Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологические свойства оригинального миметика фактора роста нервов ГК-2 на моделях нейродегенеративных заболеваний и диабета in vivo

На правах рукописи

Поварнина Полина Юрьевна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОРИГИНАЛЬНОГО МИМЕТИКА ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ ГК-2 НА МОДЕЛЯХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ДИАБЕТА IN VIVO

14.03.06 —фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 НОЯ 2073

Москва - 2013

005538387

Работа выполнена в'Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор, член-корр. РАМН Гудашева Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

заведующий кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета ФГБОУ ВПО

«Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова» Каменский Андрей Александрович

доктор биологических наук профессор,

главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН

Гарнбова Таиспп Леоновна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита диссертации состоится « ^ » 2013 года в [3 часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН.

Автореферат разослан « Ъ ° » Р'/-\ 2013 ]

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Увеличение продолжительности жизни в экономически развитых странах сопровождается ростом распространенности нейродегенеративных заболеваний, таких как цереброваскулярные нарушения, болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Паркинсона (БП). Цереброваскулярные нарушения занимают одно из ведущих мест в мире по заболеваемости, инвалидизации и смергности [Суслина З.А., Пирадов М.А., 2008]. Общемировая заболеваемость БА на 2006 год оценивалась в 26,6 миллионов человек, а к 2050 году по прогнозам число больных может вырасти вчетверо [Brookmeyer R. et al., 2007]. БП встречается примерно у 1% людей старше 60 лет и у 4% людей старше 80 лет [Dexter D.T., Jenner P., 2013]. Фармакотерапия нейродегенеративных заболеваний в настоящее время является симптоматической и не способна обеспечивать длительную нейропротекцию [Dunkel Р. et al., 2012]. Поэтому актуальным направлением фармакологии является поиск новых эффективных нейропротективных лекарственных средств. В последние годы много внимания уделяется разработке терапевтических стратегий на основе фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF) - регуляторного белка, участвующего в росте, дифференцировке и поддержании жизнедеятельности нейронов центральной и периферической нервной системы. Показано, что БП и БА сопрововдаются снижением содержания NGF в областях мозга, наиболее уязвимых при данной патологии [Calissano Р. et al., 2010; Mogi М., 1999]. На экспериментальных моделях было показано, что при ишемии головного мозга содержание NGF также снижается в поврежденных участках [Lee Т.Н. et al., 1998], однако в первые несколько часов после начала ишемии экспрессия мРНК NGF, а также концентрация самого белка многократно возрастает, что, как полагают, свидетельствует о его роли в защите нейронов от гибели [Yang J. et al., 2011]. В клиническом исследовании была установлена достоверная обратная зависимость между размерами сформированного к 5-7-м суткам после инсульта очага повреждения и уровнем NGF в спинномозговой жидкости в 1-е сутки [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001]. Эффективность NGF при внутри мозговом введении была продемонстрирована на моделях БА [Allen S. J. et al., 2011; Gu H. et al., 2009; Winkler J., Thail L.J., 1995]; БП [Chaturvedi R.K. et. al., 2006], a также на различных моделях ишемии головного мозга [Yang J. et al., 2011; Zhu W., 2011]. В настоящее время известно, что трофические свойства NGF распространяются не только на нейроны центральной и периферической нервной системы, но и на клетки некоторых других систем и органов, в частности эндокринной системы [Aloe L. et al., 2012]. NGF играет важную роль в поддержании функционирования и защите от повреждающих факторов ß-клеток поджелудочной железы [Polak М. et al., 1993], с дегенерацией которых связано развитие сахарного диабета (СД) 1-го типа. Кроме того,

NGF стимулирует секрецию инсулина 0-клетками [Rosenbaum Т. et al., 2001], что определяет его возможный потенциал для лечения СД 2-го типа. Стимуляция синтеза NGF у крыс с экспериментальным СД предотвращает гибель Р-клеток и оказывает антигипергликемический эффект [Gezginci-Oktayoglu S., Bolkent S., 2012]. Однако, попытки применения NGF в клинике были неуспешными. Это связано с неудовлетворительными фармакжинетическими свойствами данного белка, его слабой способностью проникать через биологические барьеры, а также с серьезными побочными эффектами, основные из которых - гиперальгезия и катастрофическая потеря веса. Возможным путем преодоления недостатков NGF является создание системно-активных низкомолекулярных миметиков данного нейротрофина, которые воспроизводили бы его терапевтические эффекты и не обладали бы побочными эффектами. Описанные на настоящий момент в литературе миметики NGF не отвечают этим критериям. В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН был сконструирован и синтезирован димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF, получивший шифр ГК-2 [Середенин С.Б., Гудашева Т.А., 2010]. ГК-2 продемонстрировал высокую нейропротективную активность в концентрациях 10" -10"®М на различных клеточных моделях, при этом он не обладал дифференцирующей активностью [Антипова Т.А. и др., 2010]. Было также показано, что ГК-2 вызывает фосфорилирование специфических рецепторов TrkA и активирует PI3K/Akt сигнальный путь, отвечающий за нейропротективные эффекты, не активируя МАРК путь, ответственный в основном за дифференцирующую активность NGF [Gudasheva Т. et al., 2013].

Цель работы. Выявление фармакологических эффектов оригинального миметака фактора роста нервов ГК-2 на /я vivo моделях ряда заболеваний, в патогенез которых вовлечен нейротрофин NGF.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на моделях болезни Паркинсона (галоперидоловой каталепсии; апоморфиновой стереотипии; паркинсоничесиош синдрома, индуцированного резерпином или МФТП или 6-OHDA).

2. Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на моделях болезни Альцгеймера (септо-гиппокампальной перерезки; стрептозотоциновой модели; холинергического дефицита, вызванного длительным введением сюополамина).

3. Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на модели неполной глобальной ишемии, вызванной необратимой двусторонней окклюзией сонных артерий.

4. Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на модели сахарного диабета, индуцированного стрептозотоцином.

Научная новизна. Впервые для низкомолекулярных миметиюов фактора роста нервов выявлены антипаркинсоническая и антидиабетическая активности. Впервые показано, что низкомолекулярный миметик NGF, сконструированный на основе бета-изгиба 4-й петли NGF, активирующий TrkA-рецепторы и сигнальный Akt-киназный, но не МАР-киназный путь, обладает фармакотерапевтическими эффектами полноразмерного белка на in vivo моделях болезни Паркинсона, Альцгеймера, сахарного диабета, ишемии мозга. Установлено, что дипептид ГК-2 на моделях паркинсонического синдрома (ПС) при однократном внутрибрюшинном введении за 24 ч до повреждающего воздействия снижает интенсивность галоперидоловой каталепсии, потенцирует апоморфиновую стереотипию, корректирует

экстрапирамидные нарушения на моделях ПС, индуцированного резерпином или МФТП. При хроническом введении после нейротоксинов ГК-2 практически полностью предотвращает моторные нарушения на моделях ПС, вызванного 6-OHDA или МФТП. Выявлены положительные когнитотропные эффекты ГК-2 при его хроническом в/б введении на моделях болезни Альцгеймера (перерезка септо-гиппокампального пути, введение стрептозотоцина в желудочки мозга, холинергический дефицит, вызванный скополамином). Показано, что дипептид ГК-2 снижает выраженность когнитивных нарушений и оказывает нейропротективное действие при хроническом введении на модели неполной глобальной ишемии, индуцированной двусторонней необратимой окклюзией сонных артерий. Установлено, что ГК-2. при курсовом хроническом введении на модели стептозотоцинового диабета оказывает выраженное антигипертикемическое действие и препятствует снижению массы тела.

Практическая значимость работы. Выявленные in vivo на батарее валидированных поведенческих тестов нейропротективная, антипаркинсоническая, положительная когнитотропная и антидиабетическая активности дипептидного миметика NGF ГК-2 определяют его фармакотерапевтический потенциал и перспективы дальнейшего углубленного доклинического изучения. Показано, что дипептидный миметик NGF ГК-2 активен в широком диапазоне доз (0,01-5мг/кг) при внутрибрюшинном введении и сохраняет активность при пероральном введении, что важно для потенциального средства терапии хронических заболеваний. Дипептид ГК-2 обладает активностью как при превентивном, так и при лечебном его использовании. Показано, что, в отличие от NGF, дипептид ГК-2 при хроническом введении не вызывает снижения массы тела, то есть он лишен одного из основных побочных эффектов полноразмерного белка.

Положения, выносимые иа защиту.

1. Пептидный миметик N0? ГК-2 проявляет антипархинсонические свойства на ряде моделей паркинсонического синдрома в широком диапазоне доз при внутрибрюшинном введении; активность ГК-2 сохраняется и при пероральном введении.

2. ГК-2 проявляет положительные когнитотропные свойства на моделях болезни Альцгеймера.

3. ГК-2 корректирует когнитивные нарушения и проявляет нейропротективную активность на модели неполной глобальной ишемии.

4. ГК-2 оказывает выраженное антигипергликемическое действие и препятствует снижению массы тела крыс на модели стрептозотоцинового диабета.

5. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности дальнейшей разработки дипептидного миметика N0? ГК-2 в качестве системно активного препарата, потенциально эффективного для терапии заболеваний, в патогенез которых вовлечен КОР, и, вероятно, не обладающего побочными эффектами целого белка. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 4-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Московская область, 2010), 16-м Всемирном конгрессе по вопросам обшей и клинической фармакологии (Копенгаген, 2010), 11-м Региональном Конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011), 19-м Всемирном конгрессе по болезни Паркинсона и сопутствующим расстройствам (Шанхай, 2011), 4-м съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); 23-м Американском пептидном симпозиуме (Гаваи, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 статьи - в центральных рецензируемых научных журналах и 12 тезисов — в материалах российских и международных конференций.

Личный вклад. Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализе данных литературы по теме диссертационной работы, проведении экспериментальной части исследования и анализе полученных результатов, проведении статистической обработки, формулировании выводов. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов и их обсуждения, заключения,

выводов и списка цитируемой литературы, включающего 353 источника. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 37 рисунков и 16 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспергтентстъные животные. Работа была выполнена на беспородных белых крысах-самцах (п=422), инбредных крысах-самцах линии Вистар (п=113), инбредных мышах-самцах линии C57BI/6 (п=70) и линии Balb/C (п=80). Животные были получены из сертифицированных питомников РАМН и содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде и естественной смене светового режима. При работе с крысами соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.

Материалы и реактивы. Дипептид ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(1Ч-моносукцинил-глутамил-лизина)) [Т„„=110-118"С; [a]25D=44.0°(c 0.1; вода) синтезирован в отделе химии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН. Хлоралгидрат был получен в фирме «Рапсгеас Qimica SA»; галоперидол был получен в фирме «SUN Pharmaceutical Industries LTD». Апоморфин, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП), нембутал, Tween 80, 6-гидроксидофамин (6-OHDA), стрептозотоцин (СТЗ), гидробромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) были получены в фирме «Sigma». Эмбриональная бычья сыворотка (FBS) и культуральная среда DMEM были получены в фирме «Gibco». Диметилсульфоксид (DMSO) был получен в фирме «ICN». ГК-2, галоперидол, МФТП растворяли в дистиллированной воде; апоморфин - в дистиллированной воде с добавлением 0,01% аскорбиновой кислоты; 6-OHDA растворяли в физиологическом растворе, содержащем 0,02% аскорбиновой кислоты; СТЗ для внутримозгового введения растворяли в растворе Рингера, для системного введения — в физиологическом растворе. Скополамин растворяли в физиологическом растворе. Все растворы готовили ex tempore. Для определения содержания глюкозы в крови использовался глюкометр фирмы One Touch Ultra (США). Поведение крыс в водном лабиринте Морриса регистрировали на видеокамеру, и затем видео обрабатывали с помощью программы ANY-maze (фирмы «Stoelting Со»). Во всех остальных тестах поведенческие параметры регистрировали в полуавтоматическом режиме с помощью программы RealTimer (ООО «НПК Открытая Наука»).

Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартного пакета программ «Statistica 10.0» (StatSoft, Inc., США). Использовались непараметрические методы статистики: точный критерий Фишера, ранговый однофакторный критерий Краскела-Уоллиса, U тест Манна-Уитни, критерий Вилкоксона для зависимых групп, ранговый дисперсионный критерий

Фридмана. Результаты считались достоверными при р<0,05. Данные представлялись в виде медиан и интерквартильных интервалов. Экспериментальный терапевтический

Тз = ^х100%

эффект (Тэ) дипептида ГК-2 рассчитывали по формуле: с , где а -

значение параметра в группе «повреждение+ГК-2», b - значение параметра в группе «повреждение», с - значение параметра в группе «контроль».

Модели паркинсоннческого синдрома. Для изучения антипаркинсонической активности ГК-2 был использован стандартный набор экспериментальных моделей, рекомендованный в руководстве по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ под ред. Хабриева Р.У. (Москва. - 2005г.) и в руководстве по фармакологическому исследованию под ред. Vogel H.G (Springer. - 2008). Гаюперидоловая каталепсия у крыс [Sanberg P.R., 1980]. ГК-2 вводили внутрибрюшинно (в/б) в разные промежутки времени до и после галоперидола (1 мг/кг, в/б), а также перорально за 24 ч до галоперидола (Hal). Через 60 мин после введения Hal оценивали интенсивность каталепсии. Для этого животное ставили передними лапами на пластиковую подставку высотой 10 см и замеряли время удержания неподвижной позы. Максимальное время регистрации - 120 с. Апоморфиновая стереотипия у крыс [Lal S., Sourkes T.L., 1973]. Апоморфин вводили подкожно в дозе 1,0 мг/кг. ГК-2 вводили в/б за 24 ч до апоморфина. Через 5 мин после введения апоморфина в течение 60 мин регистрировали пероральную стереотипию. Модель МФТП-индунироваиного ПС у мышей линии C57BI/6 [Snyder S.H., D'Amato D.R., 1986]. МФТП вводили однократно в дозе 30 мг/кг (в/б) или 4-кратно в дозе 15 мг/кг (в/б). ГК-2 вводили в/б за 24 ч до однократной инъекции МФТП. Спустя 90 мин, а затем 1, 7, 14 и 21 сут. визуально оценивали наличие у животных тремора, ригидности, пилоэрекции и саливации, двигательную активность в тесте открытое поле (ОП), а также измеряли длину шага [Вальдман Е.А. и соавт., 1999]. В случае 4-кратного введения МФТП [Угрюмов М.В. и соавт., 2010], ГК-2 вводили в/б через час после последней инъекции токсина, а затем каждые 48 ч (всего было 7 инъекций). Через 14 сут. после введения МФТП оценивали двигательную активность мышей в тесте ОП, а затем измеряли длину шага. ПС у крыс, индуцированный 6-OHDA [Ungerstedt U., 1971]. ПС моделировали введением крысам в правый стриатум 6-OHDA. Через час после операции, а затем через каждые 48 ч, крысам вводили в/б ГК-2, всего 8 раз. Через 24 ч после последней инъекции ГК-2 (на 16 день после операции) крысам подкожно вводили апоморфин в дозе 0,1 мг/кг и через 5 мин в течение 20мин регистрировали ротации в правую и левую стороны.

Модели болезни Альцгенмера. Перерезка септо-гиппокампального пути (fimbria-fornix) [Gasser U.E. et al., 1986]. Дипептид ГК-2 вводили в/б через 2 ч после операции,

а затем каждые 48 ч, всего 7 инъекций. Для выявления поведенческой патологии был использован тест ОП. Тестирование животных проводили через 48 ч после последней инъекции изучаемого соединения (14-й день после операции). Коэффициент угашения исследовательско-ориентировочной реакции, отражающий способность

крыс к негативному обучению (habituation), рассчитывали по формуле: Ку = -г, где а -

Ь

число пересеченных квадратов в группе в первую минуту наблюдения, a b - число пересеченных квадратов в группе в последнюю минуту наблюдения. Введение СТЗ в желудочки мозга крысам [Salkovic-Petrisic, Hoyer, 2007]. ГК-2 вводили в/б через 4 ч после операции и затем каждый день в течение 2 нед. В качестве препарата сравнения использовали мемантин, который вводили в/б по той же схеме. Через 3 нед. после операции крыс в течение 5 дней обучали нахождению затопленной платформы в водном лабиринте Морриса. Через неделю после окончания обучения оценивали способность крыс к воспроизведению навыка нахождения платформы. Холинергический deibuuum. вызванный длительным введением скополамина крысам [Буров Ю.В. и др., 1991]. Амнезию вызывали у крыс хроническим в/б введением скополамина (1 мг/кг/сутки, 20 дней). ГК-2 вводили в/б ежедневно в течение 10 дней (первая инъекция — через сутки после последней инъекции скополамина). На следующий день после окончания введения ГК-2 в течение 3 дней крыс обучали находить затопленную платформу в водном лабиринте Морриса. Каждый день проводили по 3 посадки. Через сутки после окончания обучения оценивали сохранение навыка: платформу убирали и давали крысам 60 с на ее поиск. Модель неполной глобальной ишемии головного мозга. Ишемию моделировали необратимой перевязкой обеих сонных артерий у крыс [Зарубина И.В., 2009]. ГК-2 вводили в/б через 4 ч после операции, а затем каждые 24 ч, всего было 8 инъекций. На 8-е и 9-е сутки после операции исследовательскую активность половины (п>6) животных из каждой группы оценивали в тестах ОП и «Исследование новых объектов». Для выявления возможной нейропатологии и влияния на нее дипептида ГК-2, через 2 нед после операции эти животные были декапитированы и у них была оценена выживаемость клеток коры головного мозга и гиппокампа. Поскольку известно, что содержание NGF динамически меняется в ответ на ишемию, было измерено содержание NGF в данных структурах мозга. У оставшихся животных (п>6 в каждой группе) через 3,5 мес. после операции рабочую память оценивали в тесте «Распознавание объектов». На всем протяжении эксперимента регистрировали гибель животных в группах. Для оценки способности крыс к негативному обучению в тесте ОП период наблюдения разбивали на два блока по две минуты и рассчитывали коэффициент угашения (Ку) исследовательско-ориентировочной реакции по формуле:

rr a

Ky = — t где a - число пересеченных квадратов в группе в первые две минуты

наблюдения, a b - число пересеченных квадратов в группе в последние две минуты наблюдения.

Стрептозотоциновая модель сахарного диабета. СД моделировали в/б введением СТЗ (40 мг/кг) [Szkudelski Т., 2001]. В течение 2 нед до и 4 нед после введения СТЗ животным раз в сутки в/б вводили ГК-2. Непосредственно перед введением СТЗ, а также на 3, 17 и 28 сутки после введения СТЗ у крыс из хвостовой вены брали кровь для определения содержания глюкозы. Массу крыс измеряли каждые 3-4 дня. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Антипаркинсонические эффекты ГК-2

Галоперидоловая каталепсия у крыс. Данная модель широко используется для выявления соединений с возможной антипаркинсоничесюой активностью, способных модулировать дофаминергическую (ДА) систему мозга [Ghosh A. et al., 2011]. Hal (1 мг/кг, в/б) вызывал у крыс развитие каталепсии, которая становилась хорошо выраженной через 60 мин после инъекции. Дипептид ГК-2, вводили в дозах 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 5,0 мг/кг (в/о) за 24ч до Hal. Использование подобного режима введения ГК-2 основано на предположении, что эффекты ГК-2 как миметика NGF могут быть связаны с синтезом белков de novo. ГК-2 при введении за 24 ч до Hal достоверно снижал длительность каталепсии с терапевтическим эффектом от 40 до 93% (Табл. 1). Таблица 1. Лнтнкаталептогенное действие ГК-2 при в/б введении за 24ч до Hal

Группа Доза Длительность каталепсии (с), Длительность Тэ

ГК-2, медиана (нижний квартиль - каталепсии в (в%)

мг/кг верхний квартиль) % от контроля

Hal (1 мг/кг, в/б) 0 45 (21-120) 100

0,01 6*(4-15) 14* 86

ГК-2 + Hal (1 мг/кг, в/б) 0,1 27*(П-120) 60* 40

0,5 3*(2-6) 7* 93

1,0 4"(1-6) 9 * 81

5.0 8*(5-120) 18* 72

Примечание. п=10 в каждой группе. *- р<0,05 по отношению к контролю (Hal) (точный критерий Фишера)

Антикаталептогенное действие ГК-2 сохранялось и при пероральном введении: у группы животных, получивших ГК-2 в дозе 10мг/кг, время каталепсии достоверно снижалось по сравнению с контрольной группой и составляло 39% от контроля. Способность снижать выраженность каталепсии, вызванной антагонистом дофаминовых Иг-рецепторов Hal, свидетельствует о дофамин-позитивных свойствах ГК-2. Из литературы известно о дофамин-позитивных свойствах NGF, связанных с

индукцией синтеза тирозингидроксилазы и дофаминовых 02-рецепторов [Goodman R., Hershman H.R., 1978; Greene L.A. et al., 1984; Su Z. et al., 2012]. NGF-подобный механизм действия ГК-2 [Gudasheva Т.A. et al., 2013] позволяет предположить, что способность ГК-2 при введении за 24 ч до Hal противодействовать развитию каталепсии у крыс также связана со стимуляцией синтеза соответствующих белков. Изучение разных временных режимов в/б введения ГК-2 в дозе 1 мг/кг (за 48, 24, 16, 1ч до или через 30 и 45мин после Hal) показало наличие антикаталептогенного действия этого пептида только при введении за 24 ч до или спустя 45 мин после Hal. В последнем случае эффект ГК-2 можно предположительно объяснить стимуляцией выброса дофамина. Известно, что NGF вызывает выброс дофамина как in vitro, так и in vivo при внутримозговом введении [Amino S. et al., 2002; Paredes D. et al., 2007].Ha модели галоперидоловой каталепсии наиболее выраженный терапевтический эффект ГК-2 проявлял в дозах 0,5 и 1 мг/кг (в/б). В связи с этим в дальнейших экспериментах ГК-2 изучался в данных дозах.

Апомоуфиновая стереотипия у крыс. Апоморфин (1 мг/кг; п/к) вызывал у крыс стереотипное поведение, выражавшееся в обнюхивании, лизании, укусах, которое развивалось уже через 5 мин после инъекции, что соответствовало литературным данным. Дипептид ГК-2 при введении за 24 ч до апоморфина в дозе 1 мг/кг (в/б) достоверно увеличивал интенсивность оральной стереотипии (Рис. 1). Способность ГК-2 потенцировать эффекты неселективного агониста дофаминовых Ü! и D2-рецеторов апоморфина свидетельствует о стимулирующем влиянии данного миметика NGF на ДА-систему мозга (см. предыдущий раздел).

Рисунок 1. ГК-2 (1мг/кг, в/б) потенцирует оральную стереотипию у крыс при введении за 24ч до апоморфина (1 мг/кг, п/к). п=10 в каждой группе. * - р<0,05 по отношению к контролю (группа апоморфин) (и тест Манна-Уитни)

ПС у мышей линии С57В1/6. индуцированный однократным системным введением МФТП. МФТП избирательно повреждает ДА-нейроны в основном за счет ингибирования комплекса I дыхательной цепи митохондрий. Данное нарушение является одним из основных звеньев патогенеза БП. Модель ПС, вызванного введением нейротоксина МФТП, считается наиболее адекватной, поскольку воспроизводит все основные нейропатологические и двигательные признаки данного заболевания. Через 90 мин

после введения МФТП (30 мг/кг, в/б) у мышей наблюдались тремор, ригидность, пилоэрекция, саливация, а также значительное снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности и возрастание ее латентного периода (ЛП); через 24 ч - увеличение ЛП двигательной активности; через 7 суток — снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности и увеличение ее ЛП; через 14 и 21 сутки — снижение длины шага (Табл. 2). Дипептид ГК-2 (1 мг/кг, в/б) препятствовал возникновению пилоэрекции и саливации через 90 мин после введения МФТП, предотвращал снижение горизонтальной двигательной активности в тесте ОП через 90 мин, 24 ч и 7 суток после МФТП, а также снижение длины шага на 14-е и 21-е сутки после МФТП (Табл. 2).

Таблица 2. ГК-2 (1мг/кг, в/б) корректирует моторные нарушения в условиях МФТП-индуцированного ПС у мышей при введении за 24ч до токсина (30 иг/кг, в/б).

Время после введения МФТП 90 мин 24 ч 7 сут 14 сут 21 сут

Измеряемые параметры Терапевтический эффект ГК-2

Тремор - - -

Ригидность

Пилоэрекция 75% <р=0,003) - -

Саливация 100% <р=0,04) -

Горизонтальная двигательная активность 10% <р=0,04) - 100% (р=0,03) -

Вертикальная двигательная активность

Латентный период двигательной активности 60% (р=0,03) 100% <р=0,01) 100% (р=0,0004) -

Длина шага - - 100% (р=0,09) 70% (р=0,008)

Примечание. п=8 в каждой группе. Статистическую обработку данных проводили с помощью точного критерия Фишера и и теста Манна-Уитни.

ПС у мышей линии С57В1/6, индуцированный 4-кратным системным введением МФТП. На 14-е сутки после введения МФТП (15 мг/кг, в/б, 4 раза) у мышей наблюдалось статистически достоверное снижение длины шага. ГК-2 (1 мг/кг, в/б) при 2-недельном лечебном введении полностью восстанавливал этот параметр (Рис. 2).

Рисунок 2. ГК-2 (1 мг/кг/сутки, в/б, 2 нед) при лечебном введении предотвращает снижение длины шага (симптом ригидности) у мышей с ПС, индуцированным МФТП (15 мг/кг, 4-кратно). п=10 в каждой группе. * - р=0,002 по сравнению с контролем; # - р=0,005 по сравнению с группой «МФТП» (критерий Краскела-Уоллиса с последующим пост-хок сравнением выборок с использованием и теста Манна-Уитни)

■ 55

Активность ГК-2 на модели МФТП-индуцированного ПС может быть связана как с его дофамин-позитивными, так и нейропротективными свойствами. В пользу последнего предположения свидетельствует способность ГК-2 ш vitro защищать клетки от гибели, вызванной МФТП [Антипова Т.А. и др., 2010]. Из литературы известно, что NGF предотвращает гибель клеток, индуцированную МФТП [Shimoke К., Chiba Н., 2001], а введение мышиного NGF в желудочки мозга мышам с ПС, индуцированным внутрибрюшинным введением МФТП, значительно увеличивает содержание дофамина в стриатуме [Garcia Е. et al., 1992]. NGF, сорбированный на поверхности полибутилцианоакрилатных наночастиц, при в/б введении в дозе 5 мкг эффективно снижал выраженность ригидности и увеличивал локомоторную активность у мышей с ПС, вызванным 1-кратным введением МФТП (30 мг/кг, в/б), в те же временные интервалы, что и ГК-2 в аналогичном эксперименте [Курахмаева К.Б. и др., 2008]. По выраженности терапевтического эффекта на данной модели ГК-2 сравним с NGF.

ПС у крыс, вызванный односторонним введением 6-OHDA в стриатум. 6-OHDA обладает избирательной токсичностью по отношению к катехоламинэргическим нейронам, поскольку захватывается системами транспорта катехоламинов, в основном транспортерами дофамина и норадреналина [Duty S., Jenner P., 2011]. Через 2 недели после введения крысам 6-OHDA в правый стриатум, у животных наблюдались индуцированные апоморфином ротации в противоположную повреждению сторону (это обычно объясняют гиперчувствительностью постсинаптических ДА-рецепторов, развивающейся вследствие пресинаптической денервации). Ротационного поведения не наблюдалось у ложнооперированных животных. Дипептид ГК-2 при введении в дозе 1 мг/кг (в/б) на протяжении 2 нед после операции практически полностью предотвращал ротационной поведение (Тэ=94%) (Рис. 3).

40

т о

S 35

а

о

S 30

с

X

3 25

0 л

2 20

Í 15 4

а

■

= 10

1 5

I

ложная операция (п=8)

вЮНСЛ+ГК-2 (п=7)

Рисунок 3. ГК-2 (1 мг/кг/сутки, в/б, 2 нед) предотвращает развитие апоморфиновых ротаций у крыс в условиях ПС, вызванного введением в правый стриатум 6-ОНОА. * - р=0,02 по сравнению с группой «ложная операция, # - р=0,03 по сравнению с группой «6-ОНОА (точный критерий Фишера).

Полученный в этом эксперименте эффект ГК-2 согласуется с литературными

данными об эффектах прародительского белка. Известно, что NGF противодействует нейротоксическому действию 6-OHDA как in vitro, так и in vivo. На культуре клеток PC 12 было показано, что NGF предотвращает аккумуляцию активных форм кислорода, вызванную 6-OHDA, с помощью механизма, который включает PI3K/Akt-зависимую индукцию гемоксигеназы-1 [Salinas М. et al., 2003]. При внутримозговом введении NGF снижает выраженность ротационного поведения у крыс на модели ПС, вызванного введением 6-OHDA в стриатум [Chaturvedi R.K. et al., 2006]. Эффект ГК-2 на данной модели по-видимому обусловлен его нейропротективными свойствами в отношении ДА-нейронов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об антипаркинсонической активности ГК-2. Учитывая выявленный in vitro NGF-подобный механизм действия ГК-2 [Gudasheva Т.A. et al., 2013] и исходя из литературных данных об эффектах и механизмах действия NGF, можно предположить, что антипаркинсоническая активность ГК-2 связана с его модулирующим влиянием на ДА-систему мозга, а также нейропротективными свойствами в отношении ДА-нейронов. Эффекты ГК-2 на моделях БА

Перерезка септо-гиппокампального пути (fimbria-fornix) v крыс. Перерезка септо-гиппокампального пути приводит к деафферентации гиппокампа, холинергическому дефициту и связанному с ним нарушению когнитивных функций. Тестирование крыс в ОП через 2 недели после операции не выявило статистически значимых межгрупповых различий по интенсивности горизонтальной и вертикальной двигательной активности. Анализ динамики горизонтальной двигательной активности (числа пересеченных квадратов) показал, что у ложнооперированных животных этот параметр выраженно снижался и в 4-ю минуту теста был достоверно ниже, чем в 1-ю (Ку=2,3). (Табл. 3).

Таблица 3. ГК-2 (1 мг/кг/сутки, в/б, 2 нед) восстанавливает нарушенное негативное обучение (habituation) в ОП у крыс в условиях перерезки септо-гиппокампального пути _

Группа 1-я минута 2-я минута 3-я минута 4-я минута Ку Тэ,%

ложная операция (п=6) 21(15-32) 14(11-25) 9,5* (7-16) 9*(8-13) 2,3

операция (п=10) 11,5 (8-35) 12 (9-32) 19(11-24) 11,5 (9-29) 1

операция + ГК-2 (п=8) 12,5(9-21) 11,5(7-14) 15,5 (8-17) 6,5* (3-8) 1,9 70%

Примечание. Ку - коэффициент угашения исследовательско-ориентировочной реакции. * - р<0,05 по отношению к первой минуте тестирования (критерий Вилкоксона для парных сравнений).

В норме постепенное угашение исследовательско-ориентировочной рекции при попадании в новую обстановку характерно для грызунов и является результатом привыкания или негативного обучения. Перерезка септо-гиппокампального пути

приводила к нарушению негативного обучения (habituation) у крыс, что выражалось в почти неизменном уровне горизонтальной двигательной активности на протяжении всего времени тестирования (Ку=1). ГК-2 (1 мг/кг/сутки, в/б, 2 нед) восстанавливал способность к негативному обучению (Ку=1,9) с терапевтическим эффектом 70% (Табл. 3).

Введение СТЗ в желудочки мозга. Эта модель воспроизводит практически все основные патологические признаки, характерные для БА, виочая холинергический дефицит и когнитивные нарушения [Salkovic-Petrisic М., Hoyer S., 2007]. В процессе обучения в водном лабиринте Морриса латентный период (ЛП) достижения затопленной платформы достоверно снижался у ложнооперированных животных. У оперированных животных не было выявлено статистически достоверных различий между ЛП достижения затопленной платформы в 1-й и последующие дни обучения. Таким образом, у оперированных животных наблюдалось нарушение способности к обучению в лабиринте Морриса. Введение ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 14 дней) или мемантина (10 мг/кг/сутки, в/б, 14 дней) предотвращало данное нарушение (Табл. 4). В тестовую посадку через неделю после окончания обучения у оперированных крыс наблюдалась тенденция к увеличению времени нахождения затопленной платформы по сравнению с группой «ложная операция». Лечение как ГК-2, так и мемантином, полностью препятствовало развитию данного нарушения (Рис.4). Таким образом, ГК-2 противодействовал нарушению пространственной памяти в водном лабиринте Морриса на стрептозотоциновой модели БА у крыс, не уступая по эффективности широко используемому в клинике мемантину, при этом доза ГК-2 (0,5 мг/кг, в/б) была в 20 раз ниже, чем у мемантина (10 мг/кг, в/б).

Таблица 4. ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 14 суток) при лечебном введении противодействует нарушению пространственного обучения в водном лабиринте Морриса, на модели БА, . индуцированной введением СТЗ в желудочки мозга крысам

ЛП достижения затопленной платформы, с

Группа

ложная операция (п=б)

операция (п=9)

операция+ГК-2 (п=7)

операция+мемантин (п=7)

Дни обучения

42(34-50)

36(32-39)

39(26-49)

35(29-46)

_1_

23(15-29)'

30(26-32)

21(15-31)

24(15-33)*

19(9-26)*

26 (23-46)

27(14-39)

24(18-28)

15(11-27)

17(8-26)*

11(6-16)*

10(8-35)

18(5-23)"

18(8-40)

15(4-26)*

12(4-19)*

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с 1-й днем обучения в той же группе (критерий Вшшжсона для парных сравнений).

Рисунок 4. ГК-2

(0,5мг/кг/сутки, в/б, 2 нед) противодействует нарушению воспроизведения навыка нахождения затопленной платформы в лабиринте Морриса в условиях стрептозотоциновой БА. * -р=0,09 по сравнению с группой «ложная операция», ** - р=0,07 по сравнению с группой «операция», # - р=0,09 по сравнению с группой «операция» (точный критерий Фишера).

олерация+мемантин

(4=7)

Холинергический дефицит, вызванный длительным введением скополамина крысам. В фармакологических исследованиях антагонист м-холинорецепторов скополамин широко используется для выявления препаратов, потенциально способных противодействовать холинергическому дефициту [Буров Ю.В. и др., 1991]. В настоящем исследовании у контрольных животных время достижения платформы в водном лабиринте Морриса постепенно снижалось в процессе обучения. Хроническое введение скополамина (1 мг/кг/сутки, в/б, 20 дней) приводило к нарушению способности к обучению в данном тесте, что выражалось в отсутствии достоверных различий во времени достижения платформы в первые 3 посадки у группы «скополамин». ГК-2 в дозе 0,2 мг/кг/сутки, в/б, 10 дней, корректировал данное нарушение (Рис. 5). В дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг ГК-2 не влиял на способность к обучению в данном тесте.

схополамин+ГК-2. скопопаи«>ГК-г стпопаши»ГК-г 0,2 мг/кг 0,5 мг/кг 2 и/кг

Рисунок 5. ГК-2 (0,2 мг/кг/сутки, в/б, 10 дней) противодействует нарушению пространственного обучения в водном лабиринте Морриса в условиях холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина (1 мг/кг/сутки, 20 дней, в/б). **- р=0,007; *- р=0,04 (ранговый дисперсионный анализ Фридмана).

Таким образом, миметик NGF ГК-2 противодействовал когнитивному дефициту на моделях БА у крыс. Перспективность основанных на NGF терапевтических стратегий для лечения БА обусловлена тем, что наиболее уязвимые при данном заболевании холинергические нейроны базальных отделов переднего мозга являются основной мишенью протективного действия этого нейротрофина в центральной нервной системе. Известно, что NGF при внутримозговом введении защищает данные нейроны от гибели, противодействует холинергическому дефициту и восстанавливает нарушенные когнитивные функции на моделях БА, включая модель септо-гиппокампальной перерезки [Allen J. et al, 2011; Gu H. et al., 2009; Winkler J., Thail L.J., 1995]. Когнитотропная активность ГК-2 на моделях БА подтверждает его способность in vivo воспроизводить определенные эффекты, характерные для NGF. При этом, в отличие от NGF, ГК-2 эффективен при системном введении.

Эффекты ГК-2 на модели церебральной ишемии, вызванной необратимой двусторонней окклюзией сонных артерий у крыс. Данная модель представляет собой адекватный метод оценки эффективности препаратов с предполагаемой нейропротективной активностью [Farkas Е. et al., 2007]. В группе «ишемия» в течение 14 дней после операции погибли 8 из 20 крыс (40%), а в группе «ложная операция» 1 из 18 крыс. В группе леченых дипептидом ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней) крыс гибели животных не наблюдалось (Табл. 5). Из литературы [Matsumoto К. et al., 1995] известно, что двусторонняя необратимая окклюзия сонных артерий приводит к повреждению нейронов двух типов: диффузные поражения коры головного мозга, возникающие, как полагают, вследствие острой ишемической атаки, и медленно прогрессирующая нейродегенерация в гиппокампе. В соответствии с этими данными в нашем эксперименте через 2 нед после перевязки сонных артерий у оперированных животных была достоверно снижена по сравнению с ложнооперированными жизнеспособность клеток коры головного мозга (МТТ-тест). Дипептид ГК-2 полностью восстанавливал жизнеспособность клеток коры (Рис. 6).

Таблица 5. ГК-2 (05 мг/кг/сутки, 7 дней, в/б) при лечебном введении предотвращает гибель

Группа Количество животных (п) Число выживших животных % выживших животных

Ложная операция 18 17 95

Ишемия 20 12* 60

Ишемия+ГК-2 17 17# 100

Примечание. * - р=0,01 по сравнению с группой «ложная операция», # - р=0,003 по сравнению с группой «ишемия» (точный критерий Фишера).

i

Щ |

___ i

; Ша i

щж s i-

Рисунок 6. ГК-2 (0,5 иг/кг/сутки, в/б, 7 дней) предотвращает снижение жизнеспособности клеток коры головного мозга в условиях необратимой

двусторонней окклюзии

сонных артерий.

Эксперименты были проведены совместно с к.б.н. Антаповой Т.А. Данные МТТ-теста. Результаты представлены в процентах, где за 100% принимали значение выживаемости клеток в группе «ножная операция». * - р<0,05 по сравнению с группой «ложная операция»; # - р<0,05 по сравнению с группой «ишемия» (тест Краскела-Уошшса с последующим пост-хок сравнением выборок с использованием U теста Манна-Уитаи). На поведенческом уровне на 8-й - 9-й день после операции у крыс было нарушено негативное обучение («habituation») в ОП и снижено время исследования новых объектов по сравнению с ложнооперированными животными. ГК-2 полностью предотвращал нарушение негативного обучения в ОП (Рис. 7), а также достоверно противодействовал снижению времени исследования новых объектов (84 с в группе «контроль», 35 с в группе «ишемия» и 55 с в группе «ишемия+ГК-2»),

ложная операция (п=8)

ишемня+ГК-г (п=8)

пожная операция (n=8i ни емия (п=6)

иш емия-Ч~К.2 (п-3>

Рисунок 7. ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней) при лечебном введении предотвращает нарушенне негативного обучения у крыс в ОП в условиях необратимой двусторонней окклюзии сонных артерий. Ку - коэффициент угашения исследовательско-ориентировочной реакции. * - р = 0,02 для группы «ложная операция» и 0.03 для группы «ишемия+ГК-2» по сравнению с двигательной активностью в той же группе в первые 2 минуты теста (критерий Вилкоксона для парных сравнений) ; # - р = 0,04 по сравнению с соответствующей группой (тест Краскела-Уоллиса с последующим пост-хок сравнением выборок с использованием и теста Манна-Уитни).

Можно предположить, что поведенческие нарушения, выявленные в короткие сроки после перевязки сонных артерий, связаны с дефицитом внимания, вызванным

повреждением коры головного мозга. Через 3,5 месяца после операции у ишемизированных крыс в тесте «распознавание объектов» было выявлено нарушение рабочей памяти, что выражалось в значительном снижении времени исследования нового объекта по сравнению с ложнооперированными животными. Это нарушение, вероятно, связано с гибелью нейронов гиппокампа [Farkas Е. et al., 2007]. ГК-2 предотвращал данное нарушение с терапевтическим эффектом 55% (Рис. 8). Таким образом, дипептид ГК-2 при лечебном введении в течение 7 дней на модели хронической церебральной ишемии полностью предотвращал гибель животных и снижение жизнеспособности клеток коры головного мозга, а также препятствовал развитию когнитивных нарушений как в короткий (1-2 недели), так и в отдаленный

Рисунок 8. ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней) предотвращает нарушение рабочей памяти у крыс в тесте «распознавание объектов» в условиях необратимой двусторонней окклюзии сонных артерий. В качестве критерия рабочей памяти использовали процент времени, в течение которого животное исследовало новый объект, за 100% принимали суммарное время исследования объектов. * - р=0,02 по сравнению с группой «ложная операция»; # - р=0,03 по сравнению с группой «ишемия» (точный критерий Фишера),

Из литературы известно, что прародительский белок NGF участвует в компенсаторных механизмах при ишемических повреждениях мозга. Так, клинические исследования показали, что объем инфаркта и выраженность неврологических нарушений зависят от содержания эндогенного NGF в спинномозговой жидкости в первые сутки после инсульта [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001]. На моделях экспериментальной ишемии головного мозга было продемонстрировано, что NGF при внутримозговом введении оказывает нейропротекгивное действие и снижает неврологический дефицит [Shigeno Т. et al., 1991; Yung J. et al., 2011]. Таким образом, ГК-2 воспроизводит терапевтические эффекты полноразмерного белка и на данной модели.

Антидиабетические эффекты ГК-2 (эксперименты были проведены совместно с асп. Озеровой И.В. и проф. Островской Р.У.). При системном введении СТЗ избирательно повреждает |3-клетки поджелудочной железы, в связи с чем его широко используют для моделирования экспериментального СД. В течение 2 нед. до введения СТЗ различий в экспериментальных группах по массе тела и содержанию глюкозы в

(3,5 месяца) сроки после операции.

г110 п

ж

J 100

О

| "

К 60

и Ö

I 50 i

| 40

ложная операция (п=9) иш емия (n=6J

ншемия+ГК-2 ш=9}

крови не было, то есть хроническое введение ГК-2 здоровым крысам не влияет на эти показатели. СТЗ вызывал снижение прироста массы тела крыс и выраженную гипергликемию. Дипептид ГК-2 полностью препятствовал снижению прироста массы тела крыс (прирост массы за 4 нед. в групе «контроль» составляет 50 г, в группе «СТЗ» -21 г и в группе «СТЗ+ГК-2» - 51 г). Гипергликемия у крыс с экспериментальным СД была выявлена на 3 сут. и сохранялась в течение 4 нед. после введения СТЗ. ГК-2 достоверно снижал содержание глюкозы в крови во всех точках измерения - на 1 -е, 17-е и 28-е сутки после введения СТЗ, с наиболее выраженным эффектом на 28-е сутки (Рис. 8). Таким образом, было выявлено антидиабетическое действие дипептидного миметика NGF ГК-2. Из литературы известно, что NGF защищает клетки поджелудочной железы от повреждения, в том числе вызванного гипергликемией, и стимулирует секрецию инсулина этими клетками в ответ на повышение содержания внеклеточной глюкозы [Rosenbaum Т. et al., 2001; Navarro-Tableros V. et al., 2004]. Возможный NGF-подобный механизм действия ГК-2 предполагает защиту Р-клеток поджелудочной железы и стимуляцию секреции инсулина в ответ на гипергликемию. Это говорит о перспективности его дальнейшей разработки в качестве терапевтического агента для лечения СД как 1-го, так и 2-го типа, и использования как молекулярного инструмента для изучения вовлеченности NGF в патогенез диабета. Следует отметить, ГК-2 при хроническом введении не только не вызывал снижения массы крыс (что является характерным побочным эффектом NGF), но и препятствовал снижению массы, вызванному СТЗ.

Рисунок 10. Антигипергликемическое действие ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 14 дней до СТЗ и 28 дней после СТЗ) в условиях стрептозотоцинового диабета.

На оси абсцисс показано время с момента введения СТЗ. * р<0,001 по сравнению с группой «Контроль» (критерий Краскела-Уоллиса с последующим пост-хок сравнением с использованием и теста Манна-Уитни); ** р<0,0001 по сравнению с группой «Контроль» (критерий Краскела-Уоллиса с последующим пост-хок сравнением с использованием и теста Манна-Уитна); # р<0,05 по сравнению с группой «СТЗ» (критерий Краскела-Уоллиса с последующим пост-хок сравнением с использованием и теста Манна-Уитни), л р<0,05 по сравнению с группой «СТЗ» (точный критерий Фишера).

я Контроль (п=12) О СТЗ (П=13) р СТЗ-*-ГК-2 (п=13)

3 сутки

17 сутки

28 сутки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Проведено фармакологическое изучение соединения ГК-2, оригинального миметика NGF дипептидной природы, на моделях ряда заболеваний, в патогенез которых вовлечен NGF: БП, БА, хронической церебральной ишемии и СД. В настоящее время фармакотерапия данных заболеваний является симптоматической и не предотвращает развитие патологических процессов. Выявлена антипаркинсоническая активность ГК-2. Этот дипептид снижал выраженность экстрапирамидных нарушений на моделях ПС как при однократном превентивном, так и при хроническом лечебном введении. Было выявлено, что ГК-2 эффективен в диапазоне доз по крайней мере от 0,01 до 5 мг/кг при в/б введении и сохраняет активность при пероральном введении в дозе 10 мг/кг. NGF-подобный механизм действия ГК-2, выявленный in vitro, позволяет предположить, что антипаркинсоническая активность данного соединения связана с его модулирующим влиянием на ДА-систему мозга и/или нейропротективными свойствами в отношении ДА-нейронов - эффектами, описанными для прародительского белка. О модулирующем влиянии ГК-2 на ДА-систему мозга свидетельствует его способность снижать выраженность каталепсии, вызванной преимущественным антагонистом дофаминовых 02-рецепторов галоперидолом, а также способность потенцировать оральную стереотипию, вызванную агонистом дофаминовых Di и Иг-рецепторов апоморфином. Способность ГК-2 продотвращать ротационное поведение у крыс в условиях ПС, индуцированного 6-OHDA, связана, вероятно, с его нейронротективной активностью в отношении ДА-нейронов. Это предположение согласуется с имеющимися в литературе данными о способности NGF предотвращать гибель ДА-нейронов, индуцированную 6-OHDA или МФТП. Выявлены положительные когнитотропныб эффекты ГК-2 при хроническом лечебном введении на моделях БА у крыс (перерезка fimbria-fornix, введение СТЗ в желудочки мозга и холинергический дефицит, вызванный скополамином). Можно предположить, что ГК-2, подобно прародительскому белку, обладает протективными свойствами в отношении холинергических нейронов головного мозга. Было установлено, что ГК-2 при хроническом лечебном введении проявляет нейропротективные и когнитотропные свойства на (подели неполной глобальной церебральной ишемии, вызванной необратимой двусторонней перевязкой сонных артерий у крыс. Дипептид ГК-2 полностью предотвращал снижение жизнеспособности клеток коры головного мозга, а также гибель животных на данной модели. Кроме того, ГК-2 препятствовал развитию как краткосрочных (по-видимому, связанных с повреждением коры) так и отсроченных (вероятно связанных с медленной дегенерацией нейронов гиппокампа) когнитивных карушений. Установлено, что ГК-2 обладает антидиабетическим действием. На модели стрептозотоцинового СД дипептид ГК-2 при курсовом

введении оказывал выраженное антигипергликемическое действие, а также полностью препятствал снижению массы тела крыс, вызванному СТЗ. Таким образом, показано, что пептидный миметик 4-ой петли NGF, селективно активирующий опосредованный рецепторами TrkA PI3K/Akt сигнальный путь, обладает фармакотерапевтическими эффектами полноразмерного редка на in vivo моделях БП, БА, ишемии мозга и СД. Следует отметить, что хроническое введение ГК-2 не вызывает снижение массы тела, которое является одним из побочных эффектов NGF. Полученные в настоящей работе данные позволяют сделать вывод о перспективности дальнейшей разработки дипептидного миметика NGF ГК-2 как препарата, потенциально эффективного в терапии БА, БП, церебральной ишемии и СД. ВЫВОДЫ

1. Оригинальный миметик фактора роста нервов ГК-2 активен на моделях болезни Паркинсона. ГК-2 корректирует моторные нарушения у мышей и крыс на моделях галоперидоловой каталепсии, апоморфиновой стереотипии, ротационного поведения, вызванного введением 6-OHDA в стриатум, снижает выраженность экстрапирамидных нарушений, вызванных МФТП или резерпином.

2. Дипептид ГК-2 активен на моделях болезни Альцгеймера. ГК-2 противодействует нарушению пространственной памяти у крыс в водном лабиринте Морриса, вызванному центральным введением стрептозотоцина или хроническим системным введением скополамина, и восстанавливает нарушенное «негативное обучение» (habituation) у крыс в открытом поле, вызванное септо-гиппокампальной перерезмой.

3. Дипептид ГК-2 проявляет нейропротективную и положительную когнитотропную активность на модели неполной глобальной ишемии, вызванной необратимой двусторонней окклюзией сонных артерий у крыс. ГК-2 полностью предотвращает гибель животных и восстанавливает жизнеспособность клеток коры головного мозга. ГК-2 корректирует нарушения «негативного обучения» в открытом поле, рабочей памяти в тесте «распознавание объектов» и нарушение исследовательской активности в тесте «исследование новых объектов».

4. Дипептид ГК-2 активен на модели стрептозотоцинового диабета. При курсовом (превентивном и лечебном) введении на данной модели ГК-2 оказывает выраженное антигиперпинсемическое действие и препятствует снижению массы тела крыс.

5. ГК-2 эффективен в диапазоне доз от 0,01 до 5 мг/кг при внутрибрюшинном применении и сохраняет активность при пероральном введении (5-10 мг/кг) мышам и крысам. При хроническом введении (2 недели) крысам в наиболее эффективной дозе (0,5 мг/кг) дипептид ГК-2 не вызывает характерного для фактора роста нервов побочного эффекта, снижения массы тела.

Практические рекомендации

Результаты выполненных исследований позволяют сделать заключение о целесообразности дальнейшего изучения низкомолекулярного миметика фактора роста нервов ГК-2 в качестве оригинального нейропротективного лекарственного препарата, перспективного для лечения болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера ишемии мозга, а также сахарного диабета. Список публикаций по теме диссертации

1. Поварни на, П.Ю. Влияние нового низкомолекулярного пептидомиметика фактора роста нервов ГК-2 на эффекты МФТП и галоперидола [Текст] / П.Ю. Поварнина, О.Н. Воронцова, Н.А. Бондаренко, Т.А. Гуцашепа // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - М., 2009. - С.275.

2. Поварнина, П.Ю. Оригинальный дипептидный миметик фактора роста нервов активен на экспериментальных моделях болезни Паркинсона [Текст] / П.Ю. Поварнина, О.Н. Воронцова, Т.А. Гудашева // Экспериментальная и клиническая фармакология: приложение «Материалы 5-й Международная конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - 2010. - С.72.

3. Воронцова, О.Н. Антиишемическая активность дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 [Текст] / О.Н. Воронцова, П.Ю. Поварннна, С.В. Николаев, Т.А. Гудашева // Экспериментальная и клиническая фармакология: приложение «Материалы 5-й Международная конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». -2010. - С.72.

4. Gudasheva, Т. A new dimeric linear dipeptide mimetic of NGF active on animal models of Parkinson's disease [Текст] / Т. Gudasheva, P. Povarnina, T. Antipova, S. Seredenin / Abstracts for the i6th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology // Basic&Clinical Pharmacology ¿¿.Toxicology (BCPT). - 2010. - Vol.107; Suppl.l. - P.1655.

5. Поварнина, П.Ю. Антипаркинсонические свойства дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 в экспериментах in vivo [Текст] / П.Ю. Поварнина. Т.А. Гудашева, О.Н. Воронцова, Н.А. Бондаренко, Т.А. Гудашева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 151. - №6. - С. 634-637.

6. Povarnina, P. Behavioral and biochemical effects of a novel dipeptide mimetic of nerve growth fator on a model of incomplete global ischemia in rats [Текст] / P. Povarnina, S.V. Nikolaev, T.A. Antipova, T.A. Gudasheva / Papers of the П-th Regional ENCP Meeting S-Petersburg, 14-16 April 2011. // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. - 2011. - Vol.21, Suppl.2. - P. 158.

7. Tarasiuk, AV. A novel active small mimetic of brain-derived neurotrophic factor: bis-(N-monosuccinyl-seryl-lysine) hexamethylenediamide / A.V. Tarasiuk, I.O. Loginov, P.Y. Povarnina, T.A Antipova, T. A. Gudasheva / Papers of the 11 -th Regional ENCP Meeting S-Petersbuig, 14-16 April 2011. // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. - 2011. - Vol.21, SuppL2. - P. 174.

8. Povarnina, P. Behavioral effects of a novel dipeptide mimetic of the nerve growth factor in rodent models of Parkinson's disease [Текст] / P.Povarnina, T.Gudasheva, S.Seredenin //

Parkinsinosm & Related Disorders. - 2012. - Vol.18, Suppl.2 -P.1655.

9. Поварнина, П.Ю. Нейропротекторные эффекты димерного дипептидпого миметика фактора роста нервов ГК-2 на модели двусторонней необратимой перевязки сонных артерий у крыс [Текст] / П.Ю. Поваримна, Т.А. Гудашева, О.Н. Воронцова, C.B. Николаев, Т.А. Антипова, Р.У. Островская, С.Б. Середенин // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2012. -Т.75.-N"9. -С.15-20.

10. Гудашева, Т.А. Первый системно активный дипептидный миметик фактора роста нервов [Текст] / Т.А. Гудашева, Т.А. Антипова, П.Ю. Поварнина, С.Б. Середенин // Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». -М.: илд-во Фолиум, 2012. - С.52.

11. Поваримна, П.Ю. Димерный дипептидный миметик фактора роста нервов ГК-2 проявляет нейропротекгивную активность и восстанавливает поведенческий дефицит на модели неполной глобальной ишемии мозга крыс [Текст] / П.Ю. Поварнина, C.B. Николаев // Материалы Г/ Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». -М.: изд-во Фолиум, 2012. - С.152.

12. Тарасюк, A.B. Синтезирован димерный дипептидный миметик 1-й петли нейротрофина BDNF, обладающий нейропротекгивной и лишенны антидепрессивной активности [Текст] / AB. Тараоок, П.Ю. Поварнина, И.О. Логвинов // Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - М.: изд-во Фолиум, 2012. - С.178.

13. Поварнина, П.Ю. Антидиабетическая активность оригинального дипептидного миметика фактора роста нервов [Текст] / П.Ю. Поварнина, И.В. Озерова, Р.У. Островская, Т.А. Гудашева, С.Б. Середенин // Доклады академии наук. Физиология. - 2013. - Т.449. - №3. - С.364-366.

14. Gudasheva, Т. NGF loop 4 dimeric dipeptide mimetic active on animal models of Parkinson's, Alzheimer's diseases and stroke [Текст] / T. Gudasheva, T. Antipova, P. Povarnina, S. Seredenin // Proceedings of the Twenty-Third American and the Sixth International Peptide Symposium. - 2013. - P. 194-195.

15. Гудашева, Т.А. Нейропротеетивные свойства оригинального миметика фактора роста нервов. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии [Текст] / ТА. Гудашева, П.Ю. Поварнина, Т.А. Антапова, С.Б. Середенин // Материалы всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекпия». - 2013. - Т. 11. - С. 45-46.

16. Поварнина, П.Ю. Оригинальный дипептидный миметик фактора роста нервов ГК-2 восстанавливает нарушенные когнитивные функции на моделях болезни Альцгеймера у крыс [Текст] // П.Ю. Поварнина, О.Н. Воронцова, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская, С.Б. Середенин //Actanaturae. -2013. Т.5. - №3. - С.88-95.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ

6-OHDA 6-гидроксидофамин

6-OHDA

Akt Hal NGF

(threonine-protein kinase) - серин-треониновая протеинкиназа (галоперидол)

(nerve growth factor) фактор роста нервов

РОК (phosphatidylinositol-3-kinase) фосфатидилинозитол-3-киназа

MAP (mitogen-activated protein kinase) митоген-активируемая протеинкиназа

TrkA (tropomyosin-related kinase А) тирозинкиназные рецепторы типа А

БП болезнь Паркинсона

БА болезнь Альцгеймера

В/б внутрибрюшинно

ДА дофаминергический

Ку коэффициент угашения

лп латентный период

МФТП 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

оп открытое поле

П/к подкожно

ПС паркинсонический синдром

сд сахарный диабет

стз стрептозотоцин

Подписано в печать 28.10.2013 г.

Заказ № 38 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.