Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение эффектов гимантана на ранних стадиях развития болезни Паркинсона и при индуцированных леводопой дискинезиях (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

005059387

НЕПОКЛОНОВ АЛЕКСЕИ ВИКТОРОВИЧ

Изучение эффектов гимантана на ранних стадиях развития болезни Паркинсона и при индуцированных леводопой дискинезиях (экспериментальное исследование)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 ПАЙ 2013

Москва-2013

4 С

V__/

005059387

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имепи В.В.Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН)

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Воронина Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

заведующий лабораторией радиоизотопных методов исследований ФГБУ «НИИ фармакологии

имени В.В. Закусова» РАМН Ковалев Георгий Иванович

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории общей патологии нервной системы ФГБУ «НИИ общей патологии

и патофизиологии» РАМН Кучеряну Валериян Григорьевич

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится ..................2013 года в «.......» часов на

заседании диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., 8)

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., 8)

Автореферат разослан «......»........................2013 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Вальдман Елена Артуровна

1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Одной из ключевых причин развития клинической симптоматики болезни Паркинсона (БП) является гибель дофаминергических (ДА) нейронов в черной субстанции, что сопровождается двигательными нарушениями: тремором, бради (олиго)кинезией, ригидностью, постуральными нарушениями. Известно, что двигательные нарушения при БП развиваются тогда, когда содержание ДА снижено на 60-80%, что отражает примерно такой же процент гибели ДА нейронов (Dauer, Przedborski, 2003).

До настоящего времени наиболее эффективным и широко применяемым средством лечения БП является предшественник дофамина леводопа. Однако при длительном применении эффективность препаратов леводопы снижается, и часто возникают тяжелые осложнения в виде дискинезий. Поэтому в настоящее время признанной стратегией фармакотерапии БП является отсроченное назначение леводопы, особенно пациентам относительно молодого возраста (Иллариошкин, Федорова 2008; Fabbrini et al., 2007). До назначения леводопы применяются агонисты дофаминовых рецепторов, антихолинергические средства, ингибиторы ферментов, участвующих в метаболизме дофамина - МАО-B и катехол-О-аминотрансферазы (КОМТ), амантадин, обладающий непрямым дофаминпозитивным действием и свойствами неконкурентного блокатора глутаматных рецепторов NMDA подтипа (Zubair et al., 2007; Verhagen Metman, 1999; Crosby et al., 2003; Pasi et al., 2001). Эти же препараты используются в комплексной терапии развернутых стадий БП для снижения эффективной дозы леводопы и риска развития осложнений, хотя в ряде случаев комбинация леводопы с агонистами дофамина приводит к возрастанию риска развития дискинезий (Brodsky et al., 2010). Поиск средств, эффективных и безопасных в комплексной терапии с леводопой остается актуальной проблемой (Гусев, Гехт, 2000; Катунина и др. 2006; Кучеряну, 2001).

Фармакотерапия БП является преимущественно симптоматической и Hüfipääiießä на ШжёнИс Ёь1ра5кенн6стй сиШтОмбй Заббле'йаНйй. СбзДание лекарстве'нны* средств; который Могут не только ослаблять проявления БЙ; но и замедлять её прогр!есснрование, а в riepchfeKftiee tooiyr стать средствами выбора для назначения в самый ранний период развития заболевания до появления оскоёной клиничёской снмитома+ики; япляется крайне важнь1м. Поиск нейропротекторов активно ведется как среди уже известных препаратов, так и среди Новых соединений, на основе современных представлений о механизмах гибели нейронов при БП. В качестве потенциальных средств, способных замедлить развитие заболевания, рассматриваются антиоксиданты, противовоспалительные средства, антагонисты глутаматных рецепторов NMDA подтипа, модуляторы

нейротрофических факторов (Cosi, 2002; Chen et al., 2005; Teismann et al., 2003; Klegeris and McGeer, 2000).

Параллельно с поиском нейропротекторов активно развиваются фундаментальные исследования по экспериментальному моделированию и поиску клинических маркеров самых ранних ("домоторных", "досимптомных") стадий БП, без характерной триады двигательных нарушений - акинезии, ригидности, тремора (Aubin, 1998; Bezard et al., 2001; Da Cunha et al., 2006; Lima et al., 2007; Reksidler et al., 2009; Tadaiesky et al., 2008; Угрюмов, 2010).

Гимантан - новый оригинальный препарат, созданный в ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН, обладает выраженной противопаркинсонической активностью, доказанной на экспериментальных моделях (Вальдман, Неробкова, Воронина, 1999; Вальдман, 2001; Капица и др., 2005; Морозов и соавт., 2000), и подтвержденной в клинике у больных с начальными стадиями болезни Паркинсона (Катунина и др., 2008). Положительные результаты пилотного клинического исследования определили перспективу более широкого применения гимантана при болезни Паркинсона, в том числе в составе комплексной фармакотерапии.

Установленный комплексный механизм действия гимантана — дофаминергический (Ковалев и др., 2007; Абаимов и др., 2008), блокада ионных каналов глутаматных рецепторов NMDA подтипа (Елшанская и др., 2000), ингибирование МАО-В (Вальдман и др., 2003; 2004), иммунотропная активность (Нежинская и др., 2003) - позволяет предположить наличие у гимантана свойств нейропротектора.

Целью исследования явилась оценка эффектов гимантана в сравнении с амантадином на моделях ранних стадий болезни Паркинсона и леводопа-индуцированных дискинезий и изучение механизмов его нейропротекторной активности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить эффекты гимантана в сравнении с амантадином на модели леводопа-йндуЦирйвШшых дйскийезий у крыс С паркйнсййическШи ёиНдромом средней M5këctM) вызванным унилатеральным интранигральным введением 6-гидрОкеидьфамиИа (6-1 ОДА).

2. Йзучйь йффектк гимантана, леводопы и Их комбинации на модели каталепсии, вызванной галоперндшюм.

3. Изучил эффект Гимантана в сравнений с амантадином на поведение и когнитивные функции крыс на модели ранней («досимптомной», домоторной) стадии паркинсонического синдрома, вызванного билатеральным интранигральным введением нейротоксина МФТП.

4. Изучить эффект гимантана на модели паркинсонического синдрома, вызванного интранигральным введением эндотоксина липополисахарида у крыс.

5. Изучить противовоспалительную активность гимантана на моделях периферического воспаления.

6. Оценить защитный эффект гимантана и амантадина на модели вызванного 6-ГОДА повреждения клеток нейробластомы человека 8Н-8У5У.

7. Оценить эффект гимантана на уровень ДНК повреждений и продуктов перекисного окисления липидов в структурах головного мозга мышей С57ВЬ/6 на модели паркинсонического синдрома, вызванного системным введением МФТП.

Научная новизна

Впервые установлено, что новый противопаркинсонический препарат гимантан при совместном хроническом введении с леводопой на модели паркинсонического синдрома (ПС) средней тяжести снижает скорость развития и выраженность индуцированных леводопой дискинезий, а амантадин оказывает противоположный эффект, усиливая эти нарушения. Показано, что при совместном применении гимантана и леводопы наблюдается усиление антикаталептической активности обоих препаратов.

На модели ранней («досимптомной», домоторной) стадии ПС доказана способность гимантана предотвращать развитие нарушений памяти и депрессивного компонента поведения.

На модели ПС, индуцированного интранигральным введением липополисахарида (ЛПС), выявлен корригирующий эффект гимантана в отношении вызываемого ЛПС снижения массы тела, акинезии контралатеральной повреждению передней конечности и изменения поведения животных в ответ на раздражающий запах. На моделях периферического воспаления показана противовоспалительная активность гимантана, сравнимая с действием диклофенака. В условиях модели конканавалин А - индуцированного воспаления у мышей гимантан снижает в плазме уровень провоспалительного цитокина ИЛ-6.

На модели вызванного 6-ГОДА повреждения клеток нейробластомы человека 8Н-8У5У установлено, что гимантан в концентрациях КГ7 - 10"8 М оказывает выраженный защитный эффект как при предварительном внесении в среду, так и сразу после нейротоксина, тогда как амантадин эффективен только при применении после 6-ГОДА.

Установлено, что гимантан при предварительном введении препятствует вызываемому МФТП повышению уровня продуктов перекисного окисления липидов (малонового диалъдегида и диеновых коньюгатов) в стриатуме и фронтальной коре мышей С57ВЬ'6.

Полученные данные позволяют расширить представления о спектре противопаркинсонической активности гимантана, его нейропротекторных свойствах и механизмах реализации основных эффектов.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение гимантана в сочетании с леводопой приводит к повышению ее эффективности и снижению риска развития дискинезий при ПС средней тяжести, тогда как при совместном применении леводопы с амантадином наблюдается ускорение развития и усиление выраженности дискинезий, что следует учитывать в клинической практике.

Выявленные защитные эффекты гимантана на моделях паркинсонического синдрома, его противовоспалительные и антиоксидантные свойства позволяют обосновать возможность продолжительного клинического применения препарата на ранних стадиях БП в качестве средства монотерапии, а также включение гимантана в перечень потенциальных средств превентивной фармакотерапии людей с высоким риском развития болезни Паркинсона.

Результаты исследования противоспалительной активности гимантана вошли в состав заявки на изобретение «Средство для терапии боли и воспаления при нейродегенеративных заболеваниях» (per. № 2012139274 от 14.09.12). Положения, выносимые на защиту

1. Гимантан при совместном хроническом введении с леводопой у крыс с ПС средней тяжести, вызванным односторонним введением 6-ГОДА в черную субстанцию, обладает способностью снижать скорость развития и выраженность дискинезий - побочного эффекта леводопы. Амантадин повышает скорость развития и выраженность дискинезий на этой модели.

2. Гимантан усиливает антикаталептический эффект леводопы на модели каталепсии, вызванной галоперидолом.

3. На модели ранней («домоторной», досимптомной) стадии болезни Паркинсона, вызванной билатеральным интранигральным введением нейротоксина МФТП крысам, гимантан подобно амантадину, препятствует развитию когнитивных нарушений и депрессивно-подобного поведения у крыс; антидепрессивный эффект гимантана превышает эффект амантадина.

4. На модели ПС, вызванного односторонним интранигральным введением липополисахарида (ЛПС) гимантан ослабляет вызванные ЛПС нарушения, что свидетельствует о его антипаркинсоническом эффекте и способности замедлять нейровоспаление.

5. На моделях периферического воспаления гимантан проявляет выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект, сравнимый с эффектом диклофенака натрия. В условиях модели конканавалин А - индуцированного воспаления у мышей гимантан снижает в плазме уровень провоспалительного цитокина ИЛ-6.

6. На модели 6-ГОДА повреждений клеток нейробластомы человека SH SY5Y гимантан оказывает достоверный защитный эффект при воздействии как до

нейротоксина, так и сразу после повреждения. Эффект амантадина проявляется только при его введении сразу после повреждения нейротоксином 6-ГОДА. 7. На модели ПС, вызванного системным введением МФТП у мышей линии C57BL/6, гимантан препятствует повышению уровня конечных продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида и диеновых конъюгатов) в структурах головного мозга.

Апробация

Результаты работы представлены на Региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (ECNP) (Санкт-Петербург, апрель 2011), Всемирном конгрессе по болезни Паркинсона и болезням движений (Шанхай, декабрь 2011), Конгрессе Международной коллегии по нейропсихофармакологии (CINP, Стокгольм июнь 2012), Конгрессе Европейского международного общества фармакологов (Гранада, июль 2012), 4-м съезде фармакологов России (Казань, сентябрь 2012).

Публикации

Результаты работы опубликованы в 3 статьях в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и в 7 тезисах в материалах российских и международных конференций и конгрессов. По материалам работы подана одна заявка на изобретение.

Личный вклад

Автор принимал непосредственное участие в моделировании паркинсонического синдрома, самостоятельно выполнял поведенческие эксперименты, проводил оценку ДНК-повреждений на использованных моделях, обработку и анализ полученных результатов. При активном участии автора подготовлены основные публикации по материалам диссертации, сформулированы положения и выводы работы.

Структура работы

Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов. Содержит 12 таблиц и 11 рйсункой. Список литературы включает 230 источников, из них 56 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные — нелинейные белые крысы-самцы, массой 180-200 г, нелинейные белые мыши-самцы, 18-20 г, мыши - самцы линий C57BL/6 и СБА массой 18-20 г (закрытые колонии питомника «Столбовая»),

Препараты, вещества: гимантан (2-(Ы-адамантил гексаметиленимина гндрохлорнд), амантадин (1-аминоадамантана гидрохлорид) синтезированы в опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (рук. проф. Б.М.Пятин), галоперидол (Гедеон Рихтер, Венгрия), бенСеразид, леводопа (Sigma- Aldrich, USA). Нейротоксины: 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-

тетрагидропиридин (МФТП), 6-гидроксидофамин (6-ГОДА), липополисахарид (ЛПС) (EscherichiaColi, Serotype О, SIL2630), конканавалин А, каррагенан (Sigma, США).

Моделирование ПС осуществляли путем введения нейротоксинов в черную субстанцию мозга крыс, наркотизированных этаминалом натрия (45 мг/кг, в/б), согласно координатам стереотаксического атласа для крыс (А=4, L=2,0, Р=8). Для моделирования ПС средней тяжести б-ГОДА вводили унилатерально, в левую черную субстанцию (2 мкг/мкл в 0,02% р-ре аскорбиновой кислоты объемом 4 мкл со скоростью 1 мкл/мин). Для получения селективного действия 6-ГОДА в отношении дофаминовых нейронов за 15 минут до операции вводили ингибитор транспортера норадреналина - дезипрамин (15 мг/кг в/б) (Putterman et al., 2007). Раннюю («досимптомную») стадию ПС моделировали введением МФТП (100 мкг в 2 мкл р-ра Рингера) билатерально в черную субстанцию (Da Cunha et al., 2006). Моделирование ПС липополисахаридом проводили введением ЛПС (10 мкг в 2 мкл раствора Рингера) в левую черную субстанцию (Castaño et al., 1998). Дискинезии, индуцированные леводопой, моделировали у крыс с ПС, вызванным унилатеральным введением 6-ГОДА в черную субстанцию. Животным с двигательными нарушениями хронически вводили леводопу (10 мг/кг) совместно с ингибитором периферической дофадекарбоксилазы бенсеразидом (15 мг/кг). В день тестирования двигательные нарушения оценивали 4 раза после введения препаратов каждые 35 минут на протяжении 140 минут. Регистрировали 4 типа аномальных непроизвольных движений в соответствии с валидированной для крыс шкалой: 1-аксиальная дистония; 2-жевательная дискинезия; 3-дискинезия конечностей, 4-вращательные движения в сторону, противоположную стороне повреждения. Тяжесть нарушений выражали в баллах - 1 балл - случайные, 2-частые, 3 - продолжающиеся, но прерывающиеся при сенсорном раздражении (шумовое раздражение в виде постукивания по клетке), 4 - постоянные, не прерывающиеся при сенсорном стимулировании движения (Lee et al., 2000). Каталепсию моделировали введением галоперидола (1 мг/кг, в/б). Антагонизм с гапоперидолом оценивали в градированной и альтернативной форме по сНоСобндстй йсследуёМых вёЩеетв уменьшать врёмА каталептогенИого еосйШКМ tí npótíerif живЬтнЫХ с каталепсией в тесте rió Morpurgo (1962) И. в тесте . й «Мраллельные стенки» (Воронина И др., 2012). В тесте «Цилиндр» крысу Помещали в прозрачный цилиндр (d = 18, h= 45 см, НПК «Открытая Наука», Москва) и регистрировали касание каждой передней лапой стенок цилиндра в течение 2 минут. В тесте «бйащакзщийся стержень» (UgoBasile, Italy) регистрировали (й течение 3 мин) время удерживания животных на стержне при постоянном ускорении вращения 1,5 об/мин. Для оценки нарушения обоняния при ПС использовали методику «избегания резкого запаха» (Lemasson et al., 2005). Крыс помещали на квадратную арену размером 60x60 см и высотой стенок 30 см,

7

разделенную на 9 равновеликих квадратов. В один из квадратов (угол арены) наносили каплю эфирного цитрусового масла (1-я зона). В течение 2-х минут регистрировали время нахождения животного в каждой из 3-х зон в зависимости от убывания интенсивности запаха в каждой зоне и количество заходов в 1-ую зону.

Влияние веществ на обучение и память оценивали в методике условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) в установке Lafayette Instrument Со, (США). Крысу сажали на ярко освещенную платформу хвостом к входу в темную камеру с электродным полом. Когда крыса заходила в темную камеру, ей наносили неизбегаемое электроболевое раздражение (8-10 ударов, сила тока 0,4 мА, длительность импульса 1с, интервал — 2 с). Через 24 ч после обучения УРПИ проводили тест воспроизведения навыка - крысу сажали на платформу хвостом к отверстию и регистрировали латентный период захода животного в темное отделение (Воронина и др., 2005, 2012). Оценку антидепрессивного действия веществ проводили в тесте вынужденного плавания по Порсолт (1978). Крыс помещали в цилиндр (18x45 см), наполненный водой (t=27±l °С) на 30 см на 15 мин в первый день. Во второй день фиксировали продолжительность пассивного (неподвижность, иммобилизация) и активного поведения животных в течение 6 мин после помещения животного в воду. Уксуснокислый перитонит у мышей вызывали внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты из расчета 1 мл на 100 грамм массы тела животного (Колла, 1998). Через 3 часа мышей забивали, вскрывали брюшную полость, собирали экссудат и измеряли его массу. Острый экссудативный отек на каррагенан у крыс моделировали введением в подушечку стопы 0,1 мл 1 % раствора каррагенана. (Шварц, Сюбаев, 2012). Гимантан вводили в/б за 60 мин до каррагенана. Отек стопы измеряли в течение 5 часов. Реакцию воспаления на конканавалин А (КонА) изучали у мышей линии СВА. КонА вводили в подушечку стопы (20 мкл раствора 5 мг/мл), в контралатеральную конечность -тот же объем физиологического раствора. Через 1 час мышей забивали, определяли массу лап и подсчитывали индекс реакции воспаления по формуле. Оценку повреждений ДНК в клетках структур головного мозга мышей проводили методом ДНК комет (Дурнев и др., 2012). Изучение влияния веществ на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) осуществлялось с использованием оценки уровней диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) спектрофотометрическим методом (Макаров и др., 2012). Определение продуктов пероксидации липидов в гомогенатах структур мозга мыши проводили на спектрофотометре DU-50 (Beckman-Coulter,CIHA). Моделирование повреждения дофаминергических нейронов проводили на клетках нейробластомы человека SH-SY5Y (Xie et al.. 20IPX В культуру клеток вносили нейротоксин 6-ГОДА в конечной концентрации 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 ч. Препараты вносили 3 раза (каждые 48 часов) до внесения 6-ГОДА или сразу после его воздействия в конечных концентрациях 10~6- 10"8 М. Жизнеспособность клеток

определяли с помощью колориметрического МТТ-теста, основанного на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica v. 6.0 с использованием критериев Стьюдеета, Манна-Уитни, Вилкоксона и у2. Количество животных в группе составляло от 8 до 12 голов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Исследование эффектов гнмантана при совместном применении с леводопой на модели ПС средней тяжести и леводопа-индуцированных дискинезий

Крысам с ПС, вызванным унилатеральным введением 6-ГОДА в черную субстанцию, через 3 недели после операции начинали ежедневное введение леводопы (10 мг/кг) с бенсеразидом (15 мг/кг). Доза леводопы является пороговой для индукции моторных нарушений у животных с ПС и наиболее часто используется для моделировании дискинезий у крыс (Lee et al., 2000). Животным группы «леводопа+амантадин» (и=12) одновременно с леводопой и бенсеразидом вводился амантадин 20 мг/кг, группы «леводопа+гимантан» (п=12) - гимантан 10 мг/кг. Препараты вводились внутрибрюшинно в минимальных дозах, в которых была установлена их активность на моделях ПС (Вальдман, 2001).

Хроническое введение леводопы приводило к развитию дискинезий, которые регистрировались с первой недели; к 20-му дню в группе было 40%, к 29-му - 80% животных с проявлениями дискинезий. Наиболее выражены были аксиальный и ротационный компоненты дискинезии. В группе «леводопа+амантадин» процент животных с дискинезиями был максимальным - 78% к 20-му и 90% к 29-му дню, в группе «леводопа+гимантан» - минимальным- 27% и 36%, соответственно.

В группе «леводопа+амантадин» значительно увеличилась скорость развития и тяжесть дискинезий. Достоверные более высокие значения показателей аксиальных и ротационных дискинезий зарегистрированы уже на 8-й день тестирования. Количество ротаций было значимо выше во все дни тестирования. Дискинезии конечностей оказались достоверно более выражены на 16-й и 29-й день по сравнению с животными, которым вводилась только леводопа. Жевательные аномальные движения начали развиваться только с 16-го дня, достоверных отличий от эффекта леводопы не установлено (рис. 1).

В группе «леводопа+гимантан» первые признаки вращательных дискинезий отмечались к концу первой недели, жевательные и дискинезии конечностей - к 20-му дню, а аксиальные дискинезии не появились вовсе. Во все дни наблюдения регистрировались минимальные показатели аномальных движений (рис. 1).

Рисунок 1 Влияние гимантана и амантадина при совместном введении с леводопой на развитие аномальных двигательных реакций у крыс с паркинсоническим синдромом, вызванным унилатеральным введением 6-ГОДА в черную субстанцию

*

1* у

„ ^ N

Г"1

/

---

* У

4 8 12

8 Ї 2 I,

0, *

г" '

г

- - =-= --

. , ^ . , . , .

12 16 20 29

/ 1

Дни наблюдения

Леводопа 10 мг/кг + бенсеразид 15 мг/кг

• ♦•+Аиінтадин20 мг/кг Гимантан 10 мг/кг

Дни наблюдения

По оси абсцисс - дни наблюдения. По оси ординат -аномальные двигательные реакции. * - р<0,05 но сравнению с группой «Леводопа+бенсеразид».

С 29-го по 36-й день амантадин и гимантан отменялись, введение леводопы продолжалось. Установлено, что прекращение длительного введения амантадина не приводит к изменению выраженности компонентов дискинезий. Отмечалось лишь незначительное снижение дискинезий конечностей. Отмена гимантана приводила к повышению выраженности дискинезий, конечностей и жевательного компонента. Степень жевательной дискинезии достигла уровня группы, получавшей только л&йОДОпу: Возобновление совместного <3 лёвйдоНой введения гимантана и амантадина в течение 7 дней гхривело в группе, Получавшей гимантан, к восстановлению уровня дискинезий, который был определен до отмены, то есть к значительному снижению их выраженности. На фоне амантаДина зарегистрирован прирост выраженности леводопа-индуцированных дискинезий, особенно дискинезий конечностей (рис. 2).

Эти данные подтверждают результаты оценки совместных эффектов леводопы и амантадина или леводопы и гимантана, полученные в предыдущем эксперименте.

Таблица 1 Влияние гимантана, леводопы и их комбинации на выраженность галоперидоловой каталепсии у крыс в тесте «параллельные стенки»

Группа, доза, способ введения Продолжительность каталепсии, с % крыс с каталепсией =120 с

Время после введения галоперидола

60 мин 120 мин 60 мин 120 мил

Галоперидол 1 мг/кг в/б 74,78±18,0 103,0±12,08 55,56% 77,78%

Гимантан 10 мг/кг в/б + Галоперидол 1 мг/кг в/б 19,67±9,89* 75,33±21,28 0% 50%

Леводопа, 10 мг/кг в/б + Галоперидол 1 мг/кг в/б 36,67±18,03 69,№23,05 16,67% 50%

Гимантан 10 мг/кг в/б + Леводопа 10 мг/кг в/б + Галоперидол 1 мг/кг в/б 6,33±3,43*# 16,83±3,51*л# 0% 0%

* - Р<0,05 достоверность различий в сравнении с группой «Галоперидол», л -Р<0,05 достоверность различий в сравнении с группой «Гимантан+ Галоперидол», # - Р<0,05 достоверность различий в сравнении с группой «Леводопа +Галоперидол (по критерию Манна-Уитни); п=10.

Таблица 2 Влияние гимантана, леводопы и их комбинации на выраженность галоперидоловой каталепсии у крыс в тесте «ступеньки»_

Группы (доза) Оценка каталепсии в баллах

через 60 мин через 120 мин

Галоперидол 1 мг/кг в/б 5,5±0,34 5,83±0,17

Гимантан 10 мг/кг в/б + Галоперидол 1 мг/кг в/б 1,33±0,99* 2,83±1,05*

Леводопа, 10 мг/кг в/б + Галоперидол 1 мг/кг в/б 2,83±1,28 3,67±1,2

Гимантан 10 мг/кг в/б + Леводопа 10 мг/кг в/б + Галоперидол 1 мг/кг в/б 0,33±0,33* 0±0*л#

* - Р<0,05 достоверность различий в сравнении с группой «Галоперидол», л -Р<0,05 достоверность различий в сравнении с группой «Гимантан+ Галоперидол», # - Р<0,05 достоверность различий в сравнении с группой «Леводопа +Галоперидол» (по критерию Манна-Уитни); п=10.

3. Изучение эффектов гимантана на модели ранней (домоторной, «досимптомной») стадии болезни Паркинсона у крыс

В последние годы для поиска препаратов, способных замедлить прогрессирование заболевания, разработаны модели «досимптомной» стадии болезни Паркинсона у грызунов, позволяющие воспроизводить изменения поведения, предшествующие двигательным нарушениям (Lima et al., 2007; Reksidler et al., 2008, Угрюмов, 2010). Одной из них является модель внутримозгового

и снижение количества заходов в 1-ую зону арены по сравнению с группой «ЛПС» (рис. 5).

Таблица 5. Влияние гимантана на акинезию передней конечности крыс, контралатеральной стороне интранигрального введения липополисахарида (ЛПС), в тесте «Цилиндр» (Mean ±SEM)

Группа

% касаний правой передней лапой стенок цилиндра относительно общего количества контактов верхних конечностей _

Ложно оперированные

48,9± 1,94

ЛПС

31,2±7,84*

Гимантан, 10 мг/кг

40,4±5,16

* - р<0,05 по сравнению с 1руппой ложно оперированных животных, критерий Стьюдента

Рисунок 5 Влияние гимантана на поведение крыс с ПС, вызванным интранигральным введением ЛПС, в методике «избегания резкого запаха»

ВЛО 0ЛПС вЛПС+Гимантан

I время нахождения \

100

о

1 ЗОН2

2 зона

3 зона

ед. 2 0 J количество заходов в 1 зону |

*- р<0,05 по сравнению с группой «ЛПС» (критерий Манна-Уитни).

Таким образом, на модели ПС, вызванного унилатеральным интранигральным введением ЛПС, которая рассматривается также как модель нейровосп&пения, выявлен корригирующий эффект гимантана в отношении индуцированных эндотоксином нарушений: снижения массы тела, акинезии контралатеральной повреждению передней конечности и изменения реакции животных на раздражающий запах. Установленный эффект свидетельствует о наличии у гимантана способности замедлять развитие нейровоспаления.

5. Изучение влияния гимантана на периферическое воспаление

Периферическое воспаление, также как и нейровоспаление, повышает риск развития БП, способствует прогрессированию заболевания и усугубляет тяжесть его симптоматики (Wyss-Coray and Mucke, 2002; Gao and Hong, 2008). Препараты с противоспалительной активностью рассматриваются в качестве потенциальных средств патогенетической комплексной терапии БП (Asanuma, Miyazaki, 2007).

Оценка эффекта гимантана в сравнении с диклофенаком на модели каррагенанового отека у крыс. У контрольных животных выраженность отека была максимальна, достигала своего пика через два часа после введения флогогена, что

16

соответствовало индексу реакции, равному 1,025. Гимантан оказывал дозозависимый антиэкссудативный эффект. Индексы реакции для группы животных, которым вводили гимантан в дозе 40 мг/кг, были достоверно ниже соответствующих показателей группы крыс, получавших препарат в дозе 10 мг/кг, на первом и третьем часу после введения каррагенана. Гимантан в дозе 10 мг/кг не уступал препарату сравнения диклофенаку натрия (10 мг/кг), а в дозе 40 мг/кг достоверно превышал его активность через два и три часа после введения каррагенана (табл. 6).

Таблица 6 Влияние гимантана и диклофенака на индекс реакции в условиях модели острого экссудативного отека на каррагенам у крыс

Группы Индекс реакции

0 час 1 час 2 часа 3 часа 4 часа

Контроль (каррагенан) 0 0,48±0,06 1,03±0,12 0,67±0,11 0,41 ±0,06

Диклофенак, 10 мг/кг 0 0,14±0,02* 0,54±0,05*л 0,39±0,08*л 0,21 ±0,07

Гимантан, 10 мг/кг 0 0,27±0,04*л 0,57±0,09* 0,37±0,07*л 0,19±0,05*

Гимантан, 20 мг/кг 0 0,18±0,04* 0,53±0,05* 0,29±0,05* 0,17±0,06*

Гимантан, 40 мг/кг 0 0,12±0,03* 0,37±0,04* 0,19±0,02* 0,09±0,02*

*-р<0,05 по сравнению с контрольной группой; л-р<0,05 по сравнению с группой «Гимантан, 40 мг/кг» ^-критерий Стьюдента).

Оценка эффекта гимантана в сравнении с диклофенаком на модели уксуснокислого перитонита у мышей. Антиэкссудативная активность гимантана подтвердилась в условиях модели уксуснокислого перитонита у мышей. Гимантан оказывал достоверный противовоспалительный эффект в диапазоне доз от 10 до 40 Мг/кг (табл. 7). МаксйМальйй йыражёНййй аНйвнЬстс гйШйтгШй была зафиксирована прй его введений 6 дозе 20 М1/кг и бЫйа сопоставима с эффективностью препарата сравнения диклофенака натрия в дОзС 10 мг/кг.

Оценка эффекта гимантана на реакцию воспаления на конканавалин А у Мышей. На модели реакции воспаления на конканавалин А (Кон А) у мышей гимантан в диапазоне доз от 10 до 40 мг/кг проявлял выраженный противовоспалительный эффект, достоверно снижая индекс реакции по Сравнению с контрольной группой (табл. 8). При однократном введении гимантана в дозе 10 мг/кг (в/б) было выявлено подавление реакции воспаления на Кон А на 66,7%, в дозе 20 мг/кг - на 52,8%, в дозе 40 мг/кг - на 75,4%.

При исследовании на этой модели влияния гимантана на уровень интерлейкинов в плазме крови животных установлено, что гимантан в дозах 10, 20 и 40 мг/кг достоверно снижал уровень ИЛ-6 в 2,5; 2,1 и 3,8 раза соответственно по сравнению с группой КонА (Кон А - 637,17, гимантан 10 мг/кг - 259,4, 20 мг/кг -287,1,40 мг/кг - 165,53).

Таблица 7 Влияние гимантана и диклофенака на экссудативную стадию воспаления в условиях модели уксуснокислого перитонита у мышей

Группа Масса экссудата, мг Снижение массы экссудата относительно контроля, %

Контроль 849,22±76,16 -

Диклофенак, 10 мг/кг 350,23±34,38* 58,8

Гимантан, 10 мг/кг 575,71±74,67*л 32,2

Гимантан, 20 мг/кг 444,86±91,74* 47,6

Гимантан, 40 мг/кг 534,50±93,72*л 37,1

*-р<0,05 по сравнению с контрольной группой, л- р<0,05 по сравнению с группой «Диклофенак», критерий Манна-Уитни; п=10.

Таблица 8 Влияние гимантана на реакцию воспаления на конканавалин А у мышей

Группа Индекс реакции Снижение индекса реакции относительно контроля, %

Контроль 19,5±2,3 -

Гимантан, 10 мг/кг 6,5±1,5* 66,7

Гимантан, 20 мг/кг 9,2±1,9* 52,8

Гимантан, 40 мг/кг 4,8±1,6* 75,4

* - р<0,01 по сравнению с контрольной группой, t-критерий Стьюдента.

Исследования на моделях КонА и караргенанового отека проводили в лаборатории лекарственной токсикологии совместно с д.б.н. Л.П. Коваленко и к.б.п. A.B. Таллеровой (зав. лаб. чл.-корр. РАМН А.Д. Дурнев).

6, Изучение нейропротекторной активности гимантана на модели 6-ГОДА повреждения клеток нейробластомы человека SH-SY5Y проведено в сравнении с амантадином. Гимантан или амантадин вносили в среду по двум схемам: 1-до повреждения (3 раза каждые 48 часов до внесения 6-ГОДА) и 2 - сразу после 6-ГОДА в конечных концентрациях 10"6—10"8 М. С использованием МТТ-теста установлено, что внесение 6-ГОДА приводило к достоверному повышению гибели

клеток. Предварительное (до 6-ГОДА) внесение гимантана в концентрациях 10"7 и

18

10"8 M достоверно снижало гибель клеток. Внесение амантадина до 6-ГОДА не оказывало достоверного защитного эффекта (Рис.бА). Внесение препаратов сразу после внесения 6-ГОДА приводило к достоверному снижению гибели клеток. Эффект гимантана был одинаковым в концентрациях 10"7-10'8М, эффект амантадина оказался наиболее выраженным к концентрации 10"7М (рис.бБ). Таким образом, в эксперименте in vitro определен нейропротекторный эффект гимантана, проявляющийся при его предварительном внесении (до повреждения) и сразу же после внесения нейротоксина. Эффект амантадина наблюдался только при его внесении в культуральную среду сразу после воздействия нейротоксина.

Эксперименты выполнены в лаборатории фармакологии нейропротекции совместно с K.6.U. Т.Л. Антиповой и И.О. Логвиновым

Рисунок 6 Эффект гимантана и амантадина на модели 6-ГОДА повреждения клеток SH-SY5Y (результаты МТТ-теста)

ГИМАНТАН АМАНТАДИН

А - внесение препарата за 24 часа до повреждения 6-ГОДА; Б - внесение препарата сразу после повреждения. ## - Р < 0,01 по сравнению с контролем; * - Р < 0,05, ** -Р < 0,01 по сравнению с 6-ГОДА.

7. Изучение повреждения ДНК в клетках коры и стриатума мозга мышей C57BL/6 с МФТП-индуцированным ПС и влияния на уровень ДНК гимантана проводили методом ДНК-комет. Использовали две схемы: 1 - повторное введение МФТП (20 мг/кг, в/б, 5 дней; п=8) и декапитация мышей через 24 часа после последнего введения (субхроническая модель с апоптотической гибелью

амантадин. Показано, что гимантан способен замедлять развитие и прогрессирование дискинезий, вызываемых леводопой. На модели индуцированных леводопой дискинезий амантадин в противоположность гимантану усиливает дискинезии. Установлено, что совместное применение гимантана с леводопой приводит к усилению антикаталептической активности обоих препаратов.

Выявлено действие гимантана на различных моделях периферического воспаления, что в совокупности с установленными эффектами на модели нейровоспаления, позволяет сделать заключение о противовоспалительной активности препарата. Показана способность гимантана препятствовать усилению процессов перекисного окисления липидов на модели МФТП-индуцированного ПС. Установлен нейропротекторный защитный эффект гимантана на модели 6-ГОДА повреждения клеток нейробластомы человека БН-ЗУбУ, которая рассматривается как клеточная модель повреждения дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона (Х1е е1 а1., 2010).

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности внедрения гимантана в клиническую практику как средства монотерапии ранних стадий БП и в сочетании с леводопой на развернутых стадиях БП, а также в качестве нейропротекторного препарата для замедления прогрессирования заболевания.

Выводы

1. Гимантан (10 мг/кг) при совместном хроническом введении с леводопой (10 мг/кг) и бенсеразидом (15 мг/кг) снижает выраженность и скорость развития индуцированных леводопой дискинезий (аномальные движения конечностей, жевательные и вращательные движения) у крыс с паркинсоническим синдромом, вызванным односторонним введением 6-ГОДА в черную субстанцию. Амантадин (20 мг/кг), в противоположность гимантану, при совместном хроническом применении с леводопой и бенсеразидом усиливает тяжесть и ускоряет развитие дискинезий в условиях этой модели.

2. Комбинированное применение гимантана (10 мг/кг) с леводопой (10 мг/кг) приводит к усилению антикаталептического эффекта как леводопы5 так и гимантана на МодеЛи каталёпсйй, выданной галопёридолбм.

3. ГйМаМан (10 Мг/кг) й амантадйн (20 мг/кг) препятствуют развитию когНИтйвНЫх нарушений и Депрессйвно-подобного поведения у крыс на модели ранней, «Домоторнош) стадии болезни Паркинсона, вызванной билатеральным интранигральныМ введением нейротоксина МФТП; гимантан оказывает более выраженное антйдёпрессивное действие, чём амантаДин.

4. Гимантан (10 мг/кг) проявляет защитный эффект на модели паркинсонического синдрома у крыс, вызванного унилатеральным интранигральным введением липополисахарида: снижает выраженность акинезии контралатеральной повреждению передней конечности, индуцированного

эндотоксином снижения массы тела и нарушений поведения в ответ на раздражающий запах.

5. Гимантан (10-40 мг/кг) оказывает дозозависимый противовоспалительный эффект на моделях каррагенанового отека у крыс, уксуснокислого перитонита у мышей и конканавалин А - индуцированного воспаления у мышей и по эффективности не уступает диклофенаку натрия (10 мг/кг). В условиях модели конканавалин А - индуцированного воспаления у мышей гимантан снижает уровень провоспалительного цитокина ИЛ-6 в плазме.

6. Гимантан в концентрациях 10-7-10"8 М оказывает защитный эффект на модели 6-ГОДА повреждений клеток нейробластомы человека SH SY5Y при внесении как до нейротоксина, так и сразу после повреждения. Эффект амантадина проявляется только при его применении непосредственно после повреждения клеток нейротоксином.

7. Гимантан (10 мг/кг) при введении в течение 5-ти дней до МФТП (20 мг/кг) и затем 5 дней совместно с нейротоксином устраняет вызываемое МФТП повышение уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в стриатуме и малонового диальдегида в коре.

Практические рекомендации

1. Гимантан может быть рекомендован для клинического изучения на досимптомных стадиях болезни Паркинсона в качестве средства замедляющего прогрессирование заболевания.

2. Целесообразно изучение гимантана в клинической практике как средства монотерапии ранних стадий БП и в комплексной терапии с леводопой на развернутых стадиях БП,

3. Возможность ускорения развития индуцированных леводопой дискинезий при совместном применении с амантадином следует учитывать в клинической практике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Капица, И.Г. Влияние гимантана и амантадина на развитие леводопа-индуцированных дискинезий на модели паркинсонического синдрома у крыс [Текст] / И.Г.Капица, Е.А. Иванова, A.B. Непоклонов, И.И. Кокшенев, Т.А. Воронина, Е.А. Вальдман // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2011,- №7.-С. 9-13.

2. Nepoklonov, A.V. Protective effect of the antiparkinsonian drug hemantane in MPTP model in C57/BL6 mice [Текст] / A.V. Nepoklonov, I.G. Kapitsa, T.A. Voronina T.A., E.A. Valdman / Papers of the 11-th Regional ECNP Meeting S-Petersburg, 14-16 April 2011. // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. - Vol. 21, Suppl. 2. - 2011. - P. S120.

3. Иванова, Е.А. Влияние амантадина и гимантана на развитие леводопа-икдуцированных дискннезий у крыс. [Текст] Z Е.А. Иванова, А.В. Непоклопов, И.И. Кокшенев Z Материалы III Всероссийского научно-практического семинара для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» ZZ Вестник ВолГМУ: приложение. - Волгоград: изд-во ВолГМУ, 2011. - С.34 - 36.

4. Иванова, Е.А. Изучение антикаталептической активности гимантана при различных путях введения и в комбинации с леводопой [Текст] Z Е.А. Иванова, А.В. Непоклонов. И.И. Кокшенев, И.Г. Капица, Т.А. Воронина, Е.А. Вальдман ZZ Биомедицина. - 2012. - № 1. - С. 74 - 81.

5. Kapitsa, I. The new neuroprotective agent hementane reduces L-DOPA-induced dyskinesia in hemiparkinsonian rats. [Текст] Z I. Kapitsa, E. Ivanova, A. Nepoklonov, I. Kokshenev, E. Valdman, T. Voronina ZZ Parkinsonism & Related Disorders. - Vol. 18, Suppl. 2. -2012. -P. SI 18.

6. Nepoklonov, A. Investigation of potential neuroprotective effects of hemantane on DNA damage and lipid peroxidation in mice with MPTP-induced parkinsonism [Текст] Z A. Nepoklonov, A. Zhanataev, E. Anisina, K. Kolyasnikova ZZ Parkinsonism & Related Disorders. - Vol. 18, Suppl. 2. - 2012. - P. S208.

7. Ivanova, E. Effects of hemantane on depressive-like behavior and memory in rat model of Parkinson's disease [Электронный ресурс] Z E. Ivanova, I. Kapitsa, A. Nepoklonov, E. Valdman, T. Voronina Z Abstracts of the 28,h CINP World Congress of Neuropsychopharmacology Stockholm 3-7 June 2012 Sweden. ZZ International Journal of Neuropsychopharmacology. - Suppl. 1 (htpp:ZZjournals.cambridge.orgZ trialregistration "CINP 12"). - P. 204.

8. Таллерова, А.В. Изучение противоспалительной активности нового противопаркинсонического препарата гимантан [Текст] Z А.В.Таллерова, А.В.Непоклонов ZZ Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». -М.: изд-во Фолиум, 2012. - С.139.

9. Nepoklonov, A. Hemantane for prevention and treatment of levodopa-induced dyskinesias in parkinsonian rats [Электронный ресурс] Z A. Nepoklonov, I. Kokshenev, E. Valdman, I. Kapitsa, E. Ivanova, T. Voronina Z Late abstracts of the 6* European Congress of Pharmacology. Granada Spain 17-23 July 2012 ZZ www.ephar2012.org. - P 24.

10. Непоклонов, А.В. Изучение эффектов гимантана на модели ранней («домоторной») стадии болезни Паркинсона у крыс. [Текст] Z А.В. Непоклонов, И.Г. Капица, Е.А. Иванова, Т.А. Воронина, Е.А. Вальдман Эксперим. и клиническая фармакология ZZ Экспериментальная и клиническая фармакологияУ Z 2012,- №11.-С. 3-7.

Список сокращений

БП - болезнь Паркинсона

6-ГО ДА - 6-гидроксидофамин

ДА - дофамин

ИЛ-6 - интерлейкин 6

КОМТ - катехол-О-метилтрансфераза

КонА - конкавалин А

ЛПС - липополисахарид

МАО-B - моноаминооксидаза В

МТТ - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолия бромид

ПС - паркинсонический синдром

МФТП- 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания

NMDA - N-MeTHn-D-acnapxaT

Подписано в печать 25.04.2013 г.

Заказ № 31 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.