Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Роль молекулярно-генетических маркеров в определении тактики хирургического лечения больных раком желудка

На правах рукописи

БЫКОВ ИГОРЬ ИГОРЕВИЧ

> 4

РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ТАКТИКИ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ

РАКОМ ЖЕЛУДЬ

005000906

14.01.17-Хирургия 03.02.07 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 НОЯ 2011

Москва-2011

005000906

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Хоробрых Татьяна Витальевна

доктор биологических наук, профессор Немцова Марина Вячеславовна

доктор медицинских наук, профессор Ветшев Сергей Петрович

доктор медицинских наук, профессор Асанов Алий Юрьевич

ФГУ Институт хирургии им. A.B. Вишневского

Защита состоится 2011 года в '//часов на заседании диссертаци-

онного совета Д.208.040.03 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития РФ по адресу: 117998, г.Москва, Нахимовский проспект, д.49.

Автореферат разослан « 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета -доктор медицинских наук,

профессор Шулутко Александр Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В структуре онкологической заболеваемости в России рак желудка занимает второе место после рака легкого у мужчин и третье место после рака молочной железы и меланомных новообразований у женщин.

В России ежегодно регистрируется 40-50 тысяч новых случаев рака желудка. Более половины пациентов с диагнозом рака желудка поступают на лечение с III или IV стадией заболевания, когда хирургическое лечение малоэффективно.

В структуре онкологической смертности населения России рак желудка у мужчин и женщин занимает второе место. Ежегодно в России около 45 тысяч больных умирает от этого заболевания (М. И. Давыдов, Е. М. Аксель, 2006).

Улучшение результатов лечения рака желудка во многом связывают с диагностикой и лечением ранних стадий рака желудка (S. Е. Baldus, Т. К. Zirbes, 1998, Р. Rozen, 2004).

При этом ранние формы рака желудка характеризуются отсутствием па-тогномоничных клинических симптомов и низкой дифференциально-диагностической ролью лабораторных исследований.

Решающую роль в диагностике рака желудка играют рентгенологическое и эндоскопическое исследования с гистологическим анализом биоптатов (В. G. Rembacken, Т. Gotoda, Н. Ono, Н. Kondo, 2001, Е. К. Баранская, В. Т. Ивашкин, 2002).

В основе установления диагноза лежат патогистологические критерии, в то же время остается нерешенным вопрос объективной трактовки морфологических изменений слизистой, особенно при тяжелой дисплазии в условиях хронического воспаления и при подслизистом росте опухоли (JL И. Аруин, JI. JI. Капуллер, В. А. Исаков, 1998, И. В. Василенко, В. Д. Садчиков, 2001, А. М. Ав-далян, 2002, А. М. Авдалян, С. А. Тюляндин, 2003).

Вышесказанное подтверждается и данными японских исследователей. В Японии выявляемость раннего рака желудка наиболее высокая в мире, при этом уровень «пропущенных» случаев раннего рака желудка оценивается в 19% (Н. Suzuki, 1998).

Все перечисленное диктует необходимость поиска дополнительных критериев и методов диагностики рака желудка.

В последнее время, в связи с достигнутым прогрессом в области изучения молекулярно-биологических и биохимических процессов опухолеобразования, в практической онкологии используют биохимические маркеры опухолевого роста (А. И. Карпищенко и соавт., 2001; А.С. Белохвостов и соавт., 2003; F. Safi et al., 1995; A. Spila et al., 2001; M. Duffy et al., 2003; M. Carpelan-Holmstrom et ah, 2006, G. Testino, 2004, H. С. Сергеева, 2009).

Исследование этих маркеров может значительно улучшить диагностику рака желудка.

Группу молекулярных маркеров, используемых в диагностике опухолей, можно разделить на биохимические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические.

Большая часть биохимических онкомаркеров рака желудка, вошедших в клиническую практику, определяется в крови (РЭА, СА-19-9, СА-72-4), а не в слизистой желудка. Это облегчает забор материала для исследования, но известно, что данные маркеры недостаточно чувствительны и специфичны (А. Ф. Лазарев, 2003, Е. Н. Имянитов и соавт., 2010). Они могут определяться в повышенных концентрациях в крови при доброкачественных новообразованиях желудка, воспалительных заболеваниях или при опухолях других локализаций.

Иммуногистохимические исследования проводят в операционном материале, полученном от больных, оперированных по поводу рака желудка, это значительно увеличивает их специфичность. Однако, использование этих маркеров возможно только в послеоперационном периоде, что не позволяет решить проблему ранней диагностики рака желудка. Анализ иммуногистохимических

препаратов является достаточно субъективным и может приводить к различной трактовке результатов исследования (С. И. Мозговой, Э. В. Яковлева 2004).

В последнее время, большое значение начинают приобретать молекуляр-но-генетические маркеры, основанные на использовании ДНК и РНК технологий. К этим онкологическим маркерам можно отнести структурные повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки. Подобные повреждения приводят к изменению экспрессии генов-регуляторов клеточного цикла, к повреждению генов, кодирующих адгезионные белки и факторы активности неоангиоге-неза. В связи с этим происходит изменение показателей метастатической и ин-вазивной активности, аномальное метилирование регуляторных областей ге-нов-супрессоров, изменение активности и экспрессии теломеразы в клетках опухолей (А. А. Новик, Т. А. Камилова, В. Н. Цыган, 2004). Подобные онкологические маркеры являются достаточно чувствительными и специфичными, просты в лабораторном исследовании, однако их применение требует тщательной научной разработки и подготовки для внедрения в клиническую практику.

На сегодня решение проблемы ранней диагностики рака желудка лежит на стыке нескольких дисциплин: молекулярной генетики, биохимии и хирургии рака желудка. Для этого необходимо создать систему молекулярно-генетических, иммуногистохимических и биохимических маркеров, определяемых в биоптатах слизистой желудка, которые помогут в более короткие сроки с большим процентом точности подтвердить или опровергнуть диагноз рака желудка, дополнив тем самым результаты гистологического исследования (В. М. Шелепова, 2006, А. X. Собитов и соавт. 2007).

Все вышесказанное определило актуальность и своевременность данного исследования.

Цель исследования — улучшить результаты лечения больных раком желудка за счет внедрения молекулярно-генетических методов анализа слизистой желудка для комплексной дифференциальной диагностики рака на доопераци-онном этапе.

Задачи исследования:

1. Разработать панель молекулярно-генетических маркеров для оценки изменений слизистой у больных раком желудка, для чего оценить частоту метилирования генов-супрессоров CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, экспрессию генов металлопротеиназ ММР7, ММР9, BIRC5, ТР53, PTGS2, hTERT, а также активность теломеразы в операционном материале у больных раком желудка и в биоптатах слизистой желудка у больных неопухолевыми заболеваниями.

2. Определить связь исследуемых маркеров (аномального метилирования генов CDH1, RASSFIA, MLH1, N33, DAPK и экспрессии генов металлопротеиназ ММР7, ММР9, BIRC5, TPS3, PTGS2, hTERT, а также активности теломеразы) с основными клиническими показателями и морфологическими характеристиками опухоли у больных раком желудка.

3. Изучить диагностическое значение полученной панели молекулярно-генетических маркеров в морфологически нормальной пограничной ткани у больных, оперированных по поводу рака желудка.

4. Установить возможность и целесообразность использования выбранной панели молекулярно-генетических маркеров для предоперационной диагностики у больных с подозрением на рак желудка, в материале биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании.

5. Оценить перспективы использования молекулярно-генетических маркеров для уточнения хирургической тактики лечения больных раком желудка.

Научная новизна.

Разработана оригинальная панель молекулярно-генетических маркеров, включающая исследование аномального метилирования генов-супрессоров и экспрессии генов, а также определение активности теломеразы. Показано, что панель может быть использована в качестве дополнительных маркеров диагностики и прогноза у больных с предполагаемым диагнозом рака желудка, а также для уточнения тактики хирургического лечения в отношении данной категории больных.

Впервые в России произведена оценка возможности использования данной панели на дооперационном этапе, в материале биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании, у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка с целью уточнения тактики хирургического лечения данной категории больных.

Оценена потенциальная диагностическая ценность данной панели молекулярно-генетических маркеров в слизистой оболочке желудка у больных раком желудка.

Практическая значимость работы и внедрение в практику.

Исследование панели молекулярно-генетических маркеров в образцах, полученных при эндоскопическом исследовании у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка, обладает высокой клинической ценностью и может применяться в качестве дополнительного инструмента в предоперационной диагностике рака желудка.

Использование панели молекулярно-генетических маркеров позволяет выделить группу пациентов с высоким риском злокачественного поражения и получить дополнительные диагностические данные для определения показаний к оперативному вмешательству на желудке.

Основные положения работы внедрены, используются и развиваются в Клинике факультетской хирургии им. H.H. Бурденко ПМГМУ им. И.М. Сеченова.

Материалы диссертационного исследования использовались при выполнении НИР по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции».

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на II Российском симпозиуме: «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей» (Москва, 22-23 января 2009г.), на научной конференции «Молекулярные основы наследственной патологии» (Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010г.), на VII международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 28-29 октября 2010г.), на конференции с международным участием «Актуальные вопросы неотложной хирургической гастроэнтерологии» (Геленджик, 3-5 ноября 2010г.), на Всероссийском форуме «Пироговская хирургическая неделя» (Санкт-Петербург, 24-28 ноября 2010 г.), на XI международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 8-12 декабря 2010г.), на VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 24 марта 2011г.), на XI съезде хирургов Российской Федерации (Волгоград, 25-27 мая 2011 г.).

Личный вклад автора.

Автор принимал непосредственное участие в разработке панели молеку-лярно-генетических маркеров. Участвовал во всех этапах клинического обследования пациентов, разработке и выборе оптимальной хирургической тактики лечения, а также самих оперативных вмешательствах. Участвовал в ведении пациентов в послеоперационном периоде. Самостоятельно проводил отбор образцов, подготовку и транспортировку материала для проведения молекулярно-генетических исследований. Математическая обработка полученных результатов с использованием современных статистических программ, формулирование выводов и важных практических рекомендаций проведены лично И.И. Быковым.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 в рецензируемых изданиях, в которых изложены основные положения диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аномальное метилирование генов-супрессоров СОН1, КАББРЫ, МШ1, N33, ПАРК, повышенная экспрессия генов металлопротеиназ ММР7, ММР9, ВШС5, ЬТЕКГ, РТС52, а также увеличение активности теломеразы являются характерными изменениями для рака желудка, но проявляются с различной интенсивностью.

2. Уровни метилирования генов РЛ55ПА, М1Н1, а также экспрессии генов ЬТЕКГ, ММР7, ВШС5, активности теломеразы в опухоли желудка достоверно выше (р<0,01), чем в морфологически нормальной окружающей слизистой желудка, а также по отношению к группе сравнения (биоптаты пациентов с ЖКБ), поэтому эти параметры могут дополнить систему диагностики молекулярно-генетических маркеров рака желудка.

3. Высокий уровень метилирования генов СОН], N33, БАРК в морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевой, косвенно указывает на большую вероятность вовлечения этой ткани в предопухолевую трансформацию и требует дополнительного контроля у пациентов в послеоперационном периоде.

4. Использование панели молекулярно-генетических маркеров является дополнительным методом для определения тактики ведения и прогноза заболевания в послеоперационном периоде у больных, оперированных по поводу рака желудка. Аномальное метилирование генов N33 и СОН1 является маркером негативного прогноза для рака желудка, оно связано с генерализацией опухолевого процесса и метастазированием.

5. Использование панели молекулярно-генетических маркеров является безопасным и эффективным методом предоперационной диагностики рака желудка. Принципиально возможно определение аномального метилирования генов, экспрессии генов КГЕКТ, ММР7, В1КС5, активности теломеразы в слизистой желудка на дооперационном этапе в образцах, полученных при эндоскопическом исследовании.

Структура и объем и диссертационной работы.

Диссертация изложена на 160 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками, содержит 44 таблицы, библиография включает 184 источника, из них 30 отечественных и 154 зарубежных.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЙ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего в исследование было включено 156 пациентов с нозологиями: рак желудка - 106 пациентов (группа исследования) и желчнокаменная болезнь -50 пациентов (группа сравнения), находившихся в Клинике факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко УКБ№1 ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова в период с декабря 2008 г. по декабрь 2010 г.

Все 106 пациентов группы исследования (больные раком желудка) прошли стандартное обследование, которое включало лабораторные (ОАК, ОАМ, БХАК, коагулограмму) и инструментальные (ЭКГ, ФВД, УЗИ органов брюшной полости, ЭГДС, рентгенологическое исследование, КТ органов грудной клетки и брюшной полости с в/в контрастированием) методы исследования, а также консультации профильных специалистов. Во время ЭГДС всем пациентам производили забор материала для гистологического и цитологического исследований. У 53 больных материал, полученный при ЭГДС. был исследован на молекулярно-генетические маркеры.

Все 50 пациентов из группы сравнения (больные ЖКБ) прошли предоперационное обследование, включавшее ЭГДС, при котором были получены био-птаты для проведения цитологического, гистологического исследований, а также определения молекулярно-генетических маркеров.

Всем 106 пациентам из группы исследования (больные раком желудка) было проведено плановое оперативное вмешательство: в объеме гастрэктомии 42 пациентам (40%) или резекции желудка 64 пациентам (60%) с лимфаденэк-томией в объеме Д1 9 пациентам (8%), Д2 85 пациентам (87%), ДЗ 13 пациен-

там (12%). Во всех случаях в материале, взятом из опухоли интраоперационно, в последующем, при гистологическом исследовании, подтверждено наличие опухолевых клеток. Во всех биопсийных образцах из краев резекции подтверждено отсутствие опухолевых клеток, определен атрофический гастрит в сочетании с кишечной метаплазией и/или дисплазией различной степени.

Всем 50 пациентам из группы сравнения (больные ЖКБ) была проведена плановая холецистэктомия. Во всех биопсийных образцах от пациентов с ЖКБ было подтверждено отсутствие опухолевых клеток и установлен атрофический гастрит без кишечной метаплазии и дисплазии эпителия.

Панель молекулярно-генетнческих маркеров.

В работе использована оригинальная панель молекулярно-генетических маркеров, состоящая из трех частей.

Первая часть включала определение метилирования генов СОН1, ЯАББРЫ, МШ1, N33, ПАРК, то есть определение непосредственно эпигенетических изменений ДНК, которые, однако, в дальнейшем могут быть и не реализованы в виде инициации роста опухоли.

Вторая часть панели молекулярных маркеров включала определение экспрессии генов \iTERT, ММР7, ММР9, ВШС5, РТС82, ТР53, то есть оценку реализации информации, заключенной в ДНК на этапе синтеза РНК, как факта уже произошедшего и далее реализующегося в синтезе белка.

Третьей частью панели являлось определение активности теломеразы -активного белка, синтезируемого опухолевой клеткой.

Метилирование ДНК - процесс ковалентного присоединения метальной группы к цитозину в составе СрО-динуклеотида. Метилирование вызывает эффекты, способствующие полной инактивации экспрессии гена. Аномальное метилирование генов СОН1, ЯА8БР1А, МШ1, N33, ПАРК, приводит к функциональной инактивации этих генов. Аномальное метилирование генов-супрессоров одно из самых ранних событий канцерогенеза и может выявляться задолго до клинического проявления опухолевого роста. Ген СйН! кодирует

белок Е-кадгерин, который отвечает за адгезию клеток. Снижение активности гена приводит к утрате клеточных контактов и приобретению опухолевой клеткой способности к инвазии и метастазированию. Ген - ген-супрессор, участвует в регуляции клеточной пролиферации и в апоптозе, кодирует фактор, контролирующий клеточный цикл. Ген МЬН1 - ген-супрессор, кодирует фактор, участвующий в репарации неспаренных оснований, возникающих вследствие ошибок репликации ДНК. Ген N33 проявляет супрессорные функции и демонстрирует высокий уровень метилирования в различных типах опухолей, происходящих из эпителия. Ген ИЛРК кодирует белковую киназу, обеспечивающую апоптоз и предотвращающую опухолевую прогрессию в результате ингибирования поляризации клетки. Инактивация гена ОАР-киназы приводит к миграции и инвазии опухолевых клеток, препятствует апоптозу.

Матриксные металлопротеиназы - протеазы способные лизировать все структурные компоненты экстраклеточного матрикса, продуцируются клетками стромы вокруг опухоли, их высокую продукцию связывают с метастазировани-ем, неоангиогенензом. ММР7 (матрилизин) - металлопротеиназа, секретируе-мая эпителием опухоли, ее экспрессия коррелирует с гистологической агрессивностью опухоли. ММР9 (желатиназа В) - металлопротеиназа, определяемая в здоровых растущих клетках, играет ведущую роль в ангиогенезе, в опухоли обеспечивает неоангиогенез, тем самым способствуя росту опухоли. Сур-вивин (эигумп) - эндогенный белок, относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза. В норме он участвует в процессах митоза и эмбрионального развития, поэтому присутствует преимущественно в эмбриональных клетках и в нормальных соматических клетках в течение краткого периода митоза. В опухолях ген сурвивина (ВШС5) экспрессируется в больших количествах и подавляет апоптоз. Циклооксигеназа-2 (СОХ-2) катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2 на первой стадии биосинтеза про-стагландинов, тромбоксанов и простациклинов. СОХ-2 увеличивает темп развития кровеносных сосудов и рост опухоли, а также блокирует развитие апоп-

тоза. Ген диклооксигеназы-2 - РТ052. Ген ТР53 кодирует транскрипционный фактор (р53), который при повреждении генома вызывает задержку клеточного цикла в фазе 01 и способствует апоптозу. В опухолевых клетках происходит нарушение функции гена: программа апоптоза переключается на программу неограниченной пролиферации.

Тсломераза - фермент, кодируемый геном кТЕКТ, необходимый для поддержания стабильности хромосом в процессе деления клетки и присутствующий в норме лишь в небольшом пуле активно делящихся клеток. В злокачественной опухоли теломераза играет ключевую роль в поддержании проли-феративного потенциала клеток и дальнейшего роста опухоли.

Тканевой материал для анализа панели маркеров.

У 53 (50%) пациентов группы исследования эндоскопически из края опухоли (точка Н-э) был взят материал на этапе дооперационного обследования, то есть по тем же принципам, по которым он отбирается для проведения предоперационного цитологического и гистологического исследований. Забор материала для исследования маркеров в послеоперационном периоде у больных раком желудка проводили следующим образом. Первый образец ткани (точка 1-о) забирали из верхнего края резекции, 5 см вверх от верхнего видимого края опухоли. Второй образец ткани (точка Н-о) забирали из визуально определяемой области опухоли. Третий образец ткани (точка Ш-о) забирали из нижнего края резекции, 5 см вниз от нижнего видимого края опухоли. Четвертый образец ткани (точка ГУ-о) забирали на расстоянии 0,5 см от видимого края опухоли (рисунок 1). В последующем все участки забора ткани маркировали для возможности их идентификации патоморфологом и получения максимально точного патогистологического заключения. Для каждого образца (точки 1-11-1Н-1У-о, И-э) было проведено гистологическое исследование на выявление опухолевых клеток, и при определении опухоли проводилось ее гистотипирование. У всех 106 (100%) пациентов в каждом (точки 1-П-Ш-1У-о) из образцов, полученных интраоперационно, и у 53 (50%) пациентов из образцов, полученных эндо-

скопически (точка П-э), исследовали аномальное метилирование генов СИН], ЯАББРЫ, МЬН1, N33, ПАРК методом метил-чувствительной ГТЦР, с использованием рестрикционной эндонуклеазы

Рисунок 1. Области забора тканевого материала в исследуемой группе пациентов. Hpall. Анализ экспрессии исследуемых генов hTERT, металлопротеиназ ММР7,

ММР9, BIRC5, PTGS2, ТР53 проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Для чего первым этапом выделяли тотальную клеточную РНК из образцов ткани, далее проводили обратную транскрипцию (синтез кДНК) и полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных первичной структуре кДНК исследуемых генов. Также у всех 106 (100%) пациентов в каждом (I-II-III-IV-о) из образцов, полученных интраоперационно, и у 53 (50%) пациентов из образцов, полученных эндоскопически (П-э), исследовали активность теломеразы модифицированным методом TRAP.

Забор материала в группе сравнения, у больных ЖКБ, для исследования молекулярно-генетических маркеров проводили следующим образом. Эндоскопически из интактной слизистой тела желудка (точка П-э) был взят материал на этапе дооперационного обследования для последующего проведения предоперационного цитологического и гистологического исследований. В каждом из образцов (П-э) исследовали аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1A,

MLH1, N33, DAPK, экспрессию генов hTERT, металлопротеиназ MMP7, MMP9, BIRC5, PTGS2, TP53 и активность теломеразы.

Статистические методы изучения достоверности результатов. Статистическая обработка материала выполнена на персональном компьютере на базе ОС «Windows-XP» при помощи средств «MicrosoftOffice - 2007». База данных характеристик больных была создана на основе «PASWStatistics 18.0» (SPSSInc, США)

Обработка клинических данных и полученных результатов проведена с использованием методов вариационной статистики и расчетом среднего квадра-тического отклонения, ошибок средней арифметической (М±т) и относительной величины (Р±ш). Для оценки достоверности различий пользовались критерием Стьюдента t. В основу оценки статистической достоверности показателей принят уровень вероятности более 95%. Минимальное значение критерия t, при котором различия между средними и относительными величинами считается достоверным, составляет > 2 (р<0,05).

Для оценки диагностической значимости потенциальных онкомаркеров вычисляли чувствительность, специфичность, положительную предиктивную оценку (PV+) и отрицательную предиктивную оценку (PV"), точность теста, отношение правдоподобия положительного (ОППР) и отрицательного результатов (ОПОР), отношение шансов диагностического теста (ОШДТ) по общепринятым в медицине формулам.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Проведен анализ молекулярно-генетических маркеров внутри группы больных раком желудка по клиническим подгруппам, разделенным по гистологическим вариантам опухоли, по распространенности опухолевого процесса, по классификации TNM, по классификации P. Lauren, по поражению лимфоузлов, по размеру опухоли (Рисунок 2).

Овысосодифференцироеанная аденокарцинома Еуиереннодифференцироаанная аденокарцинома £ низкодиффервнцированная аденокарцинома В першевидноклеточный рак ■ недифференцированный рак

ЕЛА □ 16 ЯП

ЯША ■ IIIB а IV

Распределение пациентов по гистологи- Распределение пациентов в зависимости от ста-ческим вариантам опухоли (в %) дии заболевания (в %)

а. Б.

Распределение больных в зависимости от Распределение больных по размеру опухоли в поражения л/у в абсолютных числах абсолютных числах

□ с поражением л/у ■ без поражения л/у

В. г.

Распределение больных по распростра- Распределение больных по классификации Р. ненности опухолевого процесса в абсо- Lauren в абсолютных числах

лютных числах

М Ранний рак Tis-T1NOMO И Местно-распространеиный рак N2-4N0-3M0 О Генерализованнй рак ТлюбаяЫлюбаяМ1

д. е.

Рисунок 2 (а, Б, В, Г, д, е). Распределение пациентов по клиническим подгруппам

Частота метилирования генов СОН1, КАББРЫ, МЬН1, N33, ОАРК, экспрессия ММР7, РТС82, активность теломеразы возрастают с увеличением размера опухоли.

Аномальное метилирование генов N33, СВН\ и увеличение экспрессии 5//?С5, ММР7, РЮ82 являются маркерами негативного прогноза для рака желудка, связаны с генерализацией опухолевого процесса и метастазированием.

Метилирование гена ПАРК является маркером благоприятного прогноза, коррелирует с малой вероятностью метастазирования в лимфатические узлы.

Частота метилирования гена СйН1 достоверно выше, а уровни экспрессии генов ВШС5 и ЬТЕЯТ достоверно ниже в опухолях диффузного типа, чем в опухолях интестинального типа.

Проведен анализ молекулярно-генетических маркеров в группе больных раком желудка в зависимости от области забора (точки 1-Л-Ш-1У-о) (Таблицы 1,2,3).

Таблица 1 Частота метили) зованин генов

юз 1 сои / | КЛХЪИА МШ1 1 ОЛРК

1-0 точка

55,0*6,8 61,25*6,7 | 4,5*2,7 3,0±2,3 | 41,5*6,7

Ц-о точка

61,15*6,7 53,25*6,8 1 14,73*4,7 15,15*3,7 | 35,55*6,6

Ш-о точка

58,6*6,7 54,2*6,8 | 2,8±2,3 2,9*2,3 | 40,5*6,7

1У-0 точка

68,05*6,5 | 65,2546,5 | 4,85±2,7 5,7*3,3 | 52,65*6,8

Таблица 2. Уровни экспрессии генов

Показатель экспрессии гена Точка забора 1-0 Точка забора П-о ОПУХОЛЬ Точка забора Ш-о Точка забора 1У-о Интервал для участка П-о (95 %)

ВШС5 0,57*0,06 0,97*0,06* 0,78*0,078 0,61*0,06 0,86-1,1

ММР9 0,3*0,04 0,65*0,06 0,38*0,04 0,35*0,05 0,54-0,77

ММР7 0,3*0,06 0,8*0,07 0,3*0,04 0,40*0,067 0,66-0,93

1'ТО.Н2 0,16*0,03 0,52*0,06 0,16*0,02 0,16*0,026 0,39-0,64

НТЕЯТ 0,15*0,02 0,42*0,043 0,26*0,038 0,25*,028 0,33-0,5

ТР53 0,25*0,08 0,27*0,05 0,13*0,05 0,36*0,09 0,13-0,4

Таблица 3. Анализ активности теломеразы

Точка забора 1-0 Точка забора П-о Точка забора Ш-о Точка забора 1У-о Интервал для Н-о (95 %)

31,0*4,8 66,1*5,8 32,6*4,9 27,6*5,1 77,7-54,5

Анализ активности маркеров при заборе в разных участках слизистой желудка в группе исследования показал, что в точке 11-о (опухоль) метилирование генов МЗЗПА, МШ1, экспрессия генов КГЕЯТ, РТв$2, ММП7, ММП9, ВЖС5 и активность теломеразы достоверно выше, чем в точках 1-Н1-1У-0 (слизистая

17

близлежащих и отдаленных от опухоли участков). Показатели маркеров прилежащих к опухоли участков и отдаленных от нее участков слизистой (I-III-IV-o) между собой не отличаются. Таким образом, показатели маркеров в опухоли и других участках слизистой желудка отличаются.

Анализ молекулярно-генетических маркеров в группе больных раком (группа исследования) по отношению к группе больных ЖКБ (группа сравнения) (Таблица 4, рисунки 3, 4).

В группе сравнения отмечаются низкие уровни метилирования по генам N33, CDH1, DAPK и отсутствие метилирования по генам RASSF1A, MLH1, низкие показатели экспрессии hTERT, ММР7, BIRC5, низкая активность теломера-зы. Таким образом, данные маркеры потенциально могут быть использованы как маркеры изменений в слизистой характерные для канцерогенеза.

Таблица 4. Анализ метилирования генов

N33 ! CDH1 | RASSF1A | MLH1 DAPK

Группа исследования, больные раком желудка (II-o точка - опухоль)

61,15*6,7 | 53,25±6,8 | 14,7514,7 | 15,1543,7 | 35,55«,6

Группа сравнения, больные ЖКЕ (П-э точка)

12,5 ±5,6 | 25,0*6,5 | 0,0 | 0,0 | 12,5 ±5,6

¡нйсч тг. нгщ- ШРЭ ртой

] вгиддкра к> винить |

Рисунок 3. Уровни экспрессии генов (95 % ДИ)

I

I

iii№iiliilililliililli

1

1

AT

| У&чы aaCcpa Ii*:' ""ici трол > |

Рисунок 4. Уровни активности теломеразы (95% ДИ)

Анализ молекулярно-генетических маркеров в группе больных раком желудка в зависимости от способа забора (интраоперационно и при ЭГДС, точки П-о и П-э) (Таблицы 5, 6, 7).

Таблица 5. Частота метилирования генов

N33 CDH1 RASSF1A I MLH1 Ii DAPK Р

П-о точка >0,05

61,15±6,7 53,25±6,8 14,75±4,7 | 15,1543,7 | 35,5St6,6

II- э точка

63,0«,6 63,0±6,6 13,1±4,3 | 14,8±4,7 | 50,0±6,8

Таблица 6. Анализ уровней экспрессии

Показатель Точка забора II-0 Точка забора П-э Р

BIRC5 0,97±0,06 0,89±0,05 >0,05

ММР9 0,65±0,06 0,7±0,05 >0,05

MUP7 0,8±0,07 0,77±0,06 >0,05

PTGS2 0,52±0,06 0,47±0,07 >0,05

hTERT 0,42±0,043 0,49±0,05 >0,05

Таблица 7. Анализ активности теломеразы

Показатель Точка П-о Точка П-э Р

Активность теломеразы 66,1±5,8 62,Ш: 4,9 >0,05

В результате проведенного исследования удалось показать принципиальную возможность определения метилирования и экспрессии выбранных генов, активности теломеразы в слизистой желудка на дооперационном этапе.

Полученный в результате эндоскопического исследования материал является достаточным по объему для осуществления молекулярно-генетических исследований.

Анализ молекулярно-генетических маркеров в группе больных раком желудка (группа исследования) в точках забора слизистой желудка отдаленных от опухоли (приближенных к краю резекции, точки 1Д1-0) по отношению к группе больных ЖКБ (группа сравнения) (Таблицы 8,9, 10).

Таблица 8. Частота метилирования генов

Показатель Точка забора 1-о Точка забора Ш-0 ЖКБ Р

N33 55,(«,8 58,6±6,7 12,5 ±5,6 <0,05

сот 61,25±6,7 54,2±6,8 25,0 ±6,5 <0,05

йАРК 41,5±6,7 40,5±6,7 12,5 ± 5,6 <0,05

Метилирование генов ИАББРЫ и МШ1 в группе сравнения не определялось. Таблица 9. Уровни экспрессии генов

Показатель Точка забора 1-0 Точка забора Ш-о ЖКБ Р

В1ЯС5 0,57±0,06 0,78±0,078 0,45±0,17 >0,05

ММП9 0,3±0,04 0,38±0,04 0,6±0,17 >0,05

ММП7 0,3±0,06 0,3±0,04 0,34«,06 >0,05

(>,16±0,03 0,16±0,02 0,43±0,16 >0,05

ИТЕЯТ 0,15±0,02 0,26±0,038 0,15±0,07 >0,05

Таблица 10. Активность теломеразы

Точка забора 1-о Точка забора Ш-о ЖКБ р

31,0 ±4,8 32,6±4,9 30,6±3,0 >0,05

Отсутствие достоверной разницы между показателями метилирования генов ЯАББР1А и МЬН1, уровнями экспрессии генов ЬТЕКТ, металлопротеиназ ММР7, ММР9, ВШС5, РТС52, а также активностью теломеразы в исследуемой группе (больные раком желудка) в точках 1,Ш-о и соответствующими показателями в группе сравнения (больные ЖКБ) подтверждает, что объемы операции (субтотальная дистальная резекция, или проксимальная резекция желудка), выполняемых при местно-распространенном росте опухоли, являются правомочными. поскольку выполняются в пределах не только морфологически неизмененных тканей, но и на фоне молекулярно-генетических изменений, несущих лишь возможный потенциал, который не реализован в развитии опухолевого процесса (экспрессии генов, синтезе белка).

Оценка статистических показателей диагностической ценности моле-кулярно-генетических маркеров рака желудка (Таблица 11).

Таблица 11.Чувствительность и специфичность, положительная и отрицательная пре-диктивная оценка, точность, отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов (ОППР), отношение шансов диагностического теста (ОШДТ) в опре-

Чувс-ть Спец-ть ПоложитПО ОтрицПО Точность ОППР ОПОР ОШДТ

мии 16,3 98,0 100,0 58,0 53,8 8,15* 0,85 9,6

¡ПЬЯНА 15,9 98,0 100,0 57,5 52,6 7,95* 0,86 9,2

втс5 69,8 87,5 78,6 60,9 79,5 5,58* 0,35** 15,9

ММР7 84,9 87,5 75,0 75,7 89,7 6,79* 0,17* 39,9

ЬТЕЯТ 62,3 99,0 100,0 55,5 74,4 62,3* 0,38** 163,9

АТ 66,7 97,0 100,0 58,1 76,9 22,2* 0,34** 65,3

* Наиболее полезные для диагностики тесты ** Полезные для диагностики тесты

С учетом оценки статистических показателей диагностической ценности маркеров экспрессию КГЕКТ, ММР7, ВШС5, а также определение активности теломеразы целесообразно использовать для дооперационной дифференциальной диагностики у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка.

Выводы

1. Для адекватной оценки молекулярно-генетических изменений слизистой у больных раком желудка целесообразно использовать комплексную панель, включающую маркеры различных стадий канцерогенеза и пригодную как на этапах диагностики, так и лечения. Разработанная панель молекулярно-генетических маркеров адекватна для оценки изменений слизистой у больных раком желудка. Она включает определение частоты метилирования генов-супрессоров СИШ, РАББР1А, МШ1, N33, ПАРК, экспрессию генов металло-протеиназ ММР7, ММР9, ВШС5, РТС82, ЪТЕЯТ, а также активности теломеразы. Интенсивность метилирования генов, показатели экспрессии и активность теломеразы достоверно выше в опухоли, чем в неопухолевой слизистой желудка группы сравнения.

2. Достоверные различия показателей молекулярно-генетических маркеров в клинических подгруппах можно использовать в качестве прогностических показателей течения рака желудка. С увеличением размера опухоли до 2-4 см достоверно возрастает степень метилирования почти всех генов, кроме БАРК, а также экспрессия ВШС5, ММР7, РТСБ2, и активность теломеразы. Аномальное метилирование генов N33 и СОШ, увеличение экспрессии ВШС5, ММР7,

Р7С5.2 являются маркерами негативного прогноза для рака желудка, и достоверно связаны с генерализацией опухолевого процесса, повышаются при генерализованном раке по сравнению с ранним и местно-распространенным раком. Метилирование гена ЭАРК напротив, является маркером благоприятного прогноза, и показатель метилирования снижается при развитии метастазов в лимфатические узлы. Показатели экспрессии генов В1ЯС5 и КТЕКГ при интести-нальном типе рака по отношению к диффузному достоверно выше. Метилирование С£>#/, напротив, характерно для опухолей диффузного типа.

3. Частота метилирования генов ЯАББРЫ, МШ1, экспрессии генов ЪТЕЯТ, ММР7, В1ЯС5, активности теломеразы в опухоли желудка достоверно выше (р<0,01), чем в морфологически нормальной окружающей слизистой желудка. Высокий уровень метилирования генов СВН1, N33, ОАРК в морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевой, не случаен и он косвенно указывает на вовлеченность этой ткани в предопухолевую трансформацию слизистой оболочки желудка.

4. Для предоперационной диагностики рака желудка с использованием молеку-лярно-генетических маркеров целесообразно использовать биопсийный материал, полученный в результате дооперационного эндоскопического исследования. Количество ДНК, РНК и белка, получаемое из эндоскопического образца, достаточно для проведения серии молекулярно-генетических исследований.

5. Экспрессионные молекулярно-генетические маркеры КГЕКТ, ММР7, В1ЯС5, а также определение активности теломеразы в биоптатах слизистой оболочки желудка на дооперационном этапе, вместе с клиническими, лабораторными и инструментальными показателями позволяют уточнить показания к операции. Субтотальная дистальная и проксимальная резекции желудка при ограниченном антральном или проксимальном росте опухоли, являются правомочными, поскольку выполняются в пределах не только морфологически неизмененных тканей, но и на фоне молекулярно-генетических изменений, несущих лишь

возможный потенциал, который не реализован в развитии опухолевого процесса (экспрессии генов, синтезе белка). Практические рекомендации

1. Параллельно с морфологическим исследованием тканевого материала, полученного при эндоскопическом исследовании, у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка, рекомендуется проводить анализ молекулярно-генетических маркеров. При этом возможно получение дополнительной диагностической информации в сомнительной клинической ситуации.

2. Для дооперационной дифференциальной диагностики у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка могут быть использованы следующие молекулярно-генетические маркеры - экспрессия генов ММР7, hTERT, BIRC5 и активность теломеразы.

3. Определение экспрессии генов hTERT, B1RC5, а также активности теломеразы полезно в диагностике рака, а определение экспрессии ММР7 наиболее перспективно.

4. Экспрессия гена hTERT показывает наибольшую вероятность злокачественного заболевания у пациентов с положительным результатом теста.

5. Исследование аномального метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, экспрессии генов ММР9, PTGS2 рационально проводить для оценки состояния слизистой оболочки после резекции желудка по поводу ракового процесса при динамическом наблюдении за больными с целью исключения истинного рецидива заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Д.Д. Жданов, H.A. Коваленко, Т.В. Хоробрых, И.И. Быков, С.Е. Северин, B.C. Орлова Теломеразная активность и ее связь с экспрессией транскрипционных вариантов гена HSP90cc и гена каталитической субьединицы теломеразы при опухолевых заболеваниях желудка и кишечника // Молекулярная медицина. - 2009 - №6. - С.37-41.

2. А.Ф. Черноусов, Т.В. Хоробрых, М.В. Немцова, А.И. Глухов, И.И. Быков Маркеры генетической нестабильности в диагностике рака желудка // Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека: Материалы II Российского симпозиума с международным участием - Москва, 2009. - С.34.

3. А.Ф. Черноусов, Т.В. Хоробрых, М.В. Немцова, А.И. Глухов, И.И. Быков Маркеры генетической нестабильности в диагностике рака желудка // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. - 2009 - Т. 20. -№ 1.-С. 109.

4. М.В. Немцова, И.И. Быков, A.B. Бабаян и др. Система молекулярных маркеров в диагностике рака желудка II Молекулярные основы наследственной патологии: Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков - Ростов-на-Дону, 2010. - С. 127.

5. О.В. Высоцкая, А.И. Глухов, И.И. Быков, Т.В. Хоробрых Исследование уровня экспрессии генов сервивина и ММР-7 для диагностики онкопатологии желудка // Молекулярная медицина и биобезопасность: Материалы VII международной конференции - Москва, 2010. — С.46-47.

6. А.Ф. Черноусов, Т.В. Хоробрых, И.И. Быков и др. Первый опыт использования маркеров молекулярно-генетической нестабильности слизистой в диагностике рака желудка // Вестник хирургической гастроэнтерологии. - 2010. -№3. - С. 84.

7. А.Ф. Черноусов, Т.В. Хоробрых, И.И. Быков и др. Использование маркеров молекулярно-генетической нестабильности слизистой в диагностике рака желудка // Вестник СПбГУ. - Приложение к научно-теоретическому журналу -2010 - С.204.

8. И.И. Быков, М.С. Микерова Использование молекулярных и генетических маркеров, определяемых в слизистой, для диагностики рака желудка // Здоровье и образование в XXI веке: МатериалыXI международного конгресса- Москва, 2010. -С.47.

9. JI.B. Свинарева, А.И. Глухов, О.В. Зимник, И.И. Быков, Т.В. Хоробрых, В.И. Швец Исследование активности теломеразы при онкопатологии желудка // Биомедицинская химия. - 2010 - Т.56. - №5. - С. 602-608.

10. И.И. Быков Молекулярные и генетические маркеры в диагностике рака желудка // Хирург. - 2010 - №9. - С.52-59.

11. И.И. Быков, М.С. Микерова, М.В. Свинарева и др. Молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака желудка // Вестник РГМУ. - 2011 - Спецвыпуск - №1 - С.342-343.

12. Хоробрых Т.В., Черноусов А.Ф., Быков И.И. и др. Определение маркеров в диагностике рака желудка // Материалы XI съезда хирургов Российской Федерации. 25-27 мая 2011: - Волгоград, 2011. - С. 380.

13. L.V. Svinareva, A.I. Glukhov, O.V. Zimnik, I.I. Bykov, T.V. Khorobrykh, V.l. Shvets The study of telomerase activity in gastric cancer // Biochemistry (Moscow) Supplement series B: Biomedical chemistry. -2011. - Vol.5. -№2. -P. 188-192.

ЗАКАЗ № 832 ПОДПИСАНО В ПЕЧАТЬ 27.10.2011 ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ООО «БЕРЕСТА-ПРЕСС», ТЕЛ. (495) 774-09-91 E-MAIL: BUMACA@STlLO.RU, T2014112@YANDEX.RU

Актуальность темы.

В структуре онкологической заболеваемости в России рак желудка занимав! второе место после рака легкого у мужчин и третье место после рака молочной железы и меланомных новообразований у женщин.

В России ежегодно регистрируем 40-50 тысяч новых случаев рака желудка. Более половины пациентов с диа1 нозом рака желудка поступают на лечение, с III или IV стадей заболевания, когда хирургическое лечение малоэффективно.

В структуре онкологической смертности населения России рак желудка у мужчин и женщин занимает второе место. Ежегодно в России около 45 тысяч больных умирает от этого заболевания (М. И. Давыдов, Е. М. Аксель, 2006).

Улучшение результатов лечения рака желудка во многом связывают с диагностикой и лечением ранних стадий рака желудка (S. Е. Baldus, Т. К. Zirbes, 1998, Р. Rozen, 2004).

При этом ранние формы рака желудка характеризуются отсутствием патогномоиичпых клинических симптомов и низкой дифференциально-диагностической ролью лабораторных исследований.

Решающую роль в диагностике рака желудка играют рентгенологическое и эндоскопическое исследования с гистологическим анализом биоптатов (В. G. Rembacken, Т. Gotoda, IL Ono, Н. Kondo, 2001, Е. К. Баранская, В. Т. Ивашкин, 2002).

В основе установления диагноза лежат патогистологические критерии, в то же время, остается нерешенным вопрос объективной трактовки морфологических изменений слизистой, особенно при тяжелой дисплазии в условиях хронического воспаления и при подслизистом росте опухоли (J1. И. Аруин, J1. Л. Капуллер, В. А. Исаков, 1998, И. В. Василенко, В. Д. Садчиков, 2001, А. М. Авдалян, 2002, А. М. Авдаляп, С. А. Тюляндин, 2003).

Вышесказанное подтверждается и данными японских исследователей. В Японии выявляемость раннего рака желудка наиболее высокая в мире, при этом уровень «пропущенных» случаев раннего рака желудка оценивается в 19% (I-I. Suzuki, 1998).

Все перечисленное диктует необходимость поиска дополнительных критериев и методов диагностики рака желудка.

В последнее время, в связи с достигнутым прогрессом в области изучения молекулярно-биологических и биохимических процессов опухолеобразования, в практической онкологии используют биохимические маркеры опухолевого роста (А. И. Карпищепко и соавт., 2001; А.С. Белохвостов и соавт., 2003; F. Safi et al., 1995; A. Spila et al., 2001; M. Duffy et al., 2003; M. Carpclan-Holmslrom el al., 2006, G. Tcstino, 2004, Ы. С. Сергеева, 2009).

Исследование этих маркеров может значительно улучшить диагностику рака желудка.

Группу молекулярных маркеров, используемых в диагностике опухолей, можно разделить на биохимические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические.

Большая часть биохимических онкомаркеров рака желудка, вошедших в клиническую практику определяется в крови (РЭА, СА-19-9, СА-72-4), а не в слизистой желудка. Это облегчает забор материала для исследования, но известно, что данные маркеры недостаточно чувствительны и специфичны (А. Ф. Лазарев, 2003, Е. Н. Имянитов и соавт., 2010). Они могут определяться в повышенных концентрациях в крови при доброкачественных новообразованиях желудка, воспалительных заболеваниях или при опухолях других локализаций.

Иммуногистохимические исследования проводят в операционном материале полученном от больных, оперированных по поводу рака желудка, это значительно увеличивает их специфичность. Однако, использование этих маркеров возможно только в послеоперационном периоде, что не позволяет решить проблему ранней диагностики рака желудка. Анализ иммуногистохимических препаратов является достаточно субъективным, и может приводить к различной трактовке результатов исследования (С. И. Мозговой, Э. В. Яковлева 2004).

В последнее время, большое значение начинают приобретать молекулярно-генетические маркеры, основанные на использовании ДНК и РНК технологий. К эшм онкологическим маркерам можно отнести структурные повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки. Подобные повреждения приводят к изменению экспрессии генов-регуляторов клеточного цикла, к повреждению генов, кодирующих адгезионные белки и факторы активности неоаигиогепеза. В связи с этим происходит изменение показателей метастатической и инвазивной активности, аномальное метилирование регуляторпых областей гепов-супрессоров, изменение активности и экспрессии теломеразы в клетках опухолей (А. А. Новик, Т. А. Камилова, В. II. Цыган, 2004). Подобные онкологические маркеры являются достаточно чувствительными и специфичными, просты в лабораторном исследовании, однако их применение требует тщательной научной разработки и подготовки для внедрения в клиническую практику.

На сегодня решение проблемы ранней диагностики рака желудка лежит на стыке нескольких дисциплин: молекулярной генетики, биохимии и хирургии рака желудка. Для этого необходимо создать систему молекулярно-гепетических, иммуногистохимических и биохимических маркеров, определяемых в биоптатах слизистой желудка, которые помогут в более короткие сроки с большим процентом точности подтвердить или опровергнуть диагноз - рака желудка, дополнив тем самым результаты гистологического исследования (В. М. Шелепова, 2006, А. X. Собитов и соавт. 2007).

Цель исследования.

Улучшить результаты лечения больных раком желудка, за счет внедрения молекулярно-генетических методов анализа слизистой желудка для комплексной дифференциальной диагностики рака на дооперационном этапе.

Задачи исследования.

1. Разработать панель молекулярно-генешческих маркеров для оценки изменений слизисюй у больных раком желудка, для чего оценить частоту метилирования генов-супрессоров СВШ, ЯА88ПА, МИН, N33, йАРК, экспрессию генов металлопротеииаз ММР7, ММР9, ВШС5, ТР53, РТС82, ИТЕЯТ, а также активность теломеразы в операционном материале у больных раком желудка и в биоптатах слизистой желудка у больных неопухолевыми заболеваниями.

2. Определить связь исследуемых маркеров (аномального метилирования генов СОИ!, 1Ы88Р1А, МШ1, N33, ИАРК и экспрессии генов металлопротеииаз ММР7, ММР9, ВШС5, ТР53, РТС82, ИТЕЯТ, а также активности теломеразы) с основными клиническими показателями и морфологическими характеристиками опухоли у больных раком желудка.

3. Изучить диагностическое значение полученной панели молекулярногенетических маркеров в морфологически нормальной пограничной ткани у больных, оперированных по поводу рака желудка.

4. Установить возможность и целесообразность использования выбранной панели молекулярно-генетических маркеров для предоперационной диагностики у больных с подозрением на рак желудка, а также в материале биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании.

5. Оценить перспективы использования молекулярно-генетических маркеров для уточнения хирургической тактики лечения больных раком желудка.

Научная новизна.

Разработана оригинальная панель молекулярно-генетических маркеров, включающая исследование аномального метилирования генов-супрессоров и экспрессии генов, а также определение активности теломеразы. Показано, что панель может быть использована в качестве дополнительных маркеров диагностики и прогноза у больных с предполагаемым диагнозом рака желудка, а также для уточнения тактики хирургическою лечения в отношении данной категории больных.

Впервые в России произведена оценка возможности использования данной панели на дооперационпом этапе, в материале биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании, у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка с целыо уточнения тактики хирургического лечения данной категории больных.

Оценена потенциальная диагностическая ценность данной панели молекулярно-генетических маркеров в слизистой оболочке желудка у больных раком желудка. Практическая значимость.

1. Исследование панели молекулярно-генетических маркеров в образцах, полученных при эндоскопическом исследовании у пациентов с предварительным диа! нозом рака желудка, обладает высокой клинической ценностью и может применяться в качестве дополнительного инструмента в предоперационной диагностике рака желудка.

2. Использование панели молекулярно-генетических маркеров позволяет выделить группу пациентов с высоким риском злокачественного поражения и получить дополнительные диагностические данные для определения показаний к оперативному вмешательству на желудке.

Положения, выносимые на защиту

1. Аномальное метилирование генов-супрессоров СОН], 1М88Р1А, МЬН1, N33, ЭАРК, повышенная экспрессия генов металлопротеиназ ММР7,

ММР9, В1ЯС5, ИТЕНТ, РЮЭ!, а также увеличеиие активности теломеразы являются характерными изменениями для рака желудка, но проявляются с различной интенсивное I ыо.

2. Уровни мешлирования генов НАББЕМ, МЬН1, а также экспрессии генов ИТЕЯТ, ММР7, ВШС5, активности теломеразы в опухоли желудка достоверно выше (р<0,01), чем в морфологически нормальной окружающей слизистой желудка, а также по отношению к I руине контроля (биоптаты пациентов с ЖКБ), поэтому эти параметры могут дополни¡ь систему диагноешки молекулярно-генетических маркеров рака желудка.

3. Высокий уровень метилирования генов СйН1, N33, ЭАРК в морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевой косвенно указывает па большую вероятность вовлечения этой ткани в предопухолевую трансформацию, и требует дополнительного контроля у таких пациентов в послеоперационном периоде.

4. Использование панели молекулярно-генетических маркеров является дополнительным методом для определения тактики ведения и прогноза заболевания в послеоперационном периоде у больных, оперированных по поводу рака желудка. Аномальное метилирование генов N33 и СОП1 является маркером негативного прогноза для рака желудка, оно связано с генерализацией опухолевого процесса и метастазированием.

5. Использование панели молекулярно-генешческих маркеров является безопасным и эффекшвным методом предоперационной диагностики рака желудка. Принципиально возможно определение аномального метилирования генов, экспрессии генов ЬТЕКТ, ММР7, В1ЯС5, активности теломеразы в слизистой желудка на дооперациоппом этапе в образцах, полученных при эндоскопическом исследовании.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на II Российском симпозиуме: «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей» (Москва, 22-23 января 2009г.), на научной конференции «Молекулярные основы наследственной патологии» (Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010г.), на Vil международной конференции «Молекулярная мединципа и биобезопасность» (Москва, 28-29 октября 2010г.), на конференции с международным участием «Актуальные вопросы неотложной хирургической гастроэнтерологии» (Геленджик, 3-5 ноября 2010г.), на Всероссийском форуме «Пироговская хирургическая неделя» (Санкт-Петербур], 24-28 ноября 2010 г.), на XI международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 8-12 декабря 2010г.), па VI международной пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 24 марта 2011г.), на XI съезде хирургов Российской Федерации (Волгоград, 25-27 мая 2011г.). Реализация результатов работы.

Основные положения работы внедрены, используются и развиваются в Клинике факультетской хирургии им. П. Н. Бурденко ПМГМУ им. И.М.Сеченова.

Материалы диссертационного исследования использовались при выполнении НИР по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научпо-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции». Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 в рециепзируемых изданиях, в которых изложены основные положения диссертации.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена па 160 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

выводы.

1. Для адекватной оценки молекулярно-генетичееких изменений слизистой у больных раком желудка целесообразно использовать комплексную панель, включающую маркеры различных стадий канцерогенеза и пригодную как на этапах диагностики, так и лечения. Разработанная панель молекулярно-генетичееких маркеров адекватна для оценки изменений слизистой у больных раком желудка. Она включает определение частош метилирования генов-супрессоров CDH1, RASSF1A, MLII1, N33, DAPK, экспрессию генов мегаллопротеиназ ММР7, ММР9, BIRC5, PTGS2, hTERT, а также активиости теломеразы. Интенсивность метилирования генов, показатели экспрессии и активность теломеразы достоверно выше в опухоли, чем в пеопухолевой слизистой желудка группы сравнения.

2. Достоверные различия показателей молекулярно-генетичееких маркеров в клинических подгруппах можно использовать в качестве прогностических показателей течения рака желудка. С увеличением размера опухоли до 2-4 см достоверно возрастает степень метилирования почти всех генов, кроме DAPK, а также экспрессия BIRC5, ММР7, PTGS2, и активность теломеразы. Аномальное метилирование генов N33 и CDII1, увеличение экспрессии BIRC5, ММР7, PTGS2 являются маркерами негативного прогноза для рака желудка, и достоверно связаны с генерализацией опухолевого процесса, повышаются при генерализованном раке по сравнению с ранним и местпо-распростраиенным раком. Метилирование гена DAPK напротив, является маркером благоприятного прогноза, и показатель метилирования снижается при развитии метастазов в лимфатические узлы. Показатели экспрессии генов BIRC5 и hTERT при интестинальном типе рака по отношению к диффузному достоверно выше. Метилирование CDH1, напротив, характерно для опухолей диффузного типа.

3. Частота метилирования генов ЯАББЕЫ, МЬН1, экспрессии генов кТЕЯТ, ММР7, В1ЯС5, активное! и теломеразы в опухоли желудка достоверно выше (р<0,01), чем в морфологически нормальной окружающей слизистой желудка. Высокий уровень метилирования генов СОН1, N33, ОАРК в морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевой, не случаен и он косвенно указывает на вовлеченность этой ткани в предопухолевую трансформацию слизистой оболочки желудка.

4. Для предоперационной диагностики рака желудка с использованием молекулярно-генежческих маркеров целесообразно использовать биопсийпый материал, полученный в результате дооперационного эндоскопического исследования. Количество ДНК, РНК и белка, получаемое из эндоскопического образца, достаточно для проведения серии молекулярно-генетических исследований.

5. Экспрессионные молекулярно-генетические маркеры ИТЕЯТ, ММР7, В1ЯС5, а также определение активности теломеразы в биоптатах слизистой оболочки желудка на дооперационном этапе, вместе с клиническими, лабораторными и инструментальными показателями позволяют уточнить показания к операции. Субтотальпая дистальная и проксимальная резекции желудка при 01 раниченном ашральном или проксимальном росте опухоли, являются правомочными, поскольку выполняются в пределах не только морфологически неизмененных тканей, но и на фоне молекулярно-генетических изменений, несущих лишь возможный потенциал, который не реализован в развитии опухолевого процесса (экспрессии генов, синтезе белка).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Параллельно с морфологическим исследованием тканевого материала, полученного при эндоскопическом исследовании, у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка, рекомендуется проводить анализ молекулярно-генетических маркеров. При этом возможно получение дополнительной диагностической информации в сомнительной клинической ситуации.

2. Для дооперационной дифференциальной диагностики у пациентов с предварительным диагнозом рака желудка могут быть использованы следующие молекулярпо-генетические маркеры - экспрессия генов ММР7, ИТЕЯТ, В1ЯС5 и активность теломеразы.

3. Определение экспрессии генов кТЕЯТ, В1ЯС5, а также активности теломеразы полезно в диагностике рака, а определение экспрессии ММР7 наиболее перспективно.

4. Экспрессия гена ИТЕЯТ показывает наибольшую вероятность злокачественного заболевания у пациентов с положительным результатом теста.

5. Исследование аномального метилирования генов СОН1, ЯАБЗПА, МЫ11, N33, ОАРК, экспрессии генов ММР9, РЮ52 рационально проводить для оценки состояния слизисюй оболочки после резекции желудка по поводу ракового процесса при динамическом наблюдении за больными с целью исключения истинного рецидива заболевания.