Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Роль мутаций некоторых генов естественного и приобретенного иммунитета в течении впервые выявленного туберкулеза у детей и подростков

/

[

"05002226

ПОСПЕЛОВ АЛЕКСЕЙ ЛЬВОВИЧ

РОЛЬ МУТАЦИЙ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ЕСТЕСТВЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА В ТЕЧЕНИИ ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ.

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

Москва -2011

005002226

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии отдела иммунологии Центрального НИИ туберкулеза.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Авербах Михаил Михайлович

Научный консультант:

Доктор медицинских наук Губкина Марина Федоровна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ляшенко Всеволод Андреевич Кандидат биологических наук Афанасьев Константин Иванович

Ведущая организация: Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом

Защита диссертации состоится « /./у» 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.02 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, г.Москва.

Автореферат разослан « У » '¿/ _ 2011 г.

/

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н.

Новикова Л. И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Эпидемическая обстановка по туберкулезу (ТБ) в России остается напряженной на протяжении последних двух десятилетий. Это связано с тем, что имеется большое число не выявленных и не излеченных больных туберкулезом, являющихся источником инфекции [Шилова М.В., 2008]. Регистрируемая заболеваемость существенно различается в субъектах Российской Федерации. Самые высокие показатели как территориальной заболеваемости (229,3/100 тыс. населения), так и заболеваемости постоянного населения (180,9/100 тыс.) зарегистрированы в 2009 г. в Республике Тыва. Они превышают среднероссийские показатели (82,6 и 66,8 на 100 тыс. населения, соответственно) в обоих случаях в 2,7 раза (Аналитический обзор по туберкулезу в Российской Федерации, 2009). При оценке эпидемиологических показателей по туберкулезу большое внимание уделяется заболеваемости детей и подростков, которая наиболее достоверно отражает напряженность ситуации по туберкулезу [Аксенова В.А. и др., 2002; Овсянкина Е.С. и др., 2008; Чернеховская Н.Е. и др., 2008].

Известно, что туберкулез является мультифакториальным заболеванием. Исход первичной встречи микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) (МБТ) с организмом (человеком) зависит от состояния иммунной системы. Дети и подростки относятся к категории, характеризующейся повышенным риском развития туберкулезной инфекции, поскольку у детей происходит возрастное становление иммунной системы, а в подростковом возрасте происходит физиологическая перестройка гормональной системы [Бережков Л.Ф., 1984].

Концепция генетической предрасположенности к туберкулезу получила подтверждение благодаря целому ряду исследований [Newpor M.J. et al.,1995; Alcais A. et al., 2005]. При проведении популяционных исследований было показано, что неблагоприятное течение туберкулеза у больных различных национальностей наблюдается при наличии определенных антигенов HLA [Поспелов JLE. и др., 1987, 2003; Садыков А.С. и др.,1999]. Также изучались различные мутации генов естественного и приобретенного иммунитета и их ассоциация с туберкулезом [Bellamy R. et al., 1998; Lopez-Maderuelo D. et al., 2003; McAdam K.P.W.J., 2004]. Полученные в этих исследованиях результаты были неоднозначны, поскольку аллельные варианты, которые ассоциировались с туберкулезом в одной популяции, не всегда прослеживались на других.

Изучение уровня цитокинов показало, что в антимико бактериальной защите важную роль играют различные цитокины: IFNy, TL-2, TNFa, IL-ip, IL-10, TGFp, IL-8 [Маянский Л.Н., 2003; Yamada H. et al„ 2000; Smith S. et al„ 2002; Li H.T. et al., 2006]. Однако в зависимости от характера течения заболевания уровень цитокинов в сыворотке больного изменяется по-разному.

Работ, которые включали бы в себя одновременно иммунологические, генетические и клинические исследования в оценке развития впервые выявленного туберкулезного процесса у детей и подростков нами не выявлено.

В связи с этим, актуально проведение комплексного исследования, направленного на изучение взаимосвязи аллелей генов естественного и приобретенного иммунитета с уровнем продуцируемых цитокинов и различными клиническими параметрами туберкулезного процесса у детей и подростков.

Цель работы: определение роли полиморфизма генов естественного и приобретенного иммунитета в течении туберкулеза у детей и подростков.

Задачи исследования:

1. Определить полиморфизм генов Nrampl, IFNy, IL-10 и сопоставить частоты аллелей и генотипов, ассоциирующихся с туберкулезом, у здоровых и больных туберкулезом детей и подростков тувинской и европейской популяций.

2. Сравнить содержание провоспалительных (IFNy, TNFa, IL-ip) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов в сыворотке крови у больных туберкулезом тувинской и европейской популяций до начала противотуберкулезной химиотерапии.

3. Изучить динамические изменения содержания цитокинов (IFNy, TNFa, IL1-P и IL-10) на разных этапах лечения больных туберкулезом в европейской популяции и определить их роль в оценке эффективности проводимой химиотерапии.

4. Изучить корреляцию между аллелями генов IFNy, IL-10, уровнем содержания цитокинов в крови и клиническими характеристиками туберкулеза у больных европейской популяции.

Научная новизна

Впервые показано, что гомозигота по аллелю С сайта INT4 гена Nrampl и гомозигота по аллелю Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще

встречаются у здорового контингента европейской части России, по сравнению с больными ТБ детьми и подростками.

Впервые показано, что гомозигота по аллелю А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречается у больных ТБ детей и подростков европейской популяции по сравнению с не болеющими ТБ. В тувинской популяции этот генотип имеется у большинства больных и контактирующих с больными туберкулезом детей и подростков.

Впервые показано, что у больных туберкулезом на фоне отсутствия «резистентных» генотипов (генотип С/С сайта INT4 гена Nrampl и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy), при генотипах А/А и А/Т сайта +874 гена IFNy уровень цитокина различен и сочетается со степенью тяжести туберкулезного процесса. Так, при генотипе А/А в группе со скудной клинической картиной уровень IFNy был достоверно ниже, по сравнению с группой с выраженной клинической картиной. Уровень IFNy в группе со скудной клинической картиной при генотипе А/А был достоверно ниже, по сравнению с генотипом А/Т.

Практическая значимость

В клинической практике данные об аллельных вариантах генов-кандидатов подверженности туберкулезу могут применяться для формирования групп риска по заболеванию туберкулезом.

Данные, полученные при анализе динамических изменений уровней провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в процессе лечения, могут служить дополнительным оценочным критерием успешно проводимой химиотерапии туберкулеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Дети и подростки тувинской популяции характеризуются низкой частотой встречаемости генотипа С/С сайта INT4 гена Nrampl и генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy, повышенной частотой встречаемости аллеля А сайта D543N по сравнению с европейской популяцией.

• У детей и подростков европейской части России генотип С/С сайта INT4 гена Nrampl и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy ассоциируются с «резистентностью» к туберкулезу. В группе не болеющих туберкулезом детей и подростков тувинской национальности данные генотипы встречаются крайне редко, что может косвенно влиять на тяжелую эпидемическую ситуацию в Республике Тыва.

• Динамическое снижение уровня IFNy в процессе лечения отражает снижение активности туберкулезного процесса в ходе проведения эффективной противотуберкулезной терапии.

• У детей и подростков из европейской части России генотипы А/А и АУТ сайта +874 гена IFNy в разной степени влияют на уровень сывороточного IFNy до начала лечения. При генотипе А/А в группе со скудной клинической картиной уровень IFNy был достоверно ниже, по сравнению с группой с выраженной клинической картиной. Уровень IFNy в группе со скудной клинической картиной при генотипе А/А был достоверно ниже, по сравнению с генотипом А/Т.

Внедрение результатов работы. Результаты диссертационного исследования по уровню цитокинов внедрены в лечебный процесс и используются как дополнительный оценочный критерий успешно проводимой химиотерапии туберкулеза в детско-подростковом отделе ЦНИИТ РАМН. Материалы диссертационного исследования вошли в лекционных курс повышения квалификации специалистов в Учебном Центре ЦНИИТ РАМН.

Апробация работы проведена 17 февраля 2011 на заседании отдела иммунологии ЦНИИ туберкулеза РАМН

Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» ЦНИИТ РАМН (Москва, 2009; Москва, 2010; Москва, 2011), на ученом совете ЦНИИТ РАМН (25.10.2010 г., Москва), на XX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010), на «Workshop: Research opportunities in ТВ drug discovery and diagnostics» (Moscow, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 118 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы 4 схемами и 36 таблицами. Библиографический указатель включает 210 источников, из них 49 работ отечественных авторов.

6

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Были обследованы образцы крови детей и подростков, больных туберкулезом и контактирующих с больными ТБ, тувинской национальности - всего 118 человек. Образцы крови больных собирались в Республиканском противотуберкулезном диспансере Республики Тыва (г. Кызыл, всего 61 человек), образцы группы контактирующих с больными ТБ собирались в противотуберкулезном санатории «Балгазын» (всего 57 человек). В группе детей и подростков женского пола было 48 человек, а мужского пола 70 человек. Возраст в общей группе больных имел диапазон от 3 до 17 лет.

Из европейской популяции были обследованы больные дети и подростки, находящиеся на стационарном лечении в Центральном НИИ Туберкулеза РАМН (ЦНИИТ РАМН) (135 впервые выявленных больных туберкулезом). В группе детей и подростков женского пола было 68 человек, а мужского пола 67 человек. Возраст в общей группе больных имел диапазон от 4 до 17 лет.

Группа контроля (для генетического исследования) европейской популяции, не болеющая туберкулезом, набиралась в Российской детской клинической больнице (дермато-аллергологическое отделение), а также среди детей и подростков из ЦНИИТ, у которых не был установлен диагноз туберкулез. Общее число детей и подростков в контрольной группе составило 51 человек. В группе детей и подростков женского пола было 22 человека, а мужского пола 29 человек. Возраст детей и подростков в группе контроля имел диапазон от 4 до 17 лет.

Для молекулярного генотипирования образцы периферической крови (35 мл) больных туберкулезом и здоровых детей и подростков собирались и помещались в пробирки с EDTA. ДНК выделялась из 200 мкл крови пациентов с помощью наборов для выделения ДНК (Magna DNA Prep 200) фирмы ООО «Лаборатория Изоген» (Россия).

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали набор реагентов для амплификации ДНК «GenePak PCR Core» ООО «Лаборатория Изоген», содержащий ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, lu, 200 мкМ и 2,5 тМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечная концентрация праймеров в реакции 0,1-0,5 мкМ, объем 5 мкл, количество ДНК 50-100 нг, объем 5 мкл. Исследуемые аллельные варианты представлены в таблице А.

Таблица А. Исследуемые полиморфные сайты.

Ген Полиморфные сайты Локализация в гене Литература

NRAMP1 469+14 G/C (INT4) Интрон 4 Soborg С. et al., 2002.

D543N Экзон 15

IFN-y +874 А/Т Интрон 1 Vidyarani M.et al., 2006.

IL-10 -1082 A/G Промотер Hyoung Doo Shin et.al., 2005.

Определение уровня цитокинов INFy, TNFa, IL-lß и IL-10 в сыворотке периферической крови проводилось методом ИФА, с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Венозную кровь набирали в чистую пластиковую пробирку. Для образования сгустка кровь оставляли на 30 мин -1 час при комнатной температуре или помещали в термостат при 37°С. Образовавшийся сгусток крови отделяли от стенок стеклянной палочкой. После этого кровь центрифугировали 10-15 мин при 1500 об/мин. Полученную сыворотку переносили в другую чистую пробирку и замораживали при -80°С. За контроль уровня цитокинов были взяты данные условно здоровых доноров (п=68), представленные фирмой производителем наборов для ИФА.

Распределение генотипов по исследованным локусам проверялось на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга. Для анализа ассоциации туберкулеза с маркерами исследуемых генов использовали критерий при сравнении групп, в которых было менее 50 человек, подсчет осуществлялся с помощью с поправкой Йетса на непрерывность, при числе степеней свободы, равном 1. Расчет всех параметров производился в программе Microsoft Excel 2007, с использованием таких элементов описательной статистики как: измерение медианы, среднего, стандартного отклонения, стандартной ошибки, внутригрупповых дисперсий, расчета доверительных интервалов, а также двухвыборочный t-тест. Также производился расчет отношения шансов и относительного риска.

Результаты исследования и обсуждение

Встречаемость некоторых аллелей генов ^АМР1, ЮТу н 1Ь-10 у больных туберкулезом детей и подростков и контактирующих с больными ТБ Республики Тыва и у больных и здоровых инфицированных детей и подростков из европейской части России.

Распределение частот аллелей (табл. 1) в единичных мутациях генов ШАМР1, и 1Ь-10 в тувинской популяции показало, что разницы между группой больных детей и подростков, и контактирующими с больными по частоте распределения аллелей не наблюдалось. При этом показатели их частоты были практически одинаковыми. В европейской популяции встречаемость тех же аллелей показала идентичную картину с тувинской популяцией. Но между собой популяции отличались по частоте встречаемости отдельных аллелей. Так, в тувинской популяции достоверно чаще встречается аллель А сайта 0543К гена ЫЯАМР! и достоверно реже аллель Т сайта +874 №№/, по сравнению с европейской, в которой аллель Т достоверно чаще встретился в группе здоровых инфицированных детей и подростков, в сравнении с больными туберкулезом.

Таблица 1. Распределение частот генов-кандидатов в тувинской и европейской популяциях._

Категория Показатель ШТ4 ЫКАМГЧ 0543К И11АМР1 +874 ^N7 -10821Ь-10

Аллель Аллель Аллель Атлель

Тувинская популяция

О С А в А Т А в

Больные п=61 частота 0,7213 0,2787 0,09021 0,9098 0,918 0,0823 0,7869 0,2131

Контакты п=57 частота 0,7281 0,2719 0,04392 0,9561 0,921 0,0794 0,7456 0,2544

Европейская популяция

О С А в А Т А в

Больные п=135 частота 0,7406 0,2593 0,0151' 0,9849 0,7707 0,22933 0,8421 0,1579

Здоровые п=51 частота 0,7156 0,2843 0,0098* 0,9902 0,5882 0,41184 0,7745 0,2254

-2,з-з,4-4 _ д0СТ0верН0е различие между группами

При сравнении генотипов сайта ШТ4 гена ШАМР1, Э543Ы гена КЯАМР1, +874 гена №N7 и 1082 гена 1Ь-10 в тувинской популяции оказалось, что разницы между больными ТБ и контактирующими с

больными ТБ детьми по частоте встречаемости генотипов по каждой мутации не обнаружено. В обеих группах наблюдалась практически одинаковая частота встречаемости указанных генотипов (Рис. 1 -4).

В европейской популяции, при сравнении тех же мутаций между группами больных и здоровых инфицированных детей и подростков (Рис. 14), показано достоверное различие в следующих генотипах: генотип С/С сайта ШТ4 гена ШАМР1 (Рис. 1) и два генотипа сайта +874 гена №N7 - А/А и Т/Т (Рис.3). Так генотип С/С мутация ШТ4 гена ЖАМР1 и генотип Т/Т сайта +874 гена 1РМу достоверно чаще встречались в группе здоровых инфицированных детей и подростков, по сравнению с больными туберкулезом (%2=6,45, р<0,05; х2=4,26, р<0,05). Для генотипа С/С сайта ШТ4 гена ^АМР] (Ж=0,088, а для генотипа Т/Т сайта +874 гена №N7 СЖ=0,17. При этом, чем меньше значении (Ж по отношению к единице (ОЯ<1), тем выше протективные свойства генотипа.

Генотип А/А сайта +874 гена 1Ь1\Гу достоверно чаще встречался в группе больных туберкулезом детей и подростков, по сравнению со здоровыми инфицированными (*2 =5,34, р<0,05), при этом (Ж=3,68, а ЯЯ=2,32.

Рис.1 Распределение генотипов сайта INT4 гена NRAMP1 в тувинской и европейской популяциях

• G/G S G/C ■ С/С

56%

0%

54%

49% 50%

Больные тувинской Контактытувинской Больные европейской Инфицированные популяции п=61 популяции п=57 популяции п=135 европейской популяции

п=51

Рис.2 Распределение генотипов сайта D543N гена

^АМР1 в тувинской и европейской популяциях

а в/в я А/в ■ А/А

84% 15% 1% 91% ИР 0% 97% 3% 0% 98% 2% 0%

Больные тувинской Контакты тувинской Больные европейской Инфицированные популяциип=61 популяциип=57 популяции п=135 европейской популяции п=51

ЯА% Рис.3 Распределение генотипов сайта +874 гена П^ в тувинской и европейской популяциях « А/А ■ А/Т ■ Т/Т 84%

56% 57%

16% 16% 25% ЯР

И! °% о% Н 1% Щ > Щш

Больные тувинской Контакты тувинской Больные европейской Инфицированные популяциип=61 популяциип=57 популяциип=135 европейской популяции п=51

I I

I

Рис.4 Распределение генотипов сайта -1082 гена IL-10 в тувинской и европейской популяциях

■ А/А Ш A/G * G/G

70%

Больные тувинской Контакты тувинской Больные европейской Инфицированные популяциип=61 популшиип=57 попупяциип=135 европейской популяции

п=51

Нам представляется, что генотип С/С сайта INT4 гена NRAMP] и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy, достоверно чаще встречающиеся у здоровых детей и подростков, проживающих на европейской части России, могут рассматриваться как генотипы «резистентности» к туберкулезу. Стоит учитывать, что это только генотип одной мутации, а не гаплотип всего гена. Как ассоциируются остальные генотипы конкретного гена с туберкулезом пока еще не изучено.

В то время как по данным нашего исследования генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy можно рассматривать как генотип «резистентности», генотип А/А сайта +874 гена IFNy можно рассматривать как генотип «чувствительности» к туберкулезу. Так, генотип А/А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречался у больных туберкулезом детей и подростков по сравнению со здоровыми инфицированными, проживающими на европейской части России, а в тувинской популяции частота генотипа А/А доминировала над генотипом А/Т в обеих группах (больные и контакты по туберкулезу). Связывая избыточное наличие в тувинской популяции чувствительного генотипа А/А сайта +874 гена IFNy и отсутствие резистентного генотипа С/С сайта INT4 гена NRAMP1 и генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy, возможно предположить, что они оказывают влияние на сложившуюся тяжелую эпидемиологическую ситуацию в Республике Тыва. При этом данные генотипы ассоциируются с заболеваемостью туберкулезом в целом, а не с какими-то отдельными его формами.

Таким образом, проанализировав полученные результаты можно говорить о том , что генотип С/С сайта INT4 гена NRAMP1 и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречаются у здорового контингента (детей и подростков), проживающего на европейской части России, и могут рассматриваться как гены резистентности к туберкулезу. Отсутствие этих генотипов у детей и подростков тувинской популяции свидетельствует в пользу возможной повышенной чувствительности к туберкулезу лиц тувинской национальности. Данные генотипы отсутствовали в исследуемой группе, однако они встречаются в тувинской популяции.

Генотип А/А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречался у больных детей и подростков, проживающих на европейской части России, а в тувинской популяции частота данного генотипа доминировала в группах больных и контактах. Исходя из этих данных, можно говорить о том, что генотип А/А, возможно, играет роль в чувствительности к туберкулезу.

Исследованные мутации гена IL-10 (-1082) и гена NRAMP1 (D543N) не показали ассоциаций с туберкулезом. Аллель А сайта D543N гена NRAMPI чаще встречался у детей и подростков из Республики Тыва, по сравнению с детьми проживающими на европейской территории России. Тем самым он может являться специфическим маркером популяции, но при этом никак не влияющим на чувствительность или резистентность к туберкулезу.

Уровень содержания цитокинов IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10 и их динамические изменения в процессе химиотерапии в зависимости от клинических параметров у детей и подростков из Республики Тыва и европейской части России.

Уровень цитокинов определялся до начала лечения у детей и подростков, больных туберкулезом из Республики Тыва и проживающих на европейской части России. Также определяли уровень цитокинов в процессе лечения у детей и подростков европейской части России (для детей и подростков из Республики Тыва измерение уровня цитокинов в динамике не проводилось).

Уровень цитокинов (IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10) в тувинской популяции, до начала лечения, показал достоверное различие только по одному цитокину IL-ip - между группами контактов и больных туберкулезом детей и подростков, р<0,05 (табл. 2). По остальным цитокинам разницы между этими двумя группами не было обнаружено. В ходе исследования при сравнении взаимосвязи уровней цитокинов сыворотки крови и клинических параметров были получены неоднозначные, хотя и достоверные по ряду параметров,

13

данные, но они не всегда совпадали с характером клинической картины заболевания. Это, скорее всего, связано с наличием паразитарных и дерматологических заболеваний, часто встречающихся у детей и подростков тувинской национальности. Данные заболевания могут кардинально изменить цитокиновый фон пациентов.

Таблица 2. Уровень цитокинов у детей и подростков из Республики Тыва.

Группы Цитокины, пг/мл.

1Шу ТОРа 1Ы0 1Ы0

Контакты 47,921±1,522 6,757±0,241 5,46±0,189* 7,091±0,259

Больные ТБ 45,923± 1,694 6,35±0,235 4,987±0,173* 6,667±0,282

*- достоверная разница между группами.

В связи с тем, что в группе контроля детей и подростков европейской популяции имелись различные соматические и остро-бронхиальные заболевания, за контроль уровня цитокинов были взяты данные условно здоровых доноров (п=68), представленные фирмой производителем наборов для ИФА. Контрольную группу из числа здоровых детей и подростков не набирали из этических соображений.

Уровень №N7, ТЫРа, 1Ы Р и 11,-10 в целом в группе больных туберкулезом европейской части России до начала лечения многократно превышал контрольные значения содержания цитокинов в сыворотке, указанные фирмой производителем тест-систем. Уровень 1РКу и 1Ь-10 достоверно снижался к 6-му месяцу пребывания в стационаре вследствие успешной противотуберкулезной химиотерапии, [Ь-1 (3 не претерпевал существенных изменений, а уровень ЮТа достоверно возрастал (табл. 3).

Среди изученных цитокинов (ИТЧу, ТОТа, 1Ь-1 (3 и 1Ь-10) динамические изменения №N7 у детей и подростков оказались наиболее показательными. В общей группе больных ТБ, при группировке по типу начала заболевания были выделены следующие типы: бессимптомное, подострое и острое. При этом уровень ШИу был наиболее высоким до лечения при остром типе начала заболевания и достоверно снижался в процессе успешного лечения во всех трех группах (табл. 4), что повторяет тенденцию изменения 1ГЫу в группе больных в целом.

Таблица 3. Динамика изменения уровня цитокинов у больных ТБ до и после

лечения.

Группы Название Кол-во Уровень Стандартная Диапазон

цитокина (п) пг/мл ошибка пг/мл

контроль И^у 68 2 0-10

1РЫу до лечения 135 53,056' 1,172 29,66-91,279

ТБ больные 1 Шу 3 месяц 86 41,064 1,165 27,84 - 97,66

№N7 6 месяц 37 42,802' 1,666 30,12-75,30

контроль ТЫ Гц 68 0,5 0-6

ТЫГ(1 до лечения 135 6,389г 0,134 3,289- 15,14

ТБ больные ЮТа 3 месяц 86 7,977 0,320 5,08-31,14

ЮТа 6 месяц 37 8,6912 0,416 3,88-18,28

контроль 1Ы[$ 68 1,6 0- и

1Ь-1(5 до лечения 135 5.186 0,137 3,15-10,82

ТБ больные 1Ь-1р 3 месяц 86 4,733 0,175 3,15-12,56

6 месяц 37 4.962 0,343 3,10-15,01

контроль 1Ь-10 68 5 0-31

П.-10 до лечения 135 5,973-* 0,110 3,15-12,13

ТБ больные 1Ь-10 3 месяц 86 6,275 0,146 3,48-9,41

1И0 6 месяц 37 4,813' 0,167 3,37 - 8,54

1-1,2-2,3-3_дОСТОверНОе различие между показателями в группе.

Таблица 4. Динамика изменения уровня цитокинов у больных

туберкулезом детей и подростков в зависимости от типа начала заболевания.

Тип начала заболевания Название цитокина Кол-во (п) Уровень пг/мл Стандартная ошибка Диапазон пг/мл

контроль 1Шу 68 2 0-10

Бессимптомное ИРИу до лечения 86 52,660' 1,504 32,404-91,279

1ТОу 3 месяц 56 41,735 1,565 27,84 - 97,669

1РИу 6 месяц 23 41,254 1,777 30,122-64,808

Подострое №N7 до лечения 19 50,2752 2,803 31,948-73,023

¡БИу 3 месяц 13 41,742 2,829 31,491 -69,828

НЪ1у 6 месяц 4 53,512 7,392 42,445 - 75,305

Острое [П\ту до лечения 19 57,409й 2,176 29,666 - 68,003

ШИу 3 месяц 10 35,553 1,747 28,753 -45,183

Ц-Т\|у 6 месяц 5 40,71 3,509 32,86 - 49,747

'"и"2- достоверное различие уровня П'Ыу между группами, р<0,05

При сравнении групп больных ТБ, разделенных по фазе процесса (инфильтрация, кальцинация и уплотнение) (табл. 5), показано, что динамика уровня цитокинов имела те же тенденции, что и основная группа в целом. При этом разница наблюдалась между группами на шестой месяц лечения. Уровень 1РЫу к шестому месяцу лечения в группе с фазой процесса «уплотнение» был достоверно ниже (Р<0,01) по сравнению с группами «инфильтрация» и «кальцинация».

Таблица 5. Динамика изменения уровня №N7 у больных туберкулезом детей и подростков в зависимости от фазы процесса ТБ.

Название Кол-во Уровень Стандартная Диапазон

Фаза процесса цитокина (П) пг/мл ошибка пг/мл

контроль 1ЕЫу 68 2 0-10

№N7 до лечения 64 53,013' 1,484 35,142-85,346

Инфильтрация 1Шу 3 месяц 45 40,69 1,686 27,84 - 97,669

1Ш7 6 месяц 19 43,910м 2,641 33,317 -75,305

1Шу до лечения 34 50,136* 1,856 32,404 - 87,628

Кальцинация 1Шу 3 .месяц 23 40,44 2,148 29,209 - 69,828

1Шу 6 месяц 9 42,4442,5 2,268 33,773 - 52,942

1Шу до лечения 24 52,2573 3,528 29,67-91,279

Уплотнение 1РЫу 3 месяц 13 43,813 3,232 29,209-61,157

1РИу 6 месяц 6 Зл^б3'4"5 1,579 30,122-40,163

1-1 2-2 3-3-----

-достоверное различие между показателями в группе.

4"4'5"5- достоверное различие между группами по уровню цитокина.

Таким образом, мы исследовали уровень сывороточных цитокинов 1РМу, 1Ь-1р, 1Ь-10 и ТТчТи у больных различными формами туберкулеза детей и подростков европейской части России в динамике (при поступлении и через 3 и 6 месяцев пребывания в стационаре) и у больных и группы контактирующих с больными туберкулезом детей и подростков республики Тыва.

Уровень указанных цитокинов в целом в группе больных туберкулезом европейской части России до начала лечения многократно превышал контрольные значения содержания цитокинов в сыворотке, указанные фирмой производителем тест-систем. Уровень №N7 и 1Ь-10 достоверно снижался к 6-му месяцу пребывания в стационаре вследствие успешной противотуберкулезной химиотерапии, 1Ь-1(5 не претерпевал существенных изменений, а уровень ТЫБа достоверно возрастал. При группировании больных по типам начала заболевания (бессимптомное, подострое и острое) или формам легочного туберкулеза (ИТ, ОТ, ТВГЛУ и «другие формы ТБ») и фазам процесса (инфильтрация, кальцинация и уплотнение) тенденции в изменении содержания №N7, 1Ь-10 и ТЫ Ра соответствовали таковым в группе больных в целом. Уровень 1Ь-1р достоверно снижался при успешном лечении туберкулеза с острым началом заболевания и при лечении таких форм как ИТ, ОТ, и «другие формы ТБ». При лечении ТВГЛУ уровень 1Ь-1Р не изменялся. При анализе уровня цитокинов в зависимости от наличия МБТ выяснилось, что до начала лечения уровень всех цитокинов у больных с наличием МБТ в мокроте не имел различий с больными, у которых нет МБТ выделения. Уровень №N7 и 1Ь-10 у больных МБТ+ и МБТ- достоверно

16

снижался в процессе лечения, уровень ТЫРа достоверно повышался к шестому месяцу химиотерапии лишь у больных МБТ-, а уровень 1Ь-1р оставался неизменным. Влияние фактора наличия распада легочной ткани не отразилось на уровне содержания цитокинов. При изучении влияния фактора туберкулиновой реакции на уровень цитокинов (дети с умеренной реакцией, дети с выраженной реакцией и дети с гиперпробой) выяснилось, что достоверной разницы между уровнем всех цитокинов в трех группах не было. Тенденция изменения уровня цитокинов соответствовала общей группе больных ТБ.

Дети и подростки из Тывы, больные различными формами туберкулеза и контактирующие с больными были обследованы однократно. Уровень всех изученных цитокинов был выше нормы. Отмечено, что уровень 1Ь-1р достоверно выше у больных ТБ по сравнению с контактирующими с больными ТБ, уровни остальных цитокинов не различались.

Сопоставление генетических вариантов мутаций, показателей цитокинов (№N7,1Ь-10) и клинических параметров у детей и подростков с впервые выявленным туберкулезом.

При сопоставлении клинического параметра «объем поражения легочной ткани», изучаемого локуса и уровня цитокина показано, что группа с малой формой и мутацией +874 гена ШКу с генотипом А/Т имеет более высокий уровень ^у до начала лечения, по сравнению с генотипом А/А той же мутации и эта разница статистически достоверна ( р=0,05) (табл.6). Для группы с ограниченной и распространенной формой туберкулеза такого различия не было обнаружено.

При изучении уровня 1Г:Ыу у больных европейской части России в зависимости от фазы туберкулезного процесса было показано его снижение к 6-му месяцу пребывания в стационаре (табл. 5). Изучение влияния генотипа с А/А мутацией +874 гена ШТЯу на его концентрацию в крови показало, что до лечения он наиболее высокий в фазе инфильтрации и достоверно ниже в фазе уплотнения, и снижается в процессе лечения. При генотипе А/Т уровень ШИу, наоборот, до лечения наиболее высокий в фазе уплотнения и достоверно ниже, чем в фазе инфильтрации и кальцинации (р=0,04). Кроме того, при генотипе А/Т уровень ШИу у больных с процессом в фазе уплотнения достоверно выше, чем с генотипом А/А мутацией +874 гена АРИу (табл. 7).

Таблица 6. Уровень П^у у детей и подростков больных туберкулезом, в зависимости от генотипа сайта +874 гена №Му при различных формах

поражения.

Группы Назва1ше цитокина Кол-во (п) Уровень пг/мл± Стандартная ошибка Кол-во (п) Уровень пг/мл+ Стандартная ошибка

Генотип А/А сайта +874 гена 1ЕЫу Генотип А/Т сайта +874 гена 1Шу

Малая форма 1 РЫу до леч. 19 49,506±2,8851 17 58,472±4,326и

И-Иу 3 месяц 13 39,636±2,165 11 42,735+2,748

И^Ыу 6 месяц 3 35,446+0,847 5 40,984+3,700

Ограниче нная форма ШЫу до леч. 26 50,975+2,271 15 52,941+3,367

1Шу 3 месяц 12 44,004+5,693 12 38,451+2.965

I РКу 6 месяц 4 38,337+1,757 6 42,292+2,681

Распрост раненная форма 1РЫу до леч. 28 53,512+1,917 25 49,710+2,362*

1РЫу 3 месяц 19 38,121+1,602 18 43,712+2,246

1ПЧу 6 месяц 8 42,273+3,260 11 47,382+4,349

- достоверные различия уровня 1РЫу в группе «малая форма» р<0,05. 2"2- достоверные различия уровня 1Жу между группами, р<0,05

Таблица 7. Уровень 1Р№/ у детей и подростков, больных туберкулезом, в зависимости от генотипа сайта +874 гена П^Иу при различных фазах

процесса.

Группы Название цитокина Кол-во (П) Уровень пг/мл+ Стандартная ошибка Кол-во (п) Уровень пг/мл+ Стандартная ошибка

Генотип А/А сайта +874 гена 1РТМу Генотип А/Т сайта +874 гена 1Р№/

Инфильтрация 1Шу до леч. 40 53,306+1,8581 24 52,124+2,4612

1Шу 3 месяц 26 40,127+2,662 19 41,459+1,713

1Шу 6 месяц 10 41,805+2,640 9 46,248+4,810

Кальцинация 1РМу до леч. 19 50,852+2,323 15 49,229+3,0854

11'.\,у 3 месяц 12 39.326+2,675 12 41,151+3,2493

1РМу 6 месяц 3 35,750+1,064 7 45,313+2,020

Уплотнение ШИу до леч. 12 44,726+4,083й 12 63,895+6,0992*3'4

1РЫу 3 месяц 6 41,075+5,185 7 47,389+5,316

1ЕЫу 6 месяц 1 35,142 5 35,142+2,251

" ■"' - достоверные различия уровня №N7 между группами, р<0,05 3-3 - достоверные различия уровня №N7 в группе уплотнение, р<0,05.

При группировке больных по типу начала заболевания (бессимптомное, подострое и острое) и изучении у них уровня ШИу было показано его наиболее высокое значение при остром типе начала заболевания и достоверное снижение в процессе успешного лечения во всех трех группах (табл. 4). Наложение на эти факторы генотипа сайта +874 гена [РЫу показало отсутствие какого-либо влияния генотипа на уровень ШИу при различном типе начала заболевания.

Мы выделили две группы больных, имеющих диаметрально противоположные клинические проявления туберкулеза, с целью сравнения генотипов сайта +874 гена IFNy и -1082 гена 1L-10, уровня IFNy и IL-10 в сыворотке крови и клинической картины заболевания. Первая группа из 10 больных туберкулезом детей и подростков имела следующие характеристики туберкулезного процесса: острое начало заболевания, наличие фазы инфильтрации, распада, выделение МБТ. Основной формой туберкулеза в этой группе являлся ИТ - 60%, также присутствовали кавернозный и фиброзно-кавернозный туберкулез. Во второй группе заболевание имело бессимптомное начало, процесс находился в фазе уплотнения, отсутствовал распад легочной ткани, МБТ не выделялись (8 человек). Основной формой туберкулеза в этой группе являлся ОТ - 75%, больные с туберкулемой - 25%. Несмотря на то, что у больных второй группы заболевание выявлено на этапе обратного развития туберкулезного процесса (фаза уплотнения), активность туберкулезной инфекции подтверждалась результатами клинико-лабораторного обследования. Из представленного материала видно, что в первой группе с выраженной клинической картиной (табл. 8) уровень IFNy при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy на момент поступления в клинику был на 10% выше, по сравнению с уровнем IFNy при генотипе А/А, однако малое число наблюдений не позволило показать достоверность указанной тенденции в уровне IFNy. Доля генотипа А/А сайта +874 гена IFNy составила 80% и по 10% пришлось на генотипы А/Т и Т/Т. Генотип А/А и A/G сайта

Таблица 8. Уровень ШЫу и 1Ь-10 (пг/мл) у детей и подростков, больных туберкулезом, в зависимости от генотипа сайта +874 гена при остром начале заболевания, фазе инфильтрации и МБТ(+)

Цитокин/сроки обследования Острое начало заболевания, фаза инфильтрации, наличие распада, МБТ(+)

Генотип сайта +874 гена IFNy Без учета генотипа

+874 А/А +874 АЯ

IFNy до леч. 56,022+3,732' (п=8) 66,634 (п=1) 60,244 (п=1)

IFNy 3 месяц 41,319+5,153 (п=5) 36,055 (п=1) 34,686 (п=1)

IFNy 6 месяц 36,968 (п=1) 40,619 (п=1) -

Цитокин/сроки обследования Генотип сайта -1082 гена 1L-10 Без учета генотипа

-1082 А/А -1082A/G

IL-10 до леч. 5,984+0,384 (п=9) 6,854 (п=1) 6,071+0,355

IL-10 3 месяц 5,657+0,475 (п=4) - 5,657±0,475

IL-Шбмесяц 4.977+1,006 (п=2) - 4,977+1,006

" - достоверное различие в уровне 1ГЫу до лечения при генотипе А/А между двумя группами (см. табл.11), р=0,005

+874 гена 1Ь-10 не оказывал влияния на уровень 1Ь-10 в сыворотке и не прослеживалось взаимного регулирования в уровне сывороточного 1РЫу и 1Ь-10.

Во второй группе больных с более благоприятной клинической картиной (табл. 9) уровень ГРЫу при генотипе А/Т сайта +874 гена ШЩ на момент поступления в клинику был в 1,75 раза (р=0,023) выше, по сравнению с уровнем №N7 при генотипе А/А. Доля генотипов А/А и А/Т сайта +874 гена /ЛУу составила по 50%. Влияния генотипа А/А и АЮ, сайта +874 гена И-10 на уровень 1Ь-10 в сыворотке не прослеживалось.

Таблица 9. Уровень №N7 и 1Ь-10 (пг/мл) у детей и подростков, больных туберкулезом, в зависимости от генотипа сайта +874 гена при бессимптомном начале заболевания, фазе уплотнения и МБТ(-)

Цитокин/сроки обследования Бессимптомное начало заболевания, фаза уплотнения, отсутствие распада, МБТ(-)

Генотип сайта +874 гена IFNy Без учета генотипа

+874 А/А +874 А/Т

IFNy до леч. 39,821±3,483u (п=4) 70,285+12,2182 (п=4) 56,091+7,309

IFNy 3 месяц 36,283+3,538 (п=3) 40.619 (п=1) 41,151+4,373

IFNy 6 месяц - 37,424 (п=1) 37,424

Цитокин/сроки обследования Генотип сайта -1082reHaIL-10 Без учета генотипа

-1082 А/А -1082 A/G

IL-10 до леч. 6,514+0,339 (п=4) 5,875+0,313 (п=4) 6,194+0,235

IL-10 3 месяц 6,147 (п=1) 6,781±l,037in=3) 6,623+0,656

IL-10 6 месяц 5,44 (п=1) - 5,44

достоверное различие в уровне №N7 до лечения при генотипе А/А между двумя группами (см. табл.10), р=0,005 2"2- достоверная разница, р=0,023

Сравнение первой и второй групп больных, имеющих генотип А/Т сайта +874 гена IFNy, не дало достоверных различий в уровне сывороточного lFNy, хотя тенденция этого процесса наметилась. Для генотипа А/А разница между двумя сравниваемыми группами была статистически достоверной (р=0,005). Так, у больных первой группы, с выраженной клинической картиной, уровень IFNy был выше в 1,4 раза, по сравнению со второй группой, имеющей слабую выраженность клинической картины.

Сопоставив между собой группу больных с острым началом заболевания, фазой инфильтрации, наличием распада легочной ткани и МБТ(+) и группу с бессимптомным началом заболевания в фазе уплотнения, без распада и МБТ(-), мы установили, что без учета конкретного полиморфизма обе эти группы по изменению уровня цитокинов повторяют данные по каждому отдельному клиническому параметру

Таким образом, с учетом генотипов уровень IFNy до начала лечения не имел достоверных различий между генотипом А/А сайта +874 гена IFNy и генотипом А/Т и Т/Т в группе с выраженной клинической картиной. Иная картина наблюдалась при меньшей степени выраженности клинической картины, там уровень IFNy был достоверно выше при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy и ниже при генотипе А/А этой же мутации, р=0,023. Между собой генотипы в двух группах также отличались. Достоверную разницу (р=0,005) наблюдали между генотипом А/А в двух группах с диаметрально противоположными клиническими характеристиками до лечения. Для генотипа А/Т разница в уровне цитокина IFNy составила менее 5% и не была достоверной из-за малого числа наблюдений. По нашим данным, генотип А/А ассоциируется с туберкулезом, и в группе с более тяжело протекающими процессами он был представлен в 80% случаев, что в 1,6 раз чаще, чем в группе больных, имеющих скудную клиническую симптоматику (50%). Это косвенно может указывать на то, что генотип А/А на начальных этапах заболевания слабее проявляет свои свойства, по сравнению с генотипом А/Т, позволяя инфекции проявить выраженный характер. В то же время нельзя игнорировать другие локусы гена IFNy, которые также могут влиять как на уровень IFNy, так и на ассоциацию с туберкулезом, т.к. один полиморфизм не может играть единоличную роль в этих процессах.

После начала химиотерапии показатели уровня IFNy между группами и между генотипами в этих группах достоверных отличий не имели, это свидетельствует о том, что на инфекцию в первую очередь влияют химиопрепараты, а иммунный ответ на инфекционное начало отходит на второй план. Установлено, что основная разница в уровне цитокина наблюдалась при естественном развитии инфекции еще до начала лечения.

Динамические измерения уровня IL-10 при генотипах А/А и A/G сайта +874 гена IL-10 в группах сравнения показали изменения в уровне цитокина, сходные с общей группой больных. Уровень IL-10 достоверно снижался к шестому месяцу лечения. Влияния данного генотипа на уровень IL-10 не выявлено.

Выводы

1. Генотип С/С сайта 1ЫТ4 гена ЫЯАМР! и генотип Т/Т сайта +874 гена ШИу достоверно чаще встречаются у здорового контингента европейской части России (8% и 8%, соответственно) по сравнению с больными туберкулезом детьми и подростками (1% и 1%, соответственно). Эти генотипы являются маркерами резистентности в отношении туберкулезной инфекции. Отсутствие выявленных генотипов в тувинской популяции возможно определяет повышенную заболеваемость туберкулезом коренного населения Республики Тыва.

2. Генотип А/А сайта +874 гена №N7 является маркером предрасположенности к заболеванию туберкулезом в обследованной группе детей и подростков европейской популяции. Наличие этого генотипа у большинства обследованных здоровых детей и подростков в тувинской популяции (84%) может способствовать повышенной заболеваемости туберкулезом коренной национальности. При этом, данный генотип ассоциируется с заболеванием туберкулезом в целом, а не с отдельными его формами.

3. Сравнение уровня цитокинов (№N7, ТОТа, 1Ь-1(3, 1Ь-10) у больных европейской и Тувинской популяций до начала противотуберкулезной химиотерапии показало, что только уровень №N7 у больных тувинской популяции до начала лечения был достоверно ниже (р=0,0005), чем у больных европейской популяции.

4. Успешная противотуберкулезная химиотерапия приводила к достоверному снижению уровня ^N7 и 1Ь-10 к 6-му месяцу пребывания в стационаре, уровень 1Ь-1р не изменялся, а уровень ТОТа достоверно возрастал. Наиболее значимым для оценки тяжести туберкулезного процесса и эффективности проводимой терапии оказался №N7, уровень которого у больных туберкулезом детей и подростков достоверно снижался на 20% в процессе химиотерапии.

5. У больных со скудной клинической картиной уровень сывороточного №N7 при генотипе А/Т сайта +874 гена №N7 в 1,75 раза (р=0,023) выше, по сравнению с уровнем №N7 при генотипе А/А до начала лечения. При сравнении групп больных со скудной и выраженной клинической симптоматикой получены достоверные различия (р=0,005) по уровню №N7 при генотипе А/А сайта +874 гена ШЧ7: уровень №N7 был в 1,4 раза выше при выраженной клинической симптоматике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Поспелов АЛ., Кордичева C.IO. Влияние некоторых локусов гена NRAMP1 у детей и подростков на предрасположенность к туберкулезу. Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» / Москва, 2009. - С. 75-77.

2. Поспелов A.J1. Влияние некоторых локусов гена NRAMP1 и IFNy у детей и подростков на предрасположенность к туберкулезу. Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» / Москва, 2010,- С. 107-109.

3. Поспелов A.JI., Кордичева С.Ю., Сороко-Новицкая А.Н., Поспелов JI.E., Чистякова Н.И., Матракшин А.Г., Хайжок В.П., Ставицкая Н.В., Гергерт В.Я., Авербах М.М. Полиморфизм локуса INT4 гена NRAMP1 у детей и подростков с локальным туберкулезом и поствакцинальными осложнениями // Туберкулез и болезни легких. - 2010. - №7. - С. 63-65.

4. Поспелов A.JL, Матракшин А.Г., Чистякова Н.И., Поспелов JT.E. Влияние полиморфизма генов IFNG и IL-10 на восприимчивость к туберкулезу в различных популяциях / Сб. трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания / Москва, 2010, Дуайн Пресс, с.141-142.

5. Pospelov L., Pospelov A., Kordicheva S. Peculiarities of inherited susceptibility to lung tuberculosis in Tuva republic / Workshop: Research opportunities in ТВ drug discovery and diagnostics / Moscow, 2010. p42.

6. Поспелов A.JI. Корреляция мутации гена IFNy с уровнем IFNy при различных клинических параметрах у больных туберкулезом / Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» / Москва, 2011.- С. 66-68.

7. Поспелов A.JL, Авербах М.М., Губкина М.Ф., Поспелов Л.Е. Влияние полиморфизма генов IFNy и IL-10 на синтез цитокинов при туберкулезе легких у детей и подростков// Туберкулез и болезни легких. - 2011. - №3. - С.52-57.

8. Поспелов А.Л., Авербах М.М., Губкина М.Ф. Уровень синтеза IFNy, TNFa, IL-lß и IL-10 на разных этапах лечения туберкулеза у детей и подростков// Туберкулез и болезни легких. - 2011. - №8. - С.36-40.

Список сокращений

NRAMP - Макрофагальный белок, ассоциируемый с естественной

резистентностью

IFNy - интерферон гамма

IFN-yR - рецептор интерферона гамма

IL-10 - интерлейкин 10

IL-lß-интерлейкин 1 бета

TNFa - фактор некроза опухолей альфа

HLA - главный комплекс гистосовместимости человека

ТБ - Туберкулез

МБТ - Mycobacterium tuberculosis

ИТ - инфильтративный туберкулез

ОТ - очаговый туберкулез

ПТК - первичный туберкулезный комплекс

ТВГЛУ - туберкулез внутригрудных лимфатических узлов

Заключение.

В различных популяциях, проживающих на территории России, показатели заболеваемости туберкулезом сильно варьируют. Взаимосвязь определенных генетических маркеров с заболеваниями, в том числе и туберкулезом, не является однозначной. Это подтверждается положительными ассоциациями с туберкулезом различных генетических вариантов одних и тех же генов в разных по происхождению популяциях.

Так высокий показатель заболеваемости туберкулезом в 2009 году выявлен в республике Тыва, уровень которого превышает средний по России в 2,7 раза. Показатели заболеваемости туберкулезом на 100.000 населения составляли в 2007 году - 183,3; в 2008 г. - 185,5; в 2009 г. - 229,3, тогда как по Российской Федерации в эти же годы - 83,3; 85,1 и в 2009 году 82,6. В Республике Тыва особенно высокая заболеваемость отмечается среди коренных жителей, которая в 4-7 раз превышает остальное население [19]. Можно предположить, что наличие туберкулеза у детей в большей степени связано с различными генетическими дефектами иммунной системы, тогда как у взрослых ведущими являются другие факторы (экологический, социальный), но при этом не исключается влияние генетических дефектов [27].

Поскольку тувинская популяция является относительно изолированной географическая изолированность, транспортная), и в такой популяции будут накапливаться чаще одинаковые мутации, и генотип будет иметь меньшую вариабельность (панмиксия внутри популяции), то для анализа генетической составляющей в заболевании туберкулезом данная популяция представляет значительный интерес. Исторически туберкулез не является «коренной» болезнью данного региона и скорее всего, был занесен в результате миграционных процессов населения. Кроме того, хорошо известно, что в эволюционном развитии остаются те гены, которые способствуют наилучшей адаптации организма в среде его обитании. Поэтому наличие этих двух факторов (искусственное привнесение болезни и эволюционное развитие

84 генотипа) может создавать повышенный шанс заболеваемости туберкулезом в данном регионе.

Европейская популяция является составной группой различных популяций, проживающих на европейской территории России. Панмиксия в ней очень высока из-за быстрой миграции населения, и генотип имеет большую вариабельность, по сравнению с изолированной тувинской популяцией. Представляется интересным оценить роль полиморфизма генов в развитии туберкулеза в этих двух популяциях. Развитие болезни является результатом взаимодействия двух генотипов и в данном исследовании генотипа человека с генотипом микобактерии туберкулеза. Результат такого взаимодействия можно оценивать по различным клиническим параметрам, а также иммунологическим показателям. Во многих исследованиях описывается ассоциация полиморфизма генов иммунного ответа человека с туберкулезом: НЬА-ОЯ2, НЬА-ВЮ5,1Ь-1 Яа А2/1Ь -1Ь (+ 3953) А1+, аллели 11214-ТЗ65-11378 гена 1Ь-12 [28; 51; 124; 160; 205]. Также исследовался уровень провоспалительных и противоспалительных цитокинов при туберкулезе (14; 99; 180; 190; 209; 210].

В данном исследовании мы определяли роль полиморфизма генов Ыгатр1, ШЫу, 1Ь-10 у детей и подростков тувинской и европейской популяций при туберкулезе в сопоставлении с уровнем провоспалительных (№N7, Т№а, 1Ь1 (3) и противовоспалительных цитокинов (1Ь-10) в сыворотке крови у больных туберкулезом и клиническими параметрами заболевания (форма и распространенность процесса, выделение МБТ из мокроты и характер течения заболевания).

В ходе работы были обследованы больные туберкулезом (61 чел.) и контактные (57 чел.) дети и подростки тувинской национальности - всего 118 человек. Также дети и подростки из европейской части России: больные туберкулезом, находящиеся на стационарном лечении в Центральном НИИ туберкулеза РАМН (европейская популяция) - 135 человек, не больные туберкулезом (группа сравнения) - 51 человек.

В тувинской популяции, в группе больных детей и подростков встречались следующие формы туберкулеза: ИТ - 34,0% (ср.возр. - 15,8 лет), ОТ - 26,0% (ср.возр. - 15,5 лет), ТВГЛУ - 12,0% (ср.возр. - 11,16 лет), ПТК -28,0% (ср.возр. - 14,5 лет). В европейской популяции, в группе больных детей и подростков было следующее распределение форм туберкулеза: ИТ -24,5% (ср.возр. - 15,4 лет), ОТ - 21,0% (ср. возр. - 12,3 лет), ТВГЛУ - 27,5% (ср.возр. - 8,31 лет), ПТК -6,0% (ср.возр. - 8,9 лет) и больные с «другими формами ТБ» - 21,0% (ср.возр. - 12,0 лет).

При сравнении генотипов мутаций INT4 гена Nrampl, D543N гена Nrampl, +874 гена IFNy и 1082 гена IL-10 в тувинской популяции оказалось, что разницы между больными и контактными детьми по частоте встречаемости генотипов по каждой мутации не обнаружено. В обеих группах наблюдалась практически одинаковая частота встречаемости указанных генотипов.

В европейской популяции при сравнении тех же мутаций между группами больных и здоровых инфицированных детей и подростков выявлено достоверное различие в следующих генотипах: генотип С/С сайта INT4 гена Nrampl и два генотипа А/А и Т/Т сайта +874 гена IFNy. Так генотип С/С сайта INT4 гена Nrampl и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречались в группе здоровых инфицированных детей и подростков, по сравнению с больными туберкулезом (% -6,45, р<0,05; л x -4,26, р<0,05). Для генотипа С/С сайта INT4 гена Nrampl отношение шансов заболеть туберкулезом было 8,8% (OR=0,088), а для генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy - 17% (0R=0,17). При этом, чем меньше значение OR по отношению к единице (OR<l), тем выше протективные свойства генотипа.

По литературным данным, ассоциация сайта INT4 гена Nrampl с туберкулезом характерна для Африканских популяций [64; 85; 199].

Европейская популяция по мутации INT4 гена Nrampl не показала ассоциацию с туберкулезом, однако именно в ней частота генотипа С/С была

86 выше (8%) у здорового контроля по сравнению с больными туберкулезом (4%) [182]. Для полиморфизма ШТ4 гена Игатр1 отношение шансов (СЖ) при суммировании данных (мета-анализ) всех исследований за период 19982004 года равнялся 1,14 [132], что является низкой ассоциацией с туберкулезом.

Для азиатских популяций ассоциация с туберкулезом характерна для мутации З'иТЫ и Э5431\Г, что было показано при мета-анализе литературных данных с 1998-2004 года [132]. По данным нескольких исследований выявлено, что аллель А сайта Э543Ы достоверно чаще встречается в азиатских популяциях (на основе 7 работ) - 12% у больных и 8% у здоровых, против 3% у больных и 1,7% в группе здоровых европейской популяции. При подсчете (Ж для всех популяций он равнялся 1,65, что дает среднюю ассоциацию с туберкулезом.

В нашем исследовании аллель А сайта Б543Ы гена Игатр1 в тувинской популяции встречался в 9% случаев у больных и в 4% у контактов, против 1,5% у больных и 1% у здоровых инфицированных европейской популяции.

Генотип А/А сайта +874 гена ШИу достоверно чаще встречался в группе больных туберкулезом детей и подростков, по сравнению со здоровыми инфицированными {% =5,34, р<0,05), при этом отношение шансов заболеть было высоко (СЖ=3,68),а относительный риск заболеть был в два раза выше у носителей данного генотипа, ЫЯ=2,32.

Нам представляется, что генотип С/С сайта ШТ4 гена Игатр1 и генотип

Т/Т сайта +874 гена 1ПЧу, достоверно чаще встречающиеся у здоровых детей и подростков, проживающих на европейской части России, могут рассматриваться как генотипы резистентности к туберкулезу. Стоит учитывать, что это только генотип одной мутации, а не гаплотип всего гена.

Как ассоциируются остальные генотипы конкретного гена к туберкулезу пока еще не изучено. Стоит отметить отсутствие генотипа С/С сайта ШТ4 у больных и контактных детей и подростков тувинской популяции, что может свидетельствовать в пользу возможной повышенной чувствительности к

87 туберкулезу лиц тувинской национальности [Рудко, 2004]. По литературным данным существует и ряд других мутаций гена Nrampl, которые ассоциируются с туберкулезом, но в разных популяциях эта ассоциация по-разному проявляется (5(CA)n, «TGTG»/del 3'UTR, +274 С\Т). [66; 82; 110; 152; 204].

Результаты полученные при исследовании пакистанской популяции, в которой было показано, что при сравнении не болеющего контроля с пациентами, имеющими различные формы туберкулеза, генотип Т/Т сайта +874 IFN-y ассоциировался с легочным туберкулезом, имеющим минимальные поражения, а генотип А/А сайта +874 IFN-y ассоциировался с тяжелыми формами легочного туберкулеза и генерализованным туберкулезом [161].

По данным нашего исследования генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy можно рассматривать как генотип резистентности, а генотип А/А сайта

874 гена IFNy, как генотип чувствительности к туберкулезу. Так генотип

А/А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречался у больных туберкулезом детей и подростков по сравнению со здоровыми инфицированными, проживающими на европейской части России, а в тувинской популяции частота генотипа А/А доминировала над генотипом

А/Т в обеих группах (больные и контактирующие с больными ТБ). Связывая избыточное наличие в тувинской популяции чувствительного генотипа А/А сайта +874 гена IFNy и отсутствие резистентного генотипа С/С сайта INT4 гена Nrampl и генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy возможно предположить, что они оказывают определенное влияние на сложившуюся тяжелую эпидемическую ситуацию в Республике Тыва. При этом данные генотипы ассоциируются с заболеваемостью туберкулезом в целом, а не с какими-то отдельными его формами. По литературным данным в испанской популяции гомозигота по аллелю А сайта +874 гена IFNy ассоциировалась с повышенной чувствительностью к туберкулезу [99]. В популяции западной

Африки мутация +874 гена IFNy была представлена доминированием

88 генотипа А/А у больных туберкулезом [110]. В китайской популяции мутация ПТЧ-у (+874 А/Т) была представлена аллелем А достоверно чаще в группе больных туберкулезом [194]. Тем самым наши данные по этому генотипу подтверждают данные ранее проведенных исследований.

Уровень цитокинов определялся до начала лечения у детей и подростков больных туберкулезом из Республики Тыва и проживающих на европейской части России. Также определяли уровень цитокинов в процессе лечения у детей и подростков европейской части России (для детей и подростков из Республики Тыва измерение уровня цитокинов в динамике не проводилось).

Уровень цитокинов (№N7, ТТМТа, 1Ь-1 (3 и 1Ь-10) в тувинской популяции до начала лечения показал достоверное различие только по одному цитокину - 1Ь-1(3 между группами контактов и больных туберкулезом детей и подростков, р<0,05. Так в группе контактных его уровень был достоверно выше, по сравнению с уровнем в группе больных туберкулезом. По остальным цитокинам разницы между этими двумя группами не было обнаружено.

Данные по уровню цитокинов у больных туберкулезом детей и подростков, проживающих в европейской части России, отличались от уровня цитокинов детей и подростков тувинской популяции. Уровень №N7 был достоверно выше у больных европейской популяции (р=0,0005), уровень 1Ь-10 был выше в тувинской популяции (р=0,014). По остальным цитокинам различий не наблюдалось.

Уровень изучаемых цитокинов (№N7, ТИБа, 1Ь-1р и 1Ь-10) в целом в группе больных туберкулезом европейской части России до начала лечения многократно превышал контрольные значения содержания цитокинов в сыворотке, указанные фирмой производителем тест систем. Уровень №N7 достоверно снижался к третьему месяцу лечения, и сохранялся на том же уровне к шестому месяцу. Снижение уровня 1Ь-10 отмечалось в более поздние сроки, достоверно к 6-му месяцу лечения. Уровень 1Ь-1(3 не претерпевал существенных изменений, а уровень Т№а достоверно возрастал как к третьему месяцу лечения, так и далее к шестому. При группировании больных по типам начала заболевания (бессимптомное, подострое и острое), клиническим формам туберкулеза (ИТ, ОТ, ТВГЛУ и «другие формы ТБ») и фазам процесса (инфильтрация, кальцинация и уплотнение) тенденции в изменении содержания №N7, 1Ь-10 и Т№а соответствовали таковым в группе больных в целом. Уровень 1Ь-1(3 достоверно снижался при успешном лечении туберкулеза у больных с острым началом заболевания и при лечении таких форм как ИТ, ОТ и «другие формы ТБ». При лечении ТВГЛУ уровень 1Ь-1р не изменялся притом, что положительная динамика туберкулезного процесса отмечалась и у этой группы больных. При анализе уровня цитокинов в зависимости от наличия МБТ, выяснилось, что до начала лечения уровень всех цитокинов у больных с наличием МБТ в мокроте не имел различий с больными, у которых не отмечалось выделения МБТ. Уровень №N7 и 1Ь-10 у больных МБТ(+) и МБТ(-) достоверно снижался в процессе лечения, уровень Т№а достоверно повышался к шестому месяцу химиотерапии лишь у больных МБТ-, а уровень 1Ь-1|3 оставался неизменным. Влияние фактора наличия распада легочной ткани не отразилось на уровне содержания цитокинов. При изучении влияния фактора выраженности туберкулиновой чувствительности на уровень цитокинов (дети с нормергией и гиперергией) выяснилось, что достоверной разницы между уровнем всех цитокинов в этих группах не было. Тенденция изменения уровня цитокинов соответствовала общей группе больных туберкулезом.

Среди изученных цитокинов (№N7, ТЫБа, 1Ь-1(3 и 1Ь-10) у детей и подростков европейской популяции динамические изменения №N7 оказались наиболее показательными. По нашему мнению снижение в процессе лечения у больных туберкулезом уровня №N7 может служить дополнительным критерием успеха химиотерапии. Особенно четко это прослеживалось при динамическом изменении его уровня в группе больных туберкулезом, выявленных в фазе уплотнения.

Проводя наше исследование, мы ожидали снижения уровня провоспалительных цитокинов в процессе лечения, однако уровень TNFa повышался. Известно, что в процессе воспаления первично вырабатываются такие цитокины как IL-1, TNFa (макрофаги), которые в дальнейшем активизируют выработку IFNy (Т-клетки). Мы предполагаем, что при проведении химиотерапии инфекционная нагрузка снижается и поэтому идет снижение уровня IFNy, однако МБТ полностью не исчезает, поэтому уровень TNFa может оставаться повышенным, поддерживая механизмы защиты. Так повышение уровня TNFa в процессе лечения может быть связано с тем, что TNFa ингибирует рост микобактерий туберкулеза в легких человека, а при уменьшении его уровня начинается рост микобактерий.

В экспериментах было показано также, что повышение уровня TNFa наблюдается как при наличии живой микобактерии, так и при наличии ее компонентов [102], а нейтрализация TNFa подавляет рост гранулем, повышая чувствительность к туберкулезной инфекции с последующими осложнениями.

Литературных данных, сопоставляющих полиморфизм гена IFNy и уровень сывороточного IFNy с клинической характеристикой туберкулезного процесса, нами не обнаружено. Уровень цитокинов в супернатантах стимулированных макрофагов сопоставлялся с кожными реакциями (PPD+,

PPD-) и у MDR больных [99; 190;201]. Для генотипа А/Т сайта +874 гена

IFNy был отмечен сниженный уровень IFNy у пациентов с PPD+ и PPD-, имеющих гомозиготу по аллелю А, по отношению к другим генотипам (А/Т и Т/Т) [99]. В исследованиях [98; 134; 150] изучали содержание специфических IFNy-синтезирующих клеток среди субпопуляций лимфоцитов CD4+ и CD8+ в сопоставлении с данными кожных проб.

Динамические изменения уровня IFNy на разных сроках противотуберкулезной терапии, как и в нашем исследовании, также

91 проводились [133]. С помощью метода QuantiFERON-TB Gold In-tube было установлено, что уровень IFNy в процессе лечения снижается, его снижение соответствовало рентгенологической картине улучшения, но при этом другие клинические характеристики туберкулезного процесса не рассматривались.

Мы выделили две группы больных, имеющих диаметрально противоположные клинические характеристики туберкулеза легких и органов дыхания с целью сравнения полиморфизма сайта +874 гена IFNy и

1082 гена IL-10, уровня IFNy и IL-10 в сыворотке крови и клинической картины заболевания. Первая группа из 10 человек больных туберкулезом детей и подростков имела острое начало заболевания, фазу инфильтрации, распад легочной ткани, выделяла МБТ. Во второй группе (8 человек) заболевание носило бессимптомное начало, процесс находился в фазе уплотнения, распада не определялось и МБТ не выделялись, активность процесса сохранялась. Было показано, что в первой группе больных с тяжелым течением туберкулеза уровень IFNy при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy был выше на 10%, по сравнению с уровнем IFNy при генотипе А/А на момент поступления в клинику, однако малое число наблюдений не позволило показать достоверность указанной тенденции по уровню IFNy.

Генотип А/А и A/G, сайта -1082 гена IL-10 не оказывал влияния на уровень

IL-10 в сыворотке и не прослеживалось взаимного регулирования уровня сывороточного IFNy и IL-10. Во второй группе больных с более благоприятной клинической картиной уровень IFNy при генотипе А/Т сайта

874 гена IFNy был в 1,75 раза (р=0,023) выше, по сравнению с уровнем

IFNy при генотипе А/А на момент поступления в клинику. Влияния генотипа

А/А и A/G сайта -1082 гена IL-10 на уровень IL-10 в сыворотке также не прослеживалось. Хотя сравнение первой и второй групп больных, имеющих генотип А/Т сайта +874 гена IFNy, не выявило достоверных различий в уровне сывороточного IFNy, отмечена тенденция этого процесса. Генотип

А/А в этих двух группах достоверно отличался по уровню IFNy. Так в группе больных со скудной клинической симптоматикой уровень IFNy был

92 достоверно ниже, по сравнению с группой больных с выраженной клинической картиной (р=0,005). Генотип A/G сайта -1082 гена IL-10 характеризовался достоверно более низким уровнем IL-10 в сыворотке у больных второй группы (р=0,042).

Таким образом, комплексное иммуно-генетическое и клиническое исследование позволило выявить влияние генетической компоненты на уровень цитокинов у впервые выявленных больных туберкулезом детей и подростков и взаимосвязь с выраженностью клинической симптоматики. Было показано, что роль полиморфизма +874 гена IFNy заключается во влиянии его на уровень цитокина IFNy при развитии туберкулеза до лечения, и этот уровень меняется в зависимости от аллельных вариантов и тяжести течения туберкулезного процесса при естественном развитии болезни.

Влияние полиморфизма на уровень цитокина нивелируется более сильным и эффективным компонентом, которым являются химиопрепараты, приводящие к более быстрому снижению инфекционной нагрузки с последующим заживлением туберкулезного воспаления, чем это могло бы происходить при естественном течение процесса.

По нашему мнению дальнейшее исследование возможной роли сочетания генотипов А/Т сайта +874 гена IFNy и A/G сайта -1082 гена IL-10 при увеличении числа наблюдений может позволить выявить предполагаемое положительное влияние данного протяженного гаплотипа на течение туберкулезного процесса. Данное предположение согласуется с результатами некоторых исследований. Так у колумбийцев генотип А/А сайта -1082 гена IL-10 и аллель Т сайта +874 гена IFNy ассоциировался с туберкулезным плевритом [113]. Генотип Т/Т ассоциировался с высоким уровнем IFNy и реже встречался у больных туберкулезом по сравнению со здоровым контролем у сицилийцев [138]. У китайцев генотип А/А сайта +874 гена IFNy чаще встречался у больных туберкулезом (Р<0.001, OR=3.79), и продуцировал меньший уровень IFNy [194]. А для IL-10 гаплотип GCC,

93 образованный мутациями -1082 (G/A), -819(С/Т) и -592 (С/А), показал слабую ассоциацию вместе с генотипом А/А сайта +874 гена IFNy с внелегочным туберкулезом у китайцев. Было определено, что фактор транскрипции NFkB был связан с аллелем Т сайта +874 гена IFNy, который был представлен в группе здорового контроля [169]. Снижение уровня IFNy отмечалось для гомозиготы по аллелю А, по отношению к другим генотипам (А/Т и Т/Т) у больных испанцев [99].

Заболевание человека туберкулезом зависит от многих факторов и со стороны организма хозяина находится под полигенным контролем. Известна ассоциация HLA-DR аллелей с развитием заболевания. [28; 160;33; 145; 179]. В работе Delgado и соавторов удалось представить конкретный механизм влияния аллельного варианта DQB*0503 на функциональную активность кодируемого протеина, который имеет слабую аффинную связываемость с ESAT-6, что выражается в низком уровне IFNy [96]. Показана роль полиморфизма гена VDR [205] и роль самого витамина D3 [167], TOJIJI-2 рецепторов (TLR2 753N) и адаптерного протеина TIRAP сигнального пути TOJIJI-2 и ТОЛЛ-4 рецепторов [125; 154], полиморфизма промотерного региона DC-SING рецептора дендритных клеток [60] и генов SFTPA1 SFTPA2, кодирующих белки сурфактанта [105; 143]. Поэтому в дальнейшем было бы интересно провести исследование, сопоставляющее полученные нами данные с одним из выше перечисленных кандидатов.

1. Генотип С/С сайта П\ПГ4 гена №1АМР1 и генотип Т/Т сайта +874 гена №N7 достоверно чаще встречаются у здорового контингента европейской части России (8% и 8%, соответственно) по сравнению с больными туберкулезом детьми и подростками (1% и 1%, соответственно). Эти генотипы являются маркерами резистентности в отношении туберкулезной инфекции. Отсутствие выявленных генотипов в тувинской популяции определяет повышенную заболеваемость туберкулезом коренного населения Республики Тыва.

2. Генотип А/А сайта +874 гена №N7 является маркером предрасположенности к заболеванию туберкулезом в обследованной группе детей и подростков европейской популяции. Наличие этого генотипа у большинства обследованных здоровых детей и подростков в тувинской популяции (84%) может способствовать повышенной заболеваемости туберкулезом коренной национальности. При этом, данный генотип ассоциируется с заболеванием туберкулезом в целом, а не с отдельными его формами.

3. Сравнение уровня цитокинов (№N7, Т№а, 1Ь-1р, 1Ь-10) у европейской и Тувинской популяций до начала противотуберкулезной химиотерапии показало, что только уровень №N7 у больных тувинской популяции до начала лечения был достоверно ниже (р=0,0005), чем у больных европейской популяции.

4. Успешная противотуберкулезная химиотерапия приводила к достоверному снижению уровня ПТМу и 1Ь-10 к 6-му месяцу пребывания в стационаре, уровень 1Ь-1|3 не изменялся, а уровень Т№а достоверно возрастал. Наиболее значимым для оценки тяжести туберкулезного процесса и эффективности проводимой терапии оказался №N7, уровень которого у больных туберкулезом детей и подростков достоверно снижался на 20% в процессе химиотерапии.

5. У больных со скудной клинической картиной уровень сывороточного №N7 при генотипе А/Т сайта +874 гена ШЫу в 1,75 раза (р=0,023) выше, по сравнению с уровнем №N7 при генотипе А/А до начала лечения. При сравнении групп больных со скудной и выраженной клинической симптоматикой получены достоверные различия (р=0,005) по уровню №N7 при генотипе А/А сайта +874 гена ШЫу: уровень №N7 был в 1,4 раза выше при выраженной клинической симптоматике.