Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль межклеточных взаимодействий через щелевые контакты в канцерогенезе

На правах рукописи

КРУТОВСКИХ Владимир Андреевич

РОЛЬ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЧЕРЕЗ ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Международном агентстве по изучению рака Всемирная Организация Здравоохранения, Лион, Франция

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

ТУРУСОВ Владимир Станиславович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

АНИСИМОВ Владимир Николаевич

доктор медицинских наук, профессор ПОЖАРИССКИЙ Казимир Марианович

доктор медицинских наук, профессор КВЕТНОЙ Игорь Моисеевич

Ведущее учреждение: Институт Цитологии РАН РФ, г. Санкт-Петербург

Защита состоится ¿¡муЗ^/^-тЯ 2005 года в часов на

заседании диссертационного совета Д.208.052.01 при НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Минздрава России

Автореферат разослан: 02е4$£у<А_2005 года

Ученый Секретарь диссертационного совета Профессор

В.В.Худолей

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Отличительной особенностью канцерогенеза является многообразие этиологических факторов, вовлеченных в этот процесс. Помимо общепризнанной роли в генезе рака генетических повреждений ряда генов, белковые продукты которых регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и клеточную смерть (Hanahan D, Weinberg RA, 2000; Vogelstein B, Kinzler KW, 2004), а также осуществляют репарационный контроль клеточного генома, существенный вклад в канцерогенез вносят и нарушения межклеточных взаимодействий (Васильев ЮМ, 1997; Yamasaki H, 1990). Контактируя между собой, клетки получают разнообразную сигнальную информацию, опосредованно влияющую на практически все аспекты их жизнедеятельности. Аппарат межклеточных взаимодействий состоит из нескольких структурно и функционально различных типов межклеточных соединений. Большинство из них - адгезивные соединения, десмосомы, плотные контакты - имеют выраженную структурно-механическую функцию, объединяя клетки в единое целое, т.е. ткань. Щелевые же контакты (ЩК), представляя собой микроскопические водяные канальцы, напрямую соединяющие цитоплазмы клеток, обеспечивают непосредственный обмен метаболитами и сигнальными молекулами между клетками в пределах данной ткани (рис.1).

Рис 1 Схематическое строение щ «пев ого контакта Щелевой ион такт состоит мэ смолпения большого числе индивидуальные мифоканапыде. пронизывающих плазматически« мембраны соседствующих друг с другом клеток Клкдый каналец в свою очеред состоит из дт/к попукжвпов - ион н аксонов. по одном/ с стороны квкдоЯ клетки К*кдыХ коннексои яеп явтея рвзупьтатом сбор*" шести молекул белков коннвксииов Структурно ксннексины представляют собой транс мембранные белю*, четьре пронизывающие латеральные мембраны клеток домены которые перемешаются двумя »мстраклэточными и одной внутриклеточной петлями

Являясь неотъемлемой составной частью комплексного аппарата межклеточных взамодействий, ЩК вносят существенный вклад в обеспечение поддержания разнообразных параметров тканевого гомеостаза (Крутовских ВА, 2000; Kumar NM, Gilula NB, 1996; Willecke K et al., 2002).

Соответственно, нарушение функции щелевых контактов существенно влияет на клеточную пролиферацию, дифференцировку, клеточную гибель, что в свою очередь имеет значительный этиопатогенетический вклад в процесс формирования новообразований (Yamasaki Н, 1990; Yamasaki H, Naus CCG, 1996; Trosko JE., Ruch RJ., 1998; Krutovskikh V, 2002; Ruch RJ., Trosko JE., 2001).

Резкое снижение способности сообщаться между собой через ЩК было отмечено in vitro у опухолевых клеток еще несколько десятилетий назад (Lowenstein WR, Kanno Y. 1966). Этиологическая значимость этого феномена, а также отвечающие за эти нарушения механизмы долгое время оставались во многом неясными, в основном, из-за отсутствия фундаментальных знаний о молекулярной структуре щелевых контактов.

До последнего времени оставалось также неясно, сопровождается ли опухолевый рост in vivo утратой межклеточной сообщаемости через ЩК аналогично феномену, описанному ещё много лет назад в культуре опухолевых клеток.

Благодаря недавнему бурному прогрессу в области биологии межклеточных взаимодействий, в частности, открытие семейства белков ЩК - коннексинов (Сх), стало возможным получение высокоспецифичных антисывороткок и молекулярных генных проб ко многим индивидуальным белкам этого семейства, что существенно расширило экспериментальные возможности в изучении как функции ЩК и входящих в их состав коннексинов, так и механизмов их нарушений в канцерогенезе.

В частности, многочисленные эксперименты по восстановлению межклеточной сообщаемости у коммуникационно дефектных линий раковых клеток путём устойчивой трансфекции в них генов ЩК коннексинов показали, что межклеточная сообщаемость является сильным опухолеподавляющим фактором (Rose В. et al., 1991; Eghbali В, et al., 1991; Chen Sh-Ch. et al., 1995). В то же время в ряде случаев обнаружилось, что подавление опухолеродности клеток при искусственном восстановлении экспрессии в них белков коннексинов далеко не всегда и не обязательно непосредственно связано с улучшением межклеточной сообщаемости. Более того, оказалось, что для подавления

опухолеродного фенотипа важно не само по себе восстановление межклеточной сообщаемости, а в большей мере тип индивидуального коннексина, с помощью которого это было произведено (Mesnil M. et al., 1995).

Таким образом, было предположено, что белки ЩК коннексины, наряду со своей основной функцией обеспечивать межклеточную сообщаемость формированием каналов щелевых контактов, также обладают дополнительными свойствами, имеющими существенное влияние на поведение опухолевых клеток.

Выяснение механизмов повреждения межклеточной сообщаемости при опухолевом процессе может существенно улучшить диагностику рака, способствовать разработке новых методов его лечения, а также способствовать разработке новых онкопрофилактических стратегий.

Цель работы:

Оценка этиопатогенетической значимости нарушений межклеточных взаимодействий через щелевые контакты в канцерогенезе.

Задачи исследования:

1. Выявить функциональные нарушения межклеточной сообщаемости через ЩК на разных этапах канцерогенеза in vivo.

2. Изучить молекулярные механизмы нарушения функций ЩК в экспериментальном и спонтанном канцерогенезе.

3. Выявить молекулярные механизмы подавления опухолевого роста белками ЩК коннексинами.

4. Экспериментально проверить предположение о многофункциональной природе белков коннексинов и оценить потенциальный вклад этих функций в коннексин-опосредованное подавление опухолевого роста.

Научная новизна

Впервые было показано, что в опухолях печени человека межклеточная сообщаемость резко снижена по сравнению с окружающей их непораженной тканью.

Впервые на экспериментальной модели гепатоканцерогенеза крыс было продемонстрировано, что предопухолевые очаговые поражения уже на самых ранних этапах своего формирования могут быть коммуникационно изолированы от окружающей их нормальной паренхимы печени.

Впервые были получены экспериментальные доказательства распространения среди опухолевых клеток через их ЩК сигнальных молекул, запускающих механизм клеточной гибели.

Впервые были обнаружены соматические мутационные повреждения гена коннексина43 (Сх43) в спорадических опухолях толстой кишки человека. Было также выявлено, что мутации гена Сх43 происходят на довольно поздних этапах формирования новообразований колоректального рака, и их возникновение тесно связано с появлением признаков озлокачествления.

Также впервые было обнаружено, что редкие варианты гена коннексина26, вызывающие врождённую доречевую глухоту по рецессивному типу, могут быть дополнительным фактором генетической предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта.

Научно-практическая значимость. Полученные в работе даные расширяют современные представления о молекулярно-генетических механизмах канцерогенеза и имеют конкретную практическую значимость.

В частности, экспериментально обнаруженная возможность распространения в популяции опухолевых клеток через ЩК вызывающих клеточную гибель сигналов может быть успешно использована для повышения эффективности лекарственной терапии рака.

Специфический характер обнаруженных в опухолях толстой кишки человека мутаций Сх43 - сдвиг рамки считывания из-за инсерции-делеции единичных нуклеотидов в карбоксильно-терминальном домене белка -дополняет имеющиеся ранее представления о молекулярных механизмах канцерогенеза толстой кишки. Разрушение в результате таких мутаций способности Сх43 взаимодействовать с целым рядом сигнально активных белков (Р-катенин, ZO-1, клаудин, дребрин и другие) (Giepmans BNG, Moolenaar WH., 1998, Toyofuku T et al., 1998; Ai Zh et al, 2000; Jin Ch., et al, 2000; Butkevich E. et al., 2004) приводит к неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Природа этих мутации также убедительно указывает на наличие нераспознанной ранее сигнальной активности Сх43 в контроле опухолевого фенотипа.

Обнаруженная в данной работе тесная взаимосвязь специфического мутационного повреждения Сх43 в его карбокси-терминальной части с появлением признаков инвазивности опухолей толстой кишки может быть использована в клинической практике в качестве нового диагностического критерия опухолевой прогрессии.

Возникающие при раке толстой кишки в результате сдвигающих рамку считывания мутаций новые аминокислотные последовательности в составе белковой молекулы Сх43 обладают сильной антигенностью и могут служить иммуно-диагностической и иммуно-терапевтической мишенью.

Высокая частота гетерозиготных носителей редких вариантов гена Сх26 среди больных раком желудочно-кишечного тракта позволяет использовать наличие этих вариантов в качестве нового критерия для раннего выявления групп повышенного онкологического риска.

Результаты исследования опубликованы в 34 научных публикациях в отечественной и международной научной периодике.

Основные положения, выносимые на защиту:

Опухолевый рост in vivo сопровождается значительным снижением межклеточной сообщаемости через ЩК, в основе чего лежат различные механизмы.

Межклеточная сообщаемость через ЩК является сильным противоопухолевым фактором.

Межклеточная сообщаемость между опухолевыми клетками через ЩК может являться путём распространения в опухолевой клеточной популяции сигналов, запускающих процесс клеточной смерти, что является существенной составляющей опухоль-подавляющего эффекта межклеточной сообщаемости.

Белки ЩК коннексины являются опухолевыми супрессорами, способными подавлять опухолевый рост независимо от межклеточной сообщаемости через ЩК. Именно это свойство и обусловливает ярко выраженную вариабельность противоопухолевого потенциала каждого из 20 известных индивидуальных коннексинов.

Индивидуальные коннексины могут быть избирательно и высоко специфично соматически мутированы в отдельных типах раков человека. Мутационно модифицированные коннексины могут приобретать способствовать ускорять опухолевую прогрессию.

Редкие варианты гена коннексина26 могут быть новым фактором предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта.

Апробация работы. Диссертация была представлена на международных конференциях по межклеточным щелевым контактам [Хирошима (Япония, 1993), Кей Ларго (США, 1997), Гватт (Швейцария, 1999), Гонолулу (США, 2001), Кембридж (Англия, 2003)], на ежегодных

симпозиумах американской ассоциации по изучению рака (1991, 1993, 1995, 1997, 1999, 2002), международном симпозиуме по раннему выявлению и предотвращению рака (Париж, Франция, 2002). Всего по теме диссертации было сделано 40 устных и постерных презентаций.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, описывающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Объём работы составляет 135 страниц. Диссертация проиллюстрирована 45 рисунками и 6 таблицами. Список цитированной литературы содержит 20 отечественных и 239 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследованиях были использованы раличные экспериментальные модели химического гепатоканцерогенеза у крыс. В опытах по индукции опухолей печени было использовано 50 Fisher 344 крыс. Ряд исследований был произведён с использованием человеческого опухолевого материала -хирургически удалённые опухоли печени, толстой кишки, желудка, мочевого пузыря, а также образцы крови. Также использовались линии опухолевых клеток грызунов (ВС31) и человека (HeLa, A431).

Межклеточная сообщаемость в опухолях печени in vivo измерялась специально разработанным для этого исследования функциональным методом нанесения уколов красителя Lucifer yellow в толщу полутонких срезов печени, основанном на феномене селективного перетекания красителей через щелевые контакты клеток (Krutovskikh V. et al, 1991, 1995; Krutovskikh V, Yamasaki H., 1995).

Межклеточная сообщаемость в культуре клеток измерялась либо методом микроиньекций красителя Lucifer yellow в отдельные клетки монослоя с последующим количественным подсчётом клеток, в которые перетёк краситель, либо упрощённым методом scrape loading, когда загрузка красителя в клетки производилась путём нанесения пореза монослоя в присутствии в питательной среде красителя Lucifer yellow с последующей полуколичественной оценкой его растекания в соседние неповреждённые клетки.

Опухоль-ассоциированные нарушения экспрессии индивидуальных белков ЩК коннексинов изучались на тканевом уровне рядом непрямых методов (иммуногистохимическая окраска и иммуноблоттинг) с использованием высокоспецифичных антисывороток, полученных в

отделе Многостадийного Канцерогенеза Международного Агентства по Изучению Рака (МАИР) иммунизацией кроликов синтетическими пептидами, соответствующими разным доменам индивидуальных коннексинов. В ряде случаев использовались коммерческие антиконнексиновые антисыворотки (Chemicon Intl, Sigma, Zymed Laboratories Inc., Transduction Laboratories). Иммуногистохимические окраски на белки коннексины производились либо с использованием метода усиления сигнала DAB продукта его последующим серебрением [Merchenthaler I. et al. 1989], либо с использьванием тирамидного метода (TSA™ Fluorescence systems, NEN™ Life Science Products). Выявление опухолевых клеток на криостатных срезах опухолей человека производилось с помощью моноклональмных антикератиновых антител (клон HI), любезно предоставленным Д-ром Трояновским СМ, (Медицинская Школа Вашингтонского Университета, Сент Луис, США). Иммунофлюопесцентно окрашенные препараты исследовались в лазерном конфокальном микроскопе Pascal 510, (С Zeiss, Germany).

Механизмы нарушений межклеточных взаимодействий через ЩК при раке изучались различными молекулярно-биологическими методами. Так, наличие мутационных повреждений генов коннексинов первоначально оценивалось непрямым методом гетеродуплекса. Образцы с выявленным аномальным профилем миграции радиоактивно меченных ПЦР-продуктов генов коннексинов проверялись на наличие в них мутаций последующим прямым секвенированием с использованием наборов ABI Prizm® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction на оборудовании АВ Applied Biosystems.

Способность белков коннексинов влиять на клеточный рост исследовалась методом устойчивой транс фекции в опухолевые клетки векторов, содержащих соответствующие гены (Invitrogen) и последующей оценки скорости роста полученных в результате отбора устойчивых клонов клеток в культуре.

Противоопухолевый эффект искусственной экспрессии коннексинов после устойчивой трансфекции в опухолевые клетки содержащих эти гены векторов оценивался по динамике развития опухолевых узлов на месте подкожного введения коннексин-экспрессирующих клеточных линий голым мышам.

Мутации белков коннексинов были произведены методом целенаправленного мутагенеза на основе ПЦР с использованием коммерческого набора (QuickChange™ Site-Directed mutagenesis kit, Stratagene).

Вовлечение межклеточной сообщаемости через ЩК в распространение вызывающих клеточную гибель сигналов изучалось на клеточной линии рака мочевого пузыря крысы (линия ВС31) методом спонтанной избирательной загрузки апоптотических клеток красителями-трейсерами (Lucifer yellow и пропидиум йодида). Клеточная гибель измерялась in situ с помощью флюоресцентно меченного маркера апоптоза Annexin V (Boehringer Mannheim), а также по характеру деградации ДНК, выделенной из клеточных гомогенатов.

Статистическая обработка экспериментальных данных производилась с использованием программы GraphPad PRIZMA 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Функциональное состояние межклеточной сообщаемости в опухолях печени человека и крыс

С помощью разработанного для целей данного исследования функционального теста на межклеточную сообщаемость через ЩК в полутонких срезах живых тканей было показано, что её уровень в опухолях печени грызунов и человека значительно ниже, чем в печёночной паренхиме, окружающей исследованные новообразования. Примечательно, что этот показатель был снижен во всех морфологических типах новообразований, включая доброкачественные, а в ряде случаев был снижен даже в таких самых ранних предшественниках новообразований, как микроскопические очаги гепатоцитов с нарушенным ферментным фенотипом (т.н. GGT и/или GST-p положительные очаговые поражения) (Krutovskikh V. et al, 1991,1994).

Метод уколов красителей в печёночную паренхиму крыс с индуцированными GST-p положительными предопухолевыми очагами (рис. 2) также показал, что гетерогенная сообщаемость между популяцией гепатоцитов, входящих в состав таких очагов, и окружающей их нормальной тканью в ряде случаев также отсутствует Эти наблюдения свидетельствуют о том, что очаги повреждённых гепатоцитов могут таким образом оказаться изолированными от негативных сигналов контроля клеточной пролиферации, предположительно циркулирующих через ЩК в нормальной непролиферирующей печени, тем самым предоставляя клеткам возможность бесконтрольно размножаться вплоть до их развития в злокачественные новообразования.

При хроническом воздействии на крыс разными промоторами крысиного гепатоканцерогенеза с различнымми механизмами действия -фенобарбиталом, полихлорированными бифенилами, клофибратом и ДДТ наблюдается значительное снижение уровеня межклеточной сообщаемости в печени и эффект этот носит хронический, но обратимый характер.

При иммуногистохимической окраске на коннексин32 было установленно, что в большинстве случаев опухоли печени человека довольно интенсивно синтезируют этот белок. Однако, в отличие от нормальной печени, где Сх32 локализован исключительно в местах межклеточных взаимодействий латеральных мембран гепатоцитов, в опухолях печени этот белок был обнаружен вне межклеточных контактов -- либо перемещённым в участки не задействованных в межклеточные контакты латеральных мембран, либо внутрь цитоплазм опухолевых клеток, как правило в околоядерное пространство. Отсутствие Сх32 в межклеточных контактах лишало опухолевые клетки возможности формировать функциональные ЩК (рис. 3).

Рис. 3 Экспрессия кйннексина32 (Сж32) и межклеточная сообщаемость в нормальней крысиной печени и гапатоцеллюлярньи слух on як В опухолж наблюдается снижение межклеточной сообщаемости в сочетании с транслокачией белке Сх32 из участков меккпетомньк контактов в цитоплазму (А), ядра (Б) или участки свободных от межклеточные взаимодействия плазматических мембргн (В и Г)

Последующий генетический анализ гена Сх32 в 20 опухолях печени человека позволил исключить мутационную природу нарушений субклеточной локализации этого белка. Дополнительно произведённый нами поиск мутаций в гене коннексина32, на сей раз в опухолях печени крыс, индуцированных генотоксическими канцерогенами диэтилнитрозамином (DEN) или этилгидроксиэтилнитрозамином (EHEN) лишь в одной из 12 отобранных по аномальной на белковом уровне экспрессии Сх32 опухолей была обнаружена точечная мутация G>A во втором нуклеотиде кодона 220, приведшая к замене His на Arg [Omori Y et al., 1996].

Мутационные повреждения индивидуальных генов коннексинов в различных типах опухолей человека

Принимая во внимание этиологическую значимость мутационной природы повреждений критических в этиологии рака генов, а также исходя из предположения, что в разных тканях разные индивидуальные коннексины могут играть биологически различную роль, нами также был произведён мутационный анализ Сх37 в опухолях лёгких и сосудов человека и крыс. В результате впервые было выявлено несколько случаев полиморфизма этого гена человека, которые, однако, оказались не связанными с предрасположенностью к онкозаболеваемости [Krutovskikh V et al., 1996].

В то же время анализ 29 новообразований толстой кишки человека выявил что в этих опухолях гипермутабельность С-концевой части Сх43. Так, по крайней мере треть проанализированных непрямым методом гетеродуплекса образцов из опухолей оказались с очевидными

аномаль

Рис 4 1139ЮСмутйц«яСх43,найдмивяеадооке(м*ноттсистой кишки человека Деления единичного нуклеэтида вжодоне 311 сдигает рамку считывания в результата чего вся последующая белковая струкрура карбоксил шого хвоста белка бьла заменена ив иную уникалыдо 35 аминокислотную последовательность

Последующее прямое секвенирование в большинстве случаев подтвердило наличие мутаций, причём в основном это оказались либо делеция одного нуклеотида (1139delC в двух случаях из 6 проанализированных аденокарцином разной степени дифференцировки, рис. 4), либо инсерция (1280insA, один случай из той же группы 6 аденокарцином, рис. 5). И в том и в другом случаях происходил сдиг рамки считывания, что на белковом уровне приводило к полной смене аминокислотной последовательности участка белка сразу после мутации и, как правило, довольно скоро завершалось появлением преждевременного стоп-кодона.

Замена аминокислотной последовательности в С-концевом домене Сх43 на новые полностью разрушало его способность взаимодействовать с целым рядом сигнально активных белков (например Р-катенин, ZO-1, клаудин, дребрин), что в свою очередь аномально активировало сигнальные системы регуляции клеточного цикла и могло привести к ростовому преимуществу экспрессирующих мутированный Сх43 опухолевых клеток. Примечательно, что другой экспрессируемый энтероцитами толстой кишки коннексин32 в этих же опухолях оказался немутированным.

М/Жжшым I

Рис 5 12вО!п8АмутацияОс43,найденнаяваденоиерцинамв толстой кишки человека кьсерция единичного нуклеотада в коконе 358 сдигеетрамк/ считывания, в результате чего вся последующая белковая структура карбоксильного хвоста белка бьп а заменена на иную уникальную 19 аминокислотную последовательность

Другой особенностью обнаруженных нами мутаций Сх43 в опухолях толстой кишки было их возникновение на довольно поздних этапах развития опухолей. Используя двойную иммуноокраску на Сх43 с антителами к немутированной цитоплазматической петле белка в паре с антителами к конечному эпитопу С-концевого участка Сх43, по избирательному исчезновению иммунореактивносри к С-концевым антителам мы обнаружили, что мутированный Сх43 селективно экспрессировался лишь в опухолевых структурах, составляющих инвазивный фронт опухоли (рис. 6).

Рис.6 Е'Ъимукогхстохимическое выявление опухолевых структур, репрессирующих мутантный Сх43 №бирагельная утрагз иммунсреакгивности к антителам против С-кинцееого домена Сх43 дикого типа (изобрамение слева) при сохранении иммунореактвности к антителам против участка внутренней петли С*43 (изобретение е центре) свидетельствует о мутационной мопификацти Оонца белка Сх43 ^Ъоброкение справа является результатом компьютерного наложения двух предыдущих изображен« д друг на друга

Примечательно, что и морфологически эти опухолевые структуры были заметно более анапластическими по сравнению с остальной массой опухоли.

Всё это по совокупности указывает на то, что экспрессия мутированного Сх43 может вносить значительный вклад в ускорение опухолевой прогрессии спонтанных новообразований толстой кишки человека.

Экпериментальное изучение опухоль-угнетающих свойств белка коннексина43 методом целенаправленного мутагенеза

Как уже упоминалось, частое отсутствие корреляции между интенсивностью межклеточной сообщаемости и способности подавлять опухолеродность неопластических клеток в результате искусственной экспрессии в них белка того или иного коннексина предпологает наличие у коннексинов свойств подавлять опухолевый рост независимо от межклеточной сообщаемости. Для проверки этого предположения нами были произведены структурные изменения белка Сх43, избирательно лишившие этот белок формировать функциональные ЩК. Способность подавления опухолевого роста коммуникационно дефектным Сх43 оценивались по опухолеродности клонов опухолевых клеток стабильно экспрессирующих такие варианты Сх43.

Используя метод целенаправленного мутагенеза, нами были произведены следующие модификации белка Сх43 (см. Рис. 7). Считается, что третий трансмембранный домен коннексинов топологически обращен внутрь каналов щелевых контактов, а периодически встречающиеся в его сотаве полярные кислоты выстилают их внутреннюю поверхность. Соответственно, если в этом домене Сх43 избирательно заменить полярные аминокислоты малого размера на большие (например ТИг154 на Туг), можно ожидать, что просвет формируемого таким коннексином канальца ЩК будет либо сужен, либо полностью непроходим. Кроме того, в этом же домене есть две консервативные полярно заряженные аминокислоты (Ьуз162 и в1и166), замена которых на маленький неполярный аланин может существенно нарушить целостность этого домена.

Дополнительно нами был удален небольшой эпитоп из 7 аминокислот из состава внутренней петли Сх43, расположенный в непосредственной близости от третьего трансмембранного домена, так как предполагалось, что этот участок внутренней петли тоже критичен для пропускной способности ЩК (далее в тексте обозначена как А).

Другим обязательным экспериментальным условием подавления исходной межклеточной сообщаемости у коммуникирующик клеток дополнительной коэкспрессией в них мутантных коннексинов была доминантно негативная природа таких мутантов. То есть, будучи ко-экспрессируемыми с нормальным типом белка Сх43, его мутантные функционально дефектные варианты должны сохранять способность вступать во взаимодействие со своим нормальным аналогом и формировать таким образом функционально дефектный ЩК. Результаты трансфекции описанных выше мутантов в коммуникирующие, экспрессирующие нормальный Сх43 ВС31 клетки подтвердили, что большинство из них обладали доминантно негативными свойствами.

Причём оказалось, что доминантно-негативная инактивация межклеточной сообщаемости в ВСЗ1 клетках наступает либо из-за утраты проходимости каналов ЩК, сформированных в местах межклеточных контактов (мутации Т154У и Д) (рис. 8), либо из-за неспособности коннексиновых комплексов быть доставленными в плазматическую мембрану клеток (мутации К162А и E166G) (рис. 9).

Последующая проверка коммуникационно дефицитных клонов на опухолеродность при их введении под кожу голым мышам выявила существенное различие между клонами этих двух типов. Так, блокировка межклеточной сообщаемости на уровне проницаемости сформированных в латеральной мембране каналов существенно усиливала опухолеродность ВС31 клеток (рис. 8)

В то же время, коммунникационно дефицитные клоны этих же клеток из-за блокировки доставки в их латеральную мембрану белковых комплексов Сх43 не только не становились более опухолеродными, но в ряде случаев казалось бы парадоксально почти полностью утрачивали свойство формировать опухолевые узлы в голых мышах. Таким образом оказалось, что противоопухолевое свойство коннексинов в большей мере зависит от их субклеточной локализации, нежели чем от межклеточной сообщаемости через ЩК, как основной функции этих белков.

Следует, однако, отметить, что полученные в этих опытах результаты не противоречат тому, что межклеточная сообщаемость через ЩК тоже является сильным ингибитором роста опухолевых клеток. Использованные в данной работе ВС31 клетки, несмотря на свою очевидную опухолеродность, обладают достаточно высокой межклеточной сообщаемостью из-за внутренне присущей им способности экспрессировать Сх43. Очевидная на первый взгляд противоречивость сочетания этих двух свойств нашла своё логическое объяснение после того, как уровень межклеточной коммуникации в этих клетках был существенно повышен путём дополнительной трансфекции в них вектора, содержащего дикий тип Сх43. В результате клоны ВС31 клеток с повышенной сообщаемостью при введении голым мышам полностью утратили свою опухолеродность.

Межклеточная сообщаемость между опухолевыми клетками как путь передачи сигналов клеточной гибели

Природа сигналов, которые, распространяясь через ЩК, столь эффективно подавляют рост опухолевых клеток, во многом неясна. Более того, утвердилось устойчивое мнение, что опухолеподавляющее действие межклеточной сообщаемости осуществляется исключительно на уровне регуляции пролиферации. В то же время опухолевый рост, как феномен увеличения клеточной массы новообразования, является результатом дисбаланса двух противоположных являний - клеточного прироста, как результата пролиферации, и клеточной утраты, как результата клеточной гибели. Соответственно, увеличение клеточной массы может быть одинаково достигнуто как усилением клеточной пролиферации, так и подавлением интенсивности клеточной гибели. Учитывая вовлечение межклеточной сообщаемости через ЩК практически во все аспекты клеточной жизнедеятельности, было логично предположить, что через каналы ЩК клетки также могут распространять некие сигналы, способные запускать клеточную смерть.

Было установлено, что хорошо сообщающиеся между собой клетки рака мочевого пузыря крысы ВС31 подвержены кризисам интенсивной клеточной гибели, которая по достижении культурой этих клеток стадии насыщенного монослоя (конфлюентности) приводит к их массовой

гибели. Было отмечено, что в этот момент клетки начинают гибнуть координирование многочисленными группами. С помощью различных методов окраски in situ нами было обнаружено, что единичные клетки с признаками апоптоза обладают соединяющими их с окружающими здоровыми клетками ЩК. Более того, используя феномен избирательной проницаемости плазматической мембраны апоптотических клеток, нам удалось получить прямые доказательства наличия функциональной сообщаемости между умирающими и здоровыми клетками. В результате кратковременной экспозиции монослоя ВС31 клеток с раствором красителя Lucifer yellow или пропидиума йодида происходило селективное проникновение краски внутрь апоптотических клеток. В подавляющем большинстве случаев попавший внутрь таких клеток краситель оставался в их цитоплазме, но иногда обнаруживалось его перетекание в соседствующие здоровые клетки монослоя (рис. 10).

Рис. 10. Наличие межклеточной сообщаемости между единичной помеченной ранним маркёром апоптоза Аннексином V апоптотической клеткой (А) и окружающими её здоровыми клетками монослоя. Сообщаемостъ выявлена растеканием красителя Пропидиуна йодида, исходно попавшего в апогпоичесгую клетку из культуральной среды (В).

Подавление межклеточной сообщаемости ВС31 клеток либо путем искусственной экспрессии доминантно негативного мутанта Сх43, либо длительной обработкой химическим блокатором ЩК - бета-глицерэтиновой кислотой - не повлияло на интенсивность первичного спонтанного апоптоза, происходящего с определённой интенсивностью в отдельных клетках монослоя, но полностью устранило последующее координированное умирание клеток очагами, что в количественном измерении составило снижение уровня клеточной смерти примерно на треть (рис. 11).

Рис. 11. Подавление межклеточной сообщаемости в хорошо сообщающихся между собой ВС31 клетках (А) устойчивой экспрессией доминантно-негативного мутанта Сх43 (В) полностью элиминирует феномен координированной клеточной смерти.

Мы попытались выяснить природу сигналов, распространяющих клеточную гибель в монослое. Исходя из верхнего лимита проницаемости ЩК, оцениваемого в примерно 1кД, было предположено, что ионы Са2+, чье вовлечение в регуляцию апоптоза хорошо известно, могут быть наиболее вероятными кандидатами на эту роль. Действительно, оказалось, что длительная обработка клеток ВС31 избирательно ограничивяющим проницаемость каналов ЩК до ионов Са2+ липопептидом олеамидом, не оказало какого-либо превентивного эффекта против координированной гибели клеток очагами, как это наблюдалось после полной блокировки ЩК бета-глицерэтиновой кислотой или доминантно негативным мутантом Сх43.

Результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, что, по крайней мере частично, противоопухолевый эффект межклеточной сообшаемости может осуществляется путём распространения сигналов, запускающих клеточную гибель.

Гетерозиготное носительство редких рецессивно связанных с наследственной глухотой вариантов коннексина-26, как новый возможный фактор генетической предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта

Индивидуальная чувствительность к окружающим факторам канцерогенеза является одним из важнейших аспектов этого процесса. В

ее основе лежит полиморфизм генов, кодирующих ключевые для возникновения рака белки [Ни JJ. et al., 2002; Goode EL. et al., 2002; Wargovich MJ, Cunningham JE, 2003; Han J. et al., 2004; Erichsen HC, Chanock SJ, 2004; Loktionov A, 2004; Imyanitov EN. et al., 2004].

Известно, что некоторые гены коннексинов обладают выраженным полиморфизмом, и в случае некоторых из них уже показано, что отдельные варианты этих генов могут либо вызывать патологические состояния (как например, Сх32 - нейродегенеративное расстройство Шаркот-Мари-Тус [СМТХ], [Bergoffen J et al., 1993] Сх2б - наследственную несиндромную сенсорную глухоту [Kelsell DR et al., 1997], Сх43 - дефекты развития глаз, зубов и пальцев [ODDD] [Paznekas Wet al., 2003; Richardson R et al., 2004], а в случае Сх31, в зависимости от топологии расположения мутации - либо расстройства слуха, либо кожные заболевания, связанное с нарушением дифференцировки кератиноцитов [Xia JH et al., 1998; Richard G et al., 1998]), либо способствовать развитию тех или иных патологических процессов, как, например, P319S вариант Сх37 - к атеросклерозу [Boerma M etal., 1999].

С целью оценить возможность причастности редких вариантов генов коннексинов к тем или иным формам новообразований мы проанализировали ген Сх26 в образцах ДНК, выделенной у больных раком желудка (28 случаев), толстой и прямой кишки (77 случаев), лёгкого (29 случаев) и молочной железы (50 случаев). В большинстве случаев рака желудка, толстой/прямой кишки и лёгкого ДНК была выделена из опухолевой ткани. У больных же раком молочной железы источником ДНК были образцы крови.

NH2

СООН

Рис 12 Часто встречаемые у больных раком желудочно-кишечного тракта гетерозиготные варианты гена С>25

Было обнаружено, что среди 28 проанализированных больных раком желудка 7, (т.е. почти четверть случаев) оказались гетерозиготными носителями редких вариантов Сх2б. В частности, было найдено по одному больному с генотипом У^/иЛ.,. и У^Ь/иЛ. А в четырёх

случаях была обнаружена гетерозигота М34Т/иЛ. (рис. 12, табл. 1). Все эти варианты Сх2б уже известны как рецессивные индукторы наследственной глухоты.

Анализ 77 больных с раками толстой и прямой кишок выявил 13% гетерозиготное носительство нескольких вариантов Сх26. В этой группе приобладал вариант - 35ёеЮ/иЛ (6 случаев). В двух случаях были обнаружены МДТ/иЛ. и по одному 312ёе114 и Ь90Р. Среди же 29 больных раком лёгкого 3 (почти 10%) оказались носителями либо 35ёеЮ (2случая), либо 312ёе114 (1 случай) аллелей Сх2б (табл.1). И вновь все эти варианты Сх2б уже известны как рецессивные индукторы глухоты.

Таблица 1

Частота гетерозиготных носителей редких вариантов гена Сх2б среди больных различными типами новообразований

35delG М34Т V27I V37I L90P 312dell4 Всего

Рак желудка (С-ГТб) 1/28 4/28 1/28 1/28 0/28 0/28 7/28

Колоректальный рак (С-Пб) 6/77 2/77 0/77 0/77 1/77 1/77 10/77

Рак Лёгкого (С-Пб) 2/29 0/29 0/29 0/29 0/29 1/29 3/29

Рак мол железы (Лион) 0/50 1/50 0/50 0/50 0/50 0/50 1/50

Здоровый контроль (С-Пб) 0/41 0/41 0/41 0/41 0/41 0/41 0/41

Вариант 35delG Cx26 является одной из наиболее частых причин Сх26-опосредованных случаев глухоты [Cryns К, et al., 2004]. Частота гетерозигот этого варианта в здоровых популяциях колеблется от 1.0 до 4.0% [Van Laer L. et al., 2001]. По нашим данным, ни у одного из 41 проанлизированного здорового донора из г. Санкт-Петербурга этого варианта гена Сх26 не было обнаружено. Средняя же чатота гетерозиготных носителей 35delG в России оценивается менее 2% (Маркова ТЖ, соавт., 2002). Значительное повышение частоты гетерозигот этого варианта среди больных раком кишечника свидетельствует в пользу возможного вовлечения мутантного коннексина-26 35delG в кишечный канцерогенез и его гетерозигорное носительство может рассматриваться как новый фактор генетической предрасположенности к этому типу новообразований. О возможной желудочно-кишечной тканеспецифич-ности онкопредрасположенности гетерозиготных носителей Сх26 свидетельствует то, что среди 50 проверенных нами случаев

спорадического рака молочной железы была обнаружена лишь одна гетерозигота M34T/w.t, в то время как частота этой гетерозиготы среди больных раком желудка в нашем исследовании составляла 14,3%.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что межклеточная сообщаемость через ЩК является существенным фактором контроля опухолевого фенотипа. Осуществляется это может различными путями - как непосредственным отрицательнным влиянием на пролиферацию клеток, так и регулированием уровня клеточной гибели.

Выявление снижения межклеточной сообщаемости в опухолях, как правило, эпигенетическими, т.е. потенциально обратимыми, путями позволяет использовать активные профилактические меры, направленные на восстановление функции межклеточной сообщаемости как в потенциальных тканях-мишенях задолго то возникновения в них опухолевых очагов, так и в предопухолевых очаговых поражениях. Возможность восстановления межклеточной сообщаемости между опухолевыми клетками в составе уже возникших новообразований также может иметь большое значение для повышения эффективности химиотерапии. Как, показали наши опыты с хорошо сообщающимися между собой опухолевыми клетками, ЩК являются эффективным путём распространения сигналов клеточной гибели.

Не менее важна как с практической, так и с теоретической точек зрения и обнаруженная нами независимая от межклеточной сообщаемости противоопухолевая активность белков индивидуальных коннексинов. Возможность нормализации опухолевого фенотипа этими белками без их участия в формировании ЩК заставляет по-новому оценить их биологию. Для лучшего понимания механизмов коннексин-опосредованного подавления опухолевого роста необходимы дополнительные фундаментальные исследования их биохимических свойств, в первую очередь, поиск их новых белков-партнёров, через взаимодействие с которыми и должны реализовываться противоопухолевые свойства каждого из отдельных коннексинов. С этой точки зрения крайне важны обнаруженные нами опухоль-специфические мутации одного из наиболее важных представителей семейства коннексинов - Сх43. Специфически связанные с опухолевым ростом мутации того или иного гена являются результатом интенсивного отбора из многих случайных только придающих опухолевым клеткам те или иные ростовые или метаболические преимущества. По сути, обнаруженная нами экспрессия

мутированного Сх43 только в инвазирующих структурах опухолей толстой кишки в сочетании с их выраженной дисплазией опосредованно указывают именно на такую возможность. Необходимо также подчеркнуть, что все найденные нами в опухолях толстой кишки мутации Сх43 были локализованы в наиболее многофункциональном С-концевом домене этого белка, вовлечённого в прямые взаимодействия с целым рядом сигнально активных белков и в наименьшей мере из всех остальных доменов белка Сх43 участвующий в регуляции проницаемости щелевых контактов. С этой точки зрения особо важна особо деструктивная на белковом уровне природа найденных нами мутаций коннексина43 - радикально меняющие структуру целого домена точечные делеции или инсерции, приводящие полной ликвидации его функции, в данном случае способности белка Сх43 участвовать в регулирующих клеточную пролиферацию сигнальных цепочках. Именно такие типы мутации (инсерция/делеция) наиболее часто встречаемы в таких известных опухолевых супрессороах, как BRCA-1 и BRCA-2.

И, наконец, обнаруженная нами повышенная частота гетерозиготных носителей редких вариантов коннексина-26 среди больных раком желудочно-кишечного тракта также даёт новое представление о роли этого белка в канцерогенезе. Потенциальная функциональная патогенность часто встречающихся у онкологических больных редких аллелей Сх26 подтверждена развитием глухоты у их гомозиготных носителей. Постоянно пониженный уровень межклеточной сообщаемости из-за наличия того или иного редкого функционально дефектного аллеля Сх26 может внести заметный вклад в промоцию канцерогенеза тех тканей, где экспрессируется этот белок. Не исключено, что дополнительно к уже сделанной нами находке предрасположенность к развитию определённых типов опухолей может быть также обусловлена полиморфизмом и других генов семейства коннексинов, как например Сх31, редкие варианты которго, как это было недавно показано, ответственны за наследственные заболевания кожи, связанные с нарушением дифференцировки кератиноцитов [Richard G et al., 1998]. Раннее выявление «скрытого» гетерозиготного носительства таких потенциально патогенных вариантов коннексинов может быть новым критерием своевременного выявления групп потенциально повышенного онкологического риска. Последующие полномасштабные популяционные исследования должны выявить истинную профилактическую ценность данного наблюдения.

Таким образом, роль нарушений межклеточной сообщаемости в канцерогенезе на осоновании полученных в данном исследовании результатов можно суммировать, как изображено на приведённой схеме. В данный момент нет убедительных доказательств в их причастности к инициации канцерогенеза. Однако, нарушения межклеточных контактов на этапе опухолевой промоции разнообразны по своей природе и их опухоль ускоряющие последствия ощутимы. Обнаружен также и вклад нарушений функции белков ЩК коннексинов и на более позднем этапе опухолевой прогрессии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что уровень межклеточной сообщаемости через щелевые контакты (ЩК) в опухолях печени как человека, так и крыс, по сравнению с окружающей их нормальной тканью, существенно снижен. Кроме того, уже на самых ранних этапах формирования новообразований печени крыс происходит их коммуникационная изоляция от окружающей нормальной печёночной паренхимы по гетерогенному типу.

2. В основе нарушений межклеточной сообщаемости в опухолях лежат различные механизмы, определяющиеся как гистогенезом опухоли, так и спектром экспрессируемых опухолью индивидуальных белков

ЩК - коннексинов. Наиболее распространённым механизмом функциональной несостоятельности коннексинов в опухолях является их аномальная транслокация из межклеточных контактов латеральных мембран в цитозоль опухолевых клеток.

3. Экспериментальное модулирование интенсивности межклеточной сообщаемости некоторых типов умеренно сообщающихся между собой опухолевых клеток in vitro показало, что полное её подавление значительно повышает их злокачественный потенциал. В то же время, дополнительное увеличение эндогенного уровня межклеточной сообщаемости коммуникирующих между собой раковых клеток в состоянии полностью подавить их опухолеродность in vivo.

4. Противоопухолевый эффект межклеточной сообщаемости частично связан с распространением среди коммуникирующих опухолевых клеток сигнальных молекул, запускающих процесс клеточной гибели апоптозом. Наиболее вероятным посредником передачи клеточной гибели через ЩК среди опухолевых клеток являются ионы Са2+

5. Белки ЩК коннексины способны подавлять опухолеродность клеток независимо от их способности обеспечивать межклеточную сообщаемость формированием канальцев ЩК. Внутрицитоплазматическое перемещение мутационно изменённого белка Сх43 из участков межклеточных контактов латеральных мембран клеток существенно усиливает его коммуникационно-независимый противоопухолевый потенциал.

6. Независимая от межклеточной сообщаемости противоопухолевые свойства коннексинов носит выраженный индивидуальный коннексин-и ткане-специфический характер.

7. Прогрессия спорадических аденокарцином толстой кишки разной степени дифференцировки может сопровождаться соматическими мутационными повреждениями коннексина43. Мутации этого гена возникают на относительно поздних стадиях развития опухолей и тесно связаны с появлением патоморфологических признаков озлокачествления этих новообразований.

8. Гетерозиготное носительство отдельных редких вариантов гена Сх26 может быть дополнительным фактором генетической предрасположенности к ракам желудочно-лишечного тракта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Обаруженный нами феномен распространения клеточной гибели в монослое коммуникирующих опухолевых клеток через ЩК может лечь в основу разработки новых подходов к лечению рака. Медикаментозное или биоинженерное повышение коммуникационной способности опухолевых клеток в сочетании с целенаправленной химиотерапией может существенно повысить цитотоксический ответ опухолевых клеток на лечение.

Тесная связь обнаруженных соматических мутационных повреждений гена Сх4В в аденокарциномах толстой кишки с их инвазивно-агрессивным поведением указывает на целесообразность включения в клинико-патоморфологическую практику анализа на мутационные повреждения гена Сх43 как нового критерия озлокачествления аденокарцином толстой кишки

Существенное повышение частоты гетерозиготного носительства отдельных вариантов гена Сх26 среди больных раком желудочно-кишечного тракта указывает на необходимость раннего массового выявления носителей таких гетерозигот Сх26 с целью их дальнейшего наблюдения как группы повышенного онкологического риска. Последующее регулярное обследование этой группы может способствовать раннему выявлению раковых заболеваний и, тем самым, существенно повысить вероятность их последующего полного излечения. Кроме того, учитывая этиопатогенетическую роль вышеуказанных вариантов Сх26 в возникновении прелингвальной несиндромной глухоты по рецессивному типу, массовое выявление гетерозиготных носителей редких вариантов Сх26 позволит также избежать в дальнейшем рождения гомозиготных детей, страдающих врождённой доречевой глухотой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль нарушений межклеточных щелевых контактов в генезе рака и других патологических состояний / ВА Крутовских // Архив Патологии. - 2000. -Т.61, -С. 3-7.

2. Научно-клиническое значение молекулярно-генетических изменений межклеточных щелевых контактов при раке толстой кишки. / Н.А Яицкий, М.В. Дубина, СВ. Васильев, Д.Е. Попов, В.А. Крутовских // Вестник РАМН. - 2003. -Т. 10,- С. 24-29.

3. Новый генетический маркер профессии рака толстой кишки / Н.А. Яицкий, СВ. Васильев, Д.Е. Попов, М.В. Дубина, В.А. Крутовских // Материалы 111-го международного хирургического конгресса «Актуальные проблемы современной хирургии» Москва, Россия, - 2003. - 22-25 февраля, С. 120.

4. Диагностическое значение генетических нарушений коннексина-43 при колоректальном раке / Н.А. Яицкий, М.В. Дубина, СВ. Васильев, Д.Е. Попов, В.А. Крутовских. // Материалы 1-го Российского съезда колопроктологов с международным участием, г. Самара, Россия, - 2003. - 1-3 октября., С. .328329.

5. Aberrant expression of gap junction gene in primary human hepatocellular carcinomas: increased expression of cardiac-type gap junction gene connexin 43 / M. Oyamada, V. Krutovskikh, M. Mesnil, С Partensky, F. Berger, H. Yamasaki. // Molecular Carcinogenesis. -1990. -vol.3, - P. 273-278.

6. Sequential changes of gap junctional intercellular communications during multistage rat liver carcinogenesis: direct measurement of communication in vivo. / V.A. Krutovskikh, M. Oyamada, H. Yamasaki // Carcinogenesis. - 1991. - vol.12, - P. 1701-1706.

7. Cell-cell communication: role in carcinogenesis and tumor suppression. / H. Yamasaki, V.A Krutovskikh, H. Nakazawa, M. Mesnil, D. Fitzgerald. // Atti del III Incontro. La Cancerogenist come processo, Brescia, Italy. -1991.—P. 111-117.

8. Role of intercellular communication in carcinogenesis and tumor suppression. / H. Yamasaki, V.A. Krutovskikh, M. Oyamada, H. Nakazawa, D.J. Fitzgerald. // In Vitro Methods of Toxicology. Eds.: Jolles G. & Cordier A., Academic Press, London, - 1992. -P. 479-491.

9. Gap junctional communication alterations at various regulatory levels of connexin expression and function during animal and human carcinogenesis. / M. Mesnil, M, Oyamada. D.J. Fitzgerald, W.M.F. Jongen, V.A. Krutovskikh, H. Yamasaki. // In: Progress in Cell Research, vol.3 Eds.: Hall J.E., Zampigni G.A. & Davis R.M., Elsevier,-1993.-P. 311-316.

10. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. / H. Yamasaki, V. Krutovskikh, M. Mesnil, A. Columbano, H. Tsuda, N. Ito. // Environmental Health Perspectives. - 1993. - vol. 101(Suppl 5), -P. 191-198.

11. Altered homologous and heterologous gap junctional intercellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protein localization but not gene mutation of connexin 32. / V. Krutovskikh, G. Mazzoleni, N. Mironov, Y. Omory, A.M. Aguelon, M. Mesnil, F. Berger, С Partensky, H. Yamasaki. // Int. J. Cancer. - 1994. - vol. 56, - P. 87-94.

12. Alteration in expression of gap junction proteins in rat liver after treatment with 3,4,5,3',4'- Pentachlorobiphenyl. / Y. Bager, K. Kenne, V. Krutovskikh, M. Mesnil, O. Traub, H. Yamasaki, L. Warngard. // Carcinogenesis. - 1994. - vol.15. -P. 2439-2443.

13. Aberrant control of gap junctional intercellular communication during multistage carcinogenesis. / H. Yamasaki, M. Mesnil, V. Krutovskikh. // Proceedings of the Conference Cancerogenesi ed Anticancerogenesi, Bologna. - 1994. - P. 53-67.

14. Aberrant control of connexin expression and functions in multistage rat and human hepatocarcinogenesis / H.Yamasaki, M. Mesnil, Y. Omori, N. Mironov, V. Krutovskikh. // Progr. Cell Res. - 1995. - vol. 4. - P. 79-82.

15. Negative growth control of HeLa cells by connexin genes: connexin-species specificity. / M. Mesnil, V.A. Krutovskikh, C.Piccoli, C.Elfgang, O.Traub, K.Willecke, H. Yamasaki // Cancer Research. -1995. -vol.55. -P. 629-639.

16. Growth inhibition of connexin 26 in HeLa cells. / M. Mesnil, V. Krutovskikh, C. Piccoli, C.Elfgand, O.Traub, K.Willecke, H.Yamasaki. // Progress in Cell Res. -vol.4. - Editors: Y. Kanno, K. Kataoka, Y. Shiba, Y. Shibata and T. Shimazu. Elsevier Science B.V. (Amsterdam) - 1995. - P. 141-144.

17. Ex vivo dye transfer assay as an approach to study gap junctional intercellular communication. / V. Krutovskikh, H. Yamasaki // Progress in Cell Res., vol.4; Editors: Y. Kanno, K. Kataoka, Y. Shiba, Y. Shibata and T. Shimazu. Elsevier Science B.V. (Amsterdam). - 1995. - P. 93-97.

18. Aberrant control of connexin expression and functions in multistage rat and human hepatocarcinogenesis / H. Yamasaki, M. Mesnil, Y. Omori, N. Mironov, V. Krutovskikh. // Progress in Cell Res. - vol.4. - Editors: Y. Kanno, K. Kataoka, Y. Shiba, Y. Shibata and T. Shimazu. Elsevier Science B.V. (Amsterdam). - 1995. - P. 79-82.

19. Inhibition of rat gap junction intercellular communication by tumor promoting agents in vivo; association with aberrant localization of connexin proteins. / V. Krutovskikh, M. Mesnil, G. Mazzoleni, H. Yamasaki // Lab. Investigation. - 1995. -vol.72.-P. 571-577

20. Connexin 32 and connexin 43 expressed in thyroid epithelial cells assemble into separate gap junctions, which are located in distinct regions of the lateral plasma membrane. / A. Guerrier, P. Fonlupt, I.Morand, R. Rabilloud, C Audebet, V.Krutovskikh, D.Gros, B.Rousset, Y. Munari-Silem // J. Cell Science. - 1995. -vol. 108.-P. 2609-2614.

21. Intercellular communication and carcinogenesis. / H. Yamasaki, M. Mesnil, Y. Omori, N. Mironov, V. Krutovskikh. // Mutation Research. - 1995. - vol.333. - P. 181-188.

22. Lack of liver tumor promoting effects of flavonoids. In vivo and in vitro studies on gap junctional intercellular communication / C Chaumontet, M. Suschetet, E.Honicman-Leban, VA. Krutovskikh, A.-M. Le Bon, R. Berges, C Heberden, M.M. Shahin. H. Yamasaki, P. Martel. // Nutrition and Cancer. - 1996. - vol. 26. -P. 251-263.

23. Human connexin37 is polymorphic but not mutated in tumors. / VA. Krutovskikh, N.M. Mironov, H. Yamasaki // Carcinogenesis. - 1996. - vol. 17. - P. 1761-1763.

24. Connexin32 gene mutation in a chemically induced rat liver tumor. / Y.Omori, VA. Krutovskikh, H. Tsuda, H. Yamasaki // Carcinogenesis. - 1996. - vol. 17. - P. 2077-2080

25. Role of blocked gap junctional intercellular communication in non-genotoxic carcinogenesis. / M. Mesnil, V. Krutovskikh, Y. Omori, H. Yamasaki. // Toxicol. Lett. - 1996. - vol. 82/83. - P. 701-706.

26. Connexin genes cell growth control. / H. Yamasaki, V. Krutovskikh, M. Mesnil, Y. Omori. //Arch. Toxicol. Suppl. -1996. - vol. 18. -P. 105-114.

27. Decreased connexin32 and a characteristic enzyme phenotype in clofibrate-induced preneoplastic lesions not shared with spontaneously occurring lesions in the rat liver. / H. Tsuda, M. Asamoto, Y. Iwahori, T. Hori, T. Ota, H. Baba-Toriyama, N. U

28. ehara, DJ. Kim, V.A. Krutovskikh, N. Takasuka, T. Tsuchiya, M. Mutai, M. Tatematsu, H. Yamasaki// Carcinogenesis.-1996.-vol.17-P. 2441-2448.

29. Triazine derivatives inhibit rat hepatocarcinogenesis but do not enhance gap junctional intercellular communication / T. Hori,-M. Asamoto, V. Krutovskikh, Y. Iwahori, M. Maeda, H. Toriyama-Baba, N. Takasuka. Tsuda H. // Jpn. J Cancer Res. -1997.-vol. 88.-P. 12-17.

30. Differential dose-dependent effect of a-, p-carotenes and lycopene on gap junction intercellular communication in rat liver in vivo. IV. Krutovskikh, M. Asamoto, H. Tsuda // Jpn. J Cancer Res. - 1997. - vol.88. - P. 1121-1124.

31. The role of gap junctional intercellular communication disorders in experimental and human carcinogenesis. / VA Krutovskikh*, H. Yamasaki. // Histology and Histopathology Journal, -1997. -vol.12. -P.761-768. (""Invited reviewer)

32. Enhanced tumorigenicity of rat bladder carcinomas by abrogation of gap junctional intercellular communication /M. Asamoto, H. Toriyama-Baba, V.A. Krutovskikh, S.M. Cohen, H. Tsuda. // Jpn. J Cancer Res. - 1998. - vol. 89. -P. 481-486.

33. Inhibition of intrinsic gap junction intercellular communication and enhancement of tumorigenicity of rat bladder carcinoma BC31 cell line by dominant-negative Cx43 mutant / V.A. Krutovskikh, H. Yamasaki, H. Tsuda, M. Asamoto // Mol. Carcinogenesis. - 1998 - vol. 23, - P. 254-261.

34. Gap junction intercellular communication as a method to test, predict and interpret carcinogenicity / VA. Krutovskikh, H. Yamasaki. // Chapter for "CARCINOGENICITY. Testing, predicting and interpreting carcinogenicity", by Marcel Dekker Inc., Edited by Kitchin K.T. - 1998. - P. 267-289

35. Genetic and epigenetic changes of intercellular communication genes during multistage carcinogenesis. / H. Yamasaki, Y. Omori, M.-L. Zaidan-Dagli, N. Mironov, M. Mesnil, V. Krutovskikh. // Cancer Detection and Prevention. - 1999.-vol.23,No4.-P.273-279.

36. Role of connexin (gap junction) genes in cell growth control and carcinogenesis. / H. Yamasaki. V. Krutovskikh, M. Mesnil, T. Tanaka, M.-L. Zaidan-Dagli, Y.Omori. // Comptes-Rendus de l'Academie des Sciences, Paris, Sciences de la Vie/ Life Science (Elsevier). - 1999. -vol. 322. - P. 151-159.

37. Connexins in tumor suppression and cancer therapy. / H. Yamasaki, Y.Omori, V. Krutovskikh, W. Zhu, N. Mironov, K. Yamakage, M. Mesnil. // In: Gap junction mediated intercellular signalling in health and disease. Published by John Wiley & sons.-1999.-P. 241-260.

38. Human hemangiosarcomas have a common polymorphism but no mutations in the connexin 37 gene / T. Saito, V. Krutovskikh, M.-J. Marion K. Ishak, W.P. Bennett, H. Yamasaki // International J. Cancer, - 2000 - vol. 86. - P. 67-70.

39. Connexin gene mutations in human genetic diseases. / V. Krutovskikh, H. Yamasaki. // Mutation Research, - 2000. -.vol. 462. -P. 197-207.

40. Differential effect of subcellular localization of communication impairing gap junction protein connexin43 on tumor cell growth. / V. Krutovskikh, S.M. Troyanovsky, C. Piccoli, H. Tsuda, M. Asamoto, H. Yamasaki. // Oncogene. - 2000. -vol. 19.-P. 505-513.

41. Gap junction intercellular communication propagates cell death in cancerous cells. / V. Krutovskikh, C. Piccoli, H. Yamasaki // Oncogene, - 2002. - vol. 21. - P. 19891999.

42. Connexin 43, but not connexin 32, is mutated at advanced stages ofhuman sporadic colon cancer. /M. Dubina, N.A. Iaitckii, D.E. Popov, S.V. Vasil'ev, V. Krutovskikh. // Oncogene. - 2002. - vol.21. - P. 4992-4996.

43. Implication of direct host-tumor intercellular interactions in non-immune host resistance to neoplastic growth. / V. Krutovskikh // Seminars in Cancer Biology. -2002. - vol. 12. - P. 267-276 (invited reviewer).

44. Selective alteration ofgap junctional intercellular communication and modulation of differentiation in dominant-negative transfected mouse osteoblast and rat liver oval cell lines. / B. Upham, J. Suzuki, G. Chen, L. McCabe, Ch-Ch. Chang, V. Krutovskikh, H. Yamasaki, J. Trosko. // Molecular Carcinogenesis. - 2003. - vol. 37.-P. 192-201.

45. Delayed liver regeneration and increased susceptibility to chemical hepatocarcinogenesis in transgenic mice expressing a dominant-negative mutant of connexin32 only in liver. / M-L. Zaidan-Dagli, H. Yamasaki, V. Krutovskikh, Y. Omori. // Carcinogenesis. - 2004. - vol. 25. - P. 483-492.

Патент

H.A. Яицкий, В.А. Крутовских, М.В. Дубина, СВ. Васильев, Д.Е. Попов, Н.Н.

Петрищев, К.Г. Шостка, Л.Д. Роман / Способ диагностики злокачественной

прогрессии опухолей толстой кишки // Патент на изобретение № RU2213781C1,

10.10.2003 (приоритет от 18.12.2002г.).

Д777

. ГГЛ-

2 2 ^ ' " "

Актуальность проблемы.

Отличительной особенностью канцерогенеза является многообразие этиологических факторов, вовлеченных в этот процесс. Помимо общепризнанной роли в генезе рака генетических повреждений ряда генов, белковые продукты которых регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и клеточную смерть (Hanahan D, Weinberg RA, 2000; Vogelstein В, Kinzler KW, 2004), а также осуществляют репарационный контроль клеточного генома, существенный вклад в канцерогенез вносят и нарушения межклеточных взаимодействий (Васильев ЮМ, 1997; Yamasaki Н, 1990). Контактируя между собой, клетки получают разнообразную сигнальную информацию, опосредованно влияющую на практически все аспекты их жизнедеятельности. Аппарат межклеточных взаимодействий состоит из нескольких структурно и функционально различных типов межклеточных соединений. Большинство из них - адгезивные соединения, десмосомы, плотные контакты - имеют выраженную структурно-механическую функцию, объединяя клетки в единое целое, т.е. ткань. Щелевые же контакты (ЩК), представляя собой микроскопические водяные канальцы, напрямую соединяющие цитоплазмы клеток, обеспечивают непосредственный обмен метаболитами и сигнальными молекулами между клетками в пределах данной ткани (рис.1, глава 1).

Являясь неотъемлемой составной частью комплексного аппарата межклеточных взамодействий, ЩК вносят существенный вклад в обеспечение поддержания разнообразных параметров тканевого гомеостаза (Крутовских ВА, 2000; Kumar N.M., GilulaN.B., 1996; Willecke К. с соавт., 2002). с

Соответственно, нарушение функции щелевых контактов существенно влияет на клеточную пролиферацию, дифференцировку, клеточную гибель, что в свою очередь имеет значительный этиопатогенетический вклад в процесс формирования новообразований (Yamasaki Н., 1990; Yamasaki Н.,

Naus C.C.G., 1996; Trosko J.E., Ruch R.J., 1998; Krutovskikh V, 2002; Ruch R.J., Trosko J.E.,2001).

Резкое снижение способности сообщаться между собой через ЩК было отмечено in vitro у опухолевых клеток еще несколько десятилетий назад (Lowenstein W.R., Kanno Y. 1966). Этиологическая значимость этого феномена, а также отвечающие за эти нарушения механизмы долгое время оставались во многом неясными, в основном, из-за отсутствия фундаментальных знаний о молекулярной структуре щелевых контактов.

До последнего времени оставалось также неясно, сопровождается ли опухолевый рост in vivo утратой межклеточной сообщаемости через ЩК аналогично феномену, описанному ещё много лет назад в культуре опухолевых клеток.

Благодаря недавнему бурному прогрессу в области биологии межклеточных взаимодействий, в частности, открытие семейства белков ЩК - коннексинов (Сх), стало возможным получение высокоспецифичных антисывороткок и молекулярных генных проб ко многим индивидуальным белкам этого семейства, что существенно расширило экспериментальные возможности в изучении как функции ЩК и входящих в их состав коннексинов, так и механизмов их нарушений в канцерогенезе.

В частности, многочисленные эксперименты по восстановлению межклеточной сообщаемости у коммуникационно дефектных линий раковых клеток путём устойчивой трансфекции в них генов ЩК коннексинов показали, что межклеточная сообщаемость является сильным опухолеподавляющим фактором (Rose В. с соавт., 1991; Eghbali В, с соавт., 1991; Chen Sh-Ch. с соавт., 1995). В то же время в ряде случаев обнаружилось, что подавление опухолеродности клеток при искусственном восстановлении экспрессии в них белков коннексинов далеко не всегда и не обязательно непосредственно связано с улучшением межклеточной сообщаемости. Более того, оказалось, что для подавления опухолеродного фенотипа важно не само по себе восстановление межклеточной сообщаемости, а в большей мере тип индивидуального коннексина, с помощью которого это было произведено (Mesnil М. с соавт., 1995).

Таким образом, было предположено, что белки ЩК коннексины, наряду со своей основной функцией обеспечивать межклеточную сообщаемость формированием каналов щелевых контактов, также обладают дополнительными свойствами, имеющими существенное влияние на поведение опухолевых клеток.

Выяснение механизмов повреждения межклеточной сообщаемости при опухолевом процессе может существенно улучшить диагностику рака, способствовать разработке новых методов его лечения, а также способствовать разработке новых онкопрофилактических стратегий.

Цель работы.

Оценка этиопатогенетической значимости нарушений межклеточных взаимодействий через щелевые контакты в канцерогенезе.

Задачи исследования:

1. Выявить функциональные нарушения межклеточной сообщаемости через ЩК на разных этапах канцерогенеза in vivo.

2. Изучить молекулярные механизмы нарушения функций ЩК в экспериментальном и спонтанном канцерогенезе.

3. Выявить молекулярные механизмы подавления опухолевого роста белками ЩК коннексинами.

4. Экспериментально проверить предположение о многофункциональной природе белков коннексинов и оценить потенциальный вклад этих функций в коннексин-опосредованное подавление опухолевого роста.

Научная новизна.

Впервые было показано, что в опухолях печени человека межклеточная сообщаемость резко снижена по сравнению с окружающей их непораженной тканью.

Впервые на экспериментальной модели гепатоканцерогенеза крыс было продемонстрировано, что предопухолевые очаговые поражения уже на самых ранних этапах своего формирования могут быть коммуникационно изолированы от окружающей их нормальной паренхимы печени.

Впервые были получены экспериментальные доказательства распространения среди опухолевых клеток через их ЩК сигнальных молекул, запускающих механизм клеточной гибели.

Впервые были обнаружены соматические мутационные повреждения гена коннексина43 (Сх43) в спорадических опухолях толстой кишки человека. Было также выявлено, что мутации гена Сх43 происходят на довольно поздних этапах формирования новообразований колоректального рака, и их возникновение тесно связано с появлением признаков озлокачествления.

Также впервые было обнаружено, что редкие варианты гена коннексина26, вызывающие врождённую доречевую глухоту по рецессивному типу, могут быть дополнительным фактором генетической предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные в работе данные расширяют современные представления о молекулярно-генетических механизмах канцерогенеза и имеют конкретную практическую значимость.

В частности, экспериментально обнаруженная возможность распространения в популяции опухолевых клеток через ЩК вызывающих клеточную гибель сигналов может быть успешно использована для повышения эффективности лекарственной терапии рака.

Специфический характер обнаруженных в опухолях толстой кишки человека мутаций Сх43 - сдвиг рамки считывания из-за инсерции-делеции единичных нуклеотидов в карбоксильно-терминальном домене белка -дополняет имеющиеся ранее представления о молекулярных механизмах канцерогенеза толстой кишки. Разрушение в результате таких мутаций способности Сх43 взаимодействовать с целым рядом сигнально активных белков (р-катешш, ZO-1, кпаудин, дребрин и другие) (Giepmans B.N.G., Moolenaar W.H., 1998, Toyofuku Т. с соавт., 1998; Ai Zh. с соавт., 2000; Jin Ch., с соавт., 2000; Butkevich Е. с соавт., 2004) приводит к неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Природа этих мутации также убедительно указывает на наличие нераспознанной ранее сигнальной активности Сх43 в контроле опухолевого фенотипа.

Обнаруженная в данной работе тесная взаимосвязь специфического мутационного повреждения Сх43 в его карбокси-терминальной части с появлением признаков инвазивности опухолей толстой кишки может быть использована в клинической практике в качестве нового диагностического критерия опухолевой прогрессии.

Возникающие при раке толстой кишки в результате сдвигающих рамку считывания мутаций новые аминокислотные последовательности в составе белковой молекулы Сх43 обладают сильной антигенностью и могут служить иммуно-диагностической и иммуно-терапевтической мишенью.

Высокая частота гетерозиготных носителей редких вариантов гена Сх26 среди больных раком желудочно-кишечного тракта позволяет использовать наличие этих вариантов в качестве нового критерия для раннего выявления групп повышенного онкологического риска.

Основные положения, выносимые на защиту. Опухолевый рост in vivo сопровождается значительным снижением межклеточной сообщаемости через ЩК, в основе чего лежат различные механизмы ; так 1) межклеточная сообщаемость через ЩК является сильным противоопухолевым фактором; 2) межклеточная сообщаемость между опухолевыми клетками через ЩК может являться путём распространения в опухолевой клеточной популяции сигналов, запускающих процесс клеточной смерти, что является существенной составляющей опухоль-подавляющего эффекта межклеточной сообщаемости.

Белки ЩК коннексины являются опухолевыми супрессорами, способными подавлять опухолевый рост независимо от межклеточной сообщаемости через ЩК. Именно это свойство и обусловливает ярко выраженную вариабельность противоопухолевого потенциала каждого из 20 известных индивидуальных коннексинов.

Индивидуальные коннексины могут быть избирательно и высоко специфично соматически мутированы в отдельных типах раков человека. Мутационно модифицированные коннексины могут приобретать способствовать ускорять опухолевую прогрессию, а редкие варианты гена коннексина26 могут быть новым фактором предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта.

Апробация работы.

Диссертация была представлена на международных конференциях по межклеточным щелевым контактам [Хирошима (Япония, 1993), Кей Ларго (США, 1997), Гватт (Швейцария, 1999), Гонолулу (США, 2001), Кембридж (Англия, 2003)], на ежегодных симпозиумах американской ассоциации по изучению рака (1991, 1993, 1995, 1997, 1999, 2002), международном симпозиуме по раннему выявлению и предотвращению рака (Париж, Франция, 2002). Всего по теме диссертации было сделано 40 устных и постерных презентаций.

Связь с планом научных исследований: Данное исследование является частью научного проекта отдела канцерогенеза МАИР, одобренного научным советом Международного Агентства по Исследованию Рака.

Публикации.

Результаты исследования опубликованы в 34 научных публикациях в отечественной и международной научной периодике.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, описывающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Объём работы составляет 176 страниц. Диссертация проиллюстрирована 50 рисунками и 7 таблицами. Список цитированной литературы содержит 17 отечественных и 256 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что уровень межклеточной сообщаемости через щелевые контакты (ЩК) в опухолях печени, как человека, так и крыс, по сравнению с окружающей их нормальной тканью, существенно снижен. Кроме того, уже на самых ранних этапах формирования новообразований печени крыс происходит их коммуникационная изоляция от окружающей нормальной печёночной паренхимы по гетерогенному типу.

2. В основе нарушений межклеточной сообщаемости в опухолях лежат различные механизмы, определяющиеся как гистогенезом опухоли, так и спектром экспрессируемых опухолью индивидуальных белков ЩК -коннексинов. Наиболее распространённым механизмом функциональной несостоятельности коннексинов в опухолях является их аномальная транслокация из межклеточных контактов латеральных мембран в цитозоль опухолевых клеток.

3. Экспериментальное модулирование интенсивности межклеточной сообщаемости некоторых типов умеренно сообщающихся между собой опухолевых клеток in vitro показало, что полное её подавление значительно повышает их злокачественный потенциал. В то же время, дополнительное увеличение эндогенного уровня межклеточной сообщаемости коммуникирующих между собой раковых клеток в состоянии полностью подавить их опухолеродность in vivo.

4. Противоопухолевый эффект межклеточной сообщаемости частично связан с распространением среди коммуникирующих опухолевых клеток сигнальных молекул, запускающих процесс клеточной гибели апоптозом. Наиболее вероятным посредником передачи клеточной гибели через ЩК среди опухолевых клеток являются ионы Са2+.

5. Белки ЩК коннексины способны подавлять опухолеродность клеток независимо от их способности обеспечивать межклеточную сообщаемость формированием канальцев ЩК. Внутрицитоплазматическое перемещение мутационно изменённого белка Сх43 из участков межклеточных контактов латеральных мембран клеток существенно усиливает его коммуникационно-независимый противоопухолевый потенциал.

6. Независимая от межклеточной сообщаемости противоопухолевые свойства коннексинов носит выраженный индивидуальный коннексин- и ткане-специфический характер.

7. Прогрессия спорадических аденокарцином толстой кишки разной степени дифференцировки может сопровождаться соматическими мутационными повреждениями коннексина43. Мутации этого гена возникают на относительно поздних стадиях развития опухолей и тесно связаны с появлением патоморфологических признаков озлокачествления этих новообразований.

8. Гетерозиготное носительство отдельных редких вариантов гена Сх26 может быть дополнительным фактором генетической предрасположенности к ракам желудочно-лишечного тракта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Обнаруженный нами феномен распространения клеточной гибели в монослое коммуникирующих опухолевых клеток через ЩК может лечь в основу разработки новых подходов к лечению рака. Медикаментозное или биоинженерное повышение коммуникационной способности опухолевых клеток в сочетании с целенаправленной химиотерапией может существенно повысить цитотоксический ответ опухолевых клеток на лечение.

2. Тесная связь обнаруженных соматических мутационных повреждений гена Сх43 в аденокарциномах толстой кишки с их инвазивно-агрессивным поведением указывает на целесообразность включения в клинико-патоморфологическую практику анализа на мутационные повреждения гена Сх43 как нового критерия озлокачествления аденокарцином толстой кишки.

3. Существенное повышение частоты гетерозиготного носительства отдельных вариантов гена Сх26 среди больных раком желудочно-кишечного тракта указывает на необходимость раннего массового выявления носителей таких гетерозигот Сх26 с целью их дальнейшего наблюдения как группы повышенного онкологического риска. Последующее регулярное обследование этой группы может способствовать раннему выявлению раковых заболеваний и, тем самым, существенно повысить вероятность их последующего полного излечения. Кроме того, учитывая этиопатогенетическую роль вышеуказанных вариантов Сх26 в возникновении прелингвальной несиндромной глухоты по рецессивному типу, массовое выявление гетерозиготных носителей редких вариантов Сх26 позволит также избежать в дальнейшем рождения гомозиготных детей, страдающих врождённой доречевой глухотой.