Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Диагностическая и прогностическая значимость генетических изменений коннексина-26 при хирургическом лечении рака желудка

На правах рукописи

МОЗГОВОЙ Евгений Дмитриевич

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КОННЕКСИНА-26 ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ РАКА ЖЕЛУДКА

14 00 27 - Хирургия 03 00 15 - Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4 \

Санкт-Петербург 2008

003163630

Работа выполнена на кафедре факультетской хирургии и в отделе молекулярно-генетических технологий научно-исследовательского центра Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Седов Валерий Михайлович доктор медицинских наук Дубина Михаил Владимирович Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Майстренко Николай Анатольевич

доктор медицинских наук Шавловский Михаил Михайлович Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Защита, состоится «_»_ 2008 г в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208 090 05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад И П Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации (187089, Санкт-Петербург, ул Льва Толстого, 6/8)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад И П Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации и на сайге www spmu runnet ru

Автореферат разослан «_»

200 г

Ученый секретарь диссертационного Совета

МЯСНИКОВА

д м н, доцент

Марина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения рак желудка (РЖ) представляет собой одно их самых распространенных онкологических заболеваний и занимает среди них второе место по частоте возникновения и смертности По данным различных авторов на начало нового тысячелетия уровень заболеваемости составил 880 ООО случаев в год, а уровень смертности около 650 ООО случаев в год [Crew К D, Neugut А1, 2006] Частота возникновения рака желудка колеблется от 114,7/100 000 в год среди мужского населения в странах с высоким уровнем заболеваемости (Япония) до 3,1/100 000 среди белых женщин в странах с низким уровнем заболеваемости (США) [Мерабишвили В М, 2001] Согласно современным исследованиям в России этот показатель составляет 32,8 и 14,3 на 100 000 населения в год с уровнем смертности 29,9 и 12,5 на 100 000 населения в год среди мужчин и женщин, соответственно [Аксель Е М и соавт, 2001, Crew К D, Neugut А1, 2006]

Высокие показатели смертности от данного заболевания в нашей стране связаны с поздним выявлением заболевания уже на более прогрессивных стадиях, что определяет актуальность диагностики патологии на ранней стадии Известно, что в Японии, несмотря на самую высокую заболеваемость раком желудка, после введения национальной программы по обязательной фиброгастродуоденоскопии для скрининга заболевания отмечено значительное снижение смертности от рака желудка [Базин И С , Гарин А М , 2001, Matsuzaka М и соавт, 2007]

В настоящее время «золотым стандартом» лечения больных раком желудка остается хирургическое вмешательство Основными требованиями, выдвигаемыми современными хирургическими критериями успеха лечения, является максимально раннее выявление опухоли, в том числе и предрасположенности к ее возникновению, для формирования групп повышенного риска заболевания, а также создание алгоритмов прогноза течения опухолевого процесса для выбора наиболее оптимальной тактики лечения каждого конкретного больного [Anderson С и соавт, 2006]

Показано, что нарушения межклеточной адгезии являются одними из характерных изменений клеточных структур при данном заболевании, являющихся т н «признаками рака» [Hanahan D , Weinberg R А, 2000] Еще одним

из таких признаков озлокачествления является приобретение опухолевой клеткой нечувствительности к воздействию сигнальных молекул (промотеров апоптоза, блокаторов клеточного цикла) из соседних клеток [Уатазак] Н с соавт , 1999, ТгоБко 1Е и соавт , 2004] В норме данное межклеточное взаимодействие осуществляется с помощью белков межклеточных щечепых контактов коннексинов и обладает опухоль-суппрессирующей функцией [Круговских В А , 2005]

Экспрессия белков семейства коннексинов в желудочно-кишечном тракте представлена коннексинами 26, 32 и 43 Ранее было показано нарушение структуры генов коннексинов 43 и 32 при раке желудочно-кишечного тракта [Дубина В М, 2004, Крутовских В А, 2005] Однако до настоящего время исследований мутационных изменений гена Сх26, кодирующего коннексин-26 при раке желудка не проводилось

Цель работы.

Определить роль мутаций гена белка коннексина-26 при возникновении рака желудка и его клиническом течении

Задачи исследования.

1 Провести хирургическое лечение больных раком желудка с последующим гистологическим исследованием опухолевой ткани

2 Провести иммуногистохимическое исследование опухолевой ткани с целью выявления внутриклеточной локализации белка коннексина-26

3 Провести молекулярно-генетический анализ гена Сх26 у больных раком желудка и у «онкологически здоровых» лиц

4 Оценить диагностическое и прогностическое значение мутаций гена Сх26 у больных раком желудка

5 Исследовать зависимость клинического течения рака желудка от выявленных мутаций гена Сх26

Научная новизна.

Впервые проведено исследование структуры гена Сх26 при раке желудка В 18,2% случаев рака желудка выявлено гетерозиготное носительство мутаций гена Сх26 (35с5еЮ, У271, М34Т, У371, Б83С, 1Ш7Н) Впервые показано, что 4

гетерозиготное носительство мутаций гена Сх26 является фактором риска возникновения рака желудка

Впервые выявлена связь структурных изменений гена коннексина-26 с инвазивной способностью опухоли В частности, показано, что при наличии структурных изменений гена Сх26 опухоль инвазирует стенку жеаудка в меньшей степени, чем при носительстве дикого типа Сх26

Впервые выявлена ассоциация мутационных изменений гена Сх2б с изъязвлением опухолевой ткани при инфильтративном типе опухолевого роста Наличие мутации в гене Сх2б предрасполагает к более частому возникновению острой хирургической патологии желудочному кровотечению и перфорации стенки желудка.

Впервые получены клинические данные, косвенно подтверждающие гипотезу о том, что основной функцией коннексина-26 является трофическая функция, по обеспечению клеток питательными веществами и/или энергетическими молекулами (глюкозой, АТФ)

Практическая значимость работы.

Полученные данные могут быть использованы как в практической деятельности любого хирургического департамента, так и в научно-исследовательском и учебном процессах

Результаты работы могут быть использованы для создания групп повышенного риска заболеваемости раком желудка и введения специальных протоколов наблюдения за данными больными В частности, можно рекомендовать лицам из группы риска регулярное проведение фиброгастро-дуоденоскопии с прицельной биопсией подозрительных участков, а также проведение гемостатической терапии на дооперационноч этапе Данные назначения показаны в виду того, что при наличии мутации кодирующей последовательности гена Сх26 в опухолевой ткани наблюдаются изъязвление, которое может приводить к желудочному кровотечению и перфорации стенки органа

Полученные результаты могут быть применены при хирургическом лечении, как прогностический критерий клинического течения заболевания В частности с учетом того, что носительство мутации гена Сх26 (в сравнении с носительством его дикого типа) предрасполагает к сниженной способности опухоли к инвазии,

возможно в спорных случаях выбора объема тактики оперативного лечения и/или при высоком риске операции избирать меньший объем хирургического вмешательства

Включение исследования структурных изменений гена Сх2б в диагностический протокол вместе с другими прогностическими факторами генетических повреждений (таких как Е-кадгерин, р-катенин и пр) позволит оценить основные патологические процессы, обусловливающие основные характеристики опухолевой ткани и разработать алюритм специфической таргетной терапии этих опухолей

Основные положения выносимые на защиту.

1 Белок межклеточных щелевых контактов коннексин-26 вовлечен в процесс онкологического перерождения клеток слизистой оболочки желудка

2 Цитоплазматическое и мембранное расположение белка коннексина-26 в опухолевых клетках при раке желудка всегда нарушено

3 Мутационные повреждения гена Сх2б являются предрасполагающим фактором для развития рака желудка

4 Мутационные повреждения Сх26 являются благоприятным прогностическим фактором клинического течения рака желудка

Личный вклад автора в проведение исследования.

Автор лично участвовал во всех хирургических вмешательствах на желудке у больных опытной группы Автором проводились все экспериментальные и клинические исследования, планирование, формирование рабочих гипотез, разработка учетных статистических документов, обобщение и анализ результатов

Апробация работы.

Основные результаты, изложенные в работе, были представлены на 1Х-ом Всероссийском слете студентов, аспирантов и молодых ученых - лауреатов конкурса «Ползуновские гранты» (Сочи, Россия, 6-10 сентября 2004 г), 1-ой Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, Россия, 29-31 мая, 2005 г), конференции молодых ученых

«Современные методы диагностики и лечения заболеваний в клинике и эксперименте» (Москва, Россия, 2005 г), Международном симпозиуме по щелевым контактам (Вистлер, Канада, 2005 г), Конференции МАЛО «Актуальные вопросы абдоминальной онкологии» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 г )

Работа была поддержана грантом Международного Агентства по Исследованию Рака (МАИР, г Лион, Франция) и грантом Центра инновационных технологий «Фонд ТВН» (г СПб, Россия) По теме диссертации опубликовано 6 научных работ

Внедрение результатов работы.

Научные и практические рекомендации внедрены в лечебный, научный и учебный процессы на кафедре факультетской хирургии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И П Павлова» ФАЗ и СР РФ (Санкт-Петербург, ул Льва Толстого, 6/8)

Полученные результаты были также внедрены в научный процесс в отделе Молекулярно-генетических технологий Научно-исследовательского центра Санкт-Петербургского Государственного медицинского Университета имени академика И П Павлова (Санкт-Петербург, ул Льва Толстого, 6/8)

Связь с планом научных исследований.

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований СПбГМУ им акад И П Павлова в рамках отраслевой программы «Разработка и совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения хирургических заболеваний с использованием новых медицинских технологий» Договор N° 031/081/001 от 08 08 2001

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4-ех глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, в котором приведены 214 источников, в том числе 45 работ на русском языке и 169 -на иностранных языках Работа иллюстрирована 22 таблицами и 25 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Проведено хирургическое лечение 55 больных раком желудка в клинике факультетской хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им акад И П Павлова Контрольную группу составили 62 пациента с неонкологическими заболеваниями (ишемическая болезнь сердца, желчнокаменная болезнь, варикозная болезнь вен нижних конечностей, грыжи и

др)

При проведении клинического обследования больных использовали стандартные лабораторные методы клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимия крови, а также инструментальные рентгенографическое исследование грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенографическое исследование желудка с двойным контрастированием, фиброэзофагогастродуоденоскопия с выполнением прицельной биопсии и последующим гистологическим исследованием, а также патоморфологическое и гистологическое исследование операционного материала Образцы ДНК были выделены из лейкоцитов периферической крови у больных опытной группы, а также у пациентов в контрольной группе Также у больных раком желудка ДНК была выделена из образцов опухолевой ткани

В целях выяснения наличия и распределения синтезируемого в слизистой оболочке желудка белка коннексина-26 проводили иммуногистохимическое окрашивание полученных образцов опухолевой ткани с помощью двойной иммуногистохимической метки Учет результатов проводили с помощью конфокального микроскопа Pascal 510 Zeiss laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)

Выделение ДНК из ядер лимфоцитов и из образцов опухолевой ткани проводили в соответствии с методикой, приведенной в руководстве GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit (Sigma, США) Для поиска структурных изменений гена Сх26 проведена ПЦР всего гена с последующим SSCP анализом Образцы с выявленными конфирмационными изменениями одноцепочечной ДНК были секвенированы на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3000

В исследовании были использованы пары олигонуклеотидов, синтезированные компанией Helix (г Санкт-Петербург, Россия) Последовательности использованных олигонуклеотидов приведены в таблице 1 8

Таблица 1

Олигонуклеотиды, использованные для амплификации гена Сх2б

Название олигонуклеотидов Последовательность Длина, н 0

Forward Cx26F 5'-CAAACCGCCCAGAGTAGAAG-3 ' 20

Reverse Cx26R 5 '-ССТС ATCCCTCTCATGCTGT-3 ' 20

Для проведения амплификации использованы следующие условия реакции предварительная денатурация - 94°С (5 мин), 40 циклов амплификации 94°С (1 мин) - денатурация, 62°С (1мин) - отжиг праймеров, 72°С (1мин) - элонгация, и заключительный синтез 72°С (3 мин) Продукты амплификации фрагментов оценивали по результатам электрофореза в 8% полиакриламидном геле Для последующего проведения ББСР анализа полученный ПЦР-продукт гена Сх26 инкубировали с рестриктазой Нт61 в течении 12-18 часов до полного расщепления всех цепочек ДНК кодирующей последовательности гена Сх26 на два неравных фрагмента (262 по и419по)

При секвенировании гена Сх2б был использован комплект олигонуклеотидов представленный в таблице 2

Таблица 2

Олигонуклеотиды использованные для секвенирования гена Сх26

Название олигонуклеотидов Последовательность Длина, н о

Forward Cx26sqF 5'-СТАССТССССАТСТСССАСА-3' 20

Reverse Cx26sqR 5 '-TGCTTGTGTAGGTCC АССАС-3 ' 20

Последовательность гена Сх26 дикого типа получена в банке нуклеотидных последовательностей «GeneBank» (www nebí nlmmh gov) Национальной Медицинской Библиотеки (г Балтимор, США) и Биоинформационного Центра «GenomeNet» (http //www genome шЛ Университета Киото (г Киото, Япония)

Результаты и их обсуждение

В группу 55 больных раком желудка, получавших хирургическое лечение, вошли 29 (52,7%) мужчин и 26 (47,3%) женщин Проведен анализ связи заболе-

ваемости раком желудка с возрастом больных. Возраст пациентов находился в пределах от 26 до 88 лет. При этом 53 больных (96,4%) были старше 40 лет. Распределение пациентов по полу и возрасту представлено на рис. 1.

Ряс. 1. Распределение больных основной группы по полу и возрасту.

Пик заболеваемости отмечен в возрастной категории 66 - 70 лет для мужчин и 70-80 лет, для женщин. Средний возраст больных раком желудка составил 63,9 ± 12,1 лет.

Распределение больных в зависимости от стадии опухоли и ее локализации представлено в таблице 3.

Таблица 3

Распределение больных по стадиям рака желудка

при разной локализации опухоли.___

Локализация опухоли Стадии рака Всего

1а 16 II Ша Шб IV

Кардиалыиый отдел - 1 1 1 2 6 11

Малая кривизна - 1 - 2 3 2 8

Большая кривизна - - 1 1 - 1 3

Тело желудка - 1 1 - 1 15 18

Выходной отдел - 3 - 1 3 б 13

Культя желудка - - - - - 2 2

Всего: % (0%) 6 (10,9%) 3 (5,4%) 5 (9,2%) 9 (16,4%) 32 (58,2%) 55 (100%)

В качестве радикальных операций (тип А) принимали вмешательства с полным удалением первичной опухоли и объемом лимфодиссекции Ш Объем операции расценивали как условно-радикальный (тип В), когда нельзя было гарантированно исключить возможности сохранения у больного микроочагов опухолевого роста, не проявляющихся на клиническом уровне Случаи, когда удалить весь объем опухолевой массы хирургическим путем не представлялось возможным, расценивали как циторедуктивные операции (тип С) Распределение больных, перенесших различные виды операций в зависимости от локализации опухоли, представлено в таблице 4

Из таблицы 4 видно, что наиболее часто в клинике выполняли условно-радикальные и циторедуктивные операции, частоты которых составили 30,9% и 27,3% соответственно.

Таблица 4

Характер типа оперативного вмешательства в зависимости

_от локализации опухоли в желудке__

Локализация Типы оперативных вмешательств Всего

Тип А Тип В Тип С Палл Экспл Отказ

Кардиальный отдел 2 4 1 2 - 2 11 (20%)

Малая кривизна 1 2 3 - 2 - 8 (14,5%)

Большая кривизна 1 1 1 - - - 3 (5,5%)

Тело желудка 1 4 б - 6 1 18 (32,7%)

Выходной отдел 3 4 4 1 1 - 13 (23,6%)

Культя желудка - 2 - - - - 2 (3,6%)

Всего 8 (14,5%) 17 (30,9%) 15 (27,3%) 3 (5.5%) 9 (16,4%) 3 (5,5%) 55 (100%)

При иммуногистохимическом исследовании белка коннексина-26 было выявлено его аномальное внутриклеточное расположение, что проявлялось либо чрезмерным синтезом с аномальным расположением в цитоплазме, либо полным отсутствием синтеза (рис 2), что подтверждает опубликованные ранее данные об эпигенетическом повреждении межклеточных щелевых контактов

Рис. 2. Иммуногистологическое окрашивание ткани рака желудка с двойной меткой (красный цвет - кератин-8, зеленый коннексин-26), увеличение *20. Слева: избыток синтеза коннексина, приводящий к «залеплению» клеточной цитоплазмы. Справа: нарушенный синтез коннексина.

В то же время, во время исследования было выявлено, что однозначный ответ на вопрос об экспрессии гена Сх26 и локализации белка коннексина-26 в опухоли дать достаточно сложно. Одна и та же опухоль довольно гетерогенна по своему строению и может содержать в себе как клетки с полным отсутствием коннексина, так и клетки синтезирующие коннексин-26 с различной степенью выраженности синтеза. Тем не менее, ни в одном исследованном нами препарате, полученном из опухолевой ткани, не было выявлено цитоплазматического и мембранного расположения коннексина-26, характерного для ткани нормальной слизистой желудка.

При исследовании кодирующей последовательности гена Сх2б мутационные изменения гена выявлены в образцах ДНК выделенных из лейкоцитов крови у 10 больных раком желудка из 55 обследованных человек (18,2%). Точно такие же изменения обнаружены и в образцах ДНК, выделенных из ткани опухоли. В 7,3% случаев было выявлено гетерозиготное наличие мутации М34Т, в 3,6% -гетерозиготное носительство мутации 35delG. Гетерозиготное носительство мутаций V27I, V37I, F83C, R127H было выявлено в 1,8% случаев, каждая. Частота выявленных мутаций представлена в таблице 5.

Как правило, степень нарушения экспрессии гена или функций, кодируемого им белка, зависит от функциональных характеристик мутаций. К тяжелым мутациям относят обычно делеции приводящие к сдвигу рамки считывания и, как следствие, - приводящие к появлению преждевременного стоп кодона. Такие

Таблица 5

Частота носительства различных вариантов мутационных изменений гена Сх26 в группе больных раком желудка

Вариант мутации Рак желудка (GC), п=55

35delG 2 (3,6%)

V27I 1 (1,8%)

М34Т 4 (7,3%)

V37I 1 (1,8%)

F83C 1 (1,8%)

R127H 1 (1,8%)

ВСЕГО 10(18,2%)

мутации, если они локализованы относительно близко к началу гена, как правило, приводят к синтезу укороченного, нестабильного белка, состоящего из небольшого числа аминокислот Так, например, делеция одного из шести гуанинов, находящихся в позициях 30-35 кодирующей области гена (35delG), приводит к появлению в 13 кодоне Сх26 гена стоп-кодона [Крутовских В А, 2005] По данным литературы, мутация 35deIG гена Сх26 встречается гомозиготном состоянии у больных наследственной претангвальной тугоухостью Мугации, приводящие к замене аминокислот в области первого трансмембранного домена белка, и вызывающие изменение его конформации, приводят к изменению пропускной способности щелевого контакта в целом, так как именно этот домен коннексина-26 принимает участие в формировании трансмембранного канала Мутации V27I, М34Т, V37I, выявленные нами в гетерозиготном состоянии с суммарной частотой 10,9% у больных рака желудка, относятся именно к этому типу мутаций

При анализе образцов ДНК в группе контроля не выявлено изменений в последовательности гена Сх26 Данные результаты свидетельствуют о том, что мутационные повреждения гена Сх26 можно рассматривать как фактор риска возникновения рака желудка (таблица 6) Рассчитанный коэффициент соотношения шансов показал, что риск развития рака желудка у носителей мутаций гена Сх26 увеличивается почти в 29 раз (OR=28,8, 95% CI 4,42-188)

При фиброэзофагогастродуоденоскопии все морфологические варианты строения опухоли были разделены по характеру роста опухоли экзофитный, эндофитный, экзофитный с изъязвлением, эндофитный с изъязвлением В образцах опухоли без изъязвления ткани мутации гена Сх26 были выявлены в 4,1% (1 из 24 случаев), в то время как в опухолях, где набчюдалось изъязвление ткани, частота

13

Таблица 6

Распределение по частоте носительства «дикого типа» и мутированного гена Сх26 у больных РЖ и в контрольной группе.

Носители «дикого типа» Сх2б Носители мутаций Сх26 Всего

Больные РЖ 45 (81,8%) 10 (18,2%)* 55

Контрольная группа 62 (100%) 0 (0%)* 62

Всего: 107 10 117

*-(р<0,001).

носительства мутаций гена Сх26 составила 33,3% (4 из 12 случаев). Данные представлены на рис. 3. Полученные отличия статистически значимы (р<0,05) и свидетельствуют о том, что наличие мутационных изменений кодирующей последовательности гена Сх2б при инфильтативном типе роста опухоли предрасполагает к повышению скорости ее распада.

: 95,8 %

66,7%

33,3%

4,2%

С изъязвлением опухоли Без изъязвления опухоли

Ц Дикий тип гена Сх26 П Наличие мутации гена Сх26

Рис. 3. Соотношение больных «с изъязвлением»/«без изъязвления» опухоли среди больных с мутацией гена Сх26 и носителей его «дикого типа» при инфильтративном типе роста.

В группе носителей мутации Сх2б при инфильтративном типе роста, у которых было выявлено изъязвление опухоли (по данным проведенной фибро-

гастродуоденоскопии) у 2 из 4 больных (50%) на момент поступления были выявлены признаки желудочного кровотечения (изъязвление опухоли под гематином, сгустки крови в просвете желудка). Все больные данной группы при поступлении в стационар жаловались на предшествующие эпизоды желудочно-кишечного кровотечения (жалобы на периодически появляющийся черный стул).

Также было проанализировано влияние мутационных изменений структуры гена Сх26 на инвазивную способность опухоли. Исследуемая группа больных была систематизирована по степени прорастания опухолью стенки желудка. Все возможные варианты инвазии опухоли были объединены в две большие группы: ограниченные стенкой желудка и распространяющиеся за пределы органа. Мутации гена Сх2б были выявлены в 7 (50%) опухолях ограниченных стенкой органа, то время как среди опухолей прорастающих за стенку органа мугации гена Сх26 были выявлены только в 3 (7,3%) случаях (р<0,005). Данные исследования свидетельствуют о том, что мутационные изменения гена Сх26 предрасполагают к снижению инвазивной способности опухоли в большинстве случаев заболевания раком желудка. Полученные результаты позволили сделать вывод, что изменение структуры гена Сх26 может быть связано со степенью инвазии опухолью стенки желудка.

50,0%

50,0%

92,7%

Ограниченные стенкой органа; (Т1+Т2)

1 Носители дикого типа гена Сх26

7,3 %

Прорастающие за стенку органа; (ТЗ+Т4)

□ Носители мутированного гена Сх26

Рис. 4. Распределение больных раком желудка по степени инвазивности опухоли у носителей дикого типа гена Сх2б и носителей мутированного гена Сх2б.

Таким образом, выявленные в работе мутационные повреждения гена Сх26 являются факторами более благоприятного клинического течения заболевания, позволяющими проводить более эффективное хирургическое лечение больных данной группы

При детальном анализе полученных обращает на себя внимание их определенная парадоксальность С одной стороны наличие гетерозиготной мутации гена Сх26 является фактором риска возникновения заболевания С другой - наличие гетерозиготной мутации гена Сх26 является благоприятным прогностическим фактором течения самого заболевания

Учитывая более благоприятную клиническую картину у больных раком желудка при наличии структурных изменений гена Сх26, была предложена гипотеза, что данные изменения могут быть не только наследственным предрасполагающим фактором к возникновению РЖ, но и фактором, обеспечивающим более благоприятное течение заболевания

По данным современной литературы, основной функцией коннексинов является обеспечение диффузного транспорта простых молекул и ионов, в том числе молекул энергетического обмена и факторов стимуляции клеточного роста [Дубина M В , 2004, Крутовских В А, 2005, Evans W H , Martin РЕМ, 2002, Trosko JE и соавт, 2004] Ранее в литературе неоднократно высказывались предположения о том, что наиболее вероятной функцией коннексина 26 является осуществление пассивного транспорта глюкозы между клетками Предположено, что изменение структуры гена Сх2б нарушает процесс межклеточного обмена, в том числе между нормальными и опухолевыми клетками Непосредственным следствием такого транспортного блока может быть недостаточное обеспечение опухолевой ткани энергетическими молекулами, в результате чего снижается скорость деления опухолевых клеток и прогрессирование опухоли в целом Данное предположение подтверждается результатами лабораторных исследований [Takata К, Hirano H, 1997, Gabriel HD и соавт, 1998] В частности, доказано, что у лабораторных мышей, нокаутных по гену Сх26, нарушен трансплацентарный транспорт глюкозы, вследствие чего эмбрионы погибали на 11 день развития

Вместе с тем, в некоторых случаях, независимо от наличия мутационных повреждений гена Сх26, отмечен более злокачественный рост опухолевой ткани, что, по-видимому, обусловлено наличием в клетках таких опухолей дополнительных факторов, обеспечивающих пролиферацию клеток 16

Например, известно, что клетка может получать энергетические молекулы необходимые для ее жизнедеятельности различными путями Одним из этих путей является адсорбция их из внеклеточной жидкости, куда они доставляются с током крови Таким образом, объем насыщения внеклеточной жидкости этими молекулами напрямую зависит от способности организма к образованию новых сосудов в быстрорастущей ткани В случае каждой конкретной опухоли одним из ключевых этапов ее прогрессии является приобретение ею способности к ангиогенезу, без которой она не способна поддерживать собственную жизнедеятельность в объеме большем, чем 2мм3 [Копнин Б П, 2002, Ьагйг В и соавт , 2006] Вероятно, в случае типичного роста опухолевой ткани при наличии у больного мутационного повреждения гена Сх2б, мы имеем дело с наличием у опухоли способности поддерживать свою жизнедеяте чьность иным способом, которым является либо модифицированная способность к неоангиогенезу, либо какой-то другой механизм остающийся пока неизвестным

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что наличие мутации в гене Сх26 является фактором, предрасполагающим к возникновению рака желудка В то же время присутствие мутации в гене Сх2б является прогностическим фактором более благоприятного клинического течения заболевания, в том числе сниженной инвазивной способности опухоли, что должно учитываться при выборе тактики и объема оперативного вмешательства

Выводы

1 Выводы и характер оперативного вмешательства при раке желудка и его прогноз должны учитывать результаты молекулярно-генетического анализа

2 При раке желудка цитоплазматическое и мембранное расположение белка коннексина-26, всегда нарушено независимо от гистологического типа опухоли

3 Частота мутационных изменений кодирующей последовательности гена Сх2б у больных раком желудка достоверно выше, чем у «онкологически здоровых» лиц Носительство мутаций кодирующей последовательности гена Сх2б является предрасполагающим фактором к возникновению рака желудка

4 Носительство кодирующем последовательности гена Сх26 является бтагоприятным прогностическим фактором клинического течения заболевания

5 При инфильтративном типе роста опухоли носительство мутации гена Сх26 может опосредовать осложнения клинического течения рака желудка в виде острого кровотечения из изъязвленных сосудов в опухолевой ткани и/или перфорации стенки органа

Практические рекомендации:

1 В случаях наличия у больного мутации в гене Сх26 и при спорном выборе тактики хирургического вмешательства можно рекомендовать избирать меньший объем оперативного вмешательства

2 При наличии у больного мутации в гене Сх2б при подготовке к оперативному лечению можно рекомендовать дополнительно назначать проведение системной гемостатической терапии

3 Полученные данные о диагностическом значении мутаций гена Сх26 в возникновении рака желудка могут быть использованы в наборе ранних диагностических методов выявления предрасположенности к данному заболеванию

4 Полученные данные о диагностическом значении мутаций гена Сх26 могут быть использованы для создания групп диспансеризации по раку желудка

5 Полученные данные о нарушении щелевого межклеточного взаимодействия при раке желудка могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в медицинских ВУЗах при изучении частной хирургии рака желудка

Список работ опубликованных по теме диссертации

1 Седов В М , Яицкий А Н, Мозговой Е Д, Волков Н М, Моисеенко Ф В , Дубина М В, Крутовских В А Клиническое значение носительства генетического полиморфизма коннексина-26 при раке желудка // Вестник хирургии им И И Грекова, 2007 - т 166, №6 - стр 11-14

2 Седов В М, Яицкий А Н, Данилов И Н, Мозговой Е Д, Дубина М В Исследование молекулярно-генетических механизмов развития рак желудка // Сборник научных трудов кафедры факультетской хирургии «Новые технологии в хирургии» Издательство СПбГМУ Санкт-Петербург, 2004 г Том 3, стр 199-206

3 Яицкий А Н , Мозговой Е Д Исследование генетического и эпигенетического повреждения белков коннексинов, как возможного специфического маркера при диагностике новообразований желудка // Магериалы 1Х-ого Всероссийского слета студентов, аспирантов и молодых ученых - лауреатов конкурса «Ползуновские гранты» - Сочи, 2004 - стр 105-109

4 Дубина М В , Васильев С В , Седов В М , Яицкий А Н , Попов Д Е, Мозговой Е Д , Волков Н М, Моисеенко В Ф , Крутовских В А Мутации генов коннексинов, как фактор предрасположенности и прогрессии рака // Материалы 1-ой Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» - СПб, 2005 - стр 18-19

5 Яицкий А Н, Мозговой Е Д, Моисеенко Ф В , Волков Н М Исследование механизмов повреждения белков щелевых контактов - коннексинов в новообразованиях желудка // Материалы научной конференции молодых ученых НИИ Хирургии им А В Вишневского - Москва, 2005 - стр 160-161

6 Dubina М V , Iaitckn А N , Mozgovoy Е, Moiseenko F , Volkov N and Krutovskikh V Heterozygous carriers of rare variants of gap junction gene connexin 26 (GJB2) are frequent among colon and stomach but not breast cancer patients // International Gap Junction Conference - Whistler, Canada, 2005 - P 147

Лицензия ИД № 00597 от 15 12 99 Подписано в печать 15 10 07 Уел печ л 1,25 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз Заказ 808/07 197022, Санкт-Петербург, ул Л Толстого 6-8 Издательство СПбГМУ

Актуальность проблемы.

Рак желудка (РЖ) по данным Всемирной Организации Здравоохранения представляет собой одно их самых распространенных онкологических заболеваний и занимает среди них второе место по частоте возникновения и смертности. По данным различных авторов на начало нового тысячелетия уровень заболеваемости составил 880.000 случаев в год, а уровень смертности около 650.000 в год [Crew K.D., Neugut A.I., 2006]. При этом частота возникновения рака желудка колеблется от 114,7/100.000 в год среди мужского населения в странах с высоким уровнем заболеваемости (Япония) до 3,1/100.000 среди белых женщин в странах с низким уровнем заболеваемости (США) [Мерабишвили В.М., 2001; Аксель Е.М. и соавт., 2001]. Согласно современным исследованиям в России этот показатель составляет 32,8 и 14,3 на 100.000 населения в год с уровнем смертности 29,9 и 12,5 на 100.000 населения в год среди мужчин и женщин, соответственно [Аксель Е.М. и соавт., 2001].

Высокие показатели смертности от рака желудка связаны с поздним выявлением заболевания уже на более прогрессивных стадиях, что определяет актуальность своевременной диагностики данного заболевания- на ранней стадии. Так в Японии, несмотря на самую высокую заболеваемость раком желудка, после введения национальной программы по обязательной фиброгастродуоденоскопии для скрининга рака желудка отмечено значительное снижение смертности от этого заболевания [Базин И.С., Гарин A.M. 2001; Crew K.D., Neugut A.I., 2006; MatsuzakaM., и соавт., 2007].

В настоящее время «золотым стандартом» лечения больных раком желудка- остается хирургическое вмешательство. Основными требованиями, выдвигаемыми современными хирургическими критериями для достижения успеха лечения является максимально раннее выявление опухоли, в том числе, и предрасположенности к ее возникновению, для формирования группы повышенного риска, а также создание алгоритмов прогноза течения опухолевого процесса для выбора наиболее оптимальной тактики лечения каждого конкретного больного. Наименее сложным в техническом исполнении и наиболее информативным на ранней стадии заболевания, является исследование носительства опухолевых маркеров. При этом, наиболее полно всем требованиям, выдвигаемым практической медициной, соответствуют молекулярно-генетические маркеры, позволяющие выявить опухоль и предрасположенность к ее возникновению. Специфичность и чувствительность молекулярно-генетических методик превышает 99% [Белохвостов А.С., Румянцев А.Г., 2003].

На фоне всех изменений происходящих в опухолевой клетке единственной известной константой при возникновении рака является наследственный генотип, с которым организм рождается и который не изменяется в течении жизни особи. Он отвечает как за предрасположенность к возникновению каждого конкретного заболевания, так и за скорость его манифестации, клиническое течение, прогрессирование и частоту рецидивирования. При выявлении связи носительства генетических изменений (мутаций) с клинической картиной заболевания, у каждого конкретного больного, появится возможность не только прогнозировать течение заболевания, но и подбирать необходимый объем терапии и хирургического вмешательства, полностью обеспечивающих излечение от рака [Баранов B.C. и соавт., 2000; Иванов В.И., Киселев JI.JI., 2005].

Наиболее известным специфическим маркером предрасположенности к опухолевому росту в желудке является Е-кадгерин. Согласно проведенным исследованиям в 95% случаев наследственного носительства мутации зоны CDH1 гена Е-кадгерина в неизмененной слизистой желудка выявляются микроскопления опухолевых клеток [Hutsman D.G., 2005].

Данные нарушения межклеточной адгезии являются одними из характерных молекулярно-генетических изменений клеточных структур, являющихся т.н. «признаками рака» [Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Копнин Б.П., 2002]. Еще одним из таких признаков озлокачествления является приобретение опухолевой клеткой нечувствительности к воздействию сигнальных молекул (промоторов апоптоза, блокаторов клеточного цикла) из соседних клеток [Yamasaki Н. и соавт., 1999; Trosko J.E. и соавт., 2004]. В норме данное межклеточное взаимодействие осуществляется с помощью белков межклеточных щелевых контактов коннексинов и обладает опухоль-суппрессирующей функцией [Крутовских В .А., 2005].

Экспрессия семейства коннексинов представлена в желудочно-кишечном тракте коннексином-26, -32 и -43. Ранее было показано эпигенетическое нарушение функции коннексина-43 и -32 при раке желудочно-кишечного тракта [Uchida Y. и соавт., 1995; Nagahara А. и соавт., 1996; Dubina M.V. и соавт., 2002; Kanczuga-Koda L., 2004]. Однако в настоящее время наличие, суть и значение нарушений коннексина-26 при раке желудка остается малопонятным.

Цель работы.

Определить роль мутаций гена белка коннексина-26 при возникновении рака желудка и его клиническом течении.

Задачи исследования.

1. Провести хирургическое лечение больных раком желудка с последующим гистологическим исследованием опухолевой ткани.

2. Провести иммуногистохимическое исследование опухолевой ткани с целью выявления внутриклеточной локализации белка коннексина-26.

3. Провести молекулярно-генетический анализ гена Сх2б у больных раком желудка и у «онкологически здоровых» лиц.

4. Оценить диагностическое и прогностическое значение, мутаций гена Сх2б у больных раком желудка.

5. Исследовать зависимость клинического течения рака желудка от выявленных мутаций гена Сх26.

Научная новизна.

Впервые проведено исследование структуры гена Gx26 при раке желудка. В 18,2% случаев рака желудка выявлено гетерозиготное носительство мутаций гена Сх2б (35delG, V27I, М34Т, V37I, F83C, R127H). Впервые показано, что гетерозиготное носительство мутаций гена Сх26 является фактором риска возникновения рака желудка.

Впервые выявлена связь структурных изменений гена коннексина-26 с инвазивной способностью опухоли. В частности, показано, что при наличии структурных изменений гена Сх26 опухоль инвазирует стенку желудка в меньшей степени, чем при носительстве дикого типа Сх26.

Впервые выявлена ассоциация мутационных изменений гена Сх26 с изъязвлением опухолевой ткани при инфильтративном типе опухолевого роста. Наличие мутации в гене Сх26 предрасполагает к более частому возникновению острой хирургической патологии: желудочному кровотечению и перфорации стенки желудка.

Впервые получены клинические данные, косвенно подтверждающие гипотезу о том, что основной функцией коннексина-26 является трофическая функция, по обеспечению клеток питательными веществами и/или энергетическими молекулами (глюкозой, АТФ).

Практическая значимость работы.

Полученные данные могут быть использованы как в практической деятельности любого хирургического департамента, так и в научно-исследовательском и учебном процессах.

Результаты работы могут быть использованы для создания групп повышенного риска заболеваемости раком желудка и введения специальных протоколов наблюдения за данными больными. В частности, можно рекомендовать лицам из группы риска регулярное проведение фиброгастродуоденоскопии с прицельной биопсией подозрительных участков, а также проведение гемостатической терапии на дооперационном этапе. Данные назначения показаны в виду того, что при наличии мутации кодирующей последовательности гена Сх26 в опухолевой ткани наблюдаются изъязвление, которое может приводить к желудочному кровотечению и перфорации стенки органа.

Полученные результаты могут быть применены при хирургическом лечении, как прогностический критерий клинического течения заболевания. В частности с учетом того, что носительство мутации гена Сх26 (в сравнении с носительством его дикого типа) предрасполагает к сниженной способности опухоли к инвазии, возможно в спорных случаях выбора объема тактики оперативного лечения и/или при высоком риске операции избирать меньший объем хирургического вмешательства, т Включение исследования структурных изменений гена Сх26 в диагностический протокол вместе с другими прогностическими факторами генетических повреждений (таких как Е-кадгерин, Р-катенин и пр.) позволит оценить основные патологические процессы, обусловливающие основные характеристики опухолевой ткани и разработать алгоритм специфической таргетной терапии этих опухолей.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Белок межклеточных щелевых контактов коннексин-26 вовлечен в процесс онкологического перерождения клеток слизистой оболочки желудка.

2. Цитоплазматическое и мембранное расположение белка коннексина-26 в опухолевых клетках при раке желудка всегда нарушено.

3. Мутационные повреждения гена Сх26 являются предрасполагающим фактором для развития рака желудка.

4. Мутационные повреждения Сх26 являются благоприятным прогностическим фактором клинического течения рака желудка.

Апробация работы.

Основные результаты, изложенные в работе, были представлены на 1Х-ом Всероссийском слете студентов, аспирантов и молодых ученых - лауреатов конкурса «Ползуновские гранты» (Сочи, Россия, 6-10 сентября 2004 г.); 1-ой Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, Россия, 29-31 мая, 2005 г.); конференции молодых ученых «Современные методы диагностики и лечения заболеваний в клинике и эксперименте» (Москва, Россия, 2005 г.); Международном симпозиуме по щелевым контактам (Вистлер, Канада, 2005 г.); Конференции МАПО «Актуальные вопросы абдоминальной онкологии» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 г.).

Работа была поддержана грантом Международного Агентства по Исследованию Рака (МАИР, г. Лион, Франция) и грантом Центра инновационных технологий «Фонд ТВН» (г. СПб, Россия).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Внедрение результатов работы.

Научные и практические рекомендации внедрены в лечебный, научный и учебный процессы на кафедре факультетской хирургии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).

Полученные результаты были также внедрены в научный процесс в отделе Молекулярно-генетических технологий Научно-исследовательского центра ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).

Связь с планом научных исследований.

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова в рамках отраслевой программы «Разработка и совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения хирургических заболеваний с использованием новых медицинских технологий». Договор № 031/081/001 от 08.08.2001.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4-ех глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, в котором приведены 214 источников, в том числе 45 работ на русском языке и 169 — на иностранных языках. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 23 рисунками.

ВЫВОДЫ:

1. Характер оперативного вмешательства при раке желудка и его прогноз должны учитывать результаты молекулярно-генетического анализа.

2. При раке желудка цитоплазматическое и мембранное .расположение белка коннексина-26, всегда нарушено независимо от гистологического типа опухоли.

3. Частота мутационных изменений кодирующей последовательности гена Сх2б у больных раком желудка достоверно выше, чем у «онкологически здоровых» лиц. Носительство мутаций кодирующей последовательности гена Сх26 является предрасполагающим фактором к возникновению рака желудка.

4. Носительство мутации кодирующей последовательности гена Сх26 является благоприятным прогностическим фактором клинического, течения заболевания.

5. При инфильтративном типе роста опухоли носительство мутации гена Сх2б может опосредовать осложнения клинического течения рака желудка в виде острого кровотечения из изъязвленных сосудов в опухолевой ткани и/или перфорации стенки органа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. В случаях наличия у больного мутации в гене Сх26 и при спорном выборе тактики хирургического вмешательства можно рекомендовать избирать меньший объем оперативного вмешательства.

2. При наличии у больного мутации в гене Сх26 при подготовке к оперативному лечению можно рекомендовать дополнительно назначать проведение системной гемостатической терапии.

3. Полученные данные о диагностическом значении мутаций гена Сх26 в возникновении рака желудка могут быть использованы в наборе ранних диагностических методов выявления предрасположенности к данному заболеванию.

4. Полученные данные о диагностическом значении мутаций гена Сх26 могут быть использованы для создания групп диспансеризации по раку желудка.

5. Полученные данные о нарушении щелевого межклеточного взаимодействия при раке желудка могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в медицинских ВУЗах при изучении частной хирургии рака желудка.