Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Молекулярно-генетическая диагностика изменений слизистой культи желудка у больных, оперированных по поводу рака

на правах рукописи

Чекунова Наталия Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ СЛИЗИСТОЙ КУЛЬТИ ЖЕЛУДКА У БОЛЬНЫХ, ОПЕРИРОВАННЫХ

ПО ПОВОДУ РАКА

14.01.17-ХИРУРГИЯ 03.02.07 - ГЕНЕТИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 4 СЕН 2014

Москва 2014

005552206

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России. Научные руководители:

Хоробрых Татьяна Витальевна доктор медицинских наук, профессор Немцова Марина Вячеславовна доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:

Ветшев Петр Сергеевич - академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель генерального директора ФГБУ «Национальный Медико-хирургический Центр имени Н.И. Пирогова» Министерства Здравоохранения РФ.

Петрин Александр Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Защита диссертации состоится « » ^¿У2014 г. в "/^часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2).

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49) и на сайте Первый МГМУ имени И.М. Сеченова (www.mma.ru). Автореферат разослан

2014г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Шулутко Александр Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

В структуре онкологической смертности населения России рак желудка занимает второе место. В среднем, в России ежедневно выявляется 144 новых больных [Аксель Е.М., Давыдов М.И., 20 Юг].

Основным фактором прогноза при лечении рака желудка являются объем хирургического вмешательства и установление стадии заболевания [Черноусов А.Ф. и соавт., 2004г]. В настоящее время субтотальная дистальная резекция желудка может быть выполнена без ущерба для радикальности при условии чистоты линии резекции и адекватной лимфаденэктомии [Чиссов В.И., Александрова Л.М., 2010г]. Что касается реконструктивного этапа операции, то основными требованиями к нему являются низкая частота послеоперационных осложнений, связанных с наложением анастомоза, а также физиологичность, обеспечивающая минимум постгастрорезекционных расстройств и минимальный риск развития метахронного рака культи желудка. Субтотальная дистальная резекция желудка по Бильрот-1 при раке обеспечивает, как необходимый объем резекции органа, так и хорошие непосредственные и отдаленные результаты, что подтверждено многочисленными исследованиями ближайших и отдаленных результатов [Черноусов А.Ф., Поликарпов С.А., 2004г].

Накопленный в мире опыт позволяет отметить, что сегодня методом выбора в лечении рака проксимального отдела желудка остается хирургический. Проксимальная субтотальная резекция желудка может быть выполнена при небольших размерах опухоли (диаметром не более 4 см), локализующихся в проксимальном отделе без распространения на верхнюю треть тела желудка, а также при раннем раке верхней трети желудка [Давыдов М.И. и соавт., 2008г].

Рецидив рака желудка после хирургического лечения возможен даже при выполнении операции в объеме КО и существенно ухудшает отдаленный

прогноз. На возникновение локорегионарных метастазов влияет не только снижение объема радикализма, но и прогрессирование опухолевого процесса. Рецидив рака желудка, в отличие от первичной опухоли, характеризуются большей агрессивностью, выражающейся в склонности к инфильтративному росту, высокой степенью инвазивности, частым прорастанием в окружающие органы и отдаленным метастазированием [Давыдов М.И. и соавт., 2008г].

Улучшение результатов лечения рака желудка во многом связывают с улучшением ранней диагностики. Однако, ранние формы этого онкологического заболевания характеризуются отсутствием патогномоничных клинических симптомов, а возможности лабораторных методов диагностики недостаточны.

Улучшение раннего выявления опухолей желудка связывают с необходимостью использования дополнительных критериев и новых методов диагностики в клинической практике. В последнее время в связи со значительным прогрессом, достигнутым в области изучения канцерогенеза, все большее значение начинают приобретать молекулярно-генетические маркеры, основанные на использовании ДНК- и РНК-технологий. Определение молекулярных маркеров проводится в операционном материале, полученном в процессе хирургического лечения или в биоптатах, полученных посредством эндоскопического исследования, с последующим или предварительным морфологическим контролем. К молекулярно-генетическим маркерам относятся структурные и функциональные повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки. Повреждения ДНК или РНК опухолевых клеток приводят к изменению генной экспрессии, в результате чего происходит нарушение регуляции клеточного цикла, изменение спектра адгезионных белков, активация факторов неоангиогенеза, повышение показателей метастатической и инвазивной активности опухолевых клеток. [Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., 2011г].

Молекулярно-генетические онкологические маркеры обладают достаточной степенью чувствительности и специфичности, они просты в лабораторном исследовании. Однако их внедрение в клиническую практику требует тщательной научной разработки и подготовки.

Несмотря на схожие механизмы регуляции каждая опухоль является

- уникальной, ее развитие и прогрессия модифицируется особенностями генома конкретного пациента и ее собственным молекулярным патогенезом, поэтому единого универсального маркера для диагностики злокачественных опухолей в настоящее время не существует. Разработка комплексных систем диагностических и прогностических маркеров, которые включают молекулярно-генетические, иммуногистохимические и биохимические, позволит получить дополнительную информацию, необходимую для эффективной диагностики, лечения и послеоперационного мониторинга пациентов с раком желудка. [М.В. Немцова и соавт., 2013г].

Цель работы.

Целью данной работы является исследование морфологически неизмененной слизистой культи желудка у больных, перенесших его резекцию по поводу рака для послеоперационного мониторинга, используя систему молекулярно-генетических маркеров.

Задачи работы.

1. Оценить отдаленные результаты оперативного лечения в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции.

- после дистальной субтотальной резекции желудка

- после проксимальной резекции желудка

2. Провести анализ эффективности комплексного лечения больных, оперированных по поводу рака в объеме субтотальной резекции.

3. Оценить молекулярно-генетические изменения (аномальное метилирование генов СОН1, ЯАББПЛ, МШ1, N33, О АР К, ЯиЫХЗ) в биоптатах слизистой культи желудка у больных, ранее оперированных по поводу рака

4. Провести анализ корреляции молекулярно-генетических изменений в биоптатах слизистой культи желудка у ранее оперированных больных с такими характеристиками опухоли, как глубина инвазии стенки желудка, степень дифференцировки, размер первичной опухоли, прохождение линии резекции в зоне первичной опухоли.

5. Оценить перспективы использования системы молекулярно- ^ генетических маркеров в качестве прогностической для оценки риска генерализации процесса и развития рецидива.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование аномального метилирования генов СОН1, ЯАББРЫ, МЬН1, N33, йАРК, ЯЫЫХЗ в послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при эндоскопическом исследовании у больных, оперированных в объеме субтотальной резекции. В результате проведенного исследования показана связь молекулярной патологии с возможным развитием генерализации опухолевого процесса. Показано, что молекулярно-генетические изменения возникают до негативных клинических проявлений у пациентов, при отсутствии опухолевых клеток в биоптатах. На основании полученных данных показано, что исследуемые молекулярно-генетические маркеры могут быть использованы в качестве дополнительных для прогнозирования течения опухолевого процесса у ранее оперированных больных.

С целью оценки результатов оперативного лечения в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции (дистальной субтотальной резекции желудка или проксимальной резекции желудка), проведен анализ эффективности комбинированного лечения больных и оценены отдаленные результаты. С учетом данных молекулярно-генетического анализа подтверждено, что выполнение резекций желудка в объеме ГШ и при условии расширенной лимфаденэктомии не только правомочно, но и не снижает степень онкологического радикализма и качества жизни у больных раком желудка.

Практическая значимость.

Изучены отдаленные результаты хирургического лечения больных раком желудка. Доказано, что выполнение оперативного вмешательства в объеме резекций (субтотальной дистальной по Бильрот-1 или проксимальной) при условии отсутствия опухолевых клеток в краях резекций и адекватной лимфаденэктомии правомочно и не приводит к развитию локорегионарных рецидивов или генерализации опухолевого процесса.

Показано, что выполнение заведомо циторедуктивных операций вследствие распространенности опухолевого процесса или наличия тяжелых конкурирующих заболеваний в сочетании с послеоперационной системной химиотерапией позволяет продлить жизнь пациентам, не снижая ее качества.

Проведено комплексное исследование эпигенетических изменений в послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при эндоскопическом исследовании. В результате исследования показано, что аномальное метилирование генов N33, СОН1 и ИЬ'МХЗ является маркерами неблагоприятного прогноза, развития генерализации опухолевого процесса, при мониторинге оперированных больных. Выявлены ассоциации молекулярно-генетических повреждений с такими клиническими характеристиками, как наличие отдаленных метастазов (р=0,0462), наличие сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта (р=0,0077), в частности атрофического гастрита (р=0, 0378), а также с высоким риском генерализации опухолевого процесса (р=0,029), что позволить использовать анализ молекулярных изменений в качестве дополнительных маркеров прогноза у ранее оперированных больных.

Предложенные ДНК-маркеры позволяют дополнить морфологические и биохимические исследования, которые используется в настоящее время для послеоперационного мониторинга больных.

Апробация работы.

Диссертация апробирована 05.03.2014 года на кафедре факультетской хирургии №1 лечебного факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова.

Материалы диссертации были представлены и обсуждены:

- На конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 26-28 октября 2011 г)

- На XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 23-27 апреля 2012г)

- На XVII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 12-14 ноября -2013г)

- Номинант в категории «Лучший проект года», подноминации «Лучший научно-исследовательский проект» Всероссийской премии в области онкологии ассоциации онкологов России IN VITA VERITAS (Санкт-Петербург, 12 сентября 2013г)

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.17 — хирургия (медицинские науки). Хирургия - область медицинской науки, изучающая заболевания и повреждения, в лечении которых важнейшее значение приобретают методы кровавого и бескровного оперативного вмешательства. Создание новой хирургической техники, разработка новых оперативных вмешательств и новых хирургических технологий, а также совершенствование методов профилактики, ранней диагностики и лечение хирургических болезней будут способствовать сохранению здоровья населения, сокращению сроков временной нетрудоспособности и восстановлению трудоспособности. Области исследования — изучение причин, механизмов развития и распространенности хирургических заболеваний; разработка и усовершенствование методов диагностики и предупреждения хирургических заболеваний; обобщение интернационального опыта, разных хирургических школ и отдельных хирургов; экспериментальная и клиническая разработка методов лечения хирургических болезней и их внедрение в клиническую практику; усовершенствование методов диспансеризации и профилактики хирургических заболеваний.

Научные положения диссертации соответствуют паспорту научной специальности 03.02.07 - генетика (медицинские науки). Генетика - это область науки, изучающая явления изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровне. Области исследования: молекулярные и цитологические основы наследственности; генетический код, структурно-функциональная организация генома; процессы репликации, рекомбинации, репарации; мутационная изменчивость, геномная и хромосомная перестройка; эпигенетика; реализация генетической информации (транскрипция, трансляция), механизмы регуляции экспрессии генов, роль геномных перестроек в реализации генного действия, взаимодействие генов; генетика индивидуального развития, апоптоз, иммуногенетика; генетика человека, медицинская генетика.

Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данных специальностей.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 в рецензируемых изданиях, в которых изложены основные положения диссертации.

Внедрение результатов исследования в клиническую практику.

Результаты проведенных научных исследований внедрены в практическую работу в Клинике факультетской хирургии им. Н. Н. Бурденко Первого МГМУ им. И.М.Сеченова.

Использование основных положении диссертации в практической работе позволило с помощью генетических маркеров дополнить и расширить общепринятую систему клинико-морфологических факторов прогноза возможной генерализации процесса у ранее оперированных больных.

Личный вклад соискателя.

Автор принимал непосредственное участие в лечении пациентов (включая предоперационную подготовку, оперативное вмешательство, послеоперационный период); ведении больных при контрольном обследовании. Автору принадлежит ведущая роль в сборе материала, анализе, обобщении и научном обосновании полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их клинической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 139 странице, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 13 рисунками, содержит 15 таблиц, библиография включает 139 источников, из них 84 отечественных и 55 зарубежных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Хирургическое лечение рака желудка в объеме резекций (субтотальной дистальной или проксимальной) при радикальности 110 и адекватной лимфаденэктомии является правомочным, так как не снижает объема онкологического радикализма, что подтверждено анализом отдаленных результатов оперативного лечения данной категории больных и результатами молекулярно-генетического анализа.

2. Хирургическое вмешательство в объеме резекций с лимфаденэктомией 02 при заведомо циторедуктивных операциях, вследствие распространенности опухолевого процесса или наличия тяжелого конкурирующего заболевания, в сочетании с послеоперационной системной химиотерапией позволяет продлить жизнь больным не снижая ее качества.

3. Из шести исследуемых генов (CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK, RUNX3) в послеоперационных биоптатах морфологически неизмененной слизистой культи желудка, полученных при эзофагогастродуоденоскопии, аномальное метилирование выявлено по 3-м генам- N33, CDH1 и RUNX3, с общей частотой метилирования 22,5% (9/40).

4. Метилирование генов N33, CDH1 и RUNX3 достоверно связано с наличием сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта (р=0,0077), в частности хронического атрофического гастрита (р=0,0378), а также с выявлением отдаленных метастазов (р=0,0462) и генерализацией опухолевого процесса (р=0,029). Корреляции молекулярно-генетических изменений в биоптатах слизистой культи желудка с такими клиническими характеристиками опухоли, как локализация, глубина инвазии в стенку желудка, дифференцировка, размер первичной опухоли и прохождение линии резекции достоверной корреляции выявлено не было

5. Исследование метилирования генов N33, CDH1 it RUNX3 может быть использовано в качестве дополнительных маркеров прогноза в послеоперационном мониторинге больных.

Общая характеристика клинических наблюдений и методов исследования.

Группу наблюдения составили 103 больных в период с декабря 2009 года по декабрь 2012 года находившихся на лечении в клинике факультетской хирургии имени H.H. Бурденко. Все больные были оперированы по поводу рака желудка в объеме субтотальных дистальных или проксимальных резекций с расширенной лимфаденэктомией. Показаниями к выполнению субтотальной дистальной резекции желудка считали опухоли антрального отдела и нижней трети тела желудка, при отсутствии в его проксимальном отделе предраковых изменений слизистой оболочки, таких как полипы, тяжелая дисплазия [Черноусов А.Ф. и соавт., 2002г.]. Субтотальную проксимальную резекцию желудка выполняли

больным с небольшим юкстакардиальным раком [Черноусов Ф.А. и соавт., 2009г.].

В исследовании преобладали пациенты старше 60 лет - 77 из 103 больных (74,8%), преимущественно мужчины - 54 из 103 (52,4%). Сопутствующие, а по сути дела конкурирующие заболевания со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем были у 68% (70 из 103) больных. Распределение пациентов по возрастным подгруппам и сгруюура сопутствующих заболеваний у больных в исследуемой группе представлены на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Распределение пациентов по возрастным подгруппам

5,8%

■ >60 лет

■ <50 лет

■ 50-60 лет

Рисунок 2. Сгруюура сопутствующих заболеваний у больных в исследуемой группе

нарушение артериальная

ритма гипертония 24.3% ХОБ/1

кардиосклероз 14,6%

Использовали международную классификацию по системе ТК'М (7-ая редакция, 1ЛСС 2009г), по которой группировали больных по стадиям. В работу были включены преимущественно пациенты с I и II стадиями заболевания - 73 из 103 (70,9%). Данную выборку объясняли тем, что одной из задач исследования являлась оценка эффективности отдаленных

результатов хирургического лечения больных с ранними формами рака желудка, правомочность выполнения резекций с расширенной лимфаденэктомией по поводу рака и возможность развития рецидива заболевания или генерализации опухолевого процесса после такого объема оперативного вмешательства у этих больных.

По гистологической структуре преобладала аденокарцинома - 90,3% всех опухолей, в основном низкой степени дифференцировки — 53 из 103 (51,5%) больных.

После предоперационной подготовки все больные были оперированы. Число субтотальных дистальных резекций желудка с расширенной лимфаденэктомией составило 95,2%, то есть 98 из 103 больных, 5 (4,8%) больным выполняли проксимальные резекции желудка.

В ходе реконструктивного этапа операции после субтотальных дистальных резекций желудка мы чаще всего выполняли реконструкцию с наложением гастродуоденоанастомоза по типу «конец в конец». Данное предпочтение объясняет наш опыт и изучение литературы, которые показывают, что субтотальная дистальная резекция желудка по первому способу Бильрота при раке обеспечивает как необходимый объем резекции органа, так и хорошие непосредственные и отдаленные результаты [Черноусов Ф. А., 2008]. Таким способом оперированы 74 из 103 пациентов, что составляет 71,9% всех больных. Показаниями для выполнения реконструкции по второму способу Бильрота считали распространение опухоли на двенадцатиперстную кишку и необходимость резекции ее верхнее-горизонтальной части, а также наличие конгломератов метастатических узлов в области привратника. Данный вид оперативного вмешательства перенесли 24 (23,3%) пациента — таблица №1.

Таблица № 1: Характер оперативных вмешательств

Оперативное вмешательство Количество операций %

Субтотальная дистальная резекция желудка с анастомозом по Бильрот I, 3/67/4 71,9 (2,9/65,1/3,9 соответственно)

лимфаденэктомия Д2/Д2,5/Д3

Субтотальная дистальная резекция желудка с анастомозом по Бильрот II, лимфаденэктомия Д2/Д2.5/ДЗ 2/21/1 23,3 (1,9/20,5/0,9 соответственно)

Субтотальная проксимальная резекция желудка, лимфаденэктомия Д2 5 4,8

Всего 103 100

Комбинированные вмешательства выполнены 9 из 103 (8,7%) больных. 4 (3,9%) - обширная резекция мезоколон, 2 (1,9%) — плоскостная резекция головки поджелудочной железы, 3 (2,9%) — атипичная резекция печени.

Для прогнозирования течения заболевания у больных, ранее оперированных в объеме резекции желудка, оценивали состояние слизистой культи желудка в послеоперационных биоптатах, полученных при эзофагогастродуоденоскопии. Был проведен морфологический анализ, а также исследование аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK и RUNX3. Известно, что эпигенетические изменения ДНК, к которым относится аномальное метилирования регуляторных районов генов, являются ранними событиями в процессе канцерогенеза, приводящими к отсутствию экспрессии генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, пролиферацию и дифференцировку. Эти изменения создают определенный потенциал молекулярно-генетической нестабильности, который в течение времени может реализоваться в виде опухолевого роста. В настоящее время считается, что аномальное метилирование является опухолевым маркером, который проявляется до клинической манифестации заболевания [Zhao С., ВиХ, 2012].

Используемая система молекулярно-генетических маркеров была предложена и ранее опробована на опухолевом материале, полученном в клинике факультетской хирургии имени H.H. Бурденко [Быков И.И., 2011]. Маркеры этой панели достоверно чаще определяются в опухоли, по сравнению с контрольной группой пациентов, имеющих неопухолевые

заболевания ЖКТ (при ЖКБ) [Немцова М.В. и соавт.,2013 г].

Из 103 вошедших в исследование больных, ранее оперированных по поводу рака в объеме резекции желудка, у 40 пациентов в биопсийном материале неизмененной слизистой культи желудка, полученном при контрольной эзофагогастродуоденоскопии, определяли аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK и RUNX3. Морфологический анализ этих образцов подтвердил отсутствие в них опухолевых клеток, у некоторых больных был выявлен атрофический гастрит.

Гены, выбранные для анализа метилирования, обладают свойствами опухолевых супрессоров, непосредственно влияют на сдерживание опухолевого роста. Их инактивация посредствам аномального метилирования характерна для различных видов опухолей, но не выявляется при воспалительных заболеваниях, а также при обратимых гиперпластических процессах [Baylin S.B., Jones Р. А., 2007].

Статистическая обработка результатов.

Статистический анализ результатов проведен при помощи программы STATISTICA V. 6.0 и включал сравнение групп с помощью двустороннего точного критерия Фишера (уровень значимости а=0.05) с поправкой на множественное сравнение, вычисление показателя отношения шансов, соответствующих 95% доверительных интервалов.

Основные результаты исследования.

Оценка отдаленных результатов оперативного лечения в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции.

В послеоперационном периоде осложнения наблюдали у 21 из 103 (20,4%) больных. Наиболее часто выявляли осложнения со стороны органов дыхания — плеврит возник у 5 из 103 (4,9%) больных и также у 5 из 103 пациентов было диагностировано нагноение послеоперационных ран. В равной степени, по 4 из 103 (3,9%) больных, наблюдали явления послеоперационного отечного панкреатита и пневмонии. У 2 (1,9%)

15

пациентов развилась острая сердечно - сосудистая недостаточность. У одного больного (1%) диагностирована несостоятельность гастродуоденоанастомоза, что успешно зажило на проводимой консервативной терапии, которая включала в себя декомпрессию области анастомоза, исключение пассажа химуса через анастомоз, установку назоинтестинального зонда за связку Трейца и аппликации фибринового клея в область дефекта. Интраоперационных осложнений и летальных исходов не было.

Субтотальную проксимальную резекцию желудка выполняли 5 из 103 (4,9%) больных, у которых был небольшой юкстакардиальный рак, преимущественно I стадии. Лишь у 1 из 5 (20,0%) больных в послеоперационном периоде в течение пяти дней сохранялись явления гастростаза, что было успешно купировано путем проводимой консервативной терапии. Летальных исходов после данного вида оперативного вмешательства отмечено не было — таблица №2.

Таблица № 2: Характер и частота осложнений после радикальных

Характер осложнении Количество осложнений*

количество %

Панкреатит 4/103 3,9

Плеврит 5/103 4,9

Несостоятельность гастродуоденоанастомоза 1/103 1

Нагноение послеоперационной раны 5/103 4,9

Острая сердечно-сосудистая недостаточность 2/103 1,9

Пневмония 4/103 3,9

Всего осложнений 21 20,4

Всего больных с осложнениями 16 15,5

*у одного больного может быть несколько осложнений

Характеризуя по степени радикальности выполненных хирургических вмешательств - в объеме Ш) выполнено 85,4% операций (88 из 103 больных); Ш — 10,7% (11 больных) — при гистологическом исследовании выявлены опухолевые клетки в краях резекции; 112 - 3,9% (4 пациента) — имели место

нерезектабельная парааортальная лимфаденопатия и оставленные метастазы в печени - рисунок 3.

Рисунок 3. Характеристика радикальности всех выполненных хирургических вмешательств.

Всего из 103 больных опухолевые клетки в проксимальном крае резекции выявлены у 11 (10,7%). Из них 9 больным выполнены заведомо циторедуктивные операции, так как имели место билобарное метастатическое поражение печени и обширные метастатические парааортальные конгломераты лимфоузлов. В одном случае пациенту объем оперативного вмешательства был уменьшен из-за наличия тяжелого конкурирующего заболевания. Еще в одном случае больной мог бы перенести гастрэктомию, но по формальным признакам было возможно выполнить субтотальную дистальную резекцию, что и было сделано. У этих двух пациентов возник рецидив заболевания, и они были повторно оперированы в объеме экстирпация культи желудка с резекцией абдоминального и нижнегрудного отдела пищевода с наложением эзофагоеюноанастомоза. В настоящее время оба живы и данных за рецидив заболевания и генерализацию опухолевого процесса нет.

В послеоперационном периоде химиотерапевтическое лечение проводили 76 (74%) из 103 больным. Химиотерапию не выполняли у больных с раком in situ, IA стадией, больных с декомпенсацией тяжелых конкурирующих заболеваний или же пациенты самостоятельно отказывались от дальнейшего проведения химиотерапии - 27 (26%) пациентов. У 3 из 76 больных (3,9%) приходилось менять первичную схему химиотерапии, так

R2 4%

R1.

11%

R0

85%

как она оказалась неэффективна, что клинически проявлялось прогрессированием заболевания.

Анализируя отдаленные результаты хирургического лечения больных, выявлено, что показатель 2-х летней выживаемости после субтотальной дистальной резекции желудка составил 98±0,06%, 3-летней — 97±0,09%; после проксимальных резекций желудка - 100% - рисунок №3, что в корреляции с тяжестью конкурирующих заболеваний и возрастом оперированных больных в сравнении с данными мировых статистик (таблица №3) позволяет говорить о правомерности выбранной лечебной тактики с точки зрения онкологического радикализма.

Рисунок 4. Отдаленная выживаемость больных, перенесших резекцию желудка по поводу рака.

Ш 2-х летняя выживаемость ■ 3-х летняя выживаемость

бмес12мес1Ям„г

18 мес 24 мес

30мес 36 мес

Таблица № 3. Трехлетняя выживаемость (%) после дистальной и

Автор год После субтотальной дистальной резекции После проксимальной резекции

А.Р. Алиев 2012 70,59 -

Д.Л. Власенко 2009 75 -

В.Ю. Скоропад 2013/2006 65 73

С.Н. Неред 2005 51,7 -

Ю.В. Думанский 2009 65,5 -

Han Мо Yoo 2011 97,3 -

Чернявский А А. 2008 - 27

Наши данные (КФХ) 2013 97,8 100

Мы оценили эффективность комплексного лечения больных, что включало в себя оперативное вмешательство и послеоперационную системную химиотерапию при наличии показаний к ней. Это позволило нам еще раз говорить о том, что выполнение резекций желудка при раке в объеме R0 в сочетании с расширенной лимфаденэктомией и при необходимости проведение химиотерапевтического лечения является правомочной тактикой ведения больных раком желудка и не снижает объема онкологического радикализма. Если же речь идет о выполнении заведомо циторедуктивных операций или снижение объема оперативного лечения из-за наличия тяжелого конкурирующего заболевания данная тактика позволяет продлить жизнь больных как минимум на 2-3 года, при этом не снижая ее качества.

Оценка и анализ корреляций молекулярно-генетических изменений в биоптатах слизистой культи желудка у ранее оперированных больных.

В проведенном исследовании из шести исследованных генов, аномальное метилирование определялось у N33, CDH1 и RUNX3, метилирование генов RASSF1A, MLH1 и DAPK в морфологически неизмененной слизистой культи желудка не определялось. Аномальное метилирование генов N33, CDH1 и RUNX3 выявлено у 9 из 40 больных (22,5%), которые составили группу (met+). В 77,5% случаев (31/40) метилирование генов в культе желудка отсутствовало, такие больные составили группу (met-). Выявление аномального метилирования генов у 22,5% (9/40) пациентов, которым проведен молекулярно-генетический анализ, позволяет говорить об адекватности выполненного хирургического лечения. При этом учитывали не только чистоту линии резекции и адекватную лимфаденэктомию, но характеристику слизистой культи желудка. Полученный результат позволяет подтвердить правомочность выполнения оперативных вмешательств при раке в объеме субтотальных дистальных или проксимальных резекций желудка в сочетании с расширенной лимфаденэктомией.

С целью выявления прогностических клинических маркеров, мы исследовали связь метилирования в неизмененной слизистой культи желудка с клиническими характеристиками ранее удаленной опухоли, такими как локализация, ее размер, наличие инвазивного роста, степень дифференцировки, а также чистотой линии резекции и наличием метастазов в регионарные лимфотические узлы и другие органы. Материал для исследования получали в период от 6 месяцев до 39 месяцев после операции.

В ходе исследования нам не удалось выявить связь метилирования в неизмененной слизистой культи желудка с такими клиническими характеристиками первичной опухоли, как локализация, размер опухоли, наличие инвазивного роста, дифференцировка, чистота линии резекции, метастазирование в лимфотические узлы.

Нами показано отсутствие связи между метилированием генов N33, СОН1 и Я.иЫХЗ и локорегионарным метастазированием опухоли, но в группе больных с отдаленными метастазами в печень, метилирование определялось достоверно чаще (р=0,0462). Интересно, что в группе пациентов, не имеющих отдаленных метастазов, метилирование не было выявлено.

У 78% больных в группе с выявленным аномальным метилированием имели место заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как хронический атрофический гастрит и язвенная болезнь желудка. Нами выявлено, что и хронический атрофический гастрит и язвенная болезнь желудка достоверно связаны с наличием аномального метилирования исследуемых нами генов (р = 0,0077). Это может свидетельствовать о том, что и хронический атрофический гастрит и язвенная болезнь желудка могут являться предрасполагающим фактором в развитии опухолевого процесса у ранее оперированных больных. Это вновь подтверждает несомненную роль хронического атрофического гастрита и длительно текущей язвенной болезни желудка в желудочном канцерогенезе.

Учитывая, что исследуемые нами пациенты наблюдались в клинике факультетской хирургии в течение нескольких лет после операции, мы смогли исследовать связь между наличием молекулярно-генетических маркеров метилирования и течением заболевания у пациентов. Выявлено, что генерализация опухолевого процесса в течение 3 лет достоверно чаще происходит у пациентов, имеющих аномальное метилирование генов N33, СИШ, RUNXЗ в морфологически нормальной слизистой культи желудка (р=0,0299). В результате проведенного исследования можно утверждать, что метилирование генов N33, СОН1, RUNXЗ в морфологически неизмененной слизистой культи желудка является маркером, ассоциированным с негативным прогнозом с точки зрения генерализации опухолевого процесса, у больных, оперированных по поводу рака желудка.

Для оставшихся 6 больных из группы (ше1+), у которых пока нет клинических проявлений рецидива заболевания или генерализации процесса, по нашему мнению, требуется дополнительный контроль и повышенная частота обследования с целью своевременного выявления симптомов негативного течения заболевания.

Таким образом, по результатам проведенной работы, можно заключить, что для адекватной оценки изменений слизистой культи желудка в процессе послеоперационного мониторинга больных, оперированных по поводу рака желудка, наряду с морфологическим анализом биоптатов целесообразно проводить исследование молекулярно-генетических маркеров. Исследование аномального метилирования генов СОН1, N33 и RUNXЗ рационально проводить для оценки состояния слизистой культи желудка после операций в объеме резекций по поводу ракового процесса при динамическом наблюдении за больными с целью прогнозирования развития генерализации опухолевого процесса.

Выводы.

1. Субтотальная дистальная резекция при локализации опухоли в антральном отделе и нижней трети тела желудка и проксимальная резекция при юкстакардиальном раке правомочны при условии оперативных вмешательств в объеме 110 и лимфаденэктомии П2, не приводят к увеличению количества послеоперационных осложнений, развитию локорегионарных рецидивов или генерализации опухолевого процесса, что подтверждается изучением отдаленных результатов лечения и данными молекулярно-генетического анализа.

2. У больных с тяжелыми конкурирующими заболеваниями снижение объема онкологического радикализма в виде резекции желудка при адекватной предоперационной подготовке позволяет продлить жизнь пациентам не снижая ее качества. Комбинированные операции и циторедуктивные вмешательства вследствие распространенности опухолевого процесса в сочетании с послеоперационной системной химиотерапией позволяют достоверно увеличить продолжительность жизни. 2-х летняя выживаемость в группе наблюдения составила 98%; 3-х летняя -97%.

3. Из шести исследуемых генов СОН1, ЯАБЯПА, МШ1, N33, ОЛРК, RUNXЗ аномальное метилирование в послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка определено только в N33, СБН1 и RUNXЗ; аномальное метилирование генов ЛЛ55/ГА4, МШ1 и БАРК в морфологически нормальной ткани слизистой культи желудка не определялось.

4. Метилирование в культе желудка достоверно связано с отдаленными метастазами (р=0,0462), сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечного тракта (р=0,0077) и генерализацией опухолевого процесса (р=0,029), но не связано с локализацией опухоли, ее размером, наличием инвазивного роста, опухолевой дифференцировкой, чистотой линии резекции и метастазами в лимфоузлы.

5. Исследование молекулярно-генетических маркеров в послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при эндоскопическом исследовании, является дополнительным фактором прогноза для ранее оперированных больных. Аномальное метилирование генов N33, СОН1 и RUNXЗ является маркером неблагоприятного прогноза и связано с развитием генерализации опухолевого процесса у оперированных больных еще на субклиническом уровне, что делает маркер перспективным для прогнозирования течения заболевания в послеоперационном периоде.

Практические рекомендации.

1. Субтотальная дистальная и проксимальная резекция желудка с расширенной лимфаденэктомией по поводу рака могут быть выполнены без ущерба для онкологического радикализма при условии отсутствия опухолевых клеток по линии резекции.

2. При распространенном опухолевом процессе или тяжелых конкурирующих заболеваниях оперативные вмешательства в объеме резекций желудка с лимфаденэктомией D2 после предварительной предоперационной подготовки и, в последующем, - системная химиотерапия - позволяют продлить пациенту жизнь.

3. Аномальное метилирование данных генов N33, СОН] и RUNXЗ в послеоперационном периоде является перспективным для прогнозирования генерализиции опухолевого процесса.

4. Исследование аномального метилирования генов СОН1, N33 и RUNXЗ следует использовать для оценки состояния морфологически неизмененной слизистой оболочки культи желудка для динамического наблюдения за больными с целью диагностики генерализации опухолевого процесса еще при отсутствии видимых проявлений опухоли.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Чекунова Н.В., Быков И.И., Залетаев Д.В., Хоробрых Т.В., Немцова М.В. Аллельный дисбаланс и нестабильность микросателлитных повторов при

раке желудка//Конференция «Актуальные проблемы онкогенетики», Медицинская генетика, 2011, т.10, №10, с.24-25

2. Немцова М.В., Хоробрых Т.В, Быков И.И., Удилова А., Чекунова Н.В. Молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака желудка//Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике, -2012, - №18, - С..42-59

3. N. Chekunova, I. Bykov, Т. Kchorobrich, М. Nemtsova. Abnormal methylation of tumor-related genes in gastric carcinomas and their adjacent nontumor areas.// Europ.J.Hum.Genet, 2012.V.20, supl, p.176-177

4. Немцова M.B., Чекунова H.B., Удилова A.A. Использование маркеров нового типа в диагностике рака желудка // Материалы Конгресса «Человек и лекарство», - 2012, С.- 166

5. А. Черноусов, Т. Хоробрых, М. Немцова, Н. Чекунова, А. Удилова Современная диагностика рецидива рака желудка у больных, перенесших его резекцию// Врач, - 2013, - №6,- С. 14-18

6. Немцова М.В., Быков И.И., Чекунова Н.В., Залетаев Д.В., Глухов А.И., Т.В. Хоробрых. Молекулярно-генетическая патология при раке желудка // Технологии живых систем. - 2013 г.- Т. 10.- № З.-С. 36-47

7. Немцова М.В., Быков И.И., Чекунова Н.В., Залетаев Д.В., Глухов А.И., Хоробрых Т.В. Системы молекулярно-генетических маркеров при раке желудка// Клиническая лабораторная диагностика,- 2013,-№11,- с.12-16

8. Checunova N. V., Kchorobrich T.V., Zaletaev D.V., Nemtsova M.V. Abnormal methylation of tumor-related genes in biopsies of the gastric mucosa from patients previously operated on gastric cancer// Europ.J.Hum.Genet, 2013,v.21,supl.2, P.294-295.

9. Чекунова Н.В. , Хоробрых T.B., Немцова М.В. Молекулярно-генетическая диагностика слизистой культи желудка у больных, перенесших его резекцию// материалы XVII Российского онкологического конгресса// Злокачественные опухоли №2, -2013г,- С. 131.

Подписано в печать 19.08.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 1765-8-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.2 8 Тел. 8-495-782-88-39