Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние органотипических фетальных клеточных культур человека и неонатальных клеточных культур кролика на показатели системы гемостаза в плазме крови больных ишемической болезнью сердца

На правах рукописи

КОРЯКИНА Лариса Борисовна

ВЛИЯНИЕ ОРГАНОТИПИЧЕСКИХ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ЧЕЛОВЕКА И НЕОНАТАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

КРОЛИКА НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в ГУ «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО

Т1 АЛ Я XI..

Научные руководители:

доктор медицинских наук Курильская Татьяна Ефимовна

кандидат биологических наук Марченко Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, доцент

Пивоваров Юрий Иванович Четверикова Татьяна Давидовна

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институткардиологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН

Защита состоится « /3 » в « » часов на заседа-

нии диссертационного совета Д.001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Общепризнано, что при ИБС нарушения системы гемостаза и реологии крови играют важную роль, как в патогенезе этого заболевания, так и его осложнений. Риск развития ИБС увеличивают повышенная адгезивно-агрегационная активность тромбоцитов, высокое содержание в плазме крови фибриногена, увеличение активности VII фактора свертывания крови, снижение антикоагуляционной и фибринолитической активности (Гасилин B.C., 1975; Кузник Б.И., 1991; Бокарев И.Н., 1996). Поэтому одна из наиболее актуальных проблем в лечении атеросклероза, ИБС, ряда других заболеваний — поиск новых методов лечения, способных нормализовать свертывающую систему эффективно и надолго. Одним из таких перспективных направлений является трансплантация различных клеточных субстратов. Механизм терапевтического воздействия фетальных клеток и тканей включает специфические (заместительные) и неспецифические (общие для всех зародышевых тканей) эффекты (Грищенко В.П., 2001). Последние обусловлены, вероятно, индукцией факторов нейроэндокринной регуляции, поддерживающих тканевой гомеостаз. При лечении экспериментальной гиперхолестеринемии у животных было продемонстрировано позитивное влияние трансплантации клеток фетальной печени на систему гемостаза (Стрекаловский Д.В., 1999). Происходило повышение антикоагулянтных свойств крови, снижение ее тромбопластической активности, стабилизация агрегационных свойств тромбоцитов. Имеются сообщения и об использовании метода клеточной терапии в лечении больных ИБС (РуновичАА., 1996, 1997; Курильская Т.Е., 1999; Никифоров СБ., 2000). У пациентов отмечалось нарастание фибрино-литической и антикоагулянтной активности за счет повышения уровня плазминогена, антитромбина Ш и снижение напряженности коагуля-ционного потенциала. После однократной трансплантации оптимальный эффект удерживался в течение длительного периода наблюдения. Раскрытие механизмов влияния клеточной терапии на систему гемостаза — решающие условие для возможного последующего использования клеточной трансплантации в терапевтических целях.

Точно установлено, что ткани человеческого организма обладают тромбопластическими и фибринолитическими свойствами. Клеточные структуры печени продуцируют факторы свертывающей и противосвер-тывающей систем крови, такие как VII фактор (проконвертин), протромбин, фибриноген, плазминоген (Маркосян А.А., 1968; Милова-нов А.П., 2001). В ткани легкого имеются тучные клетки, которые синтезируют гепарин, большое количество активаторов плазминогена. Плацента обладает мощной противосвериявмешей системой, которая

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА { СПетер О»

II пи • I

нейтрализует нарастающую гиперкоагуляцию материнской крови по мере развития беременности (Макаров В.А., 1998; Милованов А.П., 2001).

В печени синтезируются также многие белковые компоненты (ферментные системы) плазмы крови, участвующие в образовании тромбов и в фибринолизе. Легкие, плацента и сердце способны продуцировать тром-бопластиноактивные вещества, прокоагулянты, активаторы фибринолиза.

Является очевидным и тот факт, что фетальные клетки в период гестации до 20 недель не вызывают иммунной реакции отторжения, поскольку в I и II триместрах беременности еще не экспрессированы белки гистосовместимости I и II класса. В то же время они содержат большое количество различных биологически активных веществ, таких как ростовые факторы, пептиды, а-фетопротеин, антиоксиданты, микроэлементы, витамины, гормоны, адаптогены, противовоспалительные, бактериостатические соединения и пептиды, стимулирующие им-мунокомпетентные клетки (ШмидФ., 1991; Никифоров С.Б., 2000). Между тем в доступной отечественной и зарубежной литературе сведения о гемостазиологическом потенциале органотипических фетальных и неонатальных клеточных культур нами не обнаружены. Информация о воздействии клеточного материала на показатели гемостаза в плазме крови больных ишемической болезнью сердца немногочисленна, а сведения о влиянии этих клеток на плазму крови здоровых людей вообще отсутствуют. В связи с этим нам представляется актуальным расширить представления о влиянии клеточной трансплантации на активность факторов системы гемостаза в норме и патологии.

Исходя из этого, целью работы явилось изучение гемостазиологи-ческого потенциала фетальных клеточных культур человека и неонатальных клеточных культур кролика и оценка их влияния на активность факторов системы гемостаза в плазме крови больных ишемической болезнью сердца in vitro.

Задачи исследования:

1. Изучить и провести сравнительный анализ гемостазиологичес-кого потенциала органотипического фетального клеточного материала человека и неонатального клеточного материала кролика.

2. Исследовать влияние органотипических фетальных клеточных суспензионных культур человека и новорожденных кроликов на активность факторов гемостаза донорской плазмы in vitro.

3. Оценить воздействие органотипических фетальных клеточных суспензионных культур человека и новорожденных кроликов на активность факторов системы гемостаза в плазме больных ИБС in vitro.

4. Провести сравнительный анализ влияния фетальных и неонатальных клеточных суспензионных культур на активность факторов системы гемостаза в плазме крови доноров и больных ИБС.

Научная новизна

Впервые представлены данные о гемостатическом потенциале ор-ганотипических фетальных клеточных суспензионных культур человека и неонатальных клеточных суспензионных культур кроликов.

Выявлены отличительные особенности воздействия фетальных и неонатальных клеточных культур на показатели системы гемостаза в плазме крови здоровых людей и больных коронарным атеросклерозом.

Установлено, что ведущим звеном антикоагуляционного эффекта фетальных и неонатальных суспензионных культур на плазму крови больных ИБС является повышение уровня плазминогена и активности АТ-Ш.

Новыми являются данные о том, что под влиянием неонатальных клеточных суспензионных культур кролика, по сравнению с фетальными клеточными культурами человека, в плазме крови больных ИБС в большей степени увеличивается активность фибринолитической системы, в основном за счет повышения уровня плазминогена. Также установлено, что снижается уровень фибриногена и активность XIII фактора.

Разработана концептуальная схема возможного использования фетальных и неонатальных органотипических клеточных культур в целях коррекции системы гемостаза в плазме крови больных ИБС.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в том, что в эксперименте in vitro установлено наличие факторов системы гемостаза в клеточных культурах печени, легкого, сердца и плаценты человека на 18—20 неделях гестации и неонатальных клеточных культурах печени, легкого и сердца кролика. Также представилось возможным патогенетически обосновать использование различных органоти-пических клеточных суспензионных культур в целях оптимизации системы гемостаза у больных ИБС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Органотипические суспензионные клеточные культуры печени, легкого, сердца и плаценты фетусов человека и клеточные культуры печени, легкого, сердца неонатального кролика обладают свертывающими и противосвертывающими свойствами, что подтверждается стандартными тестами, принятыми для оценки состояния системы гемостаза

2. Органотипические фетальные клеточные культуры человека и неонатальные клеточные культуры кролика при совместной инкубации с донорской плазмой способствуют возрастанию активности коа-гуляционного звена при умеренном повышении активности антикоа-гулянтной и фибринолитической систем

3. При взаимодействии фетальных и неонатальных клеточных культур с плазмой крови больных ИБС выявляется более выраженное, чем в плазме крови доноров, повышение уровня плазминогена и активно-

сти АТ-Ш с одновременной ингибицией факторов протромбинового комплекса, что приводит к уравновешиванию активности свертывающей и противосвертывающей систем.

Апробация

Материалы диссертации доложены и обсуждены на молодежной научно-практической конференции СО РАМН (Новосибирск, 2000), на II межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты клеточной и фетальной терапии» (Омск, 2000), на международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование» (Пермь, 2003), на межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири « Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Иркутск, 2003), на научной конференции молодых ученых «Новое в реконструктивной хирургии», посвященной дню основания РНЦХ РАМН (Москва, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», посвященной 25-летию кафедры физико-химической биологии Иркутского государственного университета (Иркутск, 2003), на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 21 рисунком и 2 схемами. Библиография содержит 175 источников, из них 114 — отечественных, 61 — зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения цели исследования и решения поставленных задач работа выполнялась в два этапа. С целью оценки влияния фетальных и неонатальных клеточных культур на активность факторов системы гемостаза в плазме крови больных был изучен гемостазиологический потенциал фетальных клеточных культур человека на 18—20 неделях геста-ции, а также клеточные культуры кролика на 1—2 сутки неонатального периода. Исследовались фетальные суспензионные культуры печени, легкого, сердца и плаценты человека и клеточные культуры печени, легкого и сердца новорожденного кролика. Биоматериал получали в лаборатории биологически активных веществ (БАВ) Научного центра ре-6

конструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН. До исследования клеточный материал хранился в парах жидкого азота (Т — 196 °С). Суспензионные культуры размораживали при 1 + 37 °С на водяной бане в течение 15 мин. Размораживание восстанавливало мелкодисперсную структуру клеточной суспензии, при этом подавляющее число клеток сохраняло свою структуру. Во всех видах клеточных культур производился подсчет клеток в 1 мл объема (табл. 1).

Таблица 1

Количество клеток в 1 мл объема клеточных культур

Фатальные клеточные культуры Неонатальные клеточные культуры Количество клеток

печень печень 298,48 х 10е

легкое легкое 277,1 х 10е

сердце сердце 200,2 х 10е

плацента 395,7 х 10е

Путем центрифугирования в течение 10 минут при 3000 g размороженные клеточные культуры разделяли на собственно клеточную суспензию и культуральную среду, в дальнейшем именуемую как надосадочная жидкость. Разделение клеточного материала на суспензию и надосадоч-ную жидкость проводили по следующим соображениям. Мы полагали, что ряд интересующих нас факторов системы гемостаза, в результате быстрого разделения центрифугированием, способны в большей степени оказаться в надосадочной жидкости, что может привести к искажению результатов, полученных при анализе содержания факторов системы гемостаза в клеточных субстратах. Однако, доказав, что во всех исследуемых образцах нет недостоверных различий, то в последующем мы рассматривали клеточную культуру и надосадочную жидкость как единое целое.

Число фетальных клеточных культур человека и неонатальных клеточных культур кролика, использованных в исследовании, представлено в таблице 2.

Таблица 2

Число использованных в работе органотипических фетальных и неонатальных суспензионных культур

Клеточный материал Фетальные клеточные культуры Неонатальные клеточные культуры Всего

Печень 60 80 145

Легкое 60 65 125

Сердце 60 65 125

Плацента 65 65

Всего 250 210 460

Выбор клеточных культур для исследования был обусловлен не только тем, что клеточные трансплантаты, изготовленные из ткани плаценты, печени, сердца и легкого, получили позитивную оценку в кардиологической практике, но и тем, что факторы свертывающей и противосвер-тывающей систем, по данным литературы, продуцируются клеточными структурами печени, легкого, сердца взрослого человека (Мачабели М.С., 1970; Скипетров В.П., 1971). Кроме того, и плацента рассматривается как регулятор гемостаза в системе мать — плацента — плод, так как она обладает мощной противосвертывающей системой, которая снижает нарастающую гиперкоагуляцию материнской крови по мере развития беременности (Скипертов В.П., 1978;. Мачабели М.С., 1980). Поэтому можно полагать, что фетальные и неонатальные клеточные структуры будут также обладать свертывающими и противосвертывающими свойствами.

В ходе исследования клеточные культуры разводили физиологическим раствором в равных соотношениях 1:1. Поэтому в качестве контроля использовали плазму крови здоровых людей и больных ИБС, добавляя к образцам физиологический раствор в таких же объемах. Это осуществлялось для того, чтобы привести к стандартным условиям как опытные образцы, так и контрольные.

Было использовано:

♦ 20 образцов плазмы крови здоровых доноров;

♦ 33 образца плазмы крови больных ИБС.

Все пациенты находились на лечении в кардиотерапевтическом и кардиохирургическом отделениях Областной клинической больницы № 1 с диагнозом ишемическая болезнь сердца. Они имели стенокардию напряжения II—IV ф.к., толерантную к медикаментозной корона-роактивной терапии. Диагноз ИБС выставлялся на основании критериев ВОЗ, включающих наличие типичного стенокардитического синдрома, результатов нагрузочного тестирования, а в 30 % случаев был верифицирован результатами коронарографии. Стандартная медикаментозная терапия у больных ИБС была отменена за пять суток до взятия крови на исследование. Это было обусловлено тем, что антикоагулянт-ные препараты, применяемые в лечение таких пациентов, могли повлиять на полученные нами результаты.

На первом этапе исследования в клеточных культурах как феталь-ных, так и неонатальных определяли наличие факторов системы гемостаза с помощью следующих методик: активированного парциального тром-бопласгинового времени (АПТВ). С помощью этого теста оценивалась начальная фаза свертывания крови. Результат выражался в секундах (К 30— 40 сек) (Баркаган З.С., 2001); протромбинового индекса (ПИ) с использованием растворимого тромбопластина (Баркаган З.С., Мо-мотА.П., 2001). Этим определялось состояние внешнего пути коагуляции и общего пути образования тромбина. Результат оценивался в процентах (%); количественного определения концентрации фибриногена, ос-

нованного напреципитационном методе (Бояджиян X., Бакалова Р., 1982). Полученные данные переводили в г/л фибриногена, пользуясь стандартной кривой разведения; определение активности фибринстабилизирую-щего фактора (XIII) микрометодом по А.Г. Белову (1991). Антикоагулян-тная активность оценивалась определением прогрессивной активности антитромбина III (AT-III) (A. Hensen, E. Loeliger в модификации К.М. Би-шевского, 1978). Фибринолитическая активность — определением плазминогена с применением хромогенного субстрата (Баркаган З. С., М о -мот АП., 1999). Результаты выражали в процентах к норме. В нормальной плазме концентрация плазминогена составила 90—140 %.

Для изучения влияния фетальных и неонатальных клеточных культур на показатели системы гемостаза в плазме крови доноров и больных проводили второй этап исследования. В образцы плазмы крови доноров или больных ИБС вносили фетальные либо неонатальные клеточные суспензии в равных соотношениях. Смесь инкубировали в течение 30 минут на водяной бане при +37 °С. Затем добавляли в равных соотношениях те же реагенты, которые использовали на первом этапе экспериментального исследования.

До отбора образцов плазмы крови для исследования у доноров и больных ИБС оценивали состояние системы гемостаза, которое показало, что в плазме крови здоровых людей активность свертывающей и противосвертывающей систем находилась в динамическом равновесии в отличие от больных с ИБС, у которых в системе гемостаза наблюдались достаточно глубокие гемокоагуляционные нарушения. Это выражалось в повышении тромбопластической активности, снижении ан-тикоагулянтной активности, в частности антитромбина III и депрессии фибринолитической активности за счет снижения уровня плазми-ногена. Таким образом, мы имели дело с принципиально различными образцами плазмы крови.

Статистическая обработка проведена методом вариационной статистики по программе статистического анализа (Microsoft Excel) с вычислением критерия t-Стыодента. Различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе проведенного исследования было установлено, что из всех исследуемых факторов системы гемостаза в фетальных клеточных культурах человека на 18—20 неделях гестации и неонатальных клеточных культурах кролика определяются фибриногеноподобные вещества, антитромбин III и плазминоген. При сравнительном анализе содержания факторов системы гемостаза было выявлено, что по сравнению с фе-тальными клеточными культурами человека неонатальные клетки со-

держат в два раза больше фибриногеноподобных веществ (табл. 3). Максимальные значения этих веществ определены в неонатальном легком и составили в среднем 1,5 ± 0,05 г/л. Наибольший уровень фибриноге-ноподобных веществ в фетальном материале был установлен в феталь-ной плаценте (1,1 ± 0,02 г/л). Концентрация плазминогена в неонаталь-ных клеточных суспензиях кролика находилась практически на одном уровне с фетальными суспензиями человека, за исключением неона-тального сердца, где уровень плазминогена оказался выше на 7,5 % (р< 0,05), чем в аналогичной фетальной клеточной культуре (табл. 3). Мы полагаем, что это связано с более высокой функциональной зрелостью клеточных сообществ новорожденного кролика.

Активность антитромбина III в фетальных клеточных культурах человека и новорожденных кроликов практически не различалась (табл. 3), исключая фетальную культуру легкого, в которой активность этого антикоагулянта на 8 % была выше (р < 0,01). Возможно, это обусловлено тем, что легкое богато тучными клетками, которые вырабатывают гепарин. Этот антикоагулянт является кофактором АТ-Ш и повышает его ингибиторную способность по отношению к тромбину в 1000 раз.

Таким образом, из представленных данных видно, что содержание фибриногеноподобных веществ в неонатальных клеточных культурах практически в 2 раза выше, чем в фетальных клетках. Очевидно, это связано с тем, что неонатальные клеточные суспензии находятся функционально в более созревшем состоянии по сравнению с феталь-ными суспензиями. Активность антикоагулянтной и фибринолитичес-кой систем в клетках кролика и человека практически не различалась. Отметим лишь, что в фетальном легком активность АТ-Ш была выше по сравнению с другими фетальными и неонатальными субстратами. Наибольшая концентрация плазминогена выявлена в неонатальной клеточной культуре сердца по сравнению с фетальными клеточными культурами человека и клетками новорожденного кролика.

Таблица 3

Сравнительное содержание факторов системы гемостаза в фетальных клеточных культурах человека и неонатальных клеточных культурахкролика

Клеточный Показатели Печень Легкое Сердце Плацента

фетап неон фетал неон фетал неон фетал

Фибриноген, г/л 0,5 ± 0,05 1,6± 0,4* 0,5 ± 0,04 1,4 ± 0,06* 0,4 ± 0,04 0,8 ± 0,07* 1,1 ± 0,03

Антитромбин III, % 23,6 ± 0,6 28,0 ± 0,8* 36,3 ± 0,5 28,3 ± 0,6** 27,6 ± 1,1 29,3 ± 1,2 27,3 ± 0,1

Плазминоген,% 6,7 ± 0,5 6,9 ± 0,6 7,2 ± 0,05 7,8 ± 0,1 4,9 ± 0,1 12,4± 0,4** 6,7 + 0,1

Примечание: достоверность отличия активности факторов системы гемостаза в фетальных клеточных культурах от неонатальных; * -р < 0,05; ** -р < 0,01.

На втором этапе исследования оценивали влияние фетальных и неонатальных клеточных культур на показатели системы гемостаза в плазме крови больных ИБС в сравнении с донорской плазмой. Для этого было проанализировано воздействие фетальных и неонатальных клеточных культур на свертывающую и противосвертывающую системы у практически здоровых людей и больных ИБС.

Воздействие фетальных клеточных культур человека и клеток неонатального кролика на показатели системы гемостаза в плазме крови доноров

Было установлено, что фетальные и неонатальные клеточные культуры в образцах плазмы крови доноров способствуют сокращению АПТВ в среднем в два раза (табл. 4).

На активность факторов внешнего пути коагуляции и общего пути образования тромбина в плазме крови доноров клеточные суспензии влияют также практически одинаково. Так, клеточные культуры печени, легкого и неонатальные клетки легкого и сердца снижают активность факторов протромбинового комплекса на 11 и 9,5 % в отличие от фетальных клеточных суспензий сердца и плаценты и неонатальных клеток печени, которые оставляют активность этих факторов неизменной (табл. 4).

Таблица 4

Воздействие фетальных и неонатальных клеточных культур на показатели системы гемостаза в плазме крови доноров (М± т)

Показатели Плазма донор* физ. р-р п = 20 Печень п = 20 Легкое п-20 Сердце п= 20 Плацента п = 20

фетал неон фетал неон фетал неон фетал

Коагуляционное звено

АПТВ, с 41,2± 2,4 28,3 ± 0,2 18,1 ± 0,3* 19,1 ± 1,5 24,0 ± 0,4* 23,6 ± 0,3 21,5 ± 0,5* 24,7 ± 1,8

ПТИ, % 80,2 ± 0,9 69,0 ± 1,9 78,1 ± 0,9" 68,8 ± 4,3 56,5 ± 2,3* 82,6 ± 0,26 75,4 ± 3.1* 80,6 ± 8,3

Фибриноген, г/л 1,5 ± 0,31 2,3 ± 0,08 2,07 ± 0.02 1,5 ± 0,18 2,2 ± 0,15* 1,7± 0,01 2,4 ± 0,07* 2,6 ± 0,13

XIII, % 55,0 ± 2,5 71,3 ± 0,24 64,7 ± 2,6* 82,6 ± 0,59 67,2 ± 4,7" 79,9 ± 0,25 50,8 ± 0,57" 42,5 ± 0,22

Антикоагулянтная активность

АТ-Ш, % 50,1 ± 1,2 47,9 ± 0,28 56,8 ± 0,13* 51,1 ± 0,14 42,4 ± 0,3* 38,3 ±0,23 68,1 ± 0,2" 51,0 ± 1,8

Фибринолитическая активность

Плазминоген, % 53,2 ± 2,3 77,4 ± 0,24 74,1 ± 0,24* 52,1 ± 2,7* 57,8 ± 1,08 55,3 ± 0,52 52 ± 0,64 49,9 ± 1,9

Примечание: достоверность отличия фетальных, неонатальных клеточных культур и плазмы крови доноров; * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

Активность АТ-Ш в образцах плазмы здоровых людей увеличивается под воздействием неонатальных клеточных суспензий печени

и сердца в среднем на 12 %. Противоположное воздействие оказывают фетальная клеточная суспензия сердца и неонатальная клеточная культура легкого, снижая уровень АТ-Ш в образцах плазмы доноров на 12 и 8 %.

Уровень фибриногена при контакте образцов плазмы крови доноров с фетальными суспензионными культурами и неонатальными клетками повышается на 60 и 48 % соответственно. Исключением являются фетальные клетки легкого и сердца, не оказывающие влияния на этот показатель.

Фибринстабилизирующая активность, оцениваемая по уровню XIII фактора, повышается под воздействием фетальных клеток на 19 % и неонатальных на 11 %. Исключением служат клеточные культуры фетальной плаценты и неонатального сердца, не изменяющие активность фибринстабилизирующего фактора в образцах плазмы крови доноров (табл. 4).

Фибринолитическая активность в плазме крови доноров практически не изменяется как под воздействием фетальных клеточных культур, так и неонатальных. Вместе с тем фетальная и неонатальная клеточные культуры печени практически равноценно увеличивают концентрацию плазминогена в образцах плазмы крови доноров на 24 и 21 % соответственно. Клеточная культура неонатального легкого повышает уровень плазминогена на 5 % (р < 0,05), в отличие от аналогичной фетальной культуры, которая не оказывает на этот показатель влияния в плазме крови доноров (табл. 4).

Оценивая результаты влияния фетальных и неонатальных клеточных культур на плазму крови доноров, можно констатировать, что они в большей степени активизируют прокоагулянтное звено при умеренном увеличении антикоагулянтной активности и незначительном повышении активности фибринолитической системы.

Воздействие фетальных клеточных культур человека и неонатальных клеточных культур кролика на показатели системы гемостаза в плазме крови больных ИБС показало, что они практически однотипно активизируют начальную фазу свертывания крови, так как сокращают АПТВ в среднем в два раза (табл. 5). На вторую фазу — фазу внешней коагуляции и общего пути образования тромбина — фетальные и неонаталь-ные клеточные культуры влияют также практически одинаково. Фе-тальные клеточные культуры человека печени, легкого, сердца и нео-натальные клетки легкого и сердца уменьшают уровень активности факторов протромбинового комплекса на 23 и 12 %. Исключением являются фетальная культура плаценты и неонатальная клеточная культура легкого, которые не оказывают влияние на этот показатель. После контакта фетальной клеточной суспензии печени и неонатальных клеточных культур сердца и печени отмечено достоверное повышение АТ-Ш

в среднем на 10 и 13 % соответственно. При этом наибольшее влияние на увеличение этого антикоагулянта оказывают неонатальные клеточные культуры (табл. 5). Важно, что содержание фибриногена в плазме крови больных под воздействием всех исследуемых фетальных и неона-тальных клеточных культур уменьшается в среднем на 45 %.

Исследуемые клеточные культуры неонатального происхождения снижают фибринстабилизирующую активность на 15 %. Аналогичное воздействие оказывает фетальная клеточная культура печени, уменьшая активность XIII фактора на 7 %.

Фетальные клеточные культуры человека и неонатальные клетки кролика повышают уровень плазминогена в опытных образцах плазмы крови больных ИБС на 80 и 131 % соответственно. При этом наиболее выраженное влияние на концентрацию плазминогена в плазме крови больных ИБС оказывают фетальная клеточная культура плаценты и неонатальная клеточная суспензия легкого, увеличивая этот показатель на 117 и 143 % (табл. 5).

Таблица 5

Воздействие фетальных и неонатальных клеточных культур на показатели системы гемостаза в плазме крови больных ИБС (М± т)

Показатели Плазма больных + физ. р-р п = 33 Печень п = 20 Легкое п = 20 Сердце п = 20 Плацента п = 20

фетал неон фетал неон фетал неон фетал

Коагуляционное звено

АПТВ, с 48,9 ± 2,1 23,2 ± 0,4* 27,5 ± 0,3* 26,0 ± 1,1* 17,5 ± 0.4* 26,0 ± 0,6* 22,7 ± 0,5* 17,6 ± 0,08*

ПТИ, % 90,1± 4,3 58,3 ± 4,7 96,4 ± 1,1 63,1 ± 6,0* 80,0 ± 1,3* 79,8 ± 4,0* 76,0 ± 2,7* 88,1 ± 1,3

Фибриноген, г/л 1,5 ± 0,07 1,04 ± 0,01 0,7 ± 0,06* 0,9 ± 0,02 0,8 ± 0,03 0,9 ± 0,1 0,86 ± 0,03 1.3 ± 0,04

XIII, % 51,0 ± 1,9 47,0 ± 0,5 42,2 ± 0,9* 46,7 ± 2,3 29,6 ± 0,4"" 44,5 ± 1,9* 42,1 ± 1,02* 50,6 ± 1,6

Антикоагулянтная активность

АТ-Ш, % 50,1± 0,9 60,0 ± 1,07* 63,2 ± 0,5* 48,6 ± 2,0 45,6 ± 0,2* 47,4 ± 1,8 65,8 ± 0,9* 51,0± 1,8

Фибринолитическая активность

Плазминоген, % 65,8 ± 3,3 80,5 ± 4.7* 196, 0± 0.6* 160,0 ± 2,2* 209 ± 4,4* 155,0 ± 1,4* 186,3 ± 2,2* 183,5 ± 14,0*

Примечание: достоверность отличия фетальных, неонатальных клеточных культур и плазмы крови больных ИБС; * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

Таким образом, фетальные клеточные культуры человека и нео-натальные клеточные культуры кролика в образцах плазмы крови больных ИБС влияют в большей степени на противосвертывающее звено. Такое воздействие приводит к повышению антикоагулянтной и фиб-ринолитической активности и снижению напряженности коагуляци-онного потенциала.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В фетальных клеточных культурах человека и неонатальных суспензионных культурах кролика выявлены факторы системы гемостаза: фибриноген, AT-Ш, плазминоген. Исходя из этого, они способны непосредственно влиять на основные звенья системы гемостаза. Воздействие исследуемых клеточных культур было изучено на принципиально разных образцах плазмы крови, поэтому полученные эффекты несколько отличались друг от друга.

Фетальные и неонатальные клеточные культуры оказывают одинаковое воздействие на начальную фазу свертывания крови как в плазме крови доноров, так и больных ИБС, активизируя ее в два раза (рис. 1). Очевидно, это связано с тем, что в клеточных культурах как фетального, так и неонатального происхождения содержатся фосфо-липидные компоненты, активизирующие факторы начальной фазы свертывания крови. Благодаря этому осуществляется переход X фактора в активную форму и увеличение уровня тромбина (Баркаган З.С., 2001; Балуда В.П., 1975). Однако на этой фазе свертывания образуется очень небольшое количество тромбина, которое не в состоянии трансформировать фибриноген в достаточный уровень фибрина. Известно, что система гемостаза обладает удивительной способностью к ограничению образования тромбина на начальном этапе активации процесса свертывания крови, что принципиально важно прежде всего для предотвращения развития тромбоза, в основе которого лежит образование фибрина (ПапаянЛ.П., 2003).

□ донор нб-ной

1 2 3 4 1 2 3

А Б

1 - печень 2 - легкое 3 - сердце 4 - плацента

Рис. 1. Сокращение АПТВ в плазме крови больных ИБС под влиянием фетальных и неонатальных клеточных культур в сравнении с плазмой крови доноров (А - феталь-ные клеточные культуры; Б - неонатальные клеточные культуры). * -р < 0,05.

На активность факторов общего пути образования тромбина в плазме крови больных ИБС клеточные суспензии действуют практически так же, как и в плазме крови доноров. Клеточная культура фетальной печени и клетки неонатального легкого и сердца в плазме крови больных ИБС уменьшают уровень ПТИ. Очевидно, ингибирующее воздействие на активность факторов протромбинового комплекса связано с тем, что, наряду с тромбиноподобными веществами, в клеточной культуре фетальной печени и неонатальных клеточных культурах легкого и сердца содержатся антитромботические субстанции, являющиеся аналогами ингибитора фактора тканевого пути. Это ведет к уменьшению уровня тканевого фактора и тромбина в плазме крови больных ИБС. При этом фетальные клеточные суспензии сердца, плаценты и неона-тальная клеточная культура печени не оказывают влияния на уровень протромбинового индекса (рис. 2).

Рис. 2. Уменьшение ПТИ в плазме крови больных ИБС под влиянием фетальных и нео-натальных клеточных культур в сравнении с плазмой крови доноров (А - фетальные клеточные культуры; Б- неонатальные клеточные культуры). * - р < 0,05.

При сравнительном анализе изменений активности АТ-Ш в образцах плазмы больных ИБС и здоровых людей под влиянием фетальных и неонатальных клеточных культур установлена схожая картина (рис. 3). Так, фетальная суспензия печени и неонатальные клеточные культуры печени и сердца способствуют повышению активности этого антикоагулянта в среднем на 12 %, что ведет к снижению уровня тромбина и уменьшению активности Ха фактора в плазме крови больных ИБС и доноров. Мы полагаем, что такое повышение активности АТ-Ш связано с тем, что клеточные суспензии человека и животных обладают антико-агулянтной активностью. Кроме того, неонатальные клеточные суспензии печени и сердца, вероятно, имеют гепариноподобные соединения, которые способны трансформировать АТ-Ш в быстродействующий ин-

гибитор тромбина. Известно из работ АЬИ^аагёа (1968); З.С. Баркагана и К.М, Бышевского (1978), что антикоагулянтное действие непосредственно антитромбина III является незначительным, в то время как активность этого фермента в 100—1000 возрастает в присутствии кофактора данного белка — гепарина, который катализирует антикоагулянтные свойства АТ-Ш. Гепарин синтезируется в тучных клетках, которые начинают функционировать позже других клеточных структур системы свертывания крови, примерно на 22—23 неделе внутриутробного развития. Это относится в первую очередь к печени, где имеются их крупные скопления. Так как тучные клетки вырабатывают гепарин, то под его воздействием АТ-Ш трансформируется из медленно действующего в ингибитор тромбина и других активированных факторов свертывания крови быстрого или немедленного эффекта. Образуется комплекс АТ-Ш — гепарин, который обеспечивает около 80 % всей антикоагулянтной активности плазмы. Исходя из этого, комплекс АТ-Ш с гепарином увеличивает ингиби-рующую активность как к тромбину, так и к активному X фактору. Следует отметить, что фетальные клеточные культуры легкого и сердца не оказывают воздействия на активность АТ-111, в то время как неонаталь-ная клеточная культура снижает активность этого антикоагулянта в среднем на 5 % как в плазме крови доноров, так и больных ИБС.

80 70 * 60

¡1 50 <

40 30 20 10 0

1 2 3 4 1 2 3

А Б

1 - печень 2 - легкое 3 - сердце 4 - плацента

Рис. 3. Изменение активности АТ-Ш в плазме крови больных ИБС под влиянием фе-тальных и неонатальных клеточных культур в сравнении с плазмой крови доноров (А- фетальные клеточные культуры; Б - неонатальные клеточные культуры). * - р < 0,05.

Важно отметить, что содержание фибриногена в плазме крови больных ИБС под воздействием всех исследуемых фетальных клеточных культур и неонатальных клеточных суспензий уменьшается в среднем на 45 % в отличие от образцов плазмы крови доноров, где наблюдается повышение этого показателя (рис. 4).

3 - сердце

Рис. 4. Снижение содержания фибриногена в плазме крови больных ИБС под влиянием фетальных и неонатальных клеточных культур по сравнению с плазмой крови доноров (А - фетальные клеточные культуры, Б - неонатальные клеточные культуры) *-р<0,05.

В отличие от плазмы крови доноров, исследуемые клеточные культуры в образцах плазмы крови больных ИБС снижают и фиб-ринстабилизирующую активность (рис. 5). Следовательно, под действием неонатальных культур кролика и фетальных клеток сердца в плазме крови больных ИБС сгусток фибрина становится более чувствительным к действию плазмина, что может явиться отправной точкой в уменьшении адгезивности и агрегации тромбоцитов, а следовательно, привести к снижению уровня фибриногена (Петровский Б.В., 1976).

-сердце

Рис. 5. Снижение содержания фибринстабилизирующей активности в плазме крови больных ИБС под влиянием фетальных и неонатальных клеточных культур по сравнению с плазмой крови доноров (А- фетальные клеточные культуры; Б -неонатальные клеточные культуры) * - р < 0,05.

Снижение уровня фибриногена и фибринстабилизирующей активности в образцах плазмы крови больных связано, очевидно, с активизацией фибринолитического процесса. Так, все исследуемые фетальные клеточные культуры человека и неонатальные клетки кролика повышают уровень плазминогена в опытных образцах плазмы больных ИБС на 56 и 117 % соответственно по сравнению с донорской плазмой (рис. 6).

1 2 3 4 1 2 3

А Б

1 - печень 2 - легкое 3 - сердце 4 - плацента

Рис. 6. Повышение уровня плазминогена в плазме крови больных И БС под влиянием фетальных и неонатальных клеточных культур в сравнении с плазмой крови доноров (А - фетальные клеточные культуры, Б - неонатальные клеточные культуры) *-р<0,05

Повышение уровня плазминогена в образцах плазмы крови больных связано с тем, что фетальные клеточные культуры человека и неонатальные клетки кролика, вероятно, содержат тканевые активаторы, которые способны вступать в каталитическую реакцию с плазминоге-ном (Dalai P.M., 1969; RatnoffO.D., 1981; ЗубаировД.М., 2000; Сидор-кинаА.Н., 2001). В плазме больных, где изначально высокий уровень тромбина, а следовательно, и фибрина, образуется молекулярный комплекс фибрин — активатор — плазминоген, обеспечивающий селективную активацию плазминогена, ассоциированного с тромбом (Зубаи-ров Д.М., 2000; СидоркинаА.Н., 2001). При этом повышенный уровень плазминогена расщепляет не только фибрин, но и фибриноген. Однако в отсутствии фибрина действие ТАП проявляется слабо, что мы и наблюдаем при контакте клеточных культур с плазмой доноров. Привнесение фетальных и неонатальных клеток в абсолютно атромбогенную плазму доноров способствует появлению в ней пороговых концентраций тромбина. Это приводит к активизации противосвертывающей системы по принципу обратной связи со свертывающей системой и таким путем осуществляется регуляция жидкого состояния крови.

Следует отметить, что действие плазмина в организме несколько иное. В крови он расщепляет только фибрин, не действуя на его предшественника — фибриноген. Это связано со структурой доменов и особым механизмом активации плазминогена его физиологическими активаторами.

Резюмируя вышеизложенное, считаем необходимым подчеркнуть, что фетальные клеточные культуры человека и неонатальные клеточные культуры кролика в образцах плазмы крови доноров активизируют в основном свертывающую систему. В отличие от этого в образцах плазмы крови больных, где имеются нарушения в системе гемостаза, исследуемые клеточные культуры воздействуют в большей степени на противосвертывающий потенциал: увеличивают уровень плазминогена и активность антитромбина III. Привнесенные клетки снижают и активность прокоагулянтного звена за счет уменьшения активности факторов протромбинового комплекса, уровня фибриногена и фибрин-стабилизирующего фактора. Все это в совокупности препятствует развитию исходной гиперкоагуляции.

Фетальная клеточная культура печени способствует снижению факторов протромбинового комплекса и повышению активности АТ-Ш, фетальные клетки сердца в большей степени уменьшают уровень фибриногена, клеточные культуры легкого и плаценты фетусов человека более активно повышают концентрацию плазминогена. Неонатальная клеточная культура сердца в большей степени ингибирует ферментативную активность Ха фактора и тромбина, повышает активность АТ-III, а неонатальные культуры легкого и печени увеличивают концентрацию плазминогена, снижают фибринстабилизирующую активность и уровень фибриногена.

Следовательно, эффект положительного влияния на стабилизацию системы гемостаза достигается только при сочетанном воздействии клеточных культур печени, легкого, сердца и плаценты фетусов человека либо неонатальных клеточных культур печени, легкого и сердца кролика.

При этом неонатальные суспензионные культуры кролика в большей степени по сравнению с фетальными клеточными культурами человека повышают антикоагуляционный потенциал в образцах плазмы крови больных ИБС. Фетальные клеточные культуры человека в плазме крови больных ИБС наиболее активно снижают ферментативную активность факторов протромбинового комплекса, что ведет к уменьшению уровня тканевого фактора и тромбина.

Таким образом, полученные нами позитивные эффекты влияния клеточных культур на образцы плазмы крови больных ИБС позволили патогенетически обосновать возможное использование фетального клеточного материала человека и неонатального клеточного материала кролика при коррекции системы гемостаза в плазме крови больных ИБС.

Нами составлена концептуальная схема влияния клеточных суспензионных культур фетусов человека и клеток новорожденных кроликов (схема 1), на которой показано, что клеточные культуры, обладая свойствами факторов свертывающей и противосвертывающей систем крови, способны влиять на основные компоненты системы гемостаза в плазме крови больных in vitro: активизировать начальную фазу свертывания крови, ингибировать внешний путь коагуляции и общий путь образования тромбина, повышать активность AT-III, снижать фибринстабилизирующую активность и уровень фибриногена, увеличивать концентрацию плазми-ногена. Совокупность этих эффектов приводит к активизации фибрино-литической системы и снижению активности коагуляционного звена. Это в свою очередь способствует установлению динамического равновесия между свертывающей и противосвертывающей системами крови.

Активизация факторов внутренней фазы свертывания крови

Схема 1. Концептуальная схема влияния фетальных и неонатальных клеточных культур на активность факторов системы гемостаза в плазме крови больных ИБС

ВЫВОДЫ

1. Фетальные клеточные культуры человека и неонатальные культуры кролика содержат фибриногеноподобные вещества и факторы, обладающие антикоагулянтными и фибринолитическими свойствами.

Содержание фибриногеноподобных веществ в неонатальных клеточных культурах кролика в два раза выше по сравнению с фетальными клетками человека. Антикоагулянтная и фибринолитическая активность фетального клеточного материала человека и клеточного материала неонатального кролика практически не различается.

2. Органотипические фетальные клеточные культуры человека и клеточные культуры новорожденного кролика активизируют начальную фазу свертывания в плазме крови доноров и больных ИБС, поскольку более чем в два раза сокращают активированное парциальное тромбопластиновое время.

3. Клеточная культура фетальной печени и неонатальные клетки легкого и сердца оказывают ингибирующее воздействие на вторую фазу свертывания в плазме крови больных, благодаря снижению активности факторов протромбинового комплекса на 32 и 12 % соответственно.

4. Особенностью воздействия как фетальных, так и неонатальных клеточных культур на образцы плазмы крови больных ИБС в сравнении с донорской плазмой является более выраженная активация фибринолити-ческой системы за счет повышения уровня плазминогена на 56 и 117 %.

5. Неонатальные клеточные культуры кролика в большей степени активизируют противосвертывающее звено плазмы крови больных ИБС, чем фетальные клетки человека. Это происходит за счет существенного увеличения активности АТ-Ш на 8 % и концентрации плазминогена на 51 %.

6. Стабилизация системы гемостаза в образцах плазмы крови больных ИБС наиболее оптимально может обеспечиваться сочетанным применением различных клеток фетального либо неонатального происхождения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клинические и гемокоагуляционные эффекты фетальной терапии у больных ишемической болезнью сердца / В.И. Марченко, В.В. Садах, Л.Б. Корякина и др. // Клинические аспекты клеточной и фетальной терапии: Материалы II межрегиональной научн. конф., 27-28 июня 2000 г. - Омск, 2000. - С. 68-69.

2. Воздействие трансплантации фетальных тканей на систему гемостаза больных ишемической болезнью сердца / В.И. Марченко, В.В. Садах, Л.Б. Корякина и др. // Клинические аспекты клеточной и фетальной терапии: Материалы II межрегиональной научн. конф., 27-28 июня 2000 г. - Омск, 2000. - С. 69-71.

3. Корякина Л.Б. Гемостатический потенциал эмбриональных тканей человека /Л.Б. Корякина, Д.К. Курильский // Клинические аспек-

ты клеточной и фетальной терапии: Материалы II межрегиональной на-учн. конф. - Омск, 2000. - С. 62-63.

4. Корякина Л.Б. Гемостатический потенциал тканевых суспензий новорожденных кроликов / Л.Б. Корякина // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Материалы молодёжной научн.-практ. конф. СО РАМН. - Новосибирск, 2000. — С. 65.

5. Влияние клеточных суспензий на систему гемокоагуляции in vitro и in vivo / Л.Б. Корякина, Л.Д. Зубарева, А.А. Рунович и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, март 2000 г. - Иркутск, 2002. - № 5. - С. 95-98.

6. Воздействие клеточной терапии на систему гемостаза у больных коронарным атеросклерозом / В.И. Марченко, Л.Д. Зубарева, Л.Б. Корякина и др. // Здоровье и образование: Материалы международной научн.-практ. конф. 19-25 мая 2003 г. - Пермь, 2003. - С. 144.

7. Влияние фетальных клеточных суспензий человека на показатели системы гемостаза в плазме крови больных ИБС / Л.Б. Корякина, В.И. Марченко, Л.Д. Зубарева и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -Иркутск, 2003. - № 7. - С. 21-22.

8. Корякина Л.Б. Влияние криоконсервированных эмбриональных клеточных суспензий на гемостатический потенциал больных ИБС / Л.Б. Корякина // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Материалы межрегиональной научн.-практ. конф. молодых ученых Сибири, 26 ноября 2003. — Иркутск, 2003. — С. 215.

9. Биологически активные соединения фетальных тканей человека и ювенильных тканей кролика / Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова, Л.Б. Корякина и др. // Здоровье и образование: Материалы международной научн.-практ. конф. 19-25 мая 2003 г. - Пермь, 2003. - С. 158.

10. Корякина Л.Б. Роль фетальных суспензионных культур в изменении показателей системы гемостаза в плазме крови больных ИБС (in vitro) / Л.Б. Корякина // Науки о человеке: Материалы V конгресса молодых ученых и специалистов 20—21мая 2004. — Томск, 2004. — С. 56—57.

Список сокращений, использованных в работе

AT—lII - антитромбин III

АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время

ИБС - ишемическая болезнь сердца

КТ - клеточная терапия

ЛП - липопротеины

ПИ - протромбиновый индекс

ТАП - тканевой активатор плазминогена

ТГ - триглицериды

ТФ - тканевый фактор

ИПТФ - ингибитор пути тканевого фактора

Хс - холестерин

Хс ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности

Хс ЛПНП - холестерин липопротеинов низкой плотности

Хс ЛПОНП - холестерин липопротеинов очень низкой плотности

Подписано в печать 25.10.2004. Бумага офсетная. Формат 60х841/11

Гарнитура Тайме Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 100 экз. Заказ № 294-04._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon@rol ru)

32 63 4 4