Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Диагностика гиперкоагуляции с помощью теста генерации тромбина

УДК 76.29.33, 76.0

005010482

НАМЕСТНИКОВ ЮРИЙ АНДРЕЕВИЧ

ДИАГНОСТИКА ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТА ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ФЕВ 2012

005010482

На правах рукописи УДК 76.29.33, 76.03.53, 76.35.33, 76.29.48

НАМЕСТНИКОВ ЮРИЙ АНДРЕЕВИЧ

ДИАГНОСТИКА ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТА ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медикобиологического агентства России.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Людмила Петровна Папаяп

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Николай Николаевич Петрищев

доктор медицинских наук, профессор Игорь Георгиевич Дуткевич

Ведущая организация: ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» Федерального медикобиологического агентства России.

Защита состоится “______”_____________2012 г. в_______часов.

На заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства России по адресу: 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан “_______”_________________2012 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Выявление состояния гиперкоагуляции, как основного патогенетического звена в развитии тромбозов, является важнейшей клиниколабораторной задачей. Современные средства фармакотерапии и профилактики тромбоэмболических осложнений направлены именно на борьбу с гиперкоагуляцией и достижение стойкого антитромботического эффекта. Поэтому на сегодняшний день клиническая медицина ставит перед лабораториями две основные задачи: 1) выявление и количественная оценка состояния гиперкоагуляции, 2) проведение мониторинга терапии, направленной на снижение коагуляционного потенциала крови. Выполнение этих задач позволяет клиницисту объективно оценить состояние каждого пациента и получить представление об эффективности проводимой терапии. Значимость качества лабораторной оценки системы гемостаза определяется тем, что на основе получаемых данных врач назначает препараты антитромботической терапии, недостаточная доза которых может быть неэффективной, а доза, превышающая индивидуальное терапевтическое значение для данного пациента, повысит риск опасных геморрагических осложнений.

Арсенал методов лабораторной оценки системы гемостаза велик, но, к сожалению, большинство из них нечувствительны к гиперкоагуляцион-ным состояниям. Так, рутинно использующиеся клоггинговые тесты определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), тромбинового времени (ТВ) и протромбиновый тест (ПТ) чаще всего остаются неизменными даже при наступлении тромбоза (Папаян Л.П. и соавт., 1999, Момот А.П., 2006). Определение уровня фибриногена, активности фактора свертывания VIII и фактора Виллебранда, а также антитромбина, протеинов С и S может выявить отклонения от референтного интервала, но не позволит судить о наличии гиперкоагуляции в целом, так как изменения отдельных компонентов свертывающей системы могут быть нивелированы в организме включением компенсаторных механизмов (Van Veen J., 2008).

В клинической практике для оценки гиперкоагуляции используются маркеры тромбинемии - уровни D-димера, тромбин-антитромбиновых комплексов, фрагментов протромбина F1+2. Повышение этих показателей свидетельствует об интенсивности образования ключевого энзима гемостаза - тромбина, а D-димер - и об интенсивности расщепления фибрина плазмином (Кузник Б.И., 2010, Баркаган З.С. и соавт., 2004). Однако перечисленные выше показатели лишь косвенно оценивают тромбинемию.

С точки зрения информативности большой интерес для выявления гиперкоагуляции представляет современный метод глобальной оценки состояния гемостаза - тест генерации тромбина (ТГТ) (Момот А.П., 2011, Hemker Н., 2004). Известно, что к образованию тромбина приводит последовательная активация факторов свертывания крови, сопровождающаяся включением механизмов положительной и отрицательной обратной связи. В то же время система антикоагулянтов противодействует избыточной генерации тромбина. Динамическая оценка генерации тромбина с помощью ТГТ отражает состояние системы гемостаза в целом и может являться интегральным показателем баланса про- и антикоагулянтных механизмов (Hemker Н., 2006, Barrowcliffe W., 2006). Наличие такого лабораторного показателя будет представлять большой клинический интерес, так как с его помощью возможна прямая оценка тромбинемии in vitro, а значит и выявление состояния гиперкоагуляции.

Однако до сих пор не определены оптимальные условия подготовки плазмы крови к исследованию, позволяющие наилучшим образом выявлять гиперкоагуляцию (Gerotziafas G., 2005, Van Veen J., 2008). He установлено, насколько изменяется информативность метода при добавлении в исследуемую плазму тромбомодулина, который имитирует работу анти-коагулянтной системы протеина С. Разработка условий постановки ТГТ, позволяющих наилучшим образом выявлять гиперкоагуляционные состояния, и внедрение данного метода в клиническую практику позволят качественным образом изменить подход к профилактике и лечению тромбоэмболических осложнений.

Цель исследования

Разработать условия постановки теста генерации тромбина как интегрального показателя состояния системы гемостаза для диагностики гиперкоагуляции и мониторинга антитромботической терапии.

Задачи исследования

1. Определить влияние преаналитических условий на результаты теста генерации тромбина:

- взятия венозной крови;

- центрифугирования крови для подготовки к исследованию;

- хранения образцов плазмы.

2. Определить влияние тромбомодулина на частоту выявления гиперкоагуляции с помощью теста генерации тромбина.

3. Определить информативность теста генерации тромбина как интегрального показателя активации плазменного звена гемостаза для оценки гиперкоагуляции и эффекта антитромботической терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Тест генерации тромбина, являясь интегральным показателем, оценивает систему гемостаза с учетом взаимодействия факторов про-и антикоагулянтной направленности.

2. Показатели ЕТР (эндогенный тромбиновый потенциал) и Peak thrombin (пик тромбина) в отличие от клоттинговых тестов позволяют количественно оценить степень выраженности гиперкоагуляционных изменений.

3. Постановка теста генерации тромбина с использованием тромбо-модулина увеличивает возможности метода в выявлении гиперкоагуляции. Добавление в реакционную смесь тромбомодулина позволяет оценить вклад в генерацию тромбина системы протеина С, что повышает информативность исследования.

4. Модифицированный вариант теста генерации тромбина позволяет получить дополнительный показатель состояния гемостаза — чувствительность к тромбомодулину. Снижение чувствительности к тромбомодулину даже при нормальных количественных характеристиках теста генерации тромбина свидетельствует о наличии скрытого риска развития тромбоза, обусловленного нарушениями в одной из значимых антикоагулянтных систем - системе протеина С.

5. Количественное определение генерации тромбина представляет собой объективный лабораторный метод индивидуальной оценки антитромботической терапии.

Научная новизна

Впервые определены оптимальные преаналитические условия выполнения теста генерации тромбина для выявления гиперкоагуляции, доступные для широкой клинической практики.

Впервые продемонстрировано, что выявляемость гиперкоагуляции, в том числе у женщин, принимающих комбинированные оральные контрацептивы, и пациентов с постфлебитическим синдромом, значимо повышается при постановке теста генерации тромбина с добавлением человеческого рекомбинантного тромбомодулина.

Разработан и предложен новый показатель для выявления гиперкоагуляции - чувствительность к тромбомодулину.

Установлено, что при оценке индивидуального эффекта антикоагу-лянтной терапии следует ориентироваться на изменение параметров ЕТР и Peak thrombin.

Практическая значимость

Проведенное исследование продемонстрировало значимость глобальной оценки состояния гемостаза с помощью теста генерации тромбина для выявления гиперкоагуляции.

Показано, что тест генерации тромбина является чувствительным инструментом выявления гиперкоагуляции у женщин, принимающих комбинированные оральные контрацептивы, и пациентов, страдающих постфле-битическим синдромом.

Тест генерации тромбина позволяет обеспечить лабораторную оценку индивидуального эффекта антикоагулянтной терапии на основании изменения параметров ЕТР и Peak thrombin.

Своевременное выявление и количественная оценка гиперкоагуляции позволят проводить адекватную патогенетическую терапию, направленную на снижение гемостатического потенциала у пациентов, принимающих антитромботические препараты.

Апробация работы

Результаты работы доложены и обсуждены на Северо-Западной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики и лечения венозных и артериальных тромбозов» (Санкт-Петербург, 2010 г), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011 г), на краевой научно-практической конференции «Актуальные проблемы тромбозов и тромбофилий» (Краснодар, 2011 г), на VII Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2011 г), на конференции «Актуальные вопросы тромбоза и гемостаза в сердечно-сосудистой патологии» (Санкт-Петербург, 2011 г).

Внедрение в практику

Результаты диссертационной работы используются при оказании стационарной и амбулаторной помощи больным с хирургическими и гематологическими заболеваниями в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии. Материалы исследования включены в программу подготовки врачей и научных работников по вопросам физиологии и

патологии гемостаза, проводимой лабораторией свертывания крови совместно с Санкт-Петербургским государственным медицинским университетом им. И.П. Павлова.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, иллюстрирована 3 рисунками и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы (включает 10 отечественных и 104 зарубежных источника).

Личный вклад автора

Автором лично выполнены исследования по определению показателей теста генерации тромбина у больных и в контрольной группе. Проведен сбор данных, их статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служила плазма крови 96 пациентов: 36 женщин в возрасте от 18 до 56 лет, принимающих комбинированные оральные контрацептивы; 54 больных хирургической клиники Российского НИИ гематологии и трансфузиологии, из них 34 в возрасте от 22 до 77 лет с диагнозом постфлебитический синдром; 20 пациентов в возрасте от 21 до 62 лет с диагнозом варикозное расширение вен нижних конечностей; а также 6 беременных от 20 до 37 лет с диагнозом угроза невынашивания беременности, синдром потери плода. В качестве контрольной группы были обследованы 109 практически здоровых лиц (37 мужчин и 72 женщины) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих в анамнезе тромботических эпизодов.

Обследование практически здоровых лиц включало определение про-тромбинового теста по Квику (ПТ), активированного парциального тром-бопластинового времени (АПТВ), тромбинового времени (ТВ) и концентрации фибриногена. Обследование пациентов дополнительно включало определение активности фактора VIII, ристомицин-кофакторной активности фактора Виллебранда, активности антитромбина, времени Хагеман-зависимого лизиса эуглобулиновой фракции плазмы и уровня Б-димера.

Показатели состояния плазменного гемостаза определялись на автоматических коагулометрах ACL-200 производства «Instrumentation Laboratories», США и Helena АС-4 производства «Helena», Великобритания с использованием реагентов соответствующих производителей. Для оценки полученных результатов использовались референтые интервалы, разработанные лабораторией свертывания крови Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Постановка и анализ результатов теста генерации тромбина выполнялись согласно методике, предложенной Hemker Н., 2003.

В качестве триггерного реагента использовалась смесь рекомбинантного человеческого тканевого фактора rh-TF и отрицательно-заряженных прокоагулянтных фосфолипидов в конечной концентрации 5 пМоль и 4 цМоль соответственно. Автоматическая калибровка результатов проводилась относительно измеренной в аналогичных условиях активности тромбинового калибратора - «Thrombin Calibrator» - производства «Thrombinoscope bv», Нидерланды. Калибратор представлял собой синтетический аналог тромбина с заведомо известной активностью, высокоспецифичный к добавляемому в реакционную смесь субстрату.

Постановка теста выполнялась в дублях на планшетном флюоримет-ре, оборудованном диспенсером, Fluoroskan Ascent® производства ThermoFisher SCIENTIFIC, Финляндия. Длина волны экстинкции составляла 390 нм, эмиссии - 460 нм. За одну постановку в 96-луночном планшете исследовалось до 24-х образцов плазмы.

Из полученных данных с помощью программного обеспечения Thrombinoscope® версия 3.0.0.26 производилось построение и расчет показателей кривых генерации тромбина. Рассчитывались показатели: Lag time (время инициации свертывания, мин) - время, измеренное от момента внесения смеси флюорогенного субстрата и ионизированного кальция в лунку с образцом и триггером, до момента отклонения флюоресцентного сигнала от основной горизонтальной линии более чем на 2 стандартных отклонения; Peak thrombin (пиковое количество тромбина в образце, нМоль) - максимальное количество тромбина, образующееся в процессе его генерации; ttPeak (время достижения пика, мин) - время, за которое в образце генерируется максимальное количество тромбина и ЕТР (эндогенный тромбиновый потенциал, нМоль*мин) — измеренный как площадь под кривой генерации тромбина (рис. 1).

Статистический анализ полученных данных производился с помощью пакетов программного обеспечения: SPSS Statistics 17.0, Microsoft Office 2003 - Excel, Statistica 6.0.

Рисунок 1. Кривая генерации тромбина и измеряемые параметры.

А - Lag time - время инициации свертывания;

В - Peak thrombin — максимальное количество тромбина;

С - ЕТР - эндогенный тромбиновый потенциал;

D - ttPeak - время достижения пика.

Для описания полученных количественных данных использовались показатели: среднее значение (М), медиана (Me), стандартное отклонение (SD), значения процентилей (5-го, 25-го, 75-го и 95-го). Использованы критерии: t-критерий сравнения средних значений параметров в независимых выборках; критерий Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что подготовка плазмы крови и условия постановки теста генерации тромбина (ТГТ) оказывают значимое влияние на способность метода к выявлению тех или иных патологических состояний системы свертывания крови. В связи с тем, что до настоящего времени

не достигнута стандартизация условий, необходимых для выполнения данного теста с целью определения степени активации гемостаза, нами был предпринят сравнительный анализ результатов ТГТ, полученных при различных способах взятия крови, условиях ее центрифугирования и хранения образцов плазмы.

Условия взятия крови, оптимальные для выявления гиперкоагуляции, были определены путем сравнения показателей ТГТ в образцах, полученных тремя разными способами: в вакуумную пробирку Vacuett (Greiner, Австрия), пробирку с поршнем Sarstedt (Sarstedt, Германия) и самотеком. На сегодняшний день взятие крови в вакуумные пробирки является наиболее распространенным в клинической практике, поэтому для анализа полученных результатов показатели ТГТ именно в этих пробирках были приняты за 100% (табл.1). Как видно из таблицы 1, они практически не отличались от аналогичных показателей, полученных при взятии крови наиболее щадящим способом для исследования гемостаза - самотеком.

Таблица 1

Сравнение результатов теста генерации тромбина, полученных с помощью разных способов взятия крови

Показатели ТГТ Способ взятия крови Lag time, мин ЕТР нМоль*мин Peak thrombin, нМоль ttPeak, мин

Vacuett (Greiner) 100% 100% 100% 100%

Sarstedt (Sarstedt) 100% 126% 120% 102%

Самотеком 100% 109% 107% 100%

Значения ЕТР в образцах, взятых в систему Sarstedt и самотеком, повысились относительно таковых в пробирках Vacuett (Greiner) на 26% и 9% соответственно. Значения Peak thrombin изменились соответственно на 20% и 7%. Различий в значениях показателя Lag time между образцами выявлено не было. Показатель ttPeak повысился на 2% при взятии

в систему Sarstedt, в то время как изменения при взятии самотеком не наблюдалось.

Для стандартизации ТГТ, в качестве единого для проведения дальнейших исследований, был выбран способ взятия крови в вакуумные пробирки Vacuett, содержащие 3,2% раствор цитрата натрия основного, в молярной концентрации 0,109 при соотношении антикоагулянта и крови 1:9.

По литературным данным для подготовки плазмы крови перед постановкой ТГТ можно использовать различные режимы центрифугирования (Livnat Т. 2008, Dargaud Y. 2007, Altman R. 2007). В настоящей работе оптимальный для выявления гиперкоагуляции способ центрифугирования был определен путем сравнения показателей ТГТ в образцах плазм здоровых лиц и пациентов с гиперкоагуляцией с использованием четырех разных режимов центрифугирования, выполненных при комнатной температуре (22°С), как принято для проведения коагулологических исследований (табл.2).

Таблица 2

Исследуемые режимы центрифугирования для получения плазмы крови, используемой в тесте генерации тромбина

Режим 1 Режим 2 Режим 3 Режим 4

130g, 10 мин; 2500g, 30 мин 2000g, 10 мин; lOOOOg, 10 мин 2000g, 10 мин 1600g, 10 мин

Абсолютные показатели средних значений в группе здоровых лиц условно были приняты за 100%, а средние значения у лиц с гиперкоагуля-ционными состояниями - в процентах относительно значений нормы. Результаты сравнения представлены на рисунке 2. Как видно из рисунка 2, наибольшие различия между группами нормы и гиперкоагуляционных состояний наблюдались при исследовании плазм, полученных в режимах

1 и 4. Использование режима 1 позволило выявить гиперкоагуляционные состояния, как по временным, так и по количественным показателям с максимальной разницей средних значений двух групп: 25% для Lag time, 33% для ЕТР, 57% для Peak thrombin и 40% для ttPeak. При использовании режима 4 максимальная разница значений наблюдалась только по показателям

Lag time и ETP - 26% и 34% соответственно. При использовании режимов

2 и 3 разница показателей ТГТ между сравниваемыми группами была значительно меньше. Оптимальным представляется режим 1, при котором максимальная разница значений наблюдалась как по временным, так и по количественным показателям ТГТ. Выбранный нами режим центрифугирования соответствует подходу к подготовке плазмы крови для ТГТ, который другие авторы используют для выявления гиперкоагуляции (Geterotziafas G. 2007, Graff J. 2007).

Lag time

30%

20%

10%

0%

50%

40%

30%

20%

10%

ttPeak

ETP

4056 30!'» 20% 10% 0%

Peak

60%

40%

20%

0%

Рисунок 2. Разница между средними значениями показателей теста генерации тромбина в плазме здоровых лиц и пациентов с гиперкоагуляционными состояниями (в процентах); 1-4 - сравниваемые режимы центрифугирования.

Считается, что хранение плазмы при температуре -70-80°С обеспечивает оптимальные условия для исследования состояния системы гемостаза. Однако, в условиях работы клинических учреждений далеко не всегда доступно морозильное оборудование, позволяющее соблюсти подобное требование преаналитического этапа ТГТ. Для ответа на вопрос о допустимости хранения плазмы крови при более мягких условиях проведено сравнительное исследование ТГТ в образцах бедной тромбоцитами плазмы, хранившихся при -20°С и -70°С в течение двух недель перед постановкой теста. Результаты исследования ТГТ, полученные для плазмы,

хранившейся при -70°С условно были приняты за 100%, относительно них оценивали изменения значений параметров ТГТ в плазме, хранившейся при -20°С (табл.З). Изменения, выявленные в ходе исследования влияния условий хранения плазмы, были незначимые (не более 10%), что свидетельствовало о допустимости как одного, так и второго варианта хранения образцов в течение 2-х недель до проведения ТГТ.

Таблица 3

Сравнение показателей теста генерации тромбина, полученных для образцов плазмы, хранившихся при разных условиях

Апробация выбранных условий подготовки плазмы для проведения ТГТ была выполнена на плазме крови 89 практически здоровых лиц (52 женщины и 37 мужчин). Средний возраст составил 36,75 лет, минимальный - 19 лет, максимальный - 62 года. Критериями включения волонтеров в группу нормы были значения показателей рутинно используемых клоттинговых тестов: индекса АПТВ, ПТ по Квику и концентрации фибриногена - находившиеся в пределах референс-диапазона, установленного лабораторией.

С использованием выбранных нами условий преаналитического этапа были определены границы диапазона нормальных величин параметров ТГТ с использованием 5-го и 95-го процентилей, определивших 90% доверительный интервал (ДИ) (табл.4).

Таблица4

Пределы нормальных значений показателей теста генерации тромбина

Показатели ТГТ Lag time, мин ЕТР, нМоль*мин Peak thrombin, нМоль ttPeak, мин

90% ДИ 1,67-2,89 1260,17- 2089,00 234,12-387,87 4,03- 6,39

Как известно, прием комбинированных оральных контрацептивов (КОК) вызывает развитие гиперкоагуляции (Тарасова М.А. и соавт., 1999, Кобилянская В.А., 1999). В связи с этим, способность ТГТ к выявлению гиперкоагуляции была апробирована при исследовании 36 женщин (возраст 33 ± 10 лет), принимающих КОК. Продолжительность приема КОК составляла от 2-х месяцев до 12 лет (в среднем - 2 года 10 месяцев). Контрольную группу составили 50 женщин (возраст 38 ± 12 лет), не принимавших ранее и на момент обследования препараты группы КОК. Сравнение показателей ЕТР и Peak thrombin выявило значимое их повышение у женщин, принимающих КОК, по сравнению с контрольной группой — на 26% (р<0,0001) и 28% (р<0,0001) соответственно. Полученные нами данные согласуются с результатами зарубежных исследователей, согласно которым КОК как второго, так и третьего поколений вызывают развитие гипреркоагуляции, что проявляется повышением показателей ЕТР и Peak thrombin (Tchaikovski S. et al., 2007, Rosing J. et al„ 2007). Представленные результаты исследования ТГТ в плазме женщин, принимающих КОК, позволили сделать вывод о правомерности использования выбранных условий подготовки проб для выявления гиперкоагуляции.

Установлено, что ТГТ в стандартной постановке характеризует генерацию тромбина с учетом влияния антитромбина, но не оценивает вклад второго по значимости антикоагулянта - системы протеина С. По мнению ряда авторов добавление в реакционную смесь тромбомодулина (ТМ), активатора работы системы протеина С, позволяет оценить вклад системы протеина С в угнетение генерации тромбина, что значительно повышает информативность теста (Dargaud Y. et al., 2006, Liestol S. et al., 2007, Rosing J. 2007). В связи с этим следующим разделом настоящей работы явилось изучение влияния ТМ на частоту выявления гиперкоагуляции с помощью ТГТ. Постановка ТГТ была видоизменена моделированием присутствия в системе эндотелиального ТМ. Для этого в реакционную смесь добавляли растворимый рекомбинантный человеческий тромбомодулин

(гЬ-ТМ), что приводило к снижению показателей ТГТ за счет активации работы системы протеина С. Необходимое для анализа результатов количество гЬ-ТМ было определено титрованием. Для этого ТГТ был поставлен в образце пула нормальных плазм с последовательными разведениями гЬ-ТМ. Зависимость показателей ТГТ от количества гЬ-ТМ представлены в таблице 5.

Таблица 5

Зависимость показателей теста генерации тромбина от количества добавляемого в реакционную смесь тромбомодулина

Кол-во rh-TM, цМоль Lag time, мин ЕТР, нМоль* мин Peak thrombin, нМоль ttPeak, мин снижение ЕТР, % снижение Peak thrombin, %

0,00 2,00 1379,00 282,38 4,33 0 0

0,26 2,02 1270,00 264,83 4,69 7,90% 6,22%

0,52 2,02 1177,50 249,07 4,69 14,61% 11,80%

1,04 2,02 1181,50 255,25 4,53 14,32% 9,61%

2,08 1,85 1004,00 225,41 4,36 27,19% 20,17%

4,17 1,69 789,00 186,38 4,03 42,78% 34,00%

8,33 1,69 637,50 153,63 3,69 53,77% 45,59%

16,67 1,52 376,00 . 91,02 3,52 72,73% 67,77%

Для оценки вклада системы протеина С в генерацию тромбинапред-лагают использовать то количество ТМ, которое в нормальной плазме снижает показатели ЕТР и Peak thrombin примерно на 50% по сравнению с показателями в образце без ТМ. В настоящем исследовании снижение показателя ЕТР на 53,77%, Peak thrombin на 45,59% было достигнуто

добавлением в реакционную смесь rh-TM в количестве 8,33 цМоль. Это количество ТМ, равное 8,33 цМоль, использовалось нами в последующих постановках ТГТ.

Реакция системы гемостаза на добавление rh-TM определялась способом, предложенным рядом авторов (Rosing J. et al., 2007, Tchaikovski S. 2007). Показатели ТГТ (ETP и Peak thrombin) в исследуемой плазме получали при параллельной постановке без rh-TM и с добавлением rh-TM. Вычисляли разницу между ЕТР(без л-тм) и ЕТР (СГь-тм)ИЛИ Peak thrombin^ л-тм) и Peak thrombin^ rh.TM). Полученные значения делили на ЕТР(6ез гЬ-тм) или на Peak thrombin^ fh.TM) соответственно. Результат выражался в процентах и характеризовал чувствительность к тромбомодулину:

Чувствительность (ЕТР (6ез lh.TM) - ЕТР (с А_тм))

к тромбомодулину, = -------------------------------х 100%

% ЕТР (без rh-TM)

Чувствительность ( Peak thrombin (безгЬ-тм) - Peak thrombin (с гь-тм))

к тромбомодулину, = ----------------------------------------------х 100%

% Peak thrombin (без rh.TM)

Для определения границ референтного интервала чувствительности к тромбомодулину по степени снижения ЕТР и/или Peak thrombin были исследованы 20 образцов плазмы от здоровых волонтеров. Границы референтных интервалов были определены с помощью 5-го и 95-го проценти-лей (табл.6). Снижение показателей ЕТР менее чем на 39%, и Peak thrombin менее чем на 34%, расценивали как признак недостаточной чувствительности системы гемостаза к добавляемому тромбомодулину.

Таблица 6

Границы референтных интервалов показателя чувствительности к тромбомодулину

ЕТР, нМоль* мин ЕТР с rh-TM, нМоль* мин Чувствительность к ТМ (снижение ЕТР при добавлении rh-TM), % Peak thrombin, нМоль Peak thrombin с rh-TM, нМоль Чув ствительность к ТМ (снижение Peak thr. При Добавлении rh-TM), %

1231- 1951 404- 1032 39%-74% 225,39- 378,71 93,23- 218,57 34%-65%

Существует точка зрения, согласно которой постановка ТГТ, модифицированная добавлением ТМ, является более информативной для выявления гиперкоагуляции, обусловленной приемом КОК второго и третьего поколений, а главное, позволяет оценить влияние препаратов на работу системы протеина С (Rosendaal F. 2007). Для апробации видоизмененных условий постановки ТГТ были исследованы образцы плазм, полученные от 34 женщин, принимающих КОК. Мы показали, что параметры ТГГ (ЕТР и Peak thrombin) в постановке с добавлением rh-TM в группе женщин, принимающих КОК, были достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,0001). При этом гиперкоагуляция в постановке с добавлением rh-TM по показателю ЕТР выявлялась на 15%, а по показателю Peak thrombin - на 12% чаще, чем в постановке без добавления rh-TM. Следует учесть, что Peak thrombin характеризует лишь максимальное количество тромбина, образующегося в образце с момента активации процесса свертывания, в то время как ЕТР, численно выражаемый как площадь под кривой генерации тромбина, в большей степени оценивает совокупное действие про- и антикоагулянтных механизмов (Hemker Н., 2003). Если за короткий промежуток времени образуется большое количество тромбина (высокий показатель Peak thrombin), а затем так же быстро инактивируется антикоагулянтами, площадь под кривой генерации тромбина может оставаться небольшой. Соответственно показатель ЕТР будет находиться в пределах референтного интервала. Таким образом, показатель ЕТР в большей мере соответствует понятию глобальной оценки гемостаза.

Особое внимание в данном исследовании мы уделили оценке показателя чувствительности к тромбомодулину, снижение которого наблюдалось более чем у 40% обследованных женщин, принимающих КОК (табл.7). Это свидетельствует о воздействии данных препаратов на работу системы протеина С, что согласуется с результатами исследования Tchaikovski S., 2007.

Анализ частоты встречаемости снижения чувствительности к ТМ в зависимости от результатов определения ЕТР и Peak thrombin выявил некоторые особенности. Снижение чувствительности к ТМ было установлено в 15% случаев при нормальном показателе ЕТР и в 9 % случаев при нормальном показателе Peak thrombin в постановке без ТМ (табл.7). В 3% случаев снижение чувствительности к ТМ зарегистрировано при нормальном ЕТР в обоих вариантах постановки ТГТ. Подобная скрытая гиперкоагуляция может быть обусловлена нарушениями в системе протеина С. Выявить её возможно, если вычислять вышеописанным способом показатель чувствительности к тромбомодулину.

Таблица 7

Частота встречаемости снижения чувствительности к тромбомодулину у женщин, принимающих комбинированные оральные контрацептивы, с различными показателями теста генерации тромбина

Характеристика обследованных Частота встречаемости снижения чувствительности к тромбомодулину по показателю:

ЕТР Peak thrombin

41% 44%

Группа в целом (14/34) (15/34)

Женщины с нормальным

показателем ЕТР или Peak 15% 9%

thromin в постановке ТГТ (5/34) (3/34)

без rh-TM

Женщины с нормальным

показателем ЕТР или Peak 3% 0%

thromin в обеих постановках (1/34) (0/34)

ТГТ, без и с rh-TM

Таким образом, постановка с rh-TM является более физиологичной и, соответственно, более информативной в оценке гиперкоагуляции, что согласуется с данными ряда зарубежных исследователей (Delahousse В. et al., 2011, Dargaud Y. et al., 2006).

Наряду с исследованием ТГТ в двух вариантах постановки, женщинам, принимавшим КОК, определялись следующие показатели коагуло-граммы: активированное парциальное тромбопластиновое время, про-тромбиновый тест по Квику, тромбиновое время, активность фактора свертывания VIII, активность фактора Виллебранда, активность антитромбина, уровень D-димера.

Из 23-х обследованных с повышением показателей ЕТР и Peak thrombin увеличение активности фактора VIII наблюдалось у 9% (2/23), фактора Виллебранда - у 26% (6/23), снижение активности антитромбина

- у 9% (2/23) и повышение уровня D-димера - у 35% (8/23) женщин. Повышение отдельных показателей коагулограммы, свидетельствующих о наличии гиперкоагуляции, без повышения параметров ТГТ, наблюдалось у 9% (3/34) обследованных. При этом в одном случае была незначительно повышена только активность фактора Виллебранда. Еще в одном - сочетанное повышение активности факторов VIII и Виллебранда. В третьем случае наблюдалось повышение активности фактора Виллебранда и незначительное повышение уровня D-димера. Повышение количественных

показателей ТГТ - ЕТР и/или Peak thrombin - при неизмененных показателях коагулограммы установлено у 29% (10/34) женщин, принимавших КОК. Этот факт свидетельствовал о том, что, несмотря на отсутствие изменений отдельных параметров коагуляции, гемостатический баланс может быть смещен в сторону гиперкоагуляции. Использование в клинической практике клоттинговых тестов для выявления гиперкоагуляции не позволяет определить наличие данного состояния. Объясняется это тем, что исследование отдельных параметров коагуляции не отражает общей тенденции гемостаза в формировании тромбина. Отличительной чертой ТГТ и в особенности в постановке с ТМ является оценка генерации тромбина с учетом составляющих, как про-, так и антикоагулянтной направленности. Полученные нами данные при исследовании плазмы крови женщин, принимающих КОК, подтверждают данное положение.

Выявление гиперкоагуляции у пациентов с постфлебитическим синдромом (ПФС) является важной клинической задачей. В настоящей работе ТГТ был выполнен нами у 34 пациентов, страдающих ПФС. В качестве групп сравнения были обследованы 20 пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей (ВРВНК) и 83 практически здоровых лица.

Достоверных различий по показателю ЕТР в группах пациентов с ВРВНК и практически здоровых лиц не выявлено (табл.8). Напротив, в группе больных с ПФС показатель ЕТР был значимо увеличен как по сравнению с группой ВРВНК, так и с нормой. Однако индивидуальный анализ результатов исследования показал, что повышение ЕТР наблюдалось лишь в 53% случаев пациентов с ПФС. У 47% больных ЕТР, был в пределах нормы, хотя у многих из них был выявлен тот или иной маркер гиперкоагуляции: так у 37% наблюдалось повышение активности фактора VIII, у 37% - фактора Виллебранда, у 19% - концентрации фибриногена, у 25% - уровня D-димера.

Принимая во внимание тот факт, что при нормальных значениях показателей ТГТ в стандартной постановке у пациентов с ПФС по данным коагулограммы были выявлены те или иные маркеры гиперкоагуляции, у 22 человек с ПФС ТГТ был выполнен в постановке, модифицированной добавлением ТМ. Повышение ЕТР при этом наблюдалось чаще, в 59% случаев. Еще у 18% пациентов выявлено снижение чувствительности к ТМ без повышения ЕТР. Всего же повышение ЕТР и снижение чувствительности к ТМ как отражение риска ретромбоза наблюдались у 77% больных. Полученные данные при исследовании пациентов с ПФС являются дополнительным свидетельством того, что для выявления гиперкоагуляции наиболее информативным является ТГТ, модифицированный добавлением ТМ.

Таблица 8

Показатели теста генерации тромбина у практически здоровых лиц и пациентов с постфлебитическим синдромом и варикозной болезнью вен нижних конечностей в постановке без тромбомодулина

Здоровые лица (N=83) Пациенты

Показатели ТГТ ВРВНК (N=20) ПФС (N=34)

Lag time, мин Me ДИ 2,33 2,00-2,67 2,45 2,30-2,70 3,00 2,30-3,30

ЕТР, нМоль*мин Me ДИ 1693,61 1522,0-1855,33 1668,34 1526,00- 1796,00 1918,5* 1697,00- 2059,00

Peak thr., нМоль Me ДИ 310,83 284,67-351,72 289,78 264,10-318,70 310,60 286,00-351,00

ttPeak, мин Me ДИ 5,12 4,58-5,67 5,28 4,97-6,12 5,77 5,3-6,67

* р<0,005 при сравнении ПФС и ВРВНК, а также при сравнении ПТС и Нормы.

Принимая во внимание тот факт, что при нормальных значениях показателей ТГТ в стандартной постановке у пациентов с ПФС по данным коагулограммы были выявлены те или иные маркеры гиперкоагуляции, у 22 человек с ПФС ТГТ был выполнен в постановке, модифицированной добавлением ТМ. Повышение ЕТР при этом наблюдалось чаще, в 59% случаев. Еще у 18% пациентов выявлено снижение чувствительности к ТМ без повышения ЕТР. Всего же повышение ЕТР и снижение чувствительности к ТМ как отражение риска ретромбоза наблюдались у 77% больных. Полученные данные при исследовании пациентов с ПФС являются дополнительным свидетельством того, что для выявления гиперкоагуляции наиболее информативным является ТГТ, модифицированный добавлением ТМ.

Мониторинг антитромботической терапии является актуальной клинической задачей. В настоящем исследовании мы использовали ТГТ в качестве метода мониторинга эффективности терапии препаратами

низкомолекулярных гепаринов (НМГ). Аналогичный подход для контроля эффективности терапии НМГ был использован группой А1 Э1еп 2006. В своей работе мы исследовали образцы плазм шести беременных с угрозой невынашивания и синдромом потери плода. Тест был выполнен до назначения НМГ и через 10 дней от начала лечения. Лабораторный эффект терапии оценивали по степени снижения ЕТР.

Иллюстрацией приемлемости использования ТГТ для мониторинга терапии НМГ является анализ следующего примера. На рисунке 3 представлена динамика изменения ЕТР у беременной с угрозой невынашивания.

ЕТР, нМоль х мин.

1 ЕТР при добавлении 5 пМсль гЬ-ТР ЕТР при добавлении 5 пМолъ гИ-ТР и гЬ*ТМ

Рисунок 3. Динамика изменения показателя ЕТР у беременной с синдромом потери плода и угрозой невынашивания в зависимости от срока гестации и назначения препаратов.

Пациентка обследована на 4-ой неделе беременности: показатели ТГТ были в пределах нормы. По показаниям был назначен препарат прогестерона - утрожестан, что сопровождалось развитием гиперкоагуляции в первом триместре, выявленной в обеих постановках ТГТ. Назначение профилактической суточной дозы фраксипарина 0,3мл снизило показатель ЕТР. Причем в постановке с ТМ наблюдаемый эффект был значительно более выраженным, чем в обычной. Это могло быть обусловлено влиянием НМГ на работу системы протеина С. По причине развития

аллергической реакции на фраксипарин, препарат был отменен и одновременно с этим назначен метипред. К третьему триместру отмечалось значительное повышение ЕТР в обоих вариантах постановки ТГТ, что сопровождалось негативными изменениями фето-плацентарного кровотока по данным доплерометрии. Назначение фраксипарина в третьем триместре в суточной дозе 0,6мл привело к снижению ЕТР, но в отличие от первого триместра — не к столь выраженному. В связи с недостаточным антико-агулянтным эффектом доза фраксипарина была увеличена до 0,9мл в сутки. Усиление действия препарата установлено только в постановке ТГТ с ТМ. Еще большее увеличение дозы до 1,2мл проявилось парадоксальным ростом ЕТР в обеих постановках ТГТ. На 34 неделе беременности по показаниям выполнено родоразрешение операцией кесарева сечения. Гемостаз во время операции удовлетворительный, соответствовал объему выполненного вмешательства. Полученные результаты позволили индивидуально оценить антикоагулянтный эффект фраксипарина, который в третьем триместре был несопоставимо ниже, чем в начале беременности, и обеспечить объективный мониторинг проводимой терапии.

Таким образом, разработанные в настоящем исследовании условия преаналитического этапа и модификация постановки ТГТ добавлением ТМ значительно повышают его информативность как интегрального показателя активации плазменного звена гемостаза для выявления гиперкоагуляции и оценки эффекта антитромботической терапии.

ВЫВОДЫ

1. Тест генерации тромбина наиболее чувствителен к гиперкоагуляции при взятии крови в вакуумные пробирки и последующем двойном центрифугировании при комнатной температуре при 130§ в течение 10 минут и затем при 2500§ в течение 30 минут. Допускается хранение полученных образцов перед исследованием в течение двух недель как при температуре -70 С, так и -20 С.

2. Добавление в реакционную смесь тромбомодулина при постановке теста генерации тромбина значимо повышает возможности для выявления гиперкоагуляции.

3. В модифицированной постановке с добавлением тромбомодулина показатель ЕТР, отражающий количество генерируемого тромбина, повышен у 74% женщин, принимающих комбинированные оральные контрацептивы против 53% исследованных без добавления тромбомодулина и у 59% больных с постфлебитическим синдромом по сравнению с 53% исследованных стандартным методом.

4. Модифицированный вариант теста генерации тромбина позволяет получить дополнительный показатель состояния гемостаза - чувствительность к тромбомодулину. У 18% больных с постфлебитическим синдромом и нормальным значением показателя ЕТР выявлено снижение чувствительности к тромбомодулину, что свидетельствует о нарушении в системе протеина С и расценивается как фактор риска ретромбоза.

5. Тест генерации тромбина позволяет обеспечить лабораторную оценку индивидуального эффекта антитромботической терапии на основании изменения параметров ЕТР и Peak thrombin,

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование показателей теста генерации тромбина следует включить в перечень необходимых исследований у пациентов с риском тромбоэмболических осложнений, в том числе у женщин с патологией беременности.

2. Для оценки гиперкоагуляции и мониторинга антитромботической терапии следует использовать постановку теста генерации тромбина, модифицированную добавлением тромбомодулина. Наряду с оценкой количественных показателей ЕТР и Peak thrombin необходимо определять показатель чувствительности к тромбомодулину.

3. Строгое соблюдение правил преаналитической подготовки к постановке теста генерации тромбина: взятие крови в вакуумные пробирки с последующим двойным центрифугированием при комнатной температуре при 130g в течение 10 минут и затем при 2500g в течение 30 минут обеспечит оптимальные условия для выявления гиперкоагуляции.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Наместников, Ю.А. Тест генерации тромбина - интегральный показатель состояния системы свертывания крови / Ю.А. Наместников // Гематология и трансфузиология. - 2010. - Т.55 - №2. - С. 32 - 39.

2. Наместников, Ю.А. Условия постановки теста генерации тромбина для выявления состояний гиперкоагуляции / Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, О.Ю. Матвиенко, А.Е Николаева, Е.А. Хаит, Л.П. Папаян // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 7. -С. 35-38.

4. Головина, О.Г. Тест генерации тромбина - метод объективной оценки антикоагулянтного эффекта низкомолекулярных гепаринов во время беременности / О.Г. Головина, Ю.А. Наместников, О.С. Андреева, Л.П. Папаян, О.Ю. Матвиенко // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: материалы пятой Всероссийской конференции с международным участием - М., 3-5 февраля 2011г.-С. 135- 137.

5. Наместников, Ю.А. Тест генерации тромбина - метод оценки гемостаза для выявления гиперкоагуляции у больных посттромботической болезнью / Ю.А. Наместников, О.Ю. Матвиенко, Н.Б. Салтыкова, В.Д. Каргин, О.Г. Головина, Л.П. Папаян // Вестник гематологии. -2011.- Т. VII. - № 1.-С. 114-115.

6. Николаева, А.Е. Клиническое значение ретрохориальной гематомы у беременных, имеющих факторы риска по возникновению репродуктивных потерь. Опыт ведения в условиях женской консультации / А.Е. Николаева, Ф.Р. Кутуева, И.А. Кайка, Л.П. Папаян, С.И. Капустин, Ю.А. Наместников, Н.Н. Силина // Акушерство и гинекология. - 2011.

- № 5. - С. 94-98.

7. Наместников, Ю.А. Значение теста генерации тромбина в клинической практике / Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Л.П. Папаян // Онкогематология. - 2011. - Т.2. - С. 46 - 47.

8. Матвиенко, О.Ю. Вклад микрочастиц в развитие гиперкоагуляционно-го синдрома у пациентов с посттромботической болезнью / О.Ю. Матвиенко, Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Н.Б. Салтыкова // Вестник гематологии. -2011. - Т. VII. - № 1. - С. 112 - 113.

9. Николаева, А.Е. Ретрохориальная гематома как маркер наследственных тромбофилий и предиктор поздних осложнений / А.Е. Николаева, Ф.Р. Кутуева, И.А. Кайка, Л.П. Папаян, Ю.А. Наместников // «Мать и дитя»: материалы XII Всероссийского форума - М., 27 - 30 сентября 2011г.-С. 154- 155.

10. Вдовин, В.В. Тест генерации тромбина в лабораторном контроле эффективности терапии тромбастении Гланцманна препаратом Коагил -VII / В.В. Вдовин, Ю.А. Наместников, П.В. Свирин, Е.Э. Шиллер, Л.П. Папаян // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2011.- Т. 10. - № 3. - С. 41 -44.

Подписано в печать 19.01.2011. Формат 60x84/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 12. Распечатано в "Российский НИИ гематологии и трансфузиологии" ФМБА России, 191024, СПб, ул. 2-я Советская, д. 16.