Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Новый патогенетический подход к ранней диагностике и хирургическому лечению колоректального рака

На правах рукописи

Дубина Михаил Владимирович

НОВЫЙ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ И ХИРУРГИЧЕСКОМУ ЛЕЧЕНИЮ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.27 - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова Минздрава России

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор

ПЕТРИЩЕВ НИКОЛАЙ НИКОЛАЕВИЧ

доктор медицинских наук, академик РАМН профессор ЯИЦКИЙ НИКОЛАЙ АНТОНОВИЧ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

НИКОЛАЕВ ВАЛЕНТИН ИВАНОВИЧ

доктор медицинских наук, профессор ЗАЙЧИК АЛЬБЕРТ МИХАЙЛОВИЧ

доктор медицинских наук, профессор ШЕЛЫГИН ЮРИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова

Защита состоится "_"_2004 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.090.03 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П.Павлова (197089 Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова

Автореферат разослан: "_"_2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Профессор В.Ф.Митрейкин

ВВЕДЕНИЕ

Рак толстой кишки - одно из самых распространённых злокачественных заболеваний. Ежегодно в мире регистрируется более 600.000 новых случаев рака этой локализации при неуклонном увеличении заболеваемости и смертности от колоректального рака как в России так и за рубежом (Трапезников Н.Н., Поддубная И.В., 1996; Чиссов В.И. с соавт., 1999). Хирургический метод, развитие которого во многом связанно с именами многих выдающихся российских учёных, по-прежнему, остаётся основным и наиболее действенным в лечении колоректального рака (Ганичкин A.M., 1970; Фёдоров В.Д., 1987; Яицкий НА, Седов В.М., 1995). Показатель 5-летней выживаемости пациентов после радикальных операций составляет в среднем от 45 до 60% и во многом зависит от ранней диагностики заболевания (Кныш В.И., 1997). Основной причиной отсутствия заметного улучшения отдалённых результатов лечения колоректального является высокий процент рецидивов1 и метастазов. Так, у 60-80% больных с впервые установленным диагнозом определяется III-IV стадия заболевания, то есть выявляется рак с метастазами в регионарные лимфоузлы или с отдалёнными метастазами (Gazelle G.S. et al., 2000) Лишь у 5,2% больных опухоль диагностируют в течение 2 недель после первого обращения к врачу, в то время, как у 32,5% этот процесс занимает более года (Воробьев Г.И. с соавт., 1998). Таким образом, исследование этиологии и патогенеза, поиск достоверных опухолевых маркеров, совершенствование подходов и методов раннего выявления, прогноза и лечения колоректального рака остаются приоритетными направлениями медицинских исследований (Пиманов СИ. с соавт., 2001; McLeod H.L., Murray G.I., 1999).

Современная клиническая медицина уже не может обойтись без высокотехнологических генетических методов исследования, лечения и прогноза заболеваний. С развитием молекулярных технологий и внедрением их в практическую медицину накапливаются многочисленные данные о генетических и эпигенетических факторах, играющих ключевую роль в возникновении и развитии злокачественных заболеваний, в том числе рака толстой кишки. (Бочков Н.П., 1999; Lynch J.P., Hoops Т.С., 2002). Одним из ключевых структурно-функциональных факторов поддержания метаболического гомеостаза и межклеточного взаимодействия в органах и тканях являются межклеточные щелевые контакты (Evans W.H., Martin P.E., 2002). Нарушение функций

межклеточных щелевых контактов

негативного

ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

контроля роста, изменению процессов пролиферации, дифференцировки, подвижности опухолевых клеток и таким образом является важным условием прогрессии новообразований (Крутовских В.А., 2000). В качестве основного механизма изменений экспрессии щелевых контактов в опухолях животных и человека рассматриваются как генетические, так и эпигенетические нарушения белков коннексинов (Yamasaki H. et al.,

1999). Тем не менее, не смотря на то, что отдельные мутации генов коннексинов встречаются в индуцированных опухолях у экспериментальных животных, достоверных мутационных изменений генов коннексинов в злокачественных опухолях человека до недавнего времени обнаружено не было (Krutovskikh V.A. et al., 1996; Saito T. et al.,

2000).

Важную роль в системной регуляции биоритмически координированных процессов взаимодействия опухоли и организма, как на ранних этапах канцерогенеза, так и в период профессии злокачественных новообразований является мелатонин. В частности, у пациентов с опухолями толстой кишки наблюдали нарушение циркадного ритма экскреции мелатонина (Кветной И.М., Левин И.М., 1987). При этом долговременное введение мелатонина животным с опухолями кишечника, индуцированными 1,2-диметилгидразином, оказывало достоверное ингибирукюее влияние, как на ранние, так и на поздние стадии канцерогенеза (Анисимов В.Н. с соавт., 2000; Blask D.E. et al., 1999). Метастазирование является одной из основных причин отсутствия заметного улучшения отдалённых результатов лечения колоректального рака (Gazelle G.S. et al., 2000). При этом гематогенное метастазирование новообразований во многом зависит от паранеопластической дисфункции эндотелия микрососудов в органах и тканях, расположенных удалённо от первичного узла злокачественных клеток (Петрищев Н.Н., Дубина М.В., 1999). Известно, что эндотелий сосудов микроциркуляторного русла может активно включаться в регулирование процесса адгезии опухолевых клеток, определяя, таким образом, избирательную локализацию метастазов (Beloni P.N., Tressler R.J., 1990). Ранее нами было установлено, что при опухолях толстой кишки, индуцированных 1,2-диметилгидразином, у крыс происходит увеличение проницаемости эндотелия периферических микрососудов и их адгезивных свойств по отношению к лейкоцитам, которое зависит от стадии прогрессии злокачественных новообразований (Dubina M.V. et al., 1999). Вместе с тем, вопрос о молекулярных механизмах реализации противоопухолевого эффекта мелатонина на тканевом уровне остается

неизученным. В частности, не изучена роль мелатонина в регуляции экспрессии белков межклеточных щелевых контактов и изменении функциональных свойств эндотелия при опухолях толстой кишки.

Цель исследования:

Разработать новый патогенетический подход к диагностике и лечению колоректального рака.*

Задачи исследования:

1. Исследовать молекулярно-генетические механизмы нарушений межклеточных щелевых контактов, специфически связанные с прогрессией спорадических опухолей толстой кишки.

2. Выявить циркадианные особенности индуцированного канцерогенеза в толстой кишке у животных.

3. Исследовать влияние системного нейрогуморального фактора мелатонина на паранеопластические изменения в организме у животных с индуцированными опухолями толстой кишки.

4. Определить характер и патогенетическое значение взаимодействия местных изменений межклеточных щелевых контактов и системных эффектов нейрогуморального гормона мелатонина в механизмах профессии опухолей толстой кишки.

5. Обосновать диагностическую значимость выявленных молекулярно-генетических нарушений межклеточных щелевых контактов и характера секреции мелатонина при колоректальном раке.

Научная новизна. Впервые обнаружены мутации гена коннексина-43 межклеточных щелевых контактов в опухолях у пациентов с колоректальным раком.

Установлено, что соматические мутационные повреждения гена коннексина-43 происходят в диспластически измененных клетках на поздней стадии развития опухолей и, таким образом, связаны с прогрессией колоректального рака.

Выявлено, что высокий уровень эндогенной секреции мелатонина в период канцерогенного воздействия достоверно замедляет рост индуцированных опухолей толстой кишки у крыс.

Показано, что длительное воздействие мелатонином устраняет эффект расщепления ритма его эпифизарной и внеэпифизарной эндогенной секреции, а также устраняет системные паранеопластические

нарушения функций микрососудов и экспрессии белков межклеточных щелевых контактов на стадии профессии опухолей толстой кишки.

Научно-практическая значимость. Специфические мутационные повреждения гена коннексина-43, обнаруженные на стадии профессии опухолей толстой кишки расширяют современные представления о молекулярно-генетических механизмах патогенеза злокачественных новообразований и позволяют классифицировать коннексин-43 межклеточных щелевых контактов как новый опухолевый супрессор.

Важное научное значение имеют данные о высокоспецифичном повреждении карбоксильного участка коннексина-43, отвечающего за его взаимодействие с набором многочисленных биологически активных трансмембранных и цитоплазматических сигнальных белков (Р-катенин, кадхерины, окклюдин и другие), что открывает перспективу для инновационных подходов к поиску новых патогенетических механизмов опухолевой профессии.

Особый характер обнаруженных специфических мутаций гена коннексина-43 - сдвиг рамки считывания с нарушением первичной структуры белка - позволяет разработать новый методологический подход к иммунологическому выявлению мутированного коннексина-43 и может служить новым диагностическим критерием оценки профессии опухолей толстой кишки.

Возникающие в результате спонтанных мутационных повреждений в структуре коннексина-43 новые аминокислотные последовательности обладают потенциальной антигенной активностью и таким образом могут стать новой молекулярной мишенью при разработке противоопухолевых вакцин для направленной терапии отдельных форм колоректального рака.

Показанные нами данные о нормализующем влиянии длительного введения экзогенного мелатонина на факторы профессии опухолей толстой кишки в эксперименте свидетельствуют о возможном применении мелатонина как потенциального терапевтического фактора, восстанавливающего системные нарушения у пациентов с колоректальным раком

Внедрение в клиническую практику новых данных о местных и системных повреждающих факторах патогенеза опухолей толстой кишки, а также разработка новых подходов к их коррекции позволит улучшить раннюю диагностику, прогноз и результаты хирургического лечения больных с колоректальным раком.

Результаты исследования защищены патентом РФ: «Способ диагностики злокачественной прогрессии рака толстой кишки» №2213781 от 10 октября 2003 года и опубликованы в 21 научной работе.

Данные могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс медицинских вузов при рассмотрении вопросов патогенеза опухолевого роста, молекулярной онкологии, клинической генетики злокачественных новообразований, диагностики и лечения опухолей толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

Генетические нарушения межклеточных щелевых контактов - это новый механизм профессии опухолей толстой кишки на тканевом, клеточном и молекулярно-генетическом уровнях.

Мутации гена коннексина-43 являются высокоспецифичными для диспластически измененных клеток и приводят к появлению новых олигопептидных маркеров при спорадическом колоректальном раке.

Мелатонин является важным системным фактором прогрессии опухолей толстой кишки путем влияния на молекулярно-генетические механизмы тканевого гомеостаза и функциональные свойства эндотелия сосудов микроциркуляторного русла.

Данные о генетических повреждениях коннексина-43 в опухолевых клетках и системном онкостатическом влиянии мелатонина на стадии опухолевой профессии могут быть использованы для разработки новых способов диагностики, оценки профессии и коррекции лечения колоректального рака.

Апробация работы. Работа выполнена в соответствие с планом НИР СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова по отраслевой профамме №31 МЗ РФ «Разработка и совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения хирургических заболеваний с использованием новых медицинских технологий», договор МЗ №031/008/001 от 08.08.2001г.

Результаты исследования используются в практической работе Городского центра колопроктологии (городская больница №9, г.Санкт-Петербург), онкологического отделения клиники факультетской хирургии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, а также в учебном процессе на кафедрах патофизиологии, хирургических болезней стоматологического факультета, факультетской хирургии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова.

Материалы диссертации были представлены и прошли апробацию на международной конференции по межклеточным щелевым контактам (г. Гонолулу, США, 2001г.), на международном конгрессе по раннему выявлению и предотвращению рака (г.Париж, Франция, 2002г.), на симпозиуме Американской ассоциации по исследованиям рака (г.Майями, США, 2002г.), на Ш Международном хирургическом конгрессе «Актуальные проблемы современной хирургии» (г.Москва, Россия, 2002г.), на 1-м Российском съезде колопроктологов с международным участием (г.Самара, Россия, 2003г.), на международной научно-практической конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов» (г.Санкт-Петербург, Россия, 2003г.), на VII Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, Россия, 2003г.), на 9-м Европейском конгрессе по колопроктологии (г.Афины, Греция, 2003г.).

Материалы диссертации доложены и обсуждены на совместном заседании проблемной комиссии №6 «Хирургия и Онкология» и кафедры патофизиологии в октябре 2003г. Промежуточные результаты работы регулярно докладывались и обсуждались на заседаниях проблемной комиссии «Молекулярная медицина» научного совета СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова (2001 -2003 г.г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственного исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы; содержит 12 таблиц, и 18 рисунков. Список цитированной литературы включает 345 источников, в том числе 47 работ отечественных авторов и 298 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинико-генетическая часть исследовании

Материалом в клинико-генетической части наших исследований были данные историй болезни и образцы опухолевой ткани, полученные в время хирургических операций от 43-х пациентов с опухолями толстой кишки разной локализации и гистологического типа. Всем исследуемым больным в период с января по май 2000-го года проводилось

хирургическое лечение на базе городского центра колопроктологии, кафедры хирургических болезней стоматологического факультета Санкт-Петербургского государственного медицинского института им. акад. И.П.Павлова (отделение колопроктологии городской больницы №9 г. Санкт-Петербурга) и в областном онкологическом диспансере г. Санкт-Петербурга. Всем пациентам были выполнены циторедуктивные хирургические операции.

Таблица 1

Частота возникновенияразличныхопухолей в исследуемой группе

Клинический диагноз Число больных

абс. кол-во %

Аденомы 3 7,0

Полипы прямой кишки 2 4,7

Ворсинчатая опухоль прямой кишки 1 2,3

Рак прямой кишки 22 51,2

Рак сигмовидной кишки 8 18,6

Рак поперечно-ободочной кишки 4 9,3

Рак слепой кишки 1 2,3

Первично-множественный рак 2 4,7

Всего 43 100

Как видно из таблицы 1, в исследуемой нами группе пациентов существенно преобладали больные раком прямой и сигмовидной кишки: 22 пациента (51,2%) и 8 пациентов (18,6%) соответственно. Из числа всех пациентов в 26 случаях были женщины (60% от общего количества больных) и в 17 случаях мужчины (40% от общего количества больных). Возраст оперированных пациентов составлял от 39 до 88 лет. При этом наибольшее количество случаев заболевания приходилось на возраст старше 50 лет. 39 пациентов (91% от общего количества больных) были старше 50 лет как у мужчин, так и у женщин. Пик заболеваемости отмечен в возрастной категории женщин 70 - 79 лет. Это подтверждает общую закономерность о большей частоте опухолей ободочной и прямой кишки у больных среднего и пожилого возраста.

Материал из резецированных опухолей и регионарных лимфатических узлов в обязательном порядке был использован для гистологической верификации диагноза. Для дальнейших молекулярно-генетических исследований межклеточных щелевых контактов ткань иссекали из периферической участка опухоли, удаляемой в процессе радикальной операции. Учитывая поисковый характер работы, в наше

исследование были включены образцы опухолей толстой кишки с гистологическим диагнозом разных степеней злокачественности. Образцы опухолевой ткани, весом до 500 мг, помещали в отдельные пробирки объемом 1,5 мл и замораживали в жидком азоте при температуре -183°С. В дальнейшем материал хранили в термоконтейнерах при температуре -80°С. Для молекулярно-генетических и иммуногистохимических исследований из каждого образца опухоли были получены по 4-5 криосрезов толщиной 6-7 мкм.

Молекулярно-генетические исследования коннексинов в опухолях толстой кишки проводили в рамках договора о научном сотрудничестве на базе лаборатории взаимодействия гена и окружающей среды Международного агентства по исследованию рака ВОЗ (г. Лион, Франция). Данная работа была в части поддержана фантом Международного общества борьбы с раком UICC, №157-02.02.00 (г. Женева, Швейцария).

ДНК опухолевых клеток и клеток крови. Геномную ДНК из образцов опухолей толстой кишки и крови получали с использованием реагентов в наборе GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit (Sigma, США) согласно протоколу производителя. Для повышения точности и специфичности последующих молекулярно-генетических исследований из стромы каждого доступного для исследования образца опухолевой ткани, размещенного на льду, выделяли скопления опухолевых клеток в объеме 1 мм2 (25 мг). Кровь в объеме 1 мл использовали для выделения ДНК из клеток без дополнительной предварительной обработки.

Скрининговый генетический анализ ДНК опухолей на наличие мутационных повреждений коннексипа-32 и коннексина-43. Для поиска возможных мутаций генов коннексинов в опухолях толстой кишки мы использовали метод, основанный на технологии полимеразной цепной реакции - анализ гетеродуплексов, с помощью которого ранее были обнаружены мутации других генов при колоректальном раке (Curtis L.J. et al., 1994). Данный метод состоит из следующих основных этапов: амплификация избранных участков ДНК методом ПЦР с

Р33

, денатурация, медленная ренатурация и последующее электрофоретическое разделение амплифицированных генов в полиакриламидном геле. Однонитевые фрагменты ДНК при медленной ренатурации образуют дуплексы. Если последовательности двух однонитевых генетических цепей полностью комплементарны, то образуются гомодуплексы. Если в нуклеотидной последовательности исследуемого участка ДНК изменяется, по крайней мере, один нуклеотид

-11в гетерозиготном состоянии, то между нормальной и мутантной фрагментами ДНК могут образоваться гетеродуплексы. Такие гомо- и гетеродуплексные молекулы ДНК отличаются по своей электрофоретической подвижности и могут быть с высокой степенью достоверности обнаружены в полиакриламидном геле.

Нуклеотидные последовательности кодирующих участков гена коннексина-32 (GI: 4504004; с 63 по 914 п.н.) и коннексина-43 (GI: 4755136; с 208 до 1356 п.н.) находили в общедоступном банке нуклеотидных последовательностей «GeneBank» (www.ncbi.nlm.nih.gov). Для амплификации кодирующей части генов коннексина-32 и коннексина-43 использовали несколько пар праймеров, охватывающих по частям весь кодирующий участок гена (таб. 2). При поиске совместимых праймеров руководствовались ограничением метода ПЦР по длине копируемых участков - не более 500 п.н. Праймеры были синтезированы в компании Genset Sa (Франция).

Таблица 2

Олигонуклеотидные праймеры для амплификации кодирующих участков генов

коннексинов человека

Ген Фрагмент гена Праймеры

Сх32 А (39-443 п.н.), 405 п.н. прямой: 5'-АСАССОАССТОТСААТСАСС-3' обратный: 5'-САТСТСОАССТТОТСССТСТ-3'

В (371 -935 п.н.), 565 п.н. прямой: 5'-GAAAATGCTACGGCЛTGAGG-3, праймер: 5'-САССТГСССГССТАТСТСС-3'

Сх43 А (97-522 п.н.), 426 п.н. прямой: 5'-САСАООТСТСАОТСССТСАА-3' обратный: 5'-ТТТСТСТТССТТТСССАТСА-3'

В (476 - 938п.н.), 463 п.н. прямой: 5'-ТСТГСТАССТСССТСАТСТС-3' обратный: 5,-CTCTTTCCCTTAACCCGATC-3,

С (919- 1450 п.н.), 532 п.н. прямой: 5'-ОАТССССГТААССОАААСАС-З' обратный: 5'-ТССАССССАТСААААТТААС-3'

Примечание: Сх32 - коннексин 32; Сх43 - коннексин 43; п.н. - пара нуклеотидов.

Амплификацию генов коннексинов всех доступных образцов ДНК проводили на оборудовании Thermal Cycler (Perkin Elmer, США). Для контрольного тестирования режимов ПЦР использовали образец ДНК крови здорового человека. На стадии инициализации проводили денатурацию исследуемых образцов в течении 1 мин при температуре 94°С, затем - циклическую амплификацию ДНК (30 циклов): денатурация - 30 сек (94°С); отжиг - 30 сек (55°С или 58°С) и синтез - 1 мин (72°С).

Секвенирование гена коннексина-43 в ДНК спорадических опухолей толстой кишки человека. Амплифицированные

последовательности кодирующего участка гена коннексина-43 с нарушенной миграцией дуплексов в геле были секвенированы по методу Сэнжера с использованием фермента ДНК-полимеразы Taq (Krefz К. et al., 1994). Идентификацию продуктов ПЦР проводили в каждом из 2-х однонитевых фрагментов ДНК. Для секвенирования использовали режим 25 циклов по следующей программе: денатурация - 30 сек (96°С), отжиг -15 сек (50°С), синтез - 4 мин (60°С). В данной реакции использовали «гнездные» праймеры, позволяющие с большей вероятностью и точностью прочитать исследуемый генетический фрагмент. Так как выбранные нами праймеры не позволяли дифференцировать ген коннексина-43 от псевдогена (Fishman G.I. et al., 1991) в некоторых случаях с атипичной миграцией амплифицированных генетических фрагментов не было подтверждено мутационных изменений. Такие случаи были исключены из дальнейшего молекулярно-генетического анализа.

Иммунофлуоресцентный метод выявления мутированного коннексина-43 в опухолевых тканях. Иммунофлуоресцентный анализа криосрезов опухолей толстой кишки поводили с использованием поликлональных кроличьих антител с высокой степенью аффинности к двум разным участкам коннексина 43 (рис.1).

Рис.1. Принцип метода иммунофлуоресцентного исследования коннексинов с использованием двух антител к разным участкам коннексина-43.

Антитела к олигопептиду в области внутриклеточной петли коннексина-43 были предоставлены для исследований У.КгаШУ8к1кЬ (Франция). Эти антитела, меченные флуорохромом (красный цвет), специфически связывались с аминокислотной последовательностью

коннексина-43 в позиции с 119 по 142. Для распознавания С-терминального фрагмента молекулы коннексина-43 антитела были получены от Е. Rivedal (Норвегия). Эти антитела, меченные другой флуоресцентной меткой (зеленый цвет), специфически связывались с последовательностью аминокислот в позиции с 363 по 382, обладали высокой степенью аффинности к нативному белку («дикий тип») и не связывались с измененным карбоксильным фрагментом коннексина в С-терминальной части молекулы коннексина-43. Таким образом, использование двух антител к разным участкам молекулы коннексина-43, меченных разными флуоресцентными маркерами, по селективной утрате флуоресцентного сигнала зеленого цвета (антитела к белку «дикого типа») позволяло идентифицировать наличие мутированного белка в исследуемых тканях.

Экспериментальная часть исследований

Экспериментальные исследования проводили на одном виде животных - беспородных белых крысах-самцах весом 150-250 г (питомник "Рапполово" РАМН, г. Санкт-Петербург). Питание животных состояло из стандартного корма для лабораторных крыс, обогащенного витаминами и минеральными элементами. В экспериментах с индуцированным канцерогенезом в корм животным добавляли животные жиры и белки в соответствии с рекомендациями НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова. С целью стандартизации световых циркадных ритмов был создан следующий режим: свет с 09.00 до 21.00 и темнота с 21.00 до 09.00. После острых экспериментов каждое животное усыпляли парами эфира в герметичном боксе.

Химически индуцированный канцерогенез кишечника у крыс. Канцерогенез в толстой кишке индуцировали подкожным введением 1,2-диметилгидразина - ДМГ (Sigma, США). Ранее было показано, что подкожное введение ДМГ вызывает развитие аденокарцином кишечника, у 100% животных (Pozharisski K.M., 1990; Anisimov V.N с соавт., 1997). В наших исследованиях животным массой 80-100г подкожно вводили ДМГ в дозе 21мг/кг в 0,9% растворе NaCl.. Курс для индукции канцерогенеза состоял из 5 инъекций (1 инъекция в неделю). Для генетического и иммуногистохимического анализа межклеточных щелевых контактов при некропсии у крыс удаляли по 2 опухоли, локализованных в области толстой кишки. Каждый образец делили на 2 части: одна - для выделения ДНК, вторая - для иммунологического анализа.

Мелатонин в дозе 20 мг/л растворяли ex tempore в темном помещении с предварительным разведением в 0,1мл абсолютного спирта. В группах с хроническим воздействием животные получали питьевой раствор мелатонина в затемненных сосудах на протяжении темного времени суток с 21.00 до 9.00 с момента первой инъекции канцерогена. Животные остальных групп получали 0.9% раствор NaCl. На этот период свет в виварии выключали для устранения его влияния на продукцию эндогенного мелатонина.

Тетеродуплексный анализ ДНК индуцированных опухолей толстой кишки для скрининга на наличие мутационных повреждений генов коннексинов. Метод поиска, предварительного тестирования праймеров, амплификация кодирующего участка гена коннексина-32 или коннексина-43 и идентификация случаев с атипичной миграцией в полиакриламидном геле была такой же, как при скрининге для обнаружения мутаций в генах коннексинов человека.

Иммуногистохимическое исследование образцов индуцированных опухолей толстой кишки. Из каждого образца опухоли получали по 4-5 криосрезов толщиной 6 мкм. Срезы высушивали на воздухе при комнатной температуре в течении 15-20 минут и фиксировали в 10% растворе формалина в течении 5 минут. Непрямую иммуногистохимическую окраску с усилением серебрением проводили по методике, предложенной I.Merchenthaler с соавторами (1989). Использовали высокоспецифичные поликлональные антитела крысиному коннексину-32 (E.Rivedal, Норвегия) и к коннексину-43 (V.Krutovskikh, Франция). Экспрессию коннексинов межклеточных щелевых контактов оценивали с помощью световой микроскопии по наличию

Исследование концентрации мелатонина в эпифизе и в плазме крови у экспериментальных животных. Для этих исследований животных декапитировали в ночной период: с 01.00 до 03.00. Во время получения материала в помещении использовали источник красного света. Эпифиз удаляли в течение 5 секунд после декапитации животных и замораживали в жидком азоте. Кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут для получения плазмы. Эпифизы, полученные от крыс, исследовали с использованием методом электрохимической детекцией при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (Кудрин B.C. с соавт., 1995). Мелатонин эпифиза выделяли на обращёно-фазной колонке Separon SGX C18 (150 х 3 мм, 5 Содержание

мелатонина в эпифизе измеряли в нг/эпифиз, затем рассчитывали его отношение к концентрации общего белка в эпифизе, измеренной по

методу Лоури в мг/эпифиз. Концентрацию мелатонина в плазме крови определяли иммуноферментным методом ELISA (Karasek M., et al., 1994) и измеряли в пмоль/мл плазмы.

Исследование функциональных свойств эндотелия микрососудов брыжейки толстой кишки у крыс. Животных наркотизировали нембуталом в дозе 40 мг/кг веса, подкожно. В бедренную вену и артерию животных вводили катетеры для последующей внутривенной инъекции флуоресцентного индикатора проницаемости. Все исследования функциональных свойств проводили на одном типе микрососудов брыжейки толстой кишки крыс - венулах диаметром 20-25 мкм. Ход эксперимента наблюдали и контролировали на экране монитора и записывали на видеопленку для последующего компьютерного анализа исследуемых параметров и статистической обработки. Обработку видеоматериалов полученных в результате проведенных исследований производили с помощью программно-аппаратного комплекса, позволяющего проводить покадровый геометрический, скоростной и количественный анализ видеоизображения. Исследования проницаемости микрососудов проводили методом флуоресцентной биомикроскопии с расчетом коэффициента проницаемости по соотношению внутрисосудистого и интерстициального содержания ФИТЦ-глобулина, вводимого в кровоток в дозе 25мг/кг веса. Для исследования адгезивных свойств использовали метод исследования четко контрастированных в кровотоке лейкоцитов. Адгезированными считали неподвижные лейкоциты в течение 5 секунд. Для данной группы измеряли количество лейкоцитов/мм2 сосудистой стенки.

Для изучения реактивности микрососудов при остром воздействии мелатонина производили исходную видеозапись изменений исследуемых функциональных параметров и через 15 минут после внутривенного введения суточной дозы раствора мелатонина (2 мг/кг массы тела животного в 0,1 мл 0,9% раствора NaCI).

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки цифрового материала, полученного в результате экспериментальных исследований использовали стандартные статистические приемы с расчетом парного и непарного критериев достоверности Стьюдента, коэффициента корреляции, а также программу статистической обработки данных "Statgraphics", версия 3.0 («Основные методы статистического исследования» под редакцией проф. Н.И.Вишнякова, 1997), которые были реализованы с помощью

персонального компьютера и приложения MS Excell к программной операционной системе MS Windows 2000XP (Microsoft Corp., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Гистологическая характеристика образцов спорадических опухолей толстой кишки человека.. В результате предварительного гистологического анализа 29 из 45 предварительно замороженных образцов опухолей толстой кишки были избраны для последующих молекулярно-генетических исследований. Образцы опухолей, которые были исключены из исследований, при гистологическом анализе были охарактеризованы по одному из следующих критериев: 1) опухолевая ткань в срезах отсутствовала или была повреждена при размораживании (4 случая); 2) из исследуемого образца опухолевой ткани не представлялось возможным получить достаточное количество опухолевых клеток для выделения ДНК (8 случаев). Все избранные исследуемые образцы опухолей были охарактеризованы согласно Международной гистологической классификации опухолей толстой и прямой кишки ВОЗ. Наибольшее количество опухолей, в нашем исследовании составляли аденокарциномы умеренной степени дифференцировки (11 из 29 образцов) и низкодифференцированные аденокарциномы (10 из 29 образцов). Остальные формы опухолей составляли: 5 аденоматозных полипов, 2 аденокарциномы высокой степени дифференцировки и 1 ворсинчатая аденома.

Молекулярно-генетический анализ гена коннексина-32 и коннексина-43 в ДНК спорадических опухолей толстой кишки. В результате гетеродуплексного анализа с праймерами для фрагментов А, В (ген коннексина-32) и фрагментов А, В, С (ген коннексина-43) атипичная миграция амплификата в полиакриламидном геле была обнаружена только при исследовании фрагмента С гена коннексина-43. При этом признаки аномальной миграции исследуемых амплификатов были представлены только в 5 из 29 исследованных случаев (рис.2).

В результате прямого секвенирования в 5 образцах С-терминального фрагмента гена коннексина-43 с признаками аномальной миграции-гетеродуплексов в полиакриламидном геле были обнаружены следующие мутации: делеция нуклеотида - 1139delC с заменой аминокислоты Ala на Val в кодоне 311 (2 образца); вставка нуклеотида - 1280insA с заменой аминокислоты Не на Asn в кодоне 358 (1 образец). Два других случая

представляли собой «молчащие» мутации - без замены аминокислот: замена нуклеотида С>Т в кодоне 341 (1 образец) и вставка нуклеотида Т в 3 позиции за рамкой считывания кодирующего участка гена (1 образец).

Рис.2. Изменения электрофоретической подвижности С-терминалъного фрагмента гена коннексина-43 по данным гетеродуплексного анализа 29 образцов разных форм опухолей. Ауторадиографический снимок полиакриламидного геля. Цифрами обозначены случаи с аномальным характером миграции амплифиированных генетических фрагментов.

На рисунке 3 представлена схематическая пространственная характеристика выявленных генетических нарушений коннексина-43 человека при колоректальном раке.

Рис.3. Схематичное изображение топологии мутационных изменений коннексина-43 в аденокарциномах толстой кишки человека. Пунктирной линией отмечены новые аминокислотные последовательности, образующиеся в результате мутаций гена коннексина-43. 0 — «молчащие»мутации (беззамены аминокислот).

Опухолевая специфичность выявленных генетических нарушений была достоверно подтверждена сопоставлением нуклеотидной последовательности мутированного участка гена коннексина-43 в опухолевой ткани с соответствующим неизменённым участком гена в клетках крови каждого из пациентов. Все мутации были обнаружены в опухолях, локализованных в ректосигмоидальном отделе толстой кишки. При этом, исходя из гистологической классификации, мутационные изменения гена коннексина-43 преимущественно (4 из 5 случаев) соответствовали определённой форме колоректального рака аденокарциномы умеренной степени дифференцировки»; 1 случай был представлен аденокарциномой низкой степени дифференцировки.

В результате расшифровки аминокислотной последовательности коннексина-43, кодируемой соответствующим мутированным участком гена было обнаружено, что в 3 из 5 случаев сдвиг рамки считывания после мутаций 1139delC и 1280insA приводит к преждевременной остановке считывания белка только через 36 и 20 аминокислот, соответственно. При этом в структуре карбоксильного участка мутированного коннексина-43 появляются новые олигопептиды:

Ala 311 Val: VITVQNKIEWGRREAPSLTPMHSLLISPMITRILKN

11е 358 Asn: NCGPATFKQSQQSCQQQTSA

В результате поиска возможных гомологичных пептидов в общедоступной информационной базе данных всех известных белках (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) для обнаруженных нами протеинов не было идентифицировано 100% гомологии по аминокислотному составу ни с одним из известных белков человека или животных.

Иммунофлуоресцентное исследованиеэкспрессии коннексина-43 с использованием двух антител кразнымучасткам белковой молекул в образцах спорадических опухолей толстой кишки. Для подтверждения экспрессии мутированного белка коннексина-43 образцы опухолевых тканей с выявленными генетическими мутациями были исследованы иммунофлуоресцентным методом с использованием двух антител к разным участкам молекулы коннексина-43.

На рисунке 4А показано, что клетки нормального кишечного эпителия были окрашены антителами к петле коннексина-43 (красный цвет) и антителами «дикого типа» (зеленый цвет) примерно в одинаковом соотношении. В 3 из 5 образов опухолей с мутациями гена коннексина-43 были обнаружены очаговые скопления опухолевых клеток, утрачивающих иммуногенность к антителам «дикого типа», что проявлялось в виде окраски клеток только красным цветом (рис.4Б).

При этом изменения флуоресценции, свидетельствующие о наличии мутированных белков, проявлялись в опухолевых клетках с признаками дисплазии, проявляющих выраженные инвазивные свойства (рис.4В).

Рис.4. Иммунофлуоресцентная детекция мутированного коннексина- 43 с использованием двух высокоспецифичных поликлональных антител кразным участкам молекулы белка: а) крипта слизистой оболочки толстой кишки; б) опухолевый участок; в) инвазия опухолевых клеток в мышечную ткань. Лазерная конфокальная микроскопия (микроскоп Pascal 510Zeiss, Германия).

Таким образом, в результате молекулярно-генетического и иммунофлюоресцентного анализа в клетках опухолей толстой кишки были обнаружены опухоль-специфические мутации гена коннексина-43. Мутации были характерны преимущественно для аденокарцином умеренной степени дифференцировки (4 из 11 всех исследованных случаев) и аденокарцином низкой степени дифференцировки (1 из 10 всех исследованных случаев), локализованных только в ректосигмоидальном отделе толстой кишки. При этом мутационных изменений коннексина-43 в опухолях и клетках с менее выраженными признаками дисплазии выявлено не было. Обнаруженные нами мутации нарушали структуру карбоксильного участка коннексина-43 и приводили к образованию новых пептидов, обладающих потенциальными антигенными свойствами, так как не было выявлено перекрестной гомологии по аминокислотному составу ни с одним из известных в настоящее время белков человека.

А

Б

В

Экспериментальная часть исследований

Ниже приводится описание групп экспериментальных исследований с указанием количества животных. В дальнейшем каждая серия экспериментов приводится, исходя из указанного списка.

Группа 1. Контроль (п = 18).

Группа 2. Контроль + длительное введение мелатонина (п = 10).

Группа 3. Канцерогенез, индуцированный ДМГ в 09:00 (п = 14).

Группа 4. Канцерогенез (ДМГ) в 09:00 + мелатонин (п = 14).

Группа 5. Канцерогенез (ДМГ) в 21:00 (п = 10).

По данным макроскопического анализа наибольшее количество индуцированных опухолей у исследуемых животных было локализовано в нисходящем отделе толстой (у 37% крыс) и в прямой кишке (у 30% крыс). При гистологичесокм исследовании все индуцированные опухоли кишечника были классифицированы как аденокарциномы.

Данные о частоте возникновения и размерах опухолей толстой кишки, индуцированных в разное время суток, представлены в таблице 3. Среднее количество опухолей толстой кишки у крыс было примерно одинаковым как в группе с вечерним, так и с утренним канцерогенным воздействием. Средний размер опухолей у крыс при утреннем введении канцерогена имел тенденцию к увеличению на 23% по сравнению с тем же показателем при вечернем канцерогенном воздействии.

Таблица 3

Параметры канцерогенной активности 1,2-диметилгидразина (ДМГ)у крыс при

его введении в утреннее и ночное время

Параметры Группа 3 ДМГ (утро) Группа 5 ДМГ (вечер)

Количество животных п=23 п=24

Всего опухолей Количество крыс с опухолями Среднее количество опухолей на I животное Средний размер опухолей, мм2 59 21 (91%) 2,8 ± 0,4 27,2 ± 3,6 50 18 (75%) 2,8 ± 0,5 22,1 ±0,3

Кроме того, в при утреннем введении ДМГ наибольший процент составляли опухоли размером 11-50мм2 (56%), а наименьший - опухоли размером более 50мм2 (17%). В группе с вечерним воздействием ДМГ наибольший процент составляли опухоли размером до 10 мм2 (63%), а наименьший - опухоли размером более 50мм2 (8,3%).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии и генетический анализ коннексинов 32 и 43 в индуцированных опухолях толстой кишки. Общая картина изменений экспрессии коннексина-32 и коннексина-43 в опухолях у крыс на поздней стадии канцерогенеза толстой кишки, индуцированного ДМГ, представлена на рисунке 5. При иммуногистохимическом исследовании нормальной слизистой оболочки толстой кишки отмечали достаточно выраженную окраску антителами к

обоим коннексинам и наличие в исследуемой ткани межклеточных щелевых контактов. Наиболее выраженные скопления коннексинов наблюдали преимущественно в базальных участках кишечных крипт. При иммуногистохимическом исследовании опухолей толстой кишки у крыс выявлен следующий общий характер нарушений экспрессии коннексинов. В опухолевых тканях коннексины распределялась неравномерно, преимущественно в виде скоплений, локализованных в инвазивном фронте опухолевых клеток. На клеточном уровне локализация коннексинов была смещена из мембран в цитоплазму и перинуклеарную зону опухолевых клеток, что в итоге приводит к функциональным нарушениям щелевых контактов в опухолях.

Коннексин-32 Коннексин-43

участок инвазии опухоли участок инвазии опухоли

Рис.5. Микроскопическая картина экспрессии коннексина 32 и коннексина 43 в криптах нормальной слизистой обочочки толстой кишки и вучастках инвазии опухолей в мышечную ткань. Фоновая окраска ткани: гематоксилин-эозин, увеличение объектива - х20. Стрелками указаны участки и направление инвазии опухолевых клеток в мышечную ткань.

При скрининговом гетеродуплексном анализе генов коннексина-32 и коннексина-43 в 38 индуцированных опухолях толстой кишки у крыс не было обнаружено характерных признаков атипичной миграции амплификатов кодирующей части исследуемых генов.

В серии исследовании влияния экзогенного мелатонина на опухолевую прогрессию было показано, что длительное введение мелатонина приводило к достоверному снижению частоты возникновения и средних размеров ДМГ-индуцированных опухолей толстой кишки у крыс. В частности, среднее количество опухолей на фоне длительного введения мелатонина (п=14) было достоверно меньше по сравнению с тем же показателем без введения мелатонина (п=24) и составляло 1,7 ± 0,3 опухолей (без мелатонина: 2,8 ± 0,5 опухолей, р<0,05). Средний размер опухолей на фоне введения мелатонина также достоверно уменьшался сравнению с тем же показателем в группе без введения мелатонина и составлял 9,3 ± 1,8 мм2 (без мелатонина: 24,7 ± 3,9 мм2, р<0,01).

На фоне длительного введения мелатонина характер экспрессии коннексинов в опухолях толстой кишки у крыс отличался от характера экспрессии в опухолях без воздействия мелатонином в следующем: на тканевом уровне отмечали более равномерное распределение межклеточных щелевых контактов в опухолевой ткани; на клеточном уровне - преобладающая локализация коннексинов смещалась из цитоплазмы и перинуклеарной зоны обратно в область клеточных мембран.

Коэффициент проницаемости у животных с опухолями был достоверно выше по сравнению с контролем и составлял 4,28 ± 0,86 х 105 см/с (контроль - 1,57 ± 0,35 х 10-5 см/с, р=0,04). При длительном введении мелатонина проницаемость у контрольных животных имела тенденцию к снижению на 12% (р=0,3), а у крыс-опухоленосителей была повышена на 30% (р=0,2). Количество адгезированных лейкоцитов эндотелию в группе животных с индуцированным канцерогенезом кишечника также было достоверно увеличено по сравнению с контролем и составляло 1,15 ± 0,30 Х103/ММ2 (контроль: 0,35± 0,04 х103/мм2, р<0,05). На фоне длительного воздействия мелатонина адгезивность эндотелия в контрольной группе крыс имела тенденцию к увеличению на 23% (р=0,6), а у животных-опухоленосителей достоверно уменьшалась на 52% (р=0,02).

При остром введении мелатонина в контрольной проницаемость микрососудов увеличивалась на 6% (р>0,05), а в группе животных после

длительного введения мелатонина - на 66% (р=0,06). В то же время количество адгезированных лейкоцитов у крыс после острого воздействия мелатонином достоверно увеличивалось в 3,1 и в 2,9 раза (р<0,01). Проницаемость микрососудов у животных-опухоленосителей имела тенденцию к снижению на 39% (р>0,1), а у животных фоне длительного введения мелатонина - на 19% (р>0,05), исходно повышенное количество адгезированных лейкоцитов у крыс с опухолями после острого воздействия мелатонином продолжало увеличиваться на 31% (р>0,08), а на фоне введения длительного введения мелатонина -было достоверно увеличено по сравнению с исходным уровнем на 51% (р=0,02).

Таблица 4

Изменение концентрации мелатонина в эпифизе и крови у крыс с

индуцированными опухолями кишечника

Группа животных Концентрация мелатонина в эпифизе (на ЮОмкг белка), МЕЛ(э), нг/эпифиз Концентрация мелатонина в крови, МЕЛ(к) пмоль/мл Коэфф, коррел. МЕЛ(э) и МЕЛ(к), г

Контроль 3,6 ± 0,4 10,2 ±3,1 + 0,8

Контролы- МЕЛ 3,9 ± 0,6 32,4 ± 16,9 + 0,8

ДМГ 4,1 ±0,9 72,4 ± 29,3 * -0,7

ДМГ + МЕЛ 9,6 ± 2,6 * 30,1 ±7,4 + 0,4

Примечание: МЕЛ - мелатонин, ДМГ - животные с индуцированными опухолями кишечника (группы 3 и 5), * - разница данных достоверна при р <0,05.

Результаты исследования секреторной функции эпифиза и состояния внеэпифизарной секреции мелатонина у крыс индуцированным канцергенезом кишечника на фоне экзогенного введения данного гормона представлены в таблице 4. Установлено, что в группе крыс-опухоленосителей на фоне хронического введения мелатонина концентрация мелатонина в эпифизе была достоверно увеличена в 2,3 раза, а концентрация мелатонина в крови - в 2,4 раза по сравнению с группой животных-опухоленосителей без введения мелатонина. При этом важно отметить, что у животных с индуцированными опухолями толстой кишки наблюдалось значительное снижение взаимосвязи показателей концентрации мелатонина в крови и в эпифизе по сравнению с контрольными животными, а длительное введение мелатонина приводило к частичному восстановлению коэффициента корреляции у животных с опухолями до среднего уровня прямой зависимости.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Методом непрямого молекулярно-генетического анализа и секвенирования в сопрадических аденокарциномах толстой кишки у пациентов нами впервые были обнаружены мутации гена коннексина-43. При этом наиболее серьезные генетические изменения были представлены делецией 1139delC и инсерцией 1280insA нуклеотидов с заменой аминокислот соответственно в 311 и 358 позиции карбоксильного участка белка коннексина-43. Тем самым, обнаруженные нами мутации на молекулярно-генетическом уровне достоверно подтверждают современные теоретические представления о важной роли нарушений межклеточных щелевых контактов в патогенезе злокачественных опухолей. Ранее в экспериментальных исследованиях было показано, что большинство злокачественных клеточных линий теряли опухолеродность после трансфекции в них генов коннексинов. В частности, трансфекция коннексина-43 приводила к реверсии неопластического фенотипа в человеческих линиях клеток рака яичников (Fernstrom M.J. et al., 2002), а клетки глиомы крыс (Naus C.C. et al., 1992) и трансформированные фибробласты мышей (Rose В. et al, 1993) после трансфекции в них гена коннексина-43 не вызывали имплантационных опухолей у бестимусных мышей. Подобные данные уменьшения роста имплантационных опухолей были получены также при трансфекции в линии злокачественных клеток печени человека гена коннексина-32 (Eghbali В. et. al., 1991) и гена коннексина-26 (Muramatsu A. et al., 2002). Согласно современным представлениям, одним из основных механизмов ингибирующего влияния коннексинов на опухолевый рост является взаимодействие их цитоплазматического карбоксильного участка с каскадом внутриклеточных сигнальных белков (Duffy H.S. et al., 2002; Plotkin L.I., Bellido Т., 2001), контролирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток (Furlan F. et al., 2001; Krutovskikh V.A., 2002). В частности, недавно было показано прямое или опосредованное взаимодействие коннексина-43 с такими белками и молекулярными системами регуляции клеточных функций как Е-кадхерин (Hernandez-Blazquez F.J., 2001), Wnt-1, Р-катенин (Ai Z. et al., 2000), ZO-1 (Giepmans B.N., Moolenaar W.H., 1998; Toyofuku T. et al., 1998). Кроме того, трансфекция гена коннексина-43 в клетки приводила к снижению экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл: циклины A, Dl, D2, циклин-зависимые киназы CDK5, CDK6 (Chen S.C.et al., 1995).

Обнаруженные нами опухоль-специфические мутации гена коннексина-43, которые приводят к выраженному снижению экспрессии нативного белка, в комплексе с другими молекулярными маркерами могут быть использованы для ранней диагностики злокачественной прогрессии и прогноза хирургического лечения колоректального рака. При этом достоверным способом быстрого обнаружения мутированного коннексина-43 в опухолевых клетках может быть метод иммунофлуоресценции с двумя антителами к разным участкам молекулы, который мы использовали в настоящих исследованиях. В недавнем аналитическом обзоре J. Haier с соавторами (2000), опубликованном в в известном журнале "Annals of Surgery" были суммированы данные о большинстве поверхностных молекул и их внутриклеточных посредников, например: некоторые интегрины, Е-кадхерин, ß-катенин, CD44-v6, sLe\ раково-эмбриональный антиген и другие, - которые имеют важное диагностическое и прогностическое значение при хирургическом лечении колоректального рака. Более того, ранее было достоверно установлено, что снижение экспрессии коннексина-43 в опухолевых тканях также является достоверным критерием опухолевой прогрессии. В частности, D.W.Laird с соавторами (1999) показали, что выраженное снижение экспрессии мРНК коннексина-43 в гистологических образцах и в клеточных линиях рака молочной железы является достоверным показателем профессии заболевания, как у человека, так и у животных. Интересно отметить, что уровень экспрессии коннексина-43 в данных исследованиях не зависел от таких значимых показателей пролиферации клеток молочной железы, как - концентрация эстрогена, прогестерона и состояние рецептора егЬВ2. Снижение экспрессии коннексина-43 было также характерно для злокачественной прогрессии опухолей эндометрия (Schlemmer S.R. et al., 1999) и головного мозга (Soroceanu L. et al., 2001).

В мутированной части коннекина-43 нами были выявлены новые аминокислотные последовательности, возникающие в результате сдвига рамки считывания гена. Возникающие новые олигопептиды не имеют 100%-ой гомологии с известными белками человека. На наш взгляд дальнейшие исследования в этом направлении являются крайне интересными для разработки нового перспективного подхода в лечении колоректального рака- генной и направленной молекулярной терапии (Орлова Р.В., 2002). В этой связи важно отметить, что по данным М. Sansonet с соавторами (2002) трансфекция генов коннексинов в опухолевые клетки может улучшать цитостатический эффект химиопрепаратов путем индукции «эффекта свидетеля» (bystander effect),

при котором клетки не подвергшиеся воздействию изменяются соответственно поврежденным клеткам. В данных исследованиях трансфекция гена коннексина-43 в клетки глиомы крыс с предварительно введенным геном тимидин киназы, приводила к достоверному усилению токсического эффекта химиопрепарата ганцикловира in vitro. Кроме того, с точки зрения терапевтической перспективы использования обнаруженных нами новых данных об опухоль-специфических мутациях коннексина-43 крайне интересными представляются успешные результаты подавления роста глиом у крыс in vivo путем соматической трансфекции в них гена коннексина-43 (Xia Z. et al., 2002).

В результате проведенных нами исследований было показано, что циркадианный ритм организма оказывает достоверное влияние на канцерогенез в толстой кишке, индуцируемый ДМГ, у крыс, и проявляется в эффекте замедления профессии опухолей при ведении канцерогенного вещества в ночное время. Наши данные совпадают с исследованиями циркадианных особенностей канцерогенеза, проведенными ранее другими исследователями. В частности, известно, что введение крысам в утренние часы азоксиметана - одного из проксимальных метаболитов ДМГ - приводило к образованию в 2 раза большего числа гиперпластических аберрантных крипт по сравнению с введением азоксиметана в ночное время (Pereira M.A. et al, 1994). При этом авторы рассматривали данные изменения как маркер предракового процесса в толстой кишке. Важным фактором реализации канцерогенного воздействия в зависимости от циркадианного ритма является также исходное состояние тканей-мишеней в момент инициации канцерогенеза. Например, в слизистой оболочке толстой кишки у крыс при введении ДМГ в ночное время больше, чем днем, выражены уровень апоптоза (Ijiri К., 1989) и активность ферментов репарации мутаций ДНК (Marchenay С, et al., 2001).

Циркадианные особенности канцерогенеза преимущественно определяются влиянием мелатонина - гормона, секретнруемого в эпифизе и определяющего световой суточный ритм системных изменений в организме (Анисимов В.Н., 1998). В наших исследованиях экзогенное введение мелатонина с питьевой водой в дозе 20 мг/л также приводило к достоверному снижению количества и средних размеров индуцированных опухолей кишечника у крыс. Эти данные согласуются с результатами В.Н Анисимов с соваторами (2000), в которых при введении мелатонина в той же дозе снижалась множественность и гл>бина инвазии опухолей, повышалась степень их дифференцировки. В

качестве ведущего механизма онкостатического действия мелатонина на канцерогенез толстой кишки рассматриваются антиоксидантые свойства этого гормона.

Паранеопластическая дисфункция эндотелия микрососудов в органах и тканях, расположенных удалённо от первичного узла злокачественных клеток также является важным системным фактором генерализации злокачественного процесса (Петрищев Н.Н., Дубина М.В., 1999). В частности при опухолях толстой кишки, индуцированных ДМГ у крыс, ранее нами было установлено увеличение проницаемости и адгезивных свойств эндотелия микрососудов, которое зависело от стадии опухолевой прогрессии. При этом длительное введение мелатонина у крыс с индуцированными опухолями толстой кишки приводило к восстановлению и нормализации таких исходно измененных показателей профессии опухолей, как проницаемость и адгезивность микрососудов, характер экспрессии коннексинов межклеточных щелевых контактов. Наши данные согласуются с результатами ранее проведенных исследований in vitro, в которых влияние мелатонина выражалось в снижении уровня экспрессии молекул адгезии в эндотелиальных клетках и нейтрофилах (Recchioni R, et al., 1998; Sasaki M, et al. 2002) и стимуляции экспрессии коннексина-32 в клетках печени крыс (Kojima Т. et al., 1997). Интересно, что мелатонин именно в физиологической концентрации способен стимулировать нелинейную экспрессию щелевых контактов в клеточных культурах эмбриональных фибробластов и гепатоцитов in vitro, а также в крови у мышей in vivo (AUbeda et. al., 1995; Blackman C.F. et. al., 2001). Предполагается, что стимуляция экспрессии щелевых контактов является одним из важных механизмов антиинвазивных и противометастатических свойств мелатонина (Cos S., Fernandez R., 2000).

Увеличение показателей опухолевой прогрессии в экспериментальной части наших исследований сочеталось с неизменным показателем содержания мелатонина в эпифизе и достоверным увеличением концентрации этого гормона в крови у животных с индуцированными опухолями толстой кишки. Таким образом, важную роль в механизмах онкостатических свойств мелатонина, по-видимому, играет его внеэпифизаная секреция в клетках желудочно-кишечного тракта, обнаруженная ранее И.М. Кветным и И.М.Левиным (1987). Авторы данного исследования достоверно показали, что при злокачественных новообразованиях в желудочно-кишечном тракте, в том числе и при колоректальном раке, изменяется поведение всей системы

мелатонин-продуцирующих клеток (как эпифизарных, так и внеэпифизарных). При этом возникновение и рост опухоли в желудочно-кишечном тракте приводит, с одной стороны, к гиперплазии и усилению активности внеэпифизарных клеточных источников мелатонина, а с другой стороны, к дегенеративным изменениям и ослаблению синтеза мелатонина в клетках эпифиза (Петров С. В., 1984; Hajsu S. I. et al., 1972; Lapin V. et al., 1981). Если в норме суточный ритм продукции мелатонина слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта подчинен суточному ритму его образования в эпифизе, то при возникновении и развитии опухолей клетки желудочно-кишечного тракта, продуцирующие мелатонин, приобретают свой, независимый от эпифиза, ритм. В результате подобного расщепления ритмы могут стабилизироваться в противофазе, то есть один из источников синтеза мелатонина приобретает вместо ночного дневной максимум секреции гормона (Кветной И.М. и Левин И. М., 1987). Длительное введение экзогенного мелатонина в наших исследованиях приводило в частичному восстановлению коррелятивных отношений между его концентраций в эпифизе и в крови, что позволяет предположить одну из возможных перспектив применения- этого нейроэндокринного гормона- как потенциального терапевтического- фактора, восстанавливающего системные нарушения у пациентов с колоректальным раком.

ВЫВОДЫ

1. Прогрессия определенных форм спорадического колоректального рака, а именно аденокарцином разной степени дифференцировки, часто и избирательно сопровождается специфическими соматическими мутациями гена коннексина-43 межклеточных щелевых контактов.

2. Мутационные повреждения коннексина-43 возникают на относительно поздних стадиях развития злокачественных опухолей толстой кишки и ассоциированы с проявлением опухолевыми клетками инвазивных свойств.

3. Обнаруженные генетические мутации коннексина-43 полностью изменяют структуру многофункционального карбоксильного участка, участвующего во взаимодействии с комплексом цитоплазматических сигнальных белков, и таким образом детерминирует вовлечение новых молекулярных механизмов в патогенез колоректального рака.

-294. Высокий уровень эндогенной секреции мелатонина, обусловленный естественным циркадианным ритмом, при канцерогенном воздействии достоверно замедляет прогрессию индуцированных опухолей кишечника.

5. Более выраженное достоверное увеличение концентрации мелатонина в крови, чем в эпифизе у крыс на поздней стадии развития индуцированных опухолей толстой кишки, подтверждает значимость внеэпифизарной секреции мелатонина в механизмах его онкостатического действия.

6. Взаимодействие местных и системных факторов в патогенезе опухолевой прогрессии подтверждается однонаправленным нормализующим действием мелатонина на изменение характера экспрессии коннексинов межклеточных щелевых контактов в опухолевых тканях и паранеопластические изменения функциональных свойств микрососудов у крыс с индуцированными опухолями толстой кишки.

7. Высокая специфичность обнаруженных нами генетических нарушений щелевых контактов, детерминирующих межклеточное информационное взаимодействие, а также достоверные, но обратимые нарушения внеэпифизарной секреции мелатонина и функциональных свойств эндотелия микрососудов, взятые вместе, с патогенетической точки зрения характеризуют начальную стадию опухолевой профессии и могут быть использованы для дальнейшего поиска и разработки новых подходов в диагностике и лечении колоректального рака.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В алгоритм ранней диагностики рака толстой кишки целесообразно включить исследование мутаций гена коннексина-43 и анализ содержания мелатонина в плазме крови.

2. Мутационные изменения коннексина-43 сопровождаются проявлением инвазивных свойств опухолевыми клетками, что должно учитываться в прогнозе хирургического лечения колоректального рака.

3. Обнаружение мутированной формы коннексина-43 в опухолевых тканях или "регионарных лимфоузлах определяет необходимость проведения адьювантной терапии.

4. Повышенное и увеличивающееся содержание мелатонина в крови в дневное время может характеризовать опухолевую профессию в желудочно-кишечном тракте, что должно учитываться при диагностическом обследовании пациентов с подозрениями на злокачественный процесс в толстой кишке.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Петрищев Н.Н., Дубина М.В. Дисфункция эндотелия микрососудов как фактор метастазирования //Вопросы онкологии. 1999.-Т.45.-№ 5.-С484-492.

2. Петрищев Н Н., Власов Т.Д., Дубина М.В. Дисфункция эндотелия -ключевой фактор нарушений микроциркуляции //Вестник Российской ВМА.-1999.-№2.-С.41-42.

3. Дубина М.В. Влияние дексаметазона на функциональные свойства микрососудов у крыс с лимфосаркомой Плисса //Вопросы онкологии. 1999.-Т.45.-№ 5.-С.655-659.

4. Петрищев Н.Н., Гавришева Н.А., Власов Т.Д., Дубина М.В. Пантелеев В.Г. Изучение функциональных свойств микрососудов брыжейки у крыс //Физиологический журнал им. И.М.Сеченова.-2000.-Т.86.-С.358-С.361.

5. Дубина М.В., Петрищев Н.Н., Панченко А.В., Фёдоров Е.С., Анисимов

B.Н. Циркадианные особенности канцерогенеза толстой кишки, индуцированного 1,2-диметилгидразином у крыс //Вопросы онкологии.-2002.-Т.48.-№З.-С.ЗЗ 1 -334.

6. Яицкий Н.А., Дубина М.В., Васильев СВ., Попов Д.Е., Крутовских В.А. Научно-клиническое значение молекулярно-генетических изменений межклеточных щелевых контактов при раке толстой кишки //Вестник РАМН- 2003.-Т. 10.-С.24-29.

7. Яицкий Н.А., Васильев СВ., Попов Д.Е., Дубина М.В. Молекулярно-генетические исследования межклеточных щелевых контактов при колоректальном раке //Медицинский академический журнал.-2003.-Т.З.-№.3.-

C.88-95.

8. Дубина М.В. Роль коннексинов межклеточных щелевых контактов в патогенезе злокачественных новообразований //Медицинский академический журнал.-2003.-Т.З.-№.3.-Прил.4.-С. 112.

9. Яицкий Н.А., Крутовских В.А., Дубина М.В., Васильев СВ., Попов Д.Е., Петрищев Н.Н., Шостка К.Г., Роман Л.Д. Способ диагностики злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки //Патент на изобретение № КШ213781С1, 10.10.2003 (приоритет от 18.12.2002г.).

10. Яицкий Н.А., Васильев СВ., Попов Д.Е., Дубина М.В., Крутовских В.А Новый генетический маркер прогрессии рака толстой кишки /Материалы III-го международного хирургического конгресса «Актуальные проблемы современной хирургии» Москва, 22-25 февраля, 2003, С. 120.

11. Яицкий Н.А., Дубина М.В., Васильев СВ., Попов Д.Е., Крутовских В.А. Диагностическое значение генетических нарушений коннексина-43 при колоректальном раке /Материалы 1-го Российского съезда колопроктологов с международным участием, г. Самара, 1-3 октября 2003 г., С.328-329.

12.Лицкий Н.А., Васильев СВ., Дубина MB. Новые возможности молекулярных исследований в диагностике рака толстой кишки /Материалы VII-го Российского онкологического конгресса. Москва, 23-25 ноября 2003г., С.111.

13.Dubina M.V., Gavrisheva NA The changes of skin and mesenteric rhicrovascular permeability in adaptation to hypoxia in rats //Adv. Exp. Med. Biol.-1995.-Vol.388. P.363-366.

14. Dubina M.V., Petrishchev N.N., Anisimov V.N. Microvascular endothelium dysfunction in rats bearing 1,2-dimethylhydrazine-induced colon tumors //Cancer Letters.-1999.-Vol.l44.-N.2.-P.125-P.129.

15. Dubina, M.V., Petrishchev, N.N., Anisimov, V.N. Microvascular endothelium dysfunction during, growth of transplanted lymphosarcoraa and glioma in rats //Experimental and Clinical Cancer Research.-1999.-Vol. 18.-PJ37-P.542.

16. Dubina M.V., Yaitskii NA, Popov D.E., Kratovskikh V. Connexin 43 is mutated in human colon cancer, but not connexin 32 /Abstract - Book of International Gap Junction Conference, Honolulu, Hawaii, USA, 4 August - 9 August, 2001.-P.115.

17. Krutovskikh V., Yaitskii N.A., Popov D.E., Dubina M.V. Frequentes mutations de la Cx43 dans le cancer colique humain: un example representatif de l'implication specifique d'une connexine dans un tissu particulier /Abstract Book of Conference "La Communication Jonctionnelle Intercellulaire. Etat des lieux", Poiters, France, 4 September 10 - September 11,2001.-P.28.

18. Dubina M.V., Iatckii NA, Popov D.E., Vasil'ev S.V., Krutovskikh V.A. Connexin 43, but not connexin 32, is mutated at advanced stages of human sporadic colon cancer //0ncogene.-2002.-Vol.21.-N.32.-P.4992-P.4996.

19. Kratovskikh V., Yaitskii N.A., Popov D.E., Vasil'ev S.V., Dubina M.V. Connexin 43 is frequently mutated at advanced stages of human sporadic colon cancer /Abstract Book of 93 Annual Meeting of American Association for Cancer Research, San Francisco, California, USA, 6 April - 10 April, 2002.

20. Krutovskikh V., Yaitskii N.A., Popov D.E., Vasil'ev S.V., Dubina M.V. Mutational alterations of connexin 43 associated with advanced stage of progression of human colon cancer /Abstract Book of the meeting on Cancer Detection and Prevention, Paris, France.-2002.-V.26.-Suppll-P.4489.

21.Yaitski N.A.,.Vasiliev S.V., Popov D.E., Dubina M.V., Kratovskikh V.A Diagnostic implication of connexin-43 gene mutations in human colorectal cancer /Techniques in Coloproctology, Journal of 9-th Biennial Congress of European Council of Colorpoctology, Athens, Greece, May 2003, Vol.7 - Suppl.l.-P.S6.

№-8 9 18

Лицензия от ИД № 00597 от 15.12.99 Подписано в печать 12.03.04. Усл. печ. л. 2,0 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ 295/04 197089, Санкт - Петербург, ул. Л. Толстого 6/8 Издательство СПбГМУ