Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Сравнительное изучение действия канцерогенов на функции клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих рецепторы ксенобиотиков

На правах рукописи

ВОЛКОВ Максим Сергеевич

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ КАНЦЕРОГЕНОВ НА ФУНКЦИИ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ И НЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ РЕЦЕПТОРЫ КСЕНОБИОТИКОВ

Специальность 14.01.12-онкология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И.Давыдов)

Научный руководитель: Доктор биологических наук,

профессор Кобляков Валерий Александрович

Официальные оппоненты:

Красильников Михаил Александрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии

Ягужинский Лев Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, заведующий лабораторией структуры и функций биологических мембран

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО РНИМУ им. H.H. Пирогова Минсоцразвития России

Защита диссертации состоится <£(» ô5~2012 года в /V часов на заседании диссертационного совета Д.001.017.01 ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН. Автореферат разослан «<? » СН 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н., профессор s-^ybsj/Z&irj^ Юрий Владимирович Шишкин

______________ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

I________ ;

Одним из важнейших свойств организма является регулируемое размножение клеток. Неконтролируемое размножение клеток обуславливает опухолевый рост. Многие чужеродные соединения обладают способностью стимулировать пролиферацию клеток. Как правило, эти соединения относятся к группе опухолевых промоторов. К загрязнителям окружающей среды, являющимися опухолевыми промоторами, относятся составляющие выхлопных газов двигателей внутреннего сгорания - полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), хлорированные углеводороды. Эти вещества являются инертными соединениями, неспособными образовывать прочные ковалентные связи с компонентами клетки. В то же время показано, что при попадании в клетку они активируют транскрипцию генов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, такие как изоформы цитохрома Р450, глутатион трансферазу и др. Более подробное изучение действия этих соединений на функции клеток показало, что эти вещества взаимодействуют с цитоплазматическим белком АЬ-рецептором. Взаимодействие приводит к активации АЬ-рецептора, транспортировке его в ядро и после взаимодействия с белком А11МТ комплекс белков начинает функционировать как транскрипционный фактор. В дальнейшем было показано, что помимо индукции ферментов метаболизма ксенобиотиков лиганды АЬ-рецептора вызывают эффекты не связанные с транскрипцией генов. Было показано, что они влияют на пролиферацию клеток, на апоптоз и на функционирование МЩК.

Исторически сложилось так, что функции АЬ-рецептора как транскрипционного фактора вызывали наибольший интерес в биологическом действии ПАУ и других лигандов АЬ-рецептора. Поэтому начатое в более позднее время изучение других эффектов лигандов АЬ-рецептора на клеточные функции были основаны на предположении, что они так же обусловлены активацией АЬ-рецептора. Однако имеются исследования в

которых показано что изменения клеточных функций при действии лигандов АЬ рецептора реализуется в условиях, когда АЬ рецептор не экспрессировался или его функция была блокирована(А1ЬеПз В ег а1, 2002). Эти данные дали нам основание для предположения, что в клетках помимо АЬ рецептора может присутствовать некий фактор, взаимодействие с которым вызывает изменения в функционировании клеток.

В связи с этим, мы исследовали действие лигандов АЬ-рецептора на клеточные функции, связанные с промоцией, используя в качестве модели клеточные культуры экспрессирующие и не экспрессирующие АЬ-рецептор. Целью исследования - являлось изучение роли АЬ рецептора при действии его лигандов на функции клеток, нарушение которых обуславливают опухолевую промоцию. Выяснить, существует ли в клетке помимо АЬ рецептор - зависимого механизма другие механизмы нарушения клеточных функций ассоциированы с опухолевой промоцией при действии веществ типа ПАУ

Задачи исследования

В рамках поставленной цели задачей диссертационной работы являлось изучение механизма действия ряда канцерогенных ксенобиотиков - лигандов АЬ рецептора, таких как: ПАУ, хлорированные углеводороды и флавоны на функции клеток, нарушение которых, согласно современным представлениям, определяют опухоль-промоторное действие. Согласно задачам исследования в работе планировалось:

1. Провести сравнительное изучение действия лигандов АЬ рецептора таких как канцерогенные ПАУ и их неканцерогенного аналога Б(е)П, хлорированного бифенила - ароклор 1254 и соединения из класса флавонов -(3-НФ на пролиферативную активность и на изменения функционирования клеточных систем, связанных с пролиферацией, в культуре клеток, экспрессирующих и неэкспрессирующих АЬ-рецептор.

2. В клетках экспрессирующих и неэкспрессирующих АЬ-рецептор исследовать влияние этих же веществ на функционирование одного из

факторов противоапоптической защиты - транскрипционного фактора NF-кВ.

3. Выяснить, реализуется ли эффект ингибирования межклеточных щелевых контактов канцерогенными ПАУ наблюдаемый в клетках гепатом, в клетках трансформированных эмбриональных фибробластов крысы CL-1 Научная новизна

Одним из важнейших результатов исследования является обнаружение ранее неизвестных науке фактов, связанных с действием чужеродных веществ на функции клеток. Частным случаем такого действия является опухолевая промоция. До нашего исследования считалось, что канцерогены окружающей среды, в первую очередь наиболее распространенные из них - ПАУ -реализуют свой канцерогенный, токсический и другие эффекты или путем образования активных электрофильных метаболитов или благодаря активации орфанового Ah рецептора (Neumann H.G et al, 2007 ). Используя уникальную клеточную модель - клетки гепатомы 27, в которой отсутствует экспрессия как Ah рецептора, так и система метаболизма ксенобиотиков, мы показали, что стимуляция пролиферации и активация транскрипционного фактора NF-кВ может происходить независимо от экспрессии в клетке Ah рецептора и системы метаболизма. Полученные в данном исследовании результаты впервые демонстрируют тот факт, что в клетках помимо известного акцептора канцерогенных ПАУ и флавонов - Ah-рецептора -присутствуют некие неизвестные ранее факторы, взаимодействие с которыми приводит к эффектам, описанным в данном исследовании, и ассоциированные с промоторным действием. Эти данные меняют общепринятое представление о том, что Ah-рецептор является единственным компонентном клетки, взаимодействие с которым вызывает эпигенетические изменения, приводящие в конечном итоге к опухолевой промоции.

Таким образом, мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток

реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите 7 февраля 2012 года на совместной научной конференции лабораторий канцерогенных веществ, механизмов химического канцерогенеза, молекулярной эндокринологии, природных канцерогенов НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит рисунка, таблица. Состоится из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы».Список литературы содержит 144 источника

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении описывается актуальность проблемы, научная новизна, указываются цели и задачи исследования, а также обсуждается теоретическая и практическая значимость работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Обзор литературы включает общие сведения о химическом канцерогенезе. Раскрываются особенности ПАУ как канцерогенов, описывается роль Ah рецептора в метаболизме ксенобиотиков. Подробно рассмотрены современные данные о механизме активации Ah рецептора, описан современный взгляд на опухолевую промоцию и функционирование транскрипционных факторов, участвующих в пролиферации и

антиапоптической защите: АР-1 и №-кВ. Детально описана их регуляция и роль в химическом канцерогенезе. Приведены данные, свидетельствующие о том, что эффекты лигандов АЬ рецептора могут реализовываться в системах в которых АЬ рецептор не экспрессируется или он не активен. Приведен анализ литературных данных по функционированию МЩК и их роль в регуляции пролиферации и опухолевой промоции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы следующие методы исследования: культивирование различные типов клеток, полимеразная цепная реакция, обратная транскрипция, выделение РНК из культуры клеток, трансфекция генов и определение активности репортерного гена, трансфекция определение пролиферации клеток с использованием флуоресцентного красителя Су<3иап1 вЯ, идентификация белков при помощи вестерн-блоттинга, внутриклеточная инъекция флуоресцентного красителя люцифера желтого в одну из клеток монослоя с последующей регистрацией распространения его в соседние клетки, трансфекция флуоресцентного белка ОБР, статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Изучение пролиферативной активности лигандов АЬ рецептора в клетках гепатом экспресснрующих и экспрессирующих АЬ рецептор. 1.1 Клетки гепатомы 27. Показано, что клетки гепатомы 27 не экспрессируют АЬ рецептор и ферменты метаболизма ксенобиотиков. Одним из важных свойств опухолевых промоторов является стимуляция пролиферации.

Мы определяли пролиферацию в клетках Г-27 под действием изучаемых -веществ на двух системах: клеток, находящихся в состоянии пролиферации в присутствии 10% сыворотки в среде культивирования и в состоянии покоя, которое достигалось культивированием клеток в среде с содержанием сыворотки 0,5%.

Рис ! Пролиферашивнан активность клеток гепатомы 27 но<> действием лигандов ЛЬ-рецептор при культивировании в среде с 10% содержанием сыворотки(.^ и а среде с низким уровнем (0.5%/ сыворотки(Ь') .1

I

600000 500000

о

« 400000 с;

■ 300000

о а>

X 200000

с; о

100000

О часов

24 часа

48 часов

- Контроль

-Б(е)П

-Арохпор

-ДМБА

-БП

-БНФ

-МХ

0 часов

24 часа

48 часов

Та6:1.1 Пролиферативная активность клеток гепатомы 27 под действием лигандов АЬ-рецептор при культивировании а среде с 10% содержанием сыворотки и в среде с низким уровнем (0.5%) сыворотки

Степень увеличения клеток по

Вещество отношению к контролю

Среда с 10% Среда с 0,5%

содержанием содержанием

сыворотки сыворотки

БП(5мкг/мл) 1,3±0,1 2,4+0,2

МХ(5мкг/мл) 1,2+0,3 2,1+0,1

Р-нф(5мкг/мл) 1,5+0,2 4,8+_0,2

ДМБА(5мкг/мл) 1,4+0,1 4,7+0,2

Бензо/е/пирен(5мкг/мл) 0,8+0,1 1,1+0,1

Ароклор 1254(1 микромоль) 0,4+0,2 0,9+0,1

На рисЛА и табл.1 приведены данные по пролиферативной активности клеток под действием ряда лигандов АЬ-рецептора в клетках гепатомы 27 при культивировании в стандартной среде с сывороткой. Видно, что все канцерогенные ПАУ и (3-НФ стимулируют пролиферацию примерно в одинаковой степени (на 2-ые сутки культивирования увеличение количества клеток составляет 1.2 - 1.5 раза). Неканцерогенный ПАУ - Б(е)П никак не

влияет на скорость пролиферации, а хлорированный бифенил - ароклор 1254 ингибирует пролиферацию.

При культивировании клеток в течение 3-х суток в среде с низким содержанием сыворотки (рис.1 Б и табл.1) скорость роста контрольных клеток незначительно замедляется по сравнению с ростом клеток, культивируемых в присутствии сыворотки. Стимуляция пролиферации, вызванная канцерогенными ПАУ и Р-НФ, более эффективна, чем в среде с 10% сывороткой. Так на 2-ые сутки культивирования (3-НФ и ДМБА увеличивают количество клеток в 4.8 раза, а БП и MX в 2.4 и 2.1 соответственно по сравнению с контролем. Б(е)П и ароклор 1254 не влиял на пролиферативную активность.

1.2 Клетки гепатомы НерС2.Клетки гепатомы Hep G2 экспрессируют различные дифференцировочные факторы, в том числе Ah-рецептор.

Рис.2 Пролиферативиая активность клеток гепатомы HepG2 под действием лнгандов Ah-рецептор при культивировании о среде с 10% содержанием сыворотки(А) в среде с низки»уровнем (0.5%) сыворотки(Б)

А ,----

350000

300000

Ж

О & 250000

5 о 200000

а

о ф 150000

Т

1 100000

£

50000

0 часов

24 часа

Таол. 2 Пролиферативная активность клеток гепатомы НерС2 под действием лигандов АН-рецептор при культивировании а среде с 10% содержанием сыворотки и в среде с шикни уровнем (0.5%) сыворотки

Вещество Степень увеличения клеток по отношению к контролю

Среда с 10% Среда с 0,5%

содержанием содержанием

сыворотки сыворотки

БП(5мкг/мл) 1,3+0,2 1,8^0,2

МХ(5мкг/мл) 1,2+0,4 1,7+0,3

|3-нф(5мкг/мл) 1,2+0,3 1,7+0,2

ДМБА(5мкг/мл) 1,1+0,1 1,8+0,1

Бензо/е/пирен(5мкг/мл) 0.5+0,2 0,9+0,2

Ароклор 1254(1 микромоль) 0,2+0,2 0,2+0,1

На рис. 2А и табл.2 приведены данные по пролиферативной активности клеток гепатомы НерС2 под действием лигандов АЬ-рецептора при культивировании в стандартной среде с сывороткой. Из рисунка 2А видно, что БП, МХ, а также Р-НФ стимулируют пролиферацию, ДМБА практически не влияет на пролиферацию, а ароклор 1254 ингибирует пролиферацию. В среде с низким содержанием сыворотки (рис.2Б и табл.2) все канцерогенные ПАУ и (3-НФ стимулируют пролиферацию примерно в одинаковой степени (на 2-ые сутки культивирования увеличение количества клеток составляет 1.7 - 1.8 раза по отношению к контролю). Неканцерогенный ПАУ - Б(е)П слабо влияет на пролиферацию, если сравнивать его действие с канцерогенными ПАУ, а хлорированный бифенил - ароклор 1254 ингибировал пролиферации как в среде с сывороткой, так и в средебез сыворотки. Как и в случае с гепатомой 27 мы наблюдаем более эффективную стимуляцию пролиферации в среде с низким содержанием сыворотки, но степень стимуляции в клетках гепатомы НерС2 ниже, чем в культуре клеток гепатомы 27.

2. Исследование сигнального пути и анализ изменения клеточного цикла. Исходя из того, что в отсутствии сыворотки стимуляция пролиферации в обоих типах клеток выше, чем в среде с сывороткой, можно предположить, что ростовые факторы, находящиеся в сыворотке, и изучаемые нами соединения, активируют один и тот же сигнальный путь. Известно, что ростовые факторы активируют ЕЮ£1/2-зависимый МАР-

киназный путь, форсфорилируя ЕКК1/2. Мы определяли изменение уровня активной фосфорилированной формы ЕЯКШ. В качестве маркерного соединения мы использовали основной загрязнитель окружающей среды -БП. Как видно из рис, 3, БП увеличивает фосфорилиривание ЕШС1/2 как в клетках гепатомы 27, так и в клетках гепатомы НерС2, что свидетельствует об активации этого сигнального пути.

Рис.3 Изменения уровне ЕКК1/2 и ЕЯК1/2-фосф. под действием БП(5мкг/мл) в среде с нижим(0 5%) содержанием сыворотки а клетках гепатомы 27(А) и гепатомы НарС2(Б)

ERK1/2

ERKI/2-фософ

яШ итШ 1ЁР";: ■

К 30 60 180 минут К 30 60 180 минут

Б

ERK1/2

ERKI/2-фосф

К 30 60 180 минут

30 60

180 минут

Мы исследовали действие БП на клеточный цикл в клетках гепатомы 27 и гепатомы НерС2, культивируемых 3 суток в среде с низким содержанием сыворотки. Как видно из рис.4 БП вызывает уменьшение количества клеток, находящихся в с 70 до 64% фазе в клетках гепатомы 27 и с 82 до 73% для гепатомы НерС2 (рис.5),значительное увеличение количества клеток, находящихся в фазах в2/М с 17 до 28%(гепатома 27) и с 12 до 20% (гепатома Нер02), не влияя при этом на фазу Б как в гепатоме 27, так и в клетках гепатомы НерС2.

Рис 4 Изменения клеточного цикли и клетках сепатомы 27 .культивируемой 3 суток в среде с ннэкн.и содержанием сыооритки(0 5%) (А) и под действием БП(5мкг/мя) (Б)

А Б

Рис. 5 Изменения клеточного цикла а клетках гепатомы НерС2 ,культивируемой 3 суток в среде с низким содержанием сыворотки(0.5%) (А) и под действием БП(5мкг/мл) (Б)

Таким образом, передача пролиферативного сигнала при использовании клеток экспрессирующих и не экспрессирующих АЬ-рецептор происходит, через ЕШС1/2- зависимый путь. Примерно одинаковые события в обоих типах клеток происходят также и при анализе клеточного цикла: уменьшается количество клеток в фазе й 1 и увеличивается количество клеток, находящихся в фазах в2/М при действии БП. Это может указывать на общность в механизме стимуляции пролиферации в клетках экспрессирующих и не экспрессирующих АЬ-рецептор.

При сравнении действия различных типов лигандов АЬ-рецептора на пролиферацию клеток гепатом, представленные в данной работе, бросается в глаза тот факт, что в действии лигандов АЬ-рецептора различных химических

классов нет единства в действии. Так Р-нф и канцерогенные ПАУ стимулируют пролиферацию клеток, а хлорированный бифенил ароклор 1254 вызывает ингибирование как в клетках экспрессирующих так и не экспрессирующих АИ-рецептор, но несколько в большой степени в клетках НерС2 (рис.2). Различия в биологическом действии лигандов АЬ-рецептора относящихся к классу хлорированных углеводородов и других соединений встречалось и у других исследователей(БЫр1еу .1М е1 а1,2006) 3. Определение активности №-кВ в клетках гепатом. Транскрипционный фактор №-кВ участвует как в передаче митотического сигнала, так и в антиапоптической защите клеток. Активация №-кВ играет важную роль в канцерогенезе, защищая опухолевые клетки от апоптоза и поддерживая их пролиферативный статус. На различных опухолевых моделях показана активация №-кВ(Т1ап У е1 а1, 2002). Чтобы исследовать действие изучаемых веществ на активность М^-кВ мы трансфецировали клетки плазмидой, содержащей люциферазный репортерный ген под контролем респонсивного элемента ЫБ-кВ в культуре гепатомы 27 и НерС2, и оценили действие канцерогенных ПАУ и Б(е)П, полихлорированного бифенила ароклор-1254 и Р-НФ на активацию №-кВ. Как и в экспериментах по изучению действия этих веществ на пролиферацию мы исследовали эффект веществ в культуре клеток с нормальным содержанием сыворотки и с низким содержанием сыворотки. В табл. 3 приведены результаты этих экспериментов в культуре клеток гепатомы 27.

Таблица 3 /¡ктиаация транскрипционного фактора NF-кBnpu действии лигаидоа .4/1 рецептора в клетках гепатомы 27

Вещество Степень изменения ОТ-кВпо отношению к контролю

Среда с 10% Среда с 0,5%

содержанием содержанием

сыворотки сыворотки

БП(5мкг/мл) 3,2+0,1 5,0+0,2

МХ(5мкг/мл) 2,7+0,3 6,4+0,1

3-нф(5мкг/мл) 2,4+0,2 4,0^0,2

ДМБА(5мкг/мл) 2,2+0,1 3,6+0,2

Бензо/е/пирен(5мкг/мл) 1,2+0,1 1,0±0,1

Ароклор1254(1 микромоль) 1,0+0,2 0,9+0,1

Способностью активировать ЫР-кВ обладали все исследуемые канцерогенные ПАУ и [3-НФ. Ароклор 1254 и неканцерогенный Б(е)П ЫР-кВ не активировали. Активация ЫР-кВ при действии канцерогенных ПАУ и р-НФ была значительна выше в клетках, находящихся в покое, по сравнению с пролиферирующими клетками. Наиболее эффективными соединениями оказались МХ и БП.

В культуре клеток НерС2 канцерогенные ПАУ и Р-НФ активируют ЫР-кВ, как и в случае с гепатомой 27, более эффективно в среде с низким содержанием сыворотки по сравнению с клетками культивируемыми в среде с 10% содержанием сыворотки (см. табл.4). При сравнении результатов приведенных в табл. 3 и 4 можно заключить, что в клетках гепатомы Нер02 степень активации ЫР-кВ ниже, чем в клетках гепатомы 27.

Таблица 4 Активации транскрипционного фактора МГ-кВпри действии лигандов АН рецептора в клетках ИерС2

Вещество Степень изменения ОТ-кВпо отношению к контролю

Среда с 10% Среда с 0,5%

содержанием содержанием

сыворотки сыворотки

БП(5мкг/мл) 1,8+0,2 2,6+1,2

МХ(5мкг/мл) 1,5+0,1 2,2+0,1

Р-нф(5мкг/мл) 1,4+0,2 3,6+0,2

ДМБА(5мкг/мл) 1,3+0,2 2,6+0,2

Бензо/е/пирен(5мкг/мл) 1,2+0,1 1,2+0,3

Ароклор 1254(1 микромоль) 0,8+0,2 0,9+0,1

Это может свидетельствовать о том, что АЬ рецептор ингибирует стимуляцию ЫР-кВ, вызванную лигандами АЬ рецептора. Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали действие ингибитора АЬ рецептора - а-нф на активацию ЫР-кВ под действием БП в клетках гепатомы НерС2. а-нф увеличивал активность ЫР-кВ с 2.5 до 5.1 раз, что свидетельствует о том, что АЬ рецептор действительно припятствует активации ЫР-кВ.

Таблица 5 Активация транскрипционного фактора ДТ-кй при действии канцерогенного БП и а-нафтафлавона в метках гепатомы ИерС2 в среде с низким содержанием сыворотки

Вещество Степень изменения ЫР-кВ по отношению к контролю

БП(5 мкг/мл) 2.5+ 0.1

БП(5 мкг/мл)+ а-нф(25 мнкромоль) 5.1+ 0.2

а-нф(25 микромоль) 1.3+0.1

4. Определение активности ^-кВ по экспрессии мРНК 1кВ.

Активированный ЫБ-кВ вызывает транскрипцию различных генов, в том числе и гена 1кВ. Чтобы проверить, что наблюдаемая активация при трансфецировании гена МБ-кВ при действии лигандов АЬ рецептора вызывает транскрипцию зависимых от него генов мы исследовали экспрессию гена 1кВ под действием БП. Как видно из рис 6 и 7 под действием БП происходит увеличение экспрессии гена 1кВ в клетках гепатомы 27 и Нер02, сопоставимое с наблюдаемым эффектом в опытах по трансфекции. В пролиферирующих клетках гепатомы 27 и Нер02 эффект БП ниже чем в покоящихся клетках, однако уровень мРНК 1кВ остается выше, чем в контрольных клетках. Таким образом, можно заключить, что усиление активности КФ-кВ, определяемое методом трансфекции, происходит и в экспериментах с определением экспрессии мРНК 1кВ.

Рис.6 Экспрессии 1кЬ о культуре клеток гепатомы Г-27 при действий оензо/а/пирена (5мкг/мл)

мРНК (3-актин

МРНК 1кВ 4 3 2 1

трек I - клетки культивируемые в стандартных условиях, трек 2- клетки культивируемые в стандартных условиях в присутствии БП, трек 3 - клетки находящиеся в состоянии покоя, трек 4 - клетки находящиеся в состоянии покоя в присутствии БП

Рис.7 Экспрессия мРНК йРОН и /АЬ а культуре клеток НерС2 при действии 6ензо/а/пирена(5мкг/мл)

мРНК бРЭН

)

мРНК 1кВ 4 3 2 1

трек I - клетки, культивируемые в стандартных условиях, трек 2- клетки, культивируемые в стандартных условиях в присутствии ПА У,трек 3 - клетки, находящиеся в состоянии покоя, трек 4 - клетки, находящиеся в состоянии покоя в присутствии ПА У

Вещество Состояние меток Значение относительно контроля

вп 0.5°/осыворо1пкч 3.7

БП 10% сыворотки и

Название вещества Состояние клеток Значение - относительно контроля

БП 0.5%сыворотки 2.01

БП 10%сыворотки 1.06

5.Определение экспрессии мРНК Ah-рецептора и ARNT в клетках гепатомы HepG2 в среде с 0.5% и 10% содержанием сыворотки.

Более эффективная стимуляция активности NF-kB в клетках гепатомы

HepG2 в условиях с низким содержанием сыворотки могло быть связано с различным уровнем экспрессии Ah рецептора и (или) ARNT. Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали уровень экспрессии мРНК Ah-рецептора и ARNT в клетках, культивируемых с нормальным содержанием сыворотки и в условиях с низким содержанием сыворотки. Как видно из рис 10, в условиях культивирования с нормальным содержанием сыворотки, уровень мРНК Ah-рецептора значительно выше, чем в среде с 0,5% сыворотки, в то же время уровень мРНК ARNT не зависит от уровня сыворотки в среде.

И tie 10 Экспрессия мРНК Ah -рецептора u ARNT о кэетках гепатомы НерС2 о присутствии 10% сыворотки и 0.5% сыворотки Ah-рецептор ARNT

И --

Ah рецептор ARNT

GPDH ' GPDH 12 12

1 трек - клетки с нормальным содержанием сыворотки(10%)

2 трек - клетки с низким содержанием(0.5%) сыворотки

Таким образом более эффективная стимуляция NF-kB под действием лигандов Ah рецептора в клетках гепатомы 27 и HepG2 связанна с уменьшением экспрессии Ah рецептора.

6.Определение пролиферации клеток HepG2 в условиях ингибирования экспрессии Ah рецептора и ARNT. Далее мы исследовали роль Ah рецептора и белка ARNT в регуляции пролиферации при действии БП в клетках HepG2. С этой целью клетки HepG2 подвергались воздействию siRNA для генов Ah рецептора и ARNT. В качестве контроля использовали siRNA случайных последовательностей (scramble). При проверке функционирования siRNA было показано, что siRNA для генов Ah рецептора

уменьшает уровен мРНК для Ah рецептора, a siRNA для ARNT - ARNT (рис.11)

Рис. i I Определение л/РНК Ah - рецептора (А) и ARNT (Б) а метках гематомы HepG2 при трансфекции соотает сшаую н/л si РНК

А Б

L .ГГ" Í'íf Ah-рецептор ARNT

L * Г". GPDH U^zIi^iáSi GPDH

12 3 12 3

1-siAhR 1 - SiARNT

2 - siScramble 2 - siScnimble

3 - Контроль 3 - Контроль

Из рис.12 видно, что трансфекция siRNA для генов Ah рецептора уменьшает скорость пролиферации клеток HepG2 по сравнению с трансфекцией scramble. В то же время видно, что эффект от трансфекции siRNA для ARNT никак не влияет на скорость пролиферации.

Рис 12 Пролиферация в клетках гепитомы HcpG2 при трансфекции siPHK Ah рецептора или ARNT а среде с 10%

сыворотки

350000

300000 —ЭБ—1

о о с 250000 200000 -S-]

ф с; о 150000 100000 50000

1 3 4

1.Кол-во клеток через 48ч, культивирования

2.Кол-во клеток через 4дч. культивирования с трансфекцией гена scramble

3.Коп-ао клеток через 48ч культивирования с трансфекцией si РНК Ah рецептора

4.Кол-во клеток через 48ч. культивирования с трансфекцией si РНК ARNT

* - Р<0,05 по отношению к 2

Действие БП на клетки, трансфецированные siRNA для Ah рецептора, показало, что стимуляция пролиферации значительно выше (примерно в 1,5 раза) при «отключении» Ah рецептора, чем при «включенном» Ah рецепторе. «Отключение» ARNT никак не влияет на стимуляции пролиферации, вызванную БП. (рис.13)

put 13 Пролиферация tí клетках гешшюмы HepG2 при трапсфекции siPHKAli рецептора или ARNT а среде с 10% сыворотки иод дейстане Eil(5 мкг/мл)

1,6

О

i 1.4

D 7 1,2

с

о с 1 '

с ш § е о.«

О 1 о,б

Е

5 0.4

о

Ч 0,2

с

* 0

1 Степень увеличения пролиферации под действием БП в клетках с трансфекцией siPHK scramble

2 Степень увеличении пролиферации под действием БП в клетках с трансфекцией гене siPHK Ah рецептора

3 Степень увеличения пролиферации под действием БП в клетках с трансфекцией гена SiPHK ARNT

Важно заметить, что ингибирующий эффект Ah-рецептора на стимуляцию пролиферации, вызванную ПАУ, не обусловлен образованием комплекса между Ah-рецептором и белком ARNT, поскольку трансфекция клеток siRNA ARNT не влияет на скорость пролиферации ни конститутивную, ни под действием лигандов Ah-рецептора.

Таким образом, можно заключить, что Ah рецептор принимает участие в передаче митотического сигнала и уменьшение его экспрессии вызывает замедление скорости пролиферации. В то же время при стимуляции пролиферации, вызванной БП, наблюдаемое усиление пролиферации в клетках обработанных siPHK Ah рецептора, свидетельствовует о том, что в этом случае Ah рецептор выступает как ингибитор передачи стимулирующего пролиферацию сигнала. 7.Клетки рака шейки матки Hela и трансформированные эмбриональные фибробласты (CL-1). Для того, чтобы выяснить являются ли полученные результаты по стимуляции пролиферации и активации NF-kB лигандами Ah-рецептора универсальными для всех типов клеток или ограничиваются только клетками гепатом мы исследовали действия канцерогенных ПАУ - БП и MX а таже в-НФ, наиболее эффективных соединений на модели гепатом, на пролиферацию и активацию транскрипционного фактора NF-kB в клетках трансформированных фибробластов(С1_-1) и клетках рака шейки матки человека HeLa. Эти типы клеток экспрессируют как Ah рецептор, так и изоформы цитохрома Р450.

18

7.1 Определение пролиферации в НеЬа и С1-1. Как видно из рис 14А в

клетках НеЬа со стандартным уровнем сыворотки в среде на первые сутки культивирования наблюдается значительное ускорение пролиферации под действием (3-НФ по сравнению с контролем, БП и МХ также усиливают пролиферативную активность клеток, но в меньшей степени, чем при действии (3-НФ. На вторые сутки культивирования в контроле происходит примерное удвоение числа клеток по сравнению с первыми сутками, а при действии БП, МХ и [3-НФ наблюдается замедление пролиферации по сравнению с первыми сутками.

В среде с низким содержанием (рис.МБ) сыворотки в клетках НеЬа в первые сутки культивирования происходит значительное увеличение количества клеток, как в контроле, так и в клетках, обработанных лигандами АЬ-рецептора. Наиболее эффективным стимулятором пролиферации является (3-НФ, в меньшей степени пролиферативной активностью обладает МХ, а БП практически не увеличивает пролиферацию по сравнению с контролем. На вторые сутки инкубации скорость пролиферации резко падает во всех пробах по сравнению с первыми сутками. Наибольший пролиферативный эффект сохраняет (3-НФ, а эффекты БП и МХ достоверно не отличаются от контрольного уровня.

Рис. 14 Пролиферация а Не1и при'деистоии различных канцерогенов а среде с 10% содержанием сыворотки (А) и вереде с содержанием сыворотки 0,5%(Б)

А

10000000 9000000 * 8000000 | 7000000

I 6000000

| 5000000 I 4000000 | 3000000 * 2000000 1000000

® Часов

о

I Е

2500000 2000000 1500000 1000000

В клетках СЬ-1 на первые сутки культивирования в среде с 10% сывороткой (рис. 15 А) количество клеток под действием всех изучаемых веществ увеличивается примерно в 1,6-1,8 раза по отношению к контролю. На вторые сутки культивирования наступает выраженный токсический эффект в пробах, где добавлялись БП и МХ. Количество клеток в пробах с (3-НФ также уменьшалось, но не в значительной степени.

В среде с содержанием сыворотки 0,5% (рис.15Б) скорость роста клеток была значительно ниже, чем в среде с содержанием сыворотки 10%. На первые сутки культивирования количество клеток в контроле и при действии БП и МХ было примерно одинаково. На вторые сутки культивирования МХ и Р-НФ увеличивали количество клеток по отношению к контролю, а БП незначительно тормозил рост клеток по отношению к контролю.

Рис. 15 Пролиферация в СТ.-/ при действии различных канцерогенов в среде с 10% сывороткой (А) и в среде с низким содержанием сыворотки(0.5%)(Б)

А

Г

12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 -

-..... д

—•— БП

// -•—МХ

// / —4— БНФ

/// —*— Контроль

0 48

2500000 . 2000000 2 1500000 \ 1000000 1 500000

I о

I

10 48 <

В клетках CL-1 и Hela в среде с сывороткой падение скорости пролиферации на вторые сутки культивирования под действием изучаемых веществ видимо связано с тем, что в этих клетках присутствуют изоформы цитохрома Р450, которые метаболизируют ПАУ с образованием активных метаболитов, вызывающих токсический эффект. Наиболее выражен токсический эффект в клетках С1-1, что связано видимо с высоким уровнем активнеости изоформ цитохрома Р450. В клетках, культивируемых с низким содержанием сыворотки, уровень Ah рецептора снижен и соответственно ниже уровень экспрессии изоформ цитохрома Р450 и менее выражен токсический эффект. Таким образом, способность стимулировать пролиферацию при действии ПАУ и (3-НФ наблюдалась в различных типах клеток. 7.2 Определение активности NF-kB в Hela и CL-1. Далее мы исследовали действие (3-НФ, БП и МХ на активацию транскрипционного фактора NF-kB в этих культурах. Как видно из табл. 6 и 7 в среде с низким содержанием сыворотки в обоих типах культур стимулирующий эффект изучаемых веществ был более выражен, чем в условиях со стандартным содержанием сыворотки. Видно, что нет корреляции в стимуляции активности транскрипционного фактора NF-kB и стимуляции пролиферации при действии изучаемых веществ. Наиболее эффективный стимулятор пролиферации - (З-НФ активировал NF-kB менее эффективно, чем БП и МХ. Стимуляция NF-kB в клетках Hela была несколько выше, чем в клетках С1-1

и сопоставима с уровнем, определяемым в клетках Hep G2, но ниже, чем в клетках гепатомы 27.

'Габлица 6. Трансфекция NF-кВо культуре Hela с дальнейшим воздействием различных канцерогенов в среде с

Вещество Степень изменения NF-кВ по отношению к контролю

Среда с 10% Среда с 0,5%

содержанием содержанием

сыворотки сыворотки

БП(5мкг/мл) 2.6 +0.1 3.9+0.1

|3-нф(5мкт/мл) 2.0+0.1 2.3+0.2

МХ(5мкг/мл) 2.6+0.2 3.3+0.1

Таблица 7. Трансфекция ,\1~-кВв культуре Cl-l с дальнейшим воздействием различных канцерогенов в среде с нормальным и hujkum содержанием сыворотки.

Вещество Степень изменения NF-кВ по отношению к контролю

Среда с 10% Среда с 0,5%

содержанием содержанием

сыворотки сыворотки

БП(5мкг/мл) 2.1+0.1 2.9+0.06

Р-нф(5мкг/мл) 1.8+0.08 2.0+0.2

МХ(5мкг/мл) 2.2+0.1 3.2+0.2

Активация транскрипционного фактора NF-кВ как в клетках гепатом так и в трансформированных фибробластах и клетках Hela более выражена под действием изучаемых лигандов Ah-рецептора в среде с низким содержанием сыворотки.

8.Изучение влияние канцерогенных ПАУ на функционирование межклеточных щелевых контактактов в культуре клеток CL-1. Как

говорилось ранее, еще одним необходимым фактором опухолевой промоции является нарушение межклеточных щелевых контактов

Ранее в нашей лаборатории было показано ингибирование межклеточных щелевых контактов при действии БП и ряда других канцерогенных ПАУ как в клетках гепатомы 27, так и в клетках гепатомы HepG2. Поскольку МЩК нарушаются в одинаковой степени в клетках гепатомы 27 и HepG2, можно сделать вывод о том, что это действие канцерогенов не связано с активацией Ah-рецептора. Было показано, что наиболее эффективным ингибитором

является БП, блокирующие МЩК более чем на 70% уже через один час воздействия. Другие ПАУ вызывали эффект только через сутки экспозиции, а Р-НФ и хлорированные углеводороды не обладали способностью ингибировать МЩК ни в клетках гепатомы 27 ни в клетках гепатомы Нер

Чтобы выяснить, реализуется ли эффект ингибирования МЩК канцерогенами - лигандами АЬ рецептора только в клетках гепатом или на других клеточных моделях мы исследовали действие БП и МХ на клетках СЬ-1.

Рис. 16 Действие МХ(А) и БП(Б) на проницаемость ЩК для Люцифера желтого о культуре трансформированных фибробластов С1--1

Концентрация МХ и БП - 5 мкг/мл. (А, Б) контрольная культура; (В. Г) время инкубации с ПА У— / ч.; (Д. Е) время инкубации 24 ч. Показаны фазово-контрастные (А, В, Д) и соответствующие им флуоресцентные (Б. Г, Е) изображения.

Крестиком указана клетка, в которую введен краситель

На рис. 16 приведены микрофотографии клеток, характеризующие перетекание красителя через МЩК как в контрольных клетках, так и клетках, подвергнутых воздействию БП. В контрольных клетках МЩК функционируют достаточно эффективно, и введение красителя в клетку окрашивает 39+9 рядом расположенных клеток. Добавление БП уже через

№ Вещества в Время действия

концентрации 1 час 24 часа

5 мкг/мл. уровень межклеточной

связи

1 БП(5м кг/мл) 10,3 2,5

2 МХ(5мкг/мл) 75 57.2

час экспозиции на 90% снижал уровень перетекания ¡<расителя в соседние клетки. При суточной экспозиции БП практически полностью предотвращал перетекание БП в соседние клетки. Эффект МХ был значительно слабее: через час экспозиции количество окрашенных клеток составляло 75% от контроля, а через сутки-57%.. Таким образом, полученные результаты полностью совпадают с эффектами, наблюдаемыми для клеток гепатом 27 и Нер в2: БП эффективно блокировал перетекание красителя уже через после введения вещества, а МХ (наиболее эффективный ингибитор МЩК после БП) вызывал ингибирование в значительно меньшей степени даже при 24 часовой экспозиции.

Заключение

Из сравнения действия лигандов АЬ-рецептора на клетки, экспрессирующих и неэкспрессирующих АЬ рецептор видно, что активация пролиферации и активация транскрипционного фактора ЫР-кВпри действии канцерогенных ПАУ и (3-НФ более выражена в клетках, в которых АЬ-рецептор не экспрессируется (гепатома 27). На основании этих данных и предыдущих исследований, в которых продемонстрировано, что лиганды АЬ-рецептора вызвают эффекты на клеточные функции независимо от АЬ-рецептора можно предположить, что эпигенетические эффекты лигандов АЬ-рецептора не ограничиваются только активацией АЬ-рецептора. Видимо существуют в клетке другие объекты воздействия соединений типа ПАУ и нафтофлавонов, взаимодействие с которыми вызывают различные изменения в функционировании клеток.

О природе этих факторов пока нет данных. На рубеже 1990-2000 гг. различными исследовательскими группами было показано, что в цитозоле клеток наравне с АЬ-рецептором присутствует некий белок с седиментационной характеристикой 4Б, с которым связываются в не метаболизированной форме канцерогенные ПАУ, (3-НФ, но не хлорированные лиганды АЬ-рецептора (В1аЬа Ь е1 а1, 2002). Функции этого белка неизвестны. Возможно связывание с 48 белком обуславливает пролиферативный эффект ПАУ и (3-НФ. Эффект

ингибирования МЩК при действии ПАУ реализуются по другому механизму, поскольку Р-НФ не влияет на функции МЩК.

На основании нашей работы можно сказать, что существуют по крайней мере 2 фактора, помимо АЬ-рецептора, взаимодействие с которыми вызывает изменения в функционировании клеток. Один из них, ответственный за активацию пролиферации и ЫР-кВ. Активность или экспрессия этого фактора зависит от уровня сыворотки: при понижении уровня мы наблюдаем усиление действия канцерогенных ПАУ и Р-НФ. Взаимодействие с другим фактором связано с ингибированием МЩК.

С точки зрения опухоль-промоторного эффекта взаимодействие ПАУ с неизвестными акцепторами возможно не менее важно, чем взаимодействие с АЬ-рецептором. На примере данной работы и других исследований, о которых было сказано выше, показано, что стимуляция пролиферации, активация антиапоптического фактора ЫР-кВ, блокирование МЩК, т.е. изменение тех клеточных функций, которые связаны с промоцией, может осуществляться лигандами АЪ-рецептора независимо от него. На основании данного исследования мы можем предположить, что уровень экспрессии (или активность) этого фактора возрастает в условиях содержания клеток с низким уровнем сыворотки, поскольку в клетках гепатомы 27 стимуляция пролиферации и активность №-кВ под действием канцерогенных ПАУ и Р-НФ усиливается.

В процессе канцерогенеза экспрессия дифференцировочных факторов, к которым можно отнести и АЬ-рецептор, как правило, уменьшается. В некоторых опухолях уровень экспрессии АЬ-рецептора снижен по сравнению с уровнем экспрессии в гомологичной нормальной ткани (Ьесигеиг V е! а1, 2005) или экспрессируется функционально неполноценный белок (Ба! К е! а1, 2001). Если предположить, что снижение экспрессии А1>рецептора происходит на ранних стадиях канцерогенеза, то на стадии опухолевой промоции при действии ПАУ важную роль играет неизвестный фактор(ы), взаимодействие с которым(и) приводит к эффектам связанным с промоцией.

выводы

1. Лиганды Ah-рецептора - канцерогенные ПАУ и ß-НФ - стимулируют пролиферацию клеток по ERK1/2 зависимому пути в клетках гепатом, экспрессирующих и не экспрессирующих Ah-рецептор.

2. Канцерогенные ПАУ и ß-НФ активируют NF-кВ и стимулируют пролиферацию более эффективно в клетках, находящихся в состоянии покоя, независимо от экспрессии Ah-рецептора.

3. Наличие в клетках экспрессии Ah-рецептора ослабляет активацию NF-кВ при действии канцерогенных ПАУ.

4. Нахождение клеток в состоянии покоя (содержание сыворотки 0,5% в среде культивирования) уменьшает экспрессию мРНК Ah- рецептора и не влияет на экспрессию мРНК ARNT в клетках гепатомы HepG2

5. Уменьшение экспрессии Ah-рецептора увеличивает пролиферацию при действии ПАУ в клетках гепатомы HepG2

6. Канцерогенные ПАУ и ß-нф вызывают стимуляцию пролиферации, блокирование МЩК и активацию NF-кВ по независимому от Ah-рецептору пути.

7. Нарушение МЩК и влияние на пролиферацию и на активность NF-kB при действии лигандов Ah- рецептора происходят по независимым механизмам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волков М.С. Активация транскрипционного фактора nf-kb в клетках гепатом под действии канцерогенных полициклических ароматических углеводородов/ Волков М.С., Кобляков В.А // Цитология -2011-№53, выпуск 5-с. 418-422

2. Волков М.С. Независмая от Ah рецептора стимуляция пролиферации культуры клеток гепатомы 27 полициклическими ароматическими углеводородами/ Волков М.С., Кобляков В.А. Болотина H.A., Евтеев В.А. // Биохимия. - 2012- №77, вып. 2- с. 248 - 255

3. Волков М.С. Ah-рецепторзависимые и Ah-рецепторнезависимые эффекты лигандов Ah-рецептора/. Волков М.С., Кобляков В.А., Евтеев В.А., Соломатина Н.А //Цитология,- 2010-№52 вып. 8- с.661-662

4. Волков М.С. Новый механизм опухоль-промоторного действия полициклических ароматических углеводородов, независимый от экспрессии Ah рецептора/ Волков М.С., Болотина H.A., Евтеев В.А., Кобляков В.А.// Вопросы онкологии,- 2011-№57-с. 36-37

5. Кобляков В.А. Роль орфановых рецепторов, регулирующих экспрессию изоформ цитохрома р450, в процессе канцерогенеза/ Кобляков В.А., Евтеев В.А., Щербак Н.П., Колдин И.И., Волков М.С., Болотина Н.А//Вопросы онкологии.-2008-№54 вып. 2-е. 12

Список сокращений

ПАУ - полицикличечкие ароматические углеводороды

БП - бензо/а/пирен,

Б(е)П - бензо/е/пирен

MX - 3-метилхолантрен

Р-НФ - р нафтофлавон

ДМБА - 7,12 - диметилбензантрацен

1KB - ингибиторная субъединица NF-kB, экспрессируемая при активации NF-kB

МЩК - межклеточные щелевые контакты NF-kB- ядерный транскрипционный фактор кВ

Ah-рецептор - Aryl hydrocarbon receptor (Рецептор, являющийся сенсором попадания в клетку молекул ксенобиотиков)

ARNT - Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocaior(BenoK, образующий комплекс с Ah-рецептором и обеспечивающий его прохождение в ядро клетки)

GPDH - глицерол-3-фосфат дегидрогеназа

АР-1 - activated protein 1.Транскрипционный фактор, являющийся димером, содержащим по одному онкобелку от представителей семейства Jun и Fos. а-НФ - а нафтофлавон

Подписано в печать 27 •03 •12 . Формат 60x84/16. Бумага офисная «Буе^Сору». Тираж 100 экз. Заказ № 3 в в Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

2012094126

2012094126