственно после внутри-мозговых инъекций не выявило-различий в поведении крыс разных групп; характер ответной реакции соответствовал таковому до введения пептида (Р>0,05). В условиях повторного тестирования животных через 3 ч после микроинъекций показало, что животные после внутрижелудочкового введения галанина в дозах 500 и 1000 нг демонстрировали избегание в значительно меньшем числе попыток, чем крысы контрольной группы и группы с введением пептида в дозе 200 нг (Р<0,05). Исследование характера поведения животных через б ч после введений показало достоверное снижение числа избеганий у животных всех 3-х экспериментальных групп по сравнению с контролем. Указанные особенности поведения животных контрольной и опытных групп наблюдались также и через 24 ч после применения галанина. Также были исследованы особенности поведения животных в тесте активного избегания в условиях введения разных доз галанина в гиппокамп. Локальная микроинъекция галанина в вентральный гиппокамп в дозах 20, 50 и 100 нг вызывала достоверное снижение числа успешных избеганий, начиная с тестирования через 3 ч после введения пептида (Р<0,05 по сравнению с контролем). Таким образом, проведенные исследования показали, что внутрижелудочковое, а также внутригиппокампальное введение галанина, вызывало доза-незави-

симое ускорение угасания условного рефлекса в тесте активного избегания.

1.4. Влияние антагонистов некоторых нейромедиаторных систем ЦНС на эффекты гаяанина в тесте активного избегания. Внутрибрюшинное введение атропина в дозе 1 мг/кг, также как и внутрижелудочковая микроинъекция галанина, вызывала достоверное снижение числа успешных избеганий, начиная с тестирования через 3 ч после введения препаратов. В условиях совместного введения галанина и атропина достоверное снижеиие числа избеганий наблюдалось, начиная уже с первого тестирования (непосредственно после введений препаратов). При последующих тестированиях снижение числа избеганий отмечалось у животных всех групп (контроль, введение атропина, галанина), однако, наиболее значительное снижение числа избеганий наблюдалось у крыс с совместным применением галанина и атропина (Р<0,05). Применение налоксона (1 мг/кг) или кетамина (10 мг/кг) не оказывало существенного влияния на характер активного избегания животных по сравнению с контролем (Р>0,05). Применение налоксона блокировало амнестическое действие галанина в условиях активного избегания. Галанин-вызванные изменения поведения животных в указанном тесте не изменялись в условиях предварительного применения кетамина.

В целом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что введение галанина в ликворную систему ь бывает ухудшение процессов обучения и памяти в тестах пассивного и активного избегания. Указанный эффект галанина опосредован, по-видимому, его действием на структуры вентрального гиппокампа. Описанный выше нейрофармакологи-ческий анализ амнестического действия галанина позволяет Баюпочить, что в реализации данного эффекта нейропептида участвует его компрометирующей действие на ацетилхолинергическую систему мозга (опыты с потенцированием эффектов атропина). Амнестические эффекты галанина в тесте пассивного избегания могут быть обусловлены также и его блокирующим действием на систему возбуждающих аминокислот, но не на опи-атергические механизмы систем моага (опыты о налоксоном и кетами-ном). В то же время, амнестическое действие галанина на память в тесте активного избегания может быть связано с его угнетающим действием на опиатергическую систему, но не на медиаторную систему возбуждающих аминокислот.

Таким образом, в разных моделях памяти и обучения галанин ока-

ойЁал амнестическое действие. Общим для обеих поведенческих тестов было его возможное влияние через структуры вентрального гиппокампа и вовлечение в указанный эффект угнетения ацетилхолинергической системы мозга. Различия, показанные в наших исследованиях, в эффектах га-ланина для пассивного и активного избегания обусловлены участием в этих эффектах аспартат/глутачатергических или опиоидных пептидерги-ческих систем мозга. Указанное может быть связано с тем, что каждая из двух применявшихся моделей отражает различные процессы в обучении и памяти, в частности, пассивное избегание является экспериментальной моделью обучения, а активное избегание (точнее, угашение последнего, применявшееся нами) - моделью извлечения навыка (Еуреш Я. и

соавт., 1982; Wied de D., 1988). Таким "образом, на разных этапах

»

процессов памяти и обучения в реализацию эффектов галанина могут включаться различные нейромедиаторные системы. Данное соответствуют современным представлениям об участии галанина в контроле процессов обучения и памяти, об основных нейрофармакологических механизмах реализации действия галанина (Crawely J.N., Wenk G.L., 1989; Mastropaolo J. et al., 1989; Bartfai T. et al.,' 1992; Givens B.S. et al., 1992). Следует, однако, отметить, что ранее не было показано взаимодействие галанина с нейромедиаторной системой возбуждающих аминокислот. „

2. Влияние галанина па экспериментальные нейропатологические синдромы.

2.1. Эффекты галанина на ларкинсонический синдром, вызванный введением в хвостатые ядра крыс каиновой кислоты. Внутристриарное введение крысам каиновой кислоты в дозе 100 нг/сторону вызывало через 3 ч микроиъекции развитие поведенческих нарушений, характерных для паркинсонического синдрома - увеличение времени инициации движения в "открытом поле", снижение числа пересеченных квадратов и вертикальных стоек "открытого поля", появления горбатости и птоза. Аналогичное применение каиновой кислоты в дозе 20 Иг/сторону не оказывало влияния на поведение животных в использованных тестах. Внутристриарное введение галанина (2, 10, 50 нг) вызывало доза-зависимое снижение показателей двигательной "активности (числа пересеченных квадратов и вертикальных стоек в "открытом поле"), но существенно не влияло на инициацию движения, горбатость и птоз. Совместное введение в хвостатые ядра каиновой кислоты в неэффективной дозе (20 нг) и га-.

ланина в трех указанных дозах приводило к развитию упомянутых поведенческих нарушений, выраженность которых возрастала в зависимости от применявшейся дозы галанина: при введении галанина в дозе 2 нг отмечалось снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности в "открытом поле"; в дозе 10 нг, кроме указанных нарушений, регистровалось также увеличение показателя горбатости; в дозе 50 нг - отмечалось увеличение инициации движения, появление птоза.

2.2. Влияние антагонистов некоторых нейромедиаторных систем мозга на галанин-вызванное потенцирование поведенчисеких эффектов внутристриарного введения каиновой кислоты. Внутрибрюшинное введение атропина (1 мг/кг) не оказывало существенного влияния на поведенческие нарушения, вызванные внутристриарной инъекцией каиновой кислоты (Р>0,05 по сравнению с животными с введением каиновой кислоты в хвостатые ядра) и предотвращало галанин-вызванное (50 нг) снижение спонтанной двигательной активности в "открытом поле" (Р<0,05). В условиях совместного применения галанина (50.нг) и каиновой кислоты (20 нг) предварительное введение атропина предотвращало лишь снижение числа пересеченных квадратов и вертикальных стоек, не влияя на увеличение времени инциации движения, птоз и горбатость. Налоксон в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно предотвращал поведенческие нарушения, вызванные внутристриарным введением каиновой кислоты, как снижение горизонтальной и и вертикальной двигательной активности в "открытом поле", развитие птоза и горбатости, не влияя на каинайг-вызванное увеличение времени инициации движения. Введение в хвостатые ядра галанина (50 нг) в условиях предварительного введения^налоксона не оказывало существенного влияния на показатели двигательной активности в "открытом полем". Применение налоксона в условия ¡с совместного внутристрианого введения каиновой кислоты и галанина также блокировало (либо задерживало во времени) . развитие паркинсоноподобных поведенческих нарушений. Применение кетамина *(10 мг/кг) не влияло на галанин-индуцированное снижение двигательной активности в "открытом поле". Кетамин также не влиял на Срадикинетические нарушения в "открытом поле", вызванные применением каиновой кислоты, однако, предотвращал увеличение мышечного тонуса и возникновение птоза. Применение кетамина, не влияя существенно на снижение двигательной активности, вызванное совместным йнутристрианым введением каиновой кислоты и галанина, блокировало,-вместе с тем, увеличение времени инициации движения, .появление горбатости и птоза.

Таким образом, в проведенных исследованиях было показано, что галанин при введении в_хвостатые ядра доза-зависимо потенцировал поведенческие проявления паркинсонического- синдрома, вызванного внут-ристриарным введением каиновой кислоты.' Ранее также было показано, что активация гапанинергических механизмов мозга может играть важную роль в патогенезе мнестических нарушений при паркинсонизме. Исходя из настоящих исследований, можно сделать вывод о том, что указанный механизм может правомерно участвовать в формировании двигательных нарушений в условиях паркинсонического синдрома.

Проведенные исследования с применением антагонистов холинерги-ческой (атропин), опиатергической (лалоксон) и глутамат/аспартатер-гической (кетамин) медиаторных систем мозга показали, что каждый из них оказывал блокирующее действие на развитие определенных поведенческих нарушений, возникающих в условиях внутристриарного введения каиновой кислоты, галанина,.а также их комбинаций. Таким образом, в механизмы потенцирования галанином поведенческих проявлений каи-нат-индуцированного паркинсонического синдрома могут быть вовлечены холинергическая, глутаматреактивная и опиоидная пептидергические системы стриатума. Галанин при его внутристриарном введении не оказывал существннного влияния на поведенческие нарушения, возникавшие в условиях системного применения резерпина, а также введения в компактную часть черной субстанции 6-гидроксидофамина.

2.3. Влияние галанина на судорожный синдром при пикротоксиновом киндлинге. Введение галанина в боковые желудочки мозга (500, 1000, 2000 нг) доза-зависимо снижало . интенсивность судорожных реакций, вызванных введением пикротоксина животным,' подвергнутым предварительно пикротоксиновому клндлннгу. Локальная микроинъекция галанина в различные структуры мозга (хвостатые ядра, ретикулярную часть черной субстанции, прилежащее ядро) в различных дозах (50, 100, 500 нг) приводило к достоверному снижению интенсивности судорожных реакций, вызванных применением пироктоксина у крыс, подвергнутых предварительно пшфотоксиновому киндлингу. В то же время, аналогичное введение галанина в вентральный гиппокамп оказывало противосудорожное действие во всех трех применявшихся дозах. Полученные данные могут быть объяснены тем, что антиконвульсивный доза-зависимый эффект галанина в условиях его введения носит неспецифический (фармакологический) характер; напротив, доза-независимое противосудорожное дейс-

твие галанина после его введения в вентральный гиппокамп может быть интерпретировано как специфическо-физиологические. Таким образом, противосудорожноё действие галанина в условиях киндлинга обусловлено, главным образом, его прямым угнетающим влиянием на структуры вентрального гиппокампа, гиперактивация которого является ведущим механизмом фармакологического'киндлинга (Крыжановский Г.Н. и соавт., 1985; Шандра A.A., 1986). Полученные нами данные соответствуют представлениям о гиппокампе, как ключевой структуре для физиологических эффектов галанина, в частности, его амнестического действия. Следует подчеркнуть, что киндлинг является не только моделью зпилеп-тогенеза, но и памяти, обучения (Majkowski J., 1986, 1989). С этих позиций описанные эффекты галанина могут быть интерпретированы, как амнестические, что согласуется с приведенными выше данными.

Антиконвульсивный -эффект галанина проявляется также в условиях развития киндлинга при повторном введении пептида. Таким ' образом, г ал алии оказывает антиэпилептическое действие не только в условиях сформированной эпилептической активности (аналога памяти), но также ее формирования (аналога обучения). В то же время, галанин не влиял на состояние повышенной судорожной готовности, сформированной в процессе киндлинга. ...

В проведенных исследованиях было также показано, что антиконвульсивным эффектом обладал не только галанин крысы, но также и пептид с химической структурой, идентифицированной для свиньи и быка. То есть, противосудорожноё действие галанина не зависит от его ви-доспецифических структурных особенностей.

С целью идентификации активного в противосудорожном отношении фрагмента галанина было изучено влияние на судорожный киндлинг-синд-ром различных фрагментов пептида. Противосудорожными свойствами обладал фрагмент галанина 1-16, в то время, как другие исследовавшиеся фрагменты (5-16, 9-16, 21-29) не оказывали влияния на судорожный киндлинг-синдром. Следует отметить, что фрагмент 1-16. является полным агонистом галаниновых рецепторов, необходимым и достаточным для реализации эффектов галанина in vivo и in vitro (Bartfai Т. et al., ■ 1992).

Таким образом, противосудорожноё действие галанина в условиях киндлинга является, по-видимому, рецептор-обусловленным и специфическим, а не результатом неспецифических (метаболических и др.) вли-

яний. Подтверждением этого предположения явились опыты с применением селективного антагониста галаниновых рецепторов - химерного пептида М35. Введение последнего в боковые желудочки мозга в дозе 0,3 нмоля (эквимолярно эффективной противосудорожной дозе галанина) оказывало доза-зависимое проэпилептическое действие в условиях пикротоксиново-_ го киндлинга, а также блокировало противосудорожное действие галанина (100 нг), введенного в вентральный гиппокамп. Полученные данные свидетельствуют о перспективности клинического применения селективных агонистов галаниновых рецепторов в качестве возможных антикон-вульсантов.

В целом, проведенные исследования позволяют рассматривать гала-нин (или его антагонистов) как перспективное соединение для создания и разработки нового класса»лекарственных веществ для коррекции различных расстройств ЦНС (нарушения памяти, паркинсонизм, эпилепсия).

ВЫВОДЫ

1. Внутрижелудочковое введение крысам галанина 1-29 вызывает ухудшение извлечения приобретенного навыка з тесте активного избегания .и обучения в тесте пассивного избегания. Указанные эффекты галанина обусловлены его угнетающим влиянием на холйнергическую и/или активирующим - на опиатергическую нейромедиаторные системы.

2. Галанин, введенный в стриатум, доза-зависимо потенцирует эффекты внутристриарного введения каиновой кислоты в индукции пар-кинсонического синдрома у крыс. Пропаргашсонический эффект галанина обусловлен его активирующим влиянием на опиатергическуе и глута-мат/аспартатергическую медиаторные системы, связанные со стрлатумом. Галанин не. влияет на" выраженность паркинсонического сг-ндрома, выз- • ванного введением в черную субстанцию крыс 6-ГДЛ, " а также системным применением резерпина.

3. Галанин 1-29 оказывает противосудорожное действа в условиях киндлинг-индуцированного зпилептогенеза. Указанный эффект гадаяина ' реализуется, главным образом, через его влияние яа структуры гилпо-кампа, а также на ряд других структур головного мозга (хвостато© ядро, прилежащее ядро, черная субстанция).

4. Протйвосудорожный эффект галигкка а условиях ' га;нд.*шмга ле зависит от его видовой принадлежности.

5. Активным фрагментом галанина, обладающим противосудорожными свойствами, является галанин 1-16. Другие фрагменты молекулы пептида (5-16, 9-16, 21-29) не влияют на выраженность судорожного кинд-линг-синдрома.

6. Селективный антагонист галаниновых рецепторов М35 при введении в боковые желудочки оказывает проэпилептическое действие при фармакологическом киндлинге, а также блокирует антиконвульсивный эффект галанина в условиях данной модели.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Способ моделирования посттравматической эпилепсии / Положительное решение ВНИИГПЭ N. 492199 от 10,06.92 г. на авторское свидетельство на изобретение. (Соавт. Шандра А.А., Годлевский Л.С., Маза-рати А.М. ).

2. Роль факторов пептидной природы в формировании эпилептиформ-ных проявлений при пикротоксин-индуцированном киндлинге у крыс // Нейрохимия.- 1992.- Т.Н.-' N. 2.- С. 94-99. (Соавт. Шандра А.А., Годлевский Л.С., Мазаратй А.М., ВовчукС.В.). -

3. Роль факторов пептидной природы в формировании эпилептиформ-ных проявлений при индуцированном пикротоксином киндлинге у крыс // Нейрофизиология.-1993.-T.1.-N 2.-С.• 115-119. (Соавт. Шандра А.А., Годлевский Л.С., Мазаратй А.М., Вовчук C.B.," Вастьянов P.C.).

4. Влияние нейропептида галанина на экспериментальный паркинсо-нический синдром у крыс, вызванный внутристриарным введением каиновой кислоты //. Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1993.- N 8.- С. 36-39. (Соавт. 1Мндра А.А., Мазаратй А.М., Кресюн В.И.).

5. Влияние нейропептида галанина на активное избегание у крыс // Физиол. журнал им. Сеченова.- 1993.- Т.79.- H 9. (Соавт. Шандра А.А., Мазаратй А.М.).

6. Anticonvulslve effects of ealanin and gaianin fragments upon picrotoxln klndllng convulsive syndrome // Epilepsia.- 1993.- v.34.:-suppl.2.- P. 187-188. (Соавт. Шандра A.A., Мазаратй A.M., Годлевский Л.С.). • -,

. ona iM jzi-tw <0 4