Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Роль микрочастиц плазмы крови в развитии гиперкоагуляции

На правах рукописи

005057668

МАТВИЕНКО ОЛЕСЯ ЮРЬЕВНА

РОЛЬ МИКРОЧАСТИЦ ПЛАЗМЫ КРОВИ В РАЗВИТИИ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ

14.01.21 — гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1В АПР 2313

Санкт-Петербург - 2013

005057668

Работа выполнена в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России».

Научные руководители:

кандидат биологических наук доктор медицинских наук, профессор

Головина Ольга Георгиевна Петрищев Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

Бубнова Людмила Николаевна - доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории иммуногематологии ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России».

Калинина Наталья Михайловна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России

Ведущая организация: ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства России».

Защита состоится " ¿¿"J 2013 г. в часов

На заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан "_"_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Глазанова Татьяна Валентиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Тромбоэмболические заболевания продолжают лидировать среди причин смертности и инвалидизации населения. В связи с этим важной задачей является своевременная диагностика изменения гемостатического баланса в сторону гиперкоагуляции у пациентов с риском развития тромботических осложнений. Однако применение стандартных методов исследования системы свертывания крови далеко не всегда позволяет сделать однозначный вывод о коагулологическом статусе пациента. Таким образом, поиск дополнительных информативных критериев активации системы гемостаза остается одной из основных задач лабораторной службы.

Исследования последних лет показали, что в осуществлении реакций гемостаза и развитии тромбоза существенную роль играют микрочастицы (МЧ) плазмы крови (Зубаиров Д. М., 2009,. Nieuwland Р., 2007 Morel О., 2009). Они обнаруживаются в плазме как при физиологических, так и при различных патологических состояниях. МЧ отделяются от эндотелиоцитов и клеток крови под действием разнообразных активирующих стимулов, а также в процессе их старения и апоптоза. Наружная мембрана МЧ обогащена отрицательно заряженными фосфолипидами, которые являются местом сборки прокоагулянтных комплексов. МЧ экспрессируют на своей поверхности различные клеточно-специфичные антигены, в частности тканевой фактор (TF), который, как известно, является основным триггером коагуляционного каскада (Зубаиров Д. М., 2005, Weerhaim А., 2002, Enjeti А., 2008). Перечисленные особенности дают возможность предполагать, что микрочастицы могут участвовать в повышении и распространении гемостатического потенциала плазмы крови.

В настоящее время основная часть работ направлена на исследование количества и происхождения МЧ у пациентов с различной патологией, тогда как участие МЧ в осуществлении нормального гемостаза и при развитии патологических состояний, сопровождающихся изменением коагуляционного потенциала, изучено недостаточно. Последнее в немалой степени обусловлено отсутствием стандартизованных методов исследования. В связи с этим большой интерес вызывает возможность определения участия МЧ в процессе образования тромбина с помощью интегрального теста оценки состояния системы гемостаза - теста генерации тромбина (11 Т) (Hemker Н. С., 2006). Увеличение уровня генерации тромбина, которое может быть вызвано появлением в

циркуляции МЧ, экспрессирующих тканевой фактор и/или прокоагулянтные фосфолипиды, отражает рост коагуляционного потенциала плазмы крови и позволяет своевременно оценивать тромбогенную опасность.

Таким образом, исследование коагуляционного потенциала МЧ представляется актуальным, поскольку позволит получить дополнительные сведения об их значимости для развития гиперкоагуляционных изменений и улучшить диагностику состояний, сопровождающихся повышением гемостатического потенциала плазмы крови. Цель исследования

Изучение роли микрочастиц плазмы крови в процессе генерации тромбина у здоровых лиц и пациентов с заболеваниями сосудов нижних конечностей. Задачи исследования

1. Определить параметры генерации тромбина, обусловленной МЧ плазмы крови, у здоровых лиц.

2. Определить вклад тканевого фактора и прокоагулянтных фосфолипидов МЧ плазмы крови в развитие гиперкоагуляционных изменений у больных с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей.

3. Определить вклад тканевого фактора и прокоагулянтных фосфолипидов МЧ плазмы крови в развитие гиперкоагуляционных изменений у больных постфлебитическим синдромом.

4. Определить вклад тканевого фактора и прокоагулянтных фосфолипидов МЧ плазмы крови в развитие гиперкоагуляционных изменений у больных с варикозным расширением вен нижних конечностей.

5. Провести сравнительный анализ данных, оценивающих участие МЧ плазмы крови в процессе генерации тромбина у пациентов с заболеваниями сосудов нижних конечностей. Положения, выносимые на защиту

1. Коагуляционный потенциал МЧ плазмы крови у пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей, постфлебитическим синдромом и варикозным расширением вен нижних конечностей значительно выше по сравнению со здоровыми лицами. Наибольший рост уровня генерации тромбина характерен для больных с постфлебитическим синдромом.

2. У пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей МЧ плазмы крови могут обладать не только прокоагулянтным, но и антикоагулянтным потенциалом, что приводит к менее выраженному росту генерации тромбина.

3. Прием гиполипидемических препаратов ассоциируется со снижением уровня генерации тромбина за счет уменьшения участия тканевого фактора МЧ в этом процессе.

4. Развитие хронической венозной недостаточности у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей сопровождается усилением роли прокоагулянтных фосфолипидов МЧ плазмы крови в процессе генерации тромбина.

5. Исследование коагуляционного потенциала МЧ плазмы крови с помощью теста генерации тромбина открывает новые возможности диагностики гиперкоагуляционных состояний у больных с риском развития тромбоэмболических заболеваний.

Научная новизна

Впервые в России проведено исследование роли МЧ в коагуляционном процессе с помощью теста генерации тромбина, установлены пределы нормальных колебаний показателей генерации тромбина, зависимые от прокоагулянтных фосфолипидов и тканевого фактора МЧ.

Оценена роль МЧ в развитии гиперкоагуляционных изменений у пациентов с патологией сосудов нижних конечностей.

Впервые обнаружено наличие антикоагулянтного потенциала МЧ у пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей.

У пациентов, постоянно находящихся на гиполипидемической терапии, выявлено снижение роли тканевого фактора МЧ в генерации тромбина. Практическая значимость

Проведенные исследования показали, что МЧ плазмы крови обладают выраженным коагуляционным потенциалом, который значительно возрастает при развитии заболеваний сосудов нижних конечностей. Исследование генерации тромбина, обусловленной МЧ плазмы крови, позволяет выявить сдвиг гемостатического баланса в сторону гиперкоагуляции на самых ранних этапах развития заболевания и, в отличие от стандартного коагулологического обследования, может служить информативным критерием, указывающим на наличие гиперкоагуляционных изменений у пациентов с риском развития тромбоэмболических осложнений.

Апробация работы

Результаты работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 3-5 февраля 2011 г.), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 24-25 марта 2011 г.), на IX международной научно-практической конференции «Тромбозы и кровотечения - актуальные проблемы современной медицины» (Севастополь, 20-21 октября 2011 г.), на 58-ом заседании комитета по стандартизации международного общества по изучению тромбоза и гемостаза (Ливерпуль, Великобритания, 27-30 июня 2012 г.), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 80-летию Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012 г.). Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 108 страницах печатного текста, содержит 21 таблицу, иллюстрирована 16 рисунками и состоит кз следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением собственных результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы (включает 25 отечественных и 79 зарубежных источников).

Личный вклад автора

Автором лично выполнены исследования по определению показателей теста

генерации тромбина, обусловленных МЧ плазмы крови, у больных и в контрольной

группе. Проведен сбор анамнестических данных, статистическая обработка, анализ

полученных данных и обобщение результатов исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В рамках данной работы было проведено исследование образцов плазмы крови 66 здоровых лиц в возрасте от 20 до 72 лет и 102 пациентов с заболеваниями сосудов нижних конечностей в возрасте от 20 до 77 лет. У 39 пациентов имело место варикозное расширение вен нижних конечностей (ВРВНК), у 34 - постфлебитический сивдром (ПФС) и у 29 - облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей (ОАСНК). Все пациенты поступали в хирургическую клинику РосНИИГТ для планового лечения.

Взятие образцов крови осуществлялось до начала проведения каких-либо лечебных мероприятий.

Исследования проводили в обедненной тромбоцитами плазме (РРР), в плазме, лишенной тромбоцитов и содержащей только микрочастицы (PFP), а также в плазме, в которой сохранялись наиболее мелкие микрочастицы, размером менее 0,2 мкм (uPFP). Образцы РРР получали путем двойного центрифугирования при 22°С: на первом этапе - в течение 10 мин при ускорении 120g, на втором - 30 мин при 2500g. PFP получали путем дополнительного центрифугирования образцов РРР в течение 5 мин при 14000g, 22°С. С помощью модуля для фильтрации Ceveron MFU 500 проводили ультрафильтрацию PFP для получения образцов uPFP.

Стандартное коагулологическое обследование включало определение индекса АГГГВ, протромбинового теста по Квику, тромбинового времени, концентрации фибриногена (ФГ) по Клауссу, активности антитромбина (AT), активности фактора VIII и фактора Виллебранда (ф. W), времени Хагеман-зависимого лизиса эуглобулиновой фракции плазмы (XIIa-ЗЭЛ), уровня D-димера. Тромбоцитарное звено гемостаза оценивали с помощью метода внутрисосудистой активации тромбоцитов, путем вычисления показателей, характеризующих сумму активных форм тромбоцитов и число тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты.

Тест генерации тромбина выполняли с помощью метода CAT (Calibrated Automated Thrombogram). В качестве триггеров применяли реактивы производства Thrombinoscope bv (Netherlands): «PRP-Reagent», содержащий рекомбинантный TF (конечная концентрация - 1 пМ) и «MP-Reagent», включающий фосфолипиды (конечная концентрация - 4 мкМ). При использовании реактива «MP-Reagent» к исследуемой плазме добавляли ингибитор контактной активации CTI (corn trypsin inhibitor). Конечная концентрация СП составляла 40 мкг/мл. Для активации коагуляции применяли реактив «FluCa-kit», состоящий из субстрата тромбина, меченного флюорогенной меткой, и Са2+. Измерения проводили относительно калибровочного раствора, который включал калибратор и образец исследуемой плазмы. Все измерения проводили в триплетах на планшетном флюориметре Fluoroskan Ascent (ThermoFisherScientific, Finland) при 37°C и длинах волн возбуждения и эмиссии 390 нм и 460 нм соответственно. С помощью прилагаемого программного обеспечения оценивали параметры полученных тромбограмм (рис.1).

Тромбин (нМоль)

400

В —

[МШ!

Рисунок 1 .Кривая генерации тромбина и измеряемые параметры.

А - LT (lag time) - время инициации свертывания; В - Peak - максимальная концентрация тромбина;

С - ЕТР (endogenous thrombin potential) - эндогенный тромбиновый потенциал; D - ТТР (time to peak) - время достижения пика.

Скорость генерации тромбина (V, нМ/мин) рассчитывали по следующей формуле:

Peak TTP-LT

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «STATISTICА 6.0». Для описания полученных данных определяли значение медианы (Me) и 50% доверительного интервала (ДИ). Сравнение результатов, полученных в исследуемых группах, проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при значении р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Прежде всего, чтобы убедиться, что применение в качестве триггеров реактивов «PRP-Reagent» и «МР-Reagent» даёт возможность определять участие в генерации тромбина именно прокоагулянтных фосфолипидов и TF, экспрессированных на МЧ, соответственно, мы провели сравнение показателей тромбограмм, полученных при исследовании образцов плазмы здоровых лиц, содержащих различное количество фосфолипидов - РРР, PFP и uPFP.

Постановка ТГТ с применением в качестве триггера реактива «PRP-Reagent» обнаружила уменьшение количественных показателей генерации тромбина (ЕТР, Peak), а также скорости генерации тромбина (таблица 1), с уменьшением количества прокоагулянтных фосфолипидов в образцах плазмы крови.

Таблица 1

Показатели тромбограмм образцов РРР, PFP и uPFP здоровых лиц, полученные при использовании реактива «PRP-Reagent» (Me, 50%ый ДИ: 25ыа и 75ый процентили)

Показатели Образцы плазмы

тромбограмм РРР (N=10) , PFP (N=30) uPFP (N=18)

ЕТР 1444,00* 471,84 174,50**

(нМ-мин) 1182,63-1575,50 384,25-564,00 143,50-196,00

Peak 62,71* 18,40 5,29**

(нМ) 37,54-83,58 12,29-20,26 4,47-5,93

V 4,74* 1,59 0,38**

(нМ/мин) 3,05-13,11 1,19-2,01 0,30-0,44

* - достоверные различия, полученные при сравнении показателей полученных в РРР и PFP (р<0,001)

** - достоверные различия, полученные при сравнении показателей полученных в PFP и uPFP (р<0,001).

Полученные результаты говорят о том, что постановка ТГТ с использованием реактива «PRP-Reagent» позволяет оценивать генерацию тромбина, зависимую именно от наличия прокоагулянтных фосфолипвдов, источником которых в образцах свободной от тромбоцитов, а также профильтрованной плазмы крови, являются МЧ.

При проведении ТГТ с применением в качестве триггера реактива «МР-Reagent» нами была обнаружена лишь тенденция к незначительному снижению количественных показателей генерации тромбина (ЕТР, Peak) по мере ужесточения условий подготовки образцов и уменьшения количества МЧ (таблица 2).

Таблица 2

Показатели тромбограмм образцов РРР, РЕР и иРРР здоровых лиц, полученные при использовании реактива «MP-Reagent»+CTI (Ме, 50%ый ДИ: 25ый и 75ый процентили)

Показатели Образцы плазмы

тромбограмм РРР (N=11) PFP (N=24) uPFP (N=10)

ЕТР 586,00 566,50 490,00

(нМ-мин) 448,00-730,00 462,25-708,00 473,00-701,75

Peak 48,30 46,25 35,28

(нМ) 24,53-54,00 32,91-67,21 30,27-59,50

V 7,20 7,34 6,23

(нМ/мин) 3,79-9,48 5,17-12,58 5,08-11,33

Сходство параметров тромбограмм, порченных в образцах плазмы, содержащих различное количество МЧ, позволяет предположить, что активность TF в плазме крови связана именно с МЧ, причем в большей степени с мелкими МЧ, которые остаются в образцах плазмы крови после ультрафильтрации, а постановка II Т с использованием реактива «MP-Reagent» дает возможность оценивать участие TF в генерации тромбина

Исследования генерации тромбина, проведенные в образцах плазмы свободной от тромбоцитов у здоровых лиц с использованием реактивов «PRP-Reagent» и «MP-Reagent», позволили показать, что МЧ вносят значимый вклад в обеспечение гемостатического потенциала плазмы крови. Полученные в образцах PFP параметры нормальных колебаний показателей II Т, обусловленных прокоагулянтными фосфолипидами и TF МЧ, использовали в качестве контрольных значений при дальнейшем исследовании.

В связи с поставленными задачами были исследованы параметры генерации тромбина, обусловленной МЧ плазмы крови, у 102 пациентов с заболеваниями сосудов нижних конечностей. Помимо показателей 11 I, также оценивались коагуляционные показатели и степень активации тромбоцитов.

Для всех групп пациентов была характерна активация тромбоцитарного звена гемостаза, что выражалось высокими значениями показателей внутрисосудистой активации тромбоцитов.

Средние значения показателей скрининговых тестов коагулограмм (индекса АГТГВ, протромбинового теста по Квику и тромбинового времени) за исключением концентрации ФГ, характерные для каждой из обследованных групп, не отличались от таковых в группе здоровых лиц. Активность AT и время ХПа-ЗЭЛ во всех обследованных группах больных

также оставались в пределах нормальных значений и не обнаружили достоверных различий с соответствующими показателями здоровых людей. Такие же особенности были отмечены в работах других авторов (Салтыкова Н.Б., 2003, Наместников Ю.А., 2012). В то же время средние значения концентрации ФГ, активности факторов VIII и Виллебранда, т.е. тех показателей, которые могут свидетельствовать о гиперкоагуляционных изменениях, обнаружили выраженные особенности, характерные для обследованных групп пациентов и отличающие их от здоровых лиц. Так, у больных, страдающих ВРВНК, все перечисленные показатели оставались в пределах нормальных значений, но были достоверно выше таковых в группе здоровых лиц. Наиболее высокая концентрация ФГ, а также активность фактора Виллебранда отмечены у пациентов с ОАСНК, что может указывать на наличие воспалительной реакции и существенную активацию сосудистой стенки. Для больных ПФС были характерны самые высокие значения активности фактора VIII по сравнению с соответствующими данными в двух других группах пациентов.

Частота встречаемости патологических результатов тестов коагулограмм также была неоднородна в разных обследованных группах (рис. 2).

Рисунок 2. Частота встречаемости патологических результатов тестов коагулограмм у пациентов с ОАСНК, ПФС и ВРВНК.

Как видно из представленной диаграммы, наибольший процент патологических результатов отдельных параметров коагуляции был обнаружен в группе пациентов с

ОАСНК. Реже всего патологические изменения коагуляционных показателей отмечались в группе пациентов с ВРВНК.

Учитывая, что во всех группах у значительной части пациентов отмечалось повышение только отдельных маркеров гиперкоагуляции на фоне нормальных значений АТ и отсутствия угнетения фибринолитической системы, не представлялось возможным однозначно говорить о развитии гиперкоа1уляционного состояния у конкретных больных.

Анализ показателей, полученных при использовании модификации '11 Г, которая выполняется в свободной от тромбоцитов плазме и позволяет оценить роль МЧ в коагуляционном процессе, выявил изменение параметров генерации тромбина во всех обследованных группах пациентов по сравнению со здоровыми лицами (рис. 3,4).

и оаснк т пфс и врв сш

1000

р<0,0001

566

ЕТР нМ-мин

30 20 10 0

р<0,01

llil®

р<0,001

I

ШВГ

р<0,01

¡1111

V, нМ/мин

Рисунок 3. Показатели тромбограмм, характеризующие участие TF МЧ в генерации тромбина, полученные в группах здоровых людей, пациентов с ОАСНК, ПФС и ВРВНК

р - различия между группами пациентов и здоровыми лицами

Как видно из диаграмм, представленных на рисунке 3, во всех группах пациентов количественные показатели ТГТ (ЕТР и Peak), а также скорость генерации тромбина (V), характеризующие процесс образования тромбина, обусловленный TF МЧ, превышали таковые в группе здоровых лиц с высокой степенью достоверности. Наиболее высокие значения всех вышеперечисленных параметров ТГТ (ЕТР, Peak, V) были получены в группе пациентов с ПФС.

Таким образом, значимую роль в усилении генерации тромбина у всех обследованных пациентов играют МЧ за счет экспрессии на своей поверхности доступного TF. Участие TF МЧ в образовании тромбина оказывает наиболее выраженный эффект на увеличение коагуляционного потенциала у пациентов с ПФС.

На рисунке 4 представлены результаты сравнения отдельных параметров тромбограмм, характеризующие участие прокоагулянтных фосфолипидов МЧ в процессе генерации тромбина в группах здоровых лиц и пациентов с ОАСНК, ПФС и ВРВНК.

НОАСНК 0ПФС ИВРВ DN

1000 800 600 400 200 0

р<0,000001

1 813 4"<0'0001 ^ 50J - 035

471

ЕГР нМ-мин

□ ОАСНК И ПФС □ ВРВ □ N

р<0,0001 р<0,05

26 1 ЧУ- V- " '' ■ ■ ■ ; Г -!j у " 18 ¡¡¡¡И , Ц 1111ш|ш§| 20 18

Peak, нМ

s оаснк а пфс т врв □ n

„ р<0,01

и Ш 1,6

V, нМ/мин

Рисунок 4. Показатели тромбограмм, характеризующие участие прокоагулянтных фосфолипидов МЧ в генерации тромбина, полученные в группах здоровых людей, пациентов с ОАСНК, ПФС и ВРВНК.

р - различия между группами пациентов и здоровыми лицами

Как видно из приведенных на рисунке диаграмм, выраженное увеличение как количества, так и скорости тромбинообразования отмечалось только в группе пациентов с

ПФС. При ВРВНК скорость генерации тромбина не отличалась от нормальных значений. В то же время у пациентов данной группы были повышены основные показатели, увеличение которых указывает на сдвиг гемостатического потенциала в сторону гиперкоагуляции (ЕТР и Peak). В группе пациентов с ОАСНК не удалось выявить различий с группой контроля как по количественным показателям тромбограмм, гак и по скорости образования тромбина.

Однако обращал на себя внимание тот факт, что у пациентов с ОАСНК временные характеристики тромбограмм (LT, ТТР) были достоверно увеличены по сравнению с нормой (рис. 5), тогда как в двух других обследованных группах (ПФС и ВРВНК) временные показатели не отличались от таковых у здоровых лиц.

Рисунок 5. Показатели LT и ТТР в группах здоровых людей и пациентов с ОАСНК р - различия между пациентами с ОАСНК и здоровыми лицами.

Увеличение временных показателей говорит об удлинении периода, необходимого для инициации процесса генерации тромбина. Согласно литературным данным, одним из основных факторов, влияющих на длительность LT, является ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) (Dielis A.W., 2008). Патогенетические основы развития атеросклеротического процесса предрасполагают к образованию большого количества МЧ, значительную часть которых составляют эндотелиальные МЧ. Известно, что они могут обладать выраженным антикоагулянтным потенциалом за счет экспрессии на своей поверхности тромбомодулина, эндотелиального рецептора протеина С, TFPI (Steppich В., 2005). При этом атеросклеротически изменённые сосуды экспрессируют повышенное количество TFPI (Mitchell С.Т., 2009). Учитывая вышеперечисленное, можно предположить, что увеличение временных показателей ТГТ у пациентов с ОАСНК, а также отсутствие у них высоких значений ЕТР и Peak обусловлено влиянием МЧ,

обладающих антикоагулянтным потенциалом, возможно, за счет экспрессии ТТР1 на своей поверхности. Эту особенность можно рассматривать как защитный механизм, способствующий сохранению гемостатического баланса при хроническом стабильном течении заболевания. Для выяснения природы антикоагулянтного потенциала МЧ необходимы дополнительные исследования.

Таким образом, у пациентов с ПФС МЧ плазмы крови способствуют значительному увеличению гемостатического потенциала за счет наличия на их поверхности как ТТ, так и прокоагулянтных фосфолипидов. Больные, страдающие ВРВНК, как правило, не обнаруживают явных признаков активации системы гемостаза при стандартном коагулологическом обследовании. Однако, коагуляционный потенциал, обусловленный МЧ, достоверно превышает таковой в группе здоровых лиц за счет участия в генерации тромбина как ТТ, так и отрицательно заряженных фосфолипидов МЧ. Значительный вклад МЧ плазмы крови в процесс образования тромбина у пациентов с ОАСНК обусловлен П7, экспрессированным на их поверхности. Прокоагулянтные фосфолипиды МЧ у этих больных не оказывают влияния на увеличение уровня и скорости тромбинообразования, что, по-ввдимому, является результатом действия антикоагуляционного потенциала, которым обладают МЧ при данной патологии.

Следует отметить, что модификации 11Т, учитывающие вклад МЧ плазмы крови в коагуляционный процесс, оказались более информативными для выявления повышения гемостатического потенциала плазмы крови, чем стандартная постановка II "1 в бедной тромбоцитами плазме. Так, частота выявления повышенных значений ЕТР у пациентов с ПФС составляла 59% при использовании стандартной постановки теста, тогда как модификации, учитывающие вклад МЧ в генерацию тромбина, позволили выявить повышение данного показателя более чем у 70% больных (таблица 3).

Таблица3

Частота выявления повышенных значений ЕТР с помощью теста генерации тромбина у

пациентов с ПФС

Варианты постановки ТГТ % выявления повышенных значений ЕТР у пациентов с ПФС

Стандартная постановка 59%

Модификация, учитывающая вклад тканевого фактора МЧ 70%

Модификация, учитывающая вклад прокоагулянтных фосфолипидов МЧ 76%

У пациентов с ВРВНК стандартная постановка 11 Г не выявила какого-либо повышения гемостатического потенциала, в отличие от модификаций теста, учитывающих вклад МЧ. Это может говорить о том, что данные модификации пригодны для выявления изменения гемостатического потенциала на более ранних этапах развития гиперкоагуляционных изменений.

Для того чтобы убедиться, что увеличение показателей генерации тромбина не обусловлено повышением отдельных коагуляционных факторов, был проведен корреляционный анализ данных, полученных во всех обследованных группах. Каких либо значимых корреляционных связей между параметрами ill и показателями коагулограммы обнаружено не было. Это позволяет утверждать, что выявленное статистически значимое увеличение показателей ТГТ у пациентов по сравнению со здоровыми лицами не зависит от высоких значений отдельных коагуляционных факторов, а обусловлено действием TF и прокоагулянтных фосфолипидов, экспрессированных на МЧ.

Среди пациентов, страдающих ОАСНК, 10 человек получали гиполипидемические препараты из группы статинов. Известно, что статины обладают рядом плейотропных эффектов, среди которых предполагают положительное влияние на функцию эндотелия, а также антиагрегантное действие (Undas А., 2005). Сравнение средних значений тестов коагулограмм между группами больных с ОАСНК, принимающих статины и не получающих такой терапии, показало, что прием гиполипидемических препаратов ассоциировался с достоверным снижением активности фактора VIII (%) (Me: 128,0, ДИ: 102,5-149,0 против Me: 202,0, ДИ: 155,0-309,0, р<0,05). Прием гиполипидемических препаратов сказывался и на степени увеличения гемостатического потенциала МЧ плазмы крови у этих больных. Так, значения количественных показателей (ЕТР, Peak) и скорости генерации тромбина (V), обусловленные действием TF МЧ, достоверно ниже у пациентов с ОАСНК, получающих статины, по сравнению с одноименными показателями больных, не принимающих эти препараты (рис. 6). В то же время прокоагулянтные фосфолипищы МЧ не оказывают влияния на количественные показатели 11Т у пациентов с ОАСНК, независимо от включения статинов в схему терапии.

S без статинов Ш прием статинов □ N

р<0,01

в

шшшшш

46

Peak, нМ

ЕЗ без статинов □ прием статинов □ N

р<0,05

¡¡¡¡■¡¡И

16,3

Яш

7,3

V, нМ/мин

Рисунок 6. Сравнение показателей тромбограмм, характеризующих участие ТР МЧ в генерации тромбина у пациентов, находящихся на различной терапии, р - различия между группами пациентов, находящихся на различной терапии

Полученные результаты говорят о том, что статины способны ограничивать коагуляционный потенциал МЧ плазмы крови, в основном, за счет снижения участия в

этом процессе ТР, экспрессированного на МЧ. Это соответствует данным литературы, из которых следует, что прием статинов приводит к снижению экспрессии ТТ различными клетками (Undas А., 2005).

У 59% пациентов с ВРВНК наблюдалась клиническая картина хронической венозной недостаточности (ХВН). Развитие ХВН ассоциировалось с усилением роли прокоагулянтных фосфолипидов МЧ в генерации тромбина (таблица 4). Вклад ТР в обеспечение коагуляционного потенциала МЧ не изменялся в зависимости от наличия или отсутствия ХВН у больных ВРВНК и значительно превышал таковой в группе здоровых лиц.

Таблица 4

Показатели тромбограмм, характеризующие участие прокоагулянтных фосфолипидов МЧ в генерации тромбина, полученные у пациентов с ХВН и без ХВН (Ме, 50%ый

ДИ: 25ый и 75"" процентили).

Показатели Пациенты с ХВН Пациенты без ХВН

тромбограмм (N=14) (N=14)

ЕТР 650,00** 564,00

(нМ-мин) 621,5-973,25 482,5-691,75

Реак 22,15* 17,95

(нМ) 19,02-23,74 14,7-23,02

V 1,64 1,65

(нМ/мин) 1,49-2,17 1,21-2,53

* - р<0,05,** - р<0,0001, различия между группами пациентов

Таким образом, МЧ плазмы крови обладают коагуляционным потенциалом, который обусловлен наличием прокоагулянтных фосфолипидов и ТТ1 на их поверхности. У пациентов с заболеваниями сосудов нижних конечностей (ОАСНК, ПФС, ВРВНК) уровень генерации тромбина, обусловленной МЧ плазмы крови, значительно выше, чем у здоровых людей. Наиболее выражены эти изменения у пациентов с ПФС. В группе пациентов с ОАСНК, где были выявлены самые значимые гиперкоагуляционные изменения по данным коагулограмм, общий гемостатический потенциал МЧ не достигал таких высоких значений, как в группе пациентов с ПФС, что, возможно, обусловлено протекгавным влиянием антикоагулянтной активности МЧ. Применение в лечении пациентов с ОАСНК гиполипидемических препаратов позволяет значительно уменьшить коа1уляционный потенциал МЧ плазмы крови за счет снижения вклада МЧ в генерацию тромбина. У пациентов с ВРВНК единственной возможностью выявления гиперкоагуляционных изменений была оценка генерации тромбина, обусловленной МЧ

плазмы крови. Полученные данные свидетельствуют о том, что исследование коагуляционного потенциала МЧ может служить информативным тестом для выявления ранних признаков развития гиперкоагуляции.

ВЫВОДЫ

1. Установлены пределы нормальных колебаний параметров тромбограмм, характеризующие участие тканевого фактора и прокоагулянтных фосфолипидов микрочастиц плазмы крови в генерации тромбина у здоровых лиц.

2. У пациентов с ОАСНК коагуляционный потенциал плазмы крови, зависимый от микрочастиц, превышает таковой у здоровых людей за счет тканевого фактора, локализованного на микрочастицах.

3. Микрочастицы пациентов с ОАСНК, кроме прокоагулянтного, обладают и антикоагулянтным потенциалом, благодаря чему выполняют протективную функцию, способствуя ограничению генерации тромбина, обусловленной отрицательно заряженными фосфолипидами микрочастиц.

4. У пациентов с ОАСНК, принимающих гиполипвдемические препараты, выявлено выраженное снижение генерации тромбина, обусловленной тканевым фактором микрочастиц.

5. Коагуляционный потенциал плазмы крови пациентов с ПФС значительно повышен как за счет тканевого фактора, так и за счет прокоагулянтных фосфолипвдов, экспрессированных на микрочастицах.

6. У пациентов с ВРВНК коа1уляционный потенциал плазмы крови, обеспечиваемый микрочастицами, значительно выше, чем у здоровых людей. Повышение генерации тромбина обусловлено действием тканевого фактора и прокоагулянтных фосфолипидов, локализованных на микрочастицах.

7. Развитие ХВН у пациентов с ВРВНК сопровождается ростом коагуляционного потенциала плазмы крови за счет прокоагулянтных фосфолипидов микрочастиц.

8. Коагуляционный потенциал микрочастиц плазмы крови пациентов во всех обследованных группах значительно выше, чем у здоровых лиц. Наибольший рост уровня генерации тромбина характерен для больных с ПФС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование коагуляционного потенциала микрочастиц плазмы крови рекомендуется пациентам с риском развития тромботических осложнений, у которых стандартное обследование системы гемостаза не позволяет сделать однозначный вывод о наличии гиперкоагуляционных изменений.

2. У пациентов с ВРВНК целесообразно проводить исследование коагуляционного потенциала микрочастиц плазмы крови при помощи теста генерации тромбина с целью диагностики ранних признаков развития гиперкоагуляционных изменений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Матвиенко, О.Ю. Параметры генерации тромбина, обусловленной микрочастицами, в плазме крови практически здоровых лиц / О.Ю. Матвиенко, Ю.А. Наместников, О.Г. Головина // Материалы всероссийской научно-практической конференции Кировского НИИ Гематологии и переливания крови ФМБА России «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», Киров, 6-7 октября 2010 г. -С.156-157.

2. Матвиенко, О.Ю. Генерация тромбина, обусловленная микрочастицами, у пациентов с ишемическим инсультом / О.Ю. Матвиенко, Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Л.П. Папаян, Д.В. Герасименко, Е.В. Мельникова // Материалы пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), Москва, 3-5 февраля 2011 г. - С.333-334.

3. Матвиенко, О.Ю. Гиперкоагуляционный синдром при ишемическом инсульте / О.Ю. Матвиенко, ЮА. Наместников, О.Г. Головина, Е.А. Хаит, Л.П. Папаян, Д.В. Герасименко, Е.В. Мельникова, М.И. Кадинская, И.Ю. Ефимова // «Клиническая геронтология» - 2011. -№9-10. — С.34-38.

4. Наместников, Ю.А. Тест генерации тромбина - условия постановки теста для выявления состояний гиперкоагуляции / Ю.А. Наместников, О.Ю. Матвиенко, О.Г. Головина, Е.А. Хаит, А.Е. Николаева, Л.П Папаян.// «Клиническая лабораторная диагностика». — 2011. -№7.-С 35-38.

5. Матвиенко, О.Ю. Вклад микрочастиц в развитие гиперкоагуляционного синдрома у пациентов с посттромботической болезнью / О.Ю. Матвиенко, Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Н.Б. Салтыкова//Научно-практический журнал «Вестник гематологии» - 2011. - т.7, №.1 - С.112-113.

6. Наместников, Ю.А. Тест генерации тромбина - метод оценки гемостаза для выявления гиперкоагуляции у больных с поспромботической болезнью / ЮЛ. Наместников, О.Ю. Матвиенко, О.Г. Головина, Н.Б. Салтыкова, В.Д. Каргин, Л.П. Папаян // Научно-практический журнал «Вестник гематологии» - 2011. - т.7, №.1 — С.114-115.

7. Matvienko, О. Micropartical-associated thrombin generation in patients with postthrombophlebitic syndrome / Y. Namestnikov, N. Saltykova, O. Golovina // The materials of 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH, Liverpool, 2012, June 27 - 30. - Abstract PE07.

8. Матвиенко, О.Ю. Участие микрочастиц в генерации тромбина у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей / О.Ю. Матвиенко // Материалы 23й международной конференции Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов «Актуальные вопросы сосудистой хирургии», 29 июня-1 июля 2012 г., СПб. - С. 267 -269.

9. Матвиенко, О.Ю. Влияние гиполипидемических препаратов на генерацию тромбина, обусловленную микрочастицами плазмы крови / О.Ю. Матвиенко, Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Н.Б. Салтыкова // Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)», 2-3 октября 2012 г., г. Киров. - С. 88 -89.

10. Matvienko, О. Dependence of thrombin generation caused by tissue factor of microparticles on treatment with statins / O. Matvienko, O. Golovina, N. Saltykova // Thrombosis Research. -2012. - Vol. 130. - Supplement 1. -P. S184.

11. Матвиенко, О.Ю. Ранние признаки протромботических изменений / О.Ю. Матвиенко, Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Н.Б. Салтыкова // Материалы шестой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), Москва, 31 января-2 февраля 2013 г-С.240-241.

Подписано в печать 15.03.2013 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 147

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Реноме» 192007, Санкт-Петербург, наб. Обводного канала, д. 40