Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ динамики межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных клеток в культуре

61: /633-4

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

на правах рукописи

Алиева Наила Омар Хайям гызы

Анализ динамики межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных клеток в культуре.

14.00.14 - Онкология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: чл ен-корр .Р АН, доктор медицинских наук,

профессор Ю.М. Васильев

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

ВВЕДЕНИЕ 7

Актуальность проблемы 7

Цель и задачи работы 8

Научная новизна и практическая значимость работы 8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

I. Фибробласты и эпителиоциты. Морфология и организация

цитоскелета 11

1. Фибробластоподобные поляризованные клетки 11

2. Эпителиальные неполяризованные клетки 14

3. Изменение морфологии клетки под действием факторов 16

трансформации

II. Действие онкогена Ras : 18

1. Ras - представитель семейства малых GTPa3,

эффекторы Ras 18

2. Rho, Rae и Cdc42 и организация актина 20

III. Адгезия с внеклеточным матриксом, межклеточные контакты 24

1. Фокальная адгезия 24

2. Адгезионные соединения. Кадхериновая адгезия 27

2.1 Организация кадхеринового межклеточного контакта 27

2.2. Сигнальная транедукция в межклеточном адгезионном 31

комплексе

2.2.1. Кадхерины как опухолевые супрессоры 32

2.2.2. ß-катенин - центральный элементрегуляции

межклеточной адгезии 33

2.2.3. Роль малых GTPa3 в функционировании

межклеточного контакта 37

3. Другие виды межклеточных взаимодействий 39

3 3.1. Десмосома 39

3.2. Плотные контакты 40

IV. Контактное торможение движения 41

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45

I. Описание клеточных культур, использованных в работе 45

1. Клетки линии IAR-2 45

2. Клетки линии IAR-2(C4) ras 45

3. Клетки линии AGO 1523 45

4. Клетки линии Rat-1 45

5. Клетки линии Rat-1 ras 46

II. Дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия 46

III. Анализ псевдоподиальной активности 46

IV. Движение латексных частиц по поверхности клеток 48

V. Иммунофлуоресцентная микроскопия 48

РЕЗУЛЬТАТЫ 49

I. Динамика установления межклеточного контакта

^трансформированными эпителиоцитами 49

1. Морфологические характеристики эпителиальных клеток

IAR-2 49

2. Анализ видеозаписи формирования межклеточного контакта

эпителиальными клетками IAR-2 49

2.1. Нестабильный контакт 50

2.2. Начальный стабильный контакт 50

2.3. Расширяющийся стабильный контакт. Угнетение

псевдоподиальной активности 50

3. Движение покрытых СопА латексных частиц по поверхности 51 эпителиальных клеток IAR-2

3.1. Движение латексных частиц на свободном крае

эпителиальных клеток IAR-2 51

3.2. Особенности движения СопА-покрытых латексных частиц

по поверхности ламеллы в области межклеточного контакта клеток IAR-2 51

4. Анализ актинового цитоскелета эпителиальных клеток IAR-2 52

4.1 Организация актинового цитоскелета эпителиальных

клеток IAR-2 52

4.2 Изменение динамики актинового цитоскелета в ходе

формирования межклеточного контакта эпителиоцитами IAR-2 53

II. Межклеточный контакт в культурах ras-трансформированных

эпителиоцитов 62

1. Поляризованный фенотип трансформированных

эпителиоцитов IAR-2(C4)-ras 62

2. Анализ видеозаписи формирования межклеточного контакта

ras-трансформированными эпителиоцитами 62

2.1. Перекрывание ламелл 63

2.2. Ретракция ламеллы и поворот клетки 64

3. Движение покрытых Con-А латексных частиц по поверхности

клеток на свободном крае и в области формирования межклеточного

контакта трансформированными эпителиоцитами линии IAR-2(C4)-ras 64

4. Динамика актинового скелета в ходе межклеточного

взаимодействия ras-трансформированных эпителиоцитов 66

4.1. Организация актинового цитоскелета ras- 66

трансформированных эпителиоцитов

4.2. Организация актинового цитоскелета ras-трансформированных эпителиоцитов в ходе формирования межклеточного контакта 67

III. Динамика установления межклеточного контакта

фибробластами 73

1. Морфологические характеристики фибробластов линий

AGO 1523 и Rat-1 73

1.1. Фибробласты линии AGO 1523 73

1.2. Фибробласты линии Rat-1 73

2. Анализ видеозаписи формирования межклеточного контакта

фибробластами 74

2.1. Перекрывание ламелл 74

2.2. Ретракция и формирование новой ламеллы 74

3. Движение Con A-покрытых латексных частиц по поверхности

ламеллы в области межклеточного контакта фибробластов 75

4. Анализ динамики актинового цитоскелета фибробластов во

время установления межклеточного контакта 76

4.1. Организация актинового цитоскелета фибробластов 76

4.1.1. Линия AGO 1523 76

4.1.2. Линия Rat-1 77

4.2. Организация актинового цитоскелета в участках

межклеточных контактов 77

IV. Межклеточные взаимодействия ras-трансформированных 86

фибробластов

1. Морфология трансформированных фибробластов линии

Rat-1 ras 86

2. Анализ межклеточных столкновений в культуре

трансформированных фибробластов линии Rat-1 ras 86

2.1. Перекрывание ламеллярных участков 86

6 2.2. Ретракция и формирование боковой ламеллы 87

3. Перемещение покрытых СопА латексных частиц по

поверхности трансформированных фибробластов 87

4. Динамика актинового скелета в ходе межклеточного

взаимодействия ras-трансформированных фибробластов 87

4.1. Организация актина в фибробластах линии Rat-1 ras 87

4.2. Организация актина в ходе межклеточного контакта 88

ОБСУЖДЕНИЕ 94

I. Два типа контактного торможения движения 95

1. Контактное торможение движения в культурах

нетрансформированных эпителиоцитов 95

2. Контактное торможение в культурах фибробластов и

фибробластоподобных клеток 96

II. Роль актинового цитоскелета в формировании межклеточного

контакта эпителиоцитами 98

III. Роль актинового цитоскелета в формировании межклеточного

контакта фибробластами 102

IV. Контактное торможение движения - свойство как

нетрансформированных, так и трансформированных клеток 105

ВЫВОДЫ 109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одной из важнейших проблем современной онкологии является изучение механизмов инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. До настоящего времени существовала широко распространенная точка зрения, что в основе приобретения клеткой способности к инвазии лежит утрата так называемого контактного торможения движения. Феномен контактного торможения движения был впервые определен Аберкромби и соавторами (11) как свойство ^трансформированных клеток реагировать на столкновения в культуре остановкой направленного движения одной клетки по поверхности другой. Однако убедительных доказательств угнетения контактного торможения движения в ходе неопластической трансформации в то время получено не было. В настоящее время, используя современные методы видео микроскопии с высоким разрешением, представляется важным исследовать динамику межклеточных взаимодействий и механизмы осуществления контактного торможения движения в культурах нормальных и трансформированных клеток.

Одной из внутриклеточных систем, претерпевающей значительные изменения в ходе трансформации, является цитоскелет и, в частности, система актиновых микрофиламентов. Так, гаБ-индуцируемая трансформация вызывает значительные модуляции в распределении актиновых филаментов в клетке и обуславливает превращение неполяризованных эпителиальных клеток в поляризованные фибробластоподобные. С другой стороны, было показано, что система актиновых микрофиламентов играет важнейшую роль в установлении и поддержании межклеточных адгезионных соединений. Важно выяснить, каким образом изменения в организации актиновых микрофиламентов, вызванные трансформирующим действием онкогена, проявляются в ходе осуществления межклеточного контакта.

Изложенные соображения определили цель и задачи нашей работы. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей диссертационной работы являлось детальное изучение динамики ламелл и актинового цитоскелета в ходе межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных эпителиоцитов и фибробластов. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить динамику межклеточных взаимодействий в гомотипических культурах нетрансформированных и гав-трансформированных эпителиоцитов и фибробластов, используя методы видео микроскопии с высоким разрешением.

2. Исследовать распределение актин-содержащих структур в вышеозначенных культурах как до, так и после межклеточного взаимодействия.

3. Исследовать динамические изменения организации актинового цитоскелета в ходе межклеточных контактных взаимодействий при помощи актино-зависимого движения связанных с конканавалином А латексных частиц по поверхности клеток в области межклеточных контактов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Анализ динамики гомотипических межклеточных взаимодействий в культурах нетрансформированных и гав-трансформированных эпителиоцитов и фибробластов был осуществлен с использованием современных методов видео микроскопии с высоким разрешением, что позволило детально охарактеризовать особенности этого процесса, в частности, впервые определить дискретные стадии в процессе межклеточной адгезии для каждого исследуемого типа клеток. На основании полученных нами данных было описано два различных способа осуществления контактного торможения

движения в культурах неполяризованных эпителиоцитов и фибробластоподобных клеток.

Впервые был проведен сравнительный компьютерный анализ изменений псевдоподиальной активности в ходе осуществления межклеточного контакта. Было достоверно показано угнетение псевдоподиальной активности в областях клеточного края, непосредственно прилегающих к зоне межклеточного контакта у дискоидных нетрансформированных эпителиоцитов и отсутствие подобного угнетения в культурах фибробластоподобных клеток.

Динамика актинового цитоскелета была изучена при помощи методики с использованием связанных с конканавалином А латексных частиц, осуществляющих актинозависимые перемещения по поверхности клеток. Такой экспериментальный подход позволил изучить распределение сил натяжения в актиновом цитоскелете. Впервые подобные движения были исследованы в области межклеточных контактов. Было обнаружено формирование нового вектора натяжения в ходе осуществления межклеточного контакта ^трансформированными неполяризованными эпителиоцитами,

обеспечивающего расширение контакта. Было показано, что при межклеточных взаимодействиях фибробластоподобных клеток характер движения латексных частиц не изменяется.

Методом иммунофлуоресценции была впервые показана реорганизация актинового цитоскелета в ходе формирования межклеточного контакта неполяризованными эпителиоцитами, в частности впервые было обнаружено, что установление межклеточной адгезии нетрансформированными эпителиоцитами сопровождается разрушением кольцевого периферического пучка актиновых микрофиламентов. В ходе межклеточных взаимодействий в культурах фибробластоподобных клеток распределение актиновых микрофиламентов в клетке принципиально не изменялось.

Таким образом, теоретическое значение диссертационной работы состоит в том, что выявлены два различных способа осуществления феномена

контактного торможения движения, основанных на различиях в изначальной организации актинового цитоскелета ^трансформированных эпителиоцитов с неполяризованной псевдоподиальной активностью и поляризованных фибробластоподобных клеток.

Наряду с теоретическим значением полученные данные имеют научно-прикладное значение, поскольку расширяют понимание механизмов, лежащих в основе приобретения неподвижными неполяризованными клетками способности направленно перемещаться, что в конечном итоге приводит к инвазивности и метастазированию.

и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ФИБРОБЛАСТЫ И ЭПИТЕЛИОЦИТЫ. МОРФОЛОГИЯ И ОРГАНИЗАЦИЯ ЦИТОСКЕЛЕТА.

В нашей работе мы использовали два различных морфологичкских типа клеток: поляризованные фибробластоподобные клетки и неполяризованные эпителиоциты. В данном случае термин поляризация относится к характеру распределения псевдоподиальной активности по периметру клетки.

1. Фибробластоподобные поляризованные клетки.

Фибробластоподобные клетки имеют вытянутую поляризованную форму, которая возникает благодаря неравному распределению псевдоподий по периметру клетки. Клеточный край распластанной поляризованной клетки можно разделить на две зоны: активную ведущую ламеллу, формирующую псевдоподии, и стабильный край. Активный край формирует псевдоподии различных форм, от плоских ламеллоподий до нитеобразных филоподий. В результате такого распластывания клетка приобретает удлиненную поляризованную форму. Движение поляризованного фибробласта - это анизотропное распластывание только в одном из выбранных направлений. Прикрепление псевдоподии и подтягивание тела клетки в направлении выбрасываемой псевдоподии двигает фибробласт вперед. Направление движения регулируется несколькими группами внешних факторов (186): структурой субстрата, контактами с соседними клетками и хемотаксисом. К позитивным внешним факторам относятся хемотаксис и адгезивные субстраты, а негативным - контакт с соседними клетками и неадгезивные субстраты.

Выбрасывание псевдоподий на активном крае является результатом локальной полимеризации актина, сопровождающейся формированием сети микрофиламентов (40, 41). Активный край считается основной зоной полимеризации микрофиламентов в клетке.

В настоящее время общепризнанной является теория постоянного тока или круговорота актина в клетке между клеточным краем и эндоплазмой (57, 181). Актиновая сеть формируется на клеточном крае движущийся клетки и перемещается центростремительно, в то время как деполимеризованный актин двигается в обратном направлении к краю клетки. Этот факт нашел свое подтверждение во многих экспериментальных моделях (13, 59, 60, 181).

Активное движение вперед клеток также часто сопровождается центростремительным транспортом внутриклеточного содержимого, а также частиц, расположенных на поверхности клеток и связанных с актиновым цитоскелетом через мембранные гликопротеиновые рецепторы. В экспериментах часто используются связанные с конканавалином микросферы, 0.5 мкм в диаметре (111). Частицы спонтанно или при помощи лазерной ловушки, прикрепленные к поверхности клетки, двигаются центростремительно. Скорость движения частиц коррелирует со скоростью центростремительного транспорта актин-содержащих структур в цитоплазме (59). Подобное движение наблюдается только у клеток, способных к локомоции. Эти наблюдения показывают особую функциональную роль активного края ламеллы.

Если частица прикреплена к какой либо другой части ламеллы за пределами активного края, ее движение ограничивается медленным диффундированием на одном месте.

Использование латексных частиц для исследования оказалось очень продуктивным, т.к. таким образом можно оценивать направление сил натяжения в актиновом цитоскелете, а также их изменения во время различных процессов, таких как, например, установление межклеточного контакта.

Важно подчеркнуть, что кругооборот актин-содержащих структур в фибробласте способствует поляризации псевдоподиальной активности. Постоянное перераспределение актиновых структур приводит к тому, что псевдоподиальный материал направляется в те области клетки, в которых в

данный момент времени существуют оптимальные внешние условия для формирования псевдоподий. Таким образом, возникает поляризация клетки -

и 1 __V/ и V

создание такой морфологии, при которой активный край, на котором формируются псевдоподии, располагается с одной стороны фибробласта, что приводит к его направленному движению. Поляризация псевдоподиальной активности, вызванная внешними факторами, стабилизируется за счет реорганизации актинового цитоскелета (186).

Таким образом, возникает зональная организация актинового цитоскелета у фибробластов (9, 5, 7). Исследования тонкой структуры системы микрофиламентов, проведенные с использованием метода платиновых реплик, показали, что в фибробластах актиновый скелет имеет следующие зоны:

1.) Самая дистальная зона активного края, содержащая густую сеть микрофиламентов;

2.) Зона ламеллы, следующая по направлению к центру клетки и содержащая многочисленные сократимые структуры - стрессфибриллы;

3.) Зона эндоплазмы, самая проксимальная, закрытая дорзальным пластом микрофиламентов.

Важным аспектом функционирования актинового цитоскелета является его взаимодействие с системой микротрубочек. Если актиновый кортекс отвечает за движение клеток, то система микротрубочек - за организацию этого движения (187).

По данным иммунофлуоресцентной микроскопии в поляризованных клетках, имеющих часто протяженные стабильные участки клеточного края, микротрубочки ориентируются параллельно этим стабильным краям (8).

Процессы, сопряженные с высокой степенью поляризации псевдо�