Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль клеток лимфатических узлов в продукции иммуномодуляторов в иммунном организме

-Л 9 2

у _ -

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

НОВИКОВ Владимир Иванович

УДК 612.112.94 : 017.1.064.08

РОЛЬ КЛЕТОК ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ В ПРОДУКЦИИ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ КЛЕТКАМИ КОСТНОГО МОЗГА В ИММУННОМ ОРГАНИЗМЕ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

) \

Москва — 1992

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР

Научный консультант -

Академик АН и АМН СССР,профессор Р. Е Петров

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Ю. К. Токмачев доктор медицинских наук, профессор Л. Е Коваль чук доктор медицинских наук, профессор Ю. И. Зимин Ведущее учреждение - 2-й Московский медицинский институт им. Е И, Пирогова

'Защита состоится "<2-^' _1992 г. в ^^ ■

часов на заседании Специализированного совета Л 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу': Москва,115 478,Каширское шоссе,д. 24,корп. 2 '

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан "/О" 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета '

доктор биологических наук А. Е Колобов

ад

¡Актуальность проблемы. Важнейшим направлением развития современ-"——НМ иммунологии является поиск возможностей регуляции функциональной активности клеток иммунной системы. Это связано с тем, что значительное число заболеваний протекает с различными формами нарушения иммунитета, требующими соответствующей коррекции (Петров Р. В. и др. 1985,

1989). За последние годы был достигнут значительный прогресс в области разработки лекарственных препаратов на основе биологически активных соединений эндогенного происхождения обеспечивающих направленное воздействие на различные этапы развития иммунных реакций (Чередеев А. Ей др., 1989, Chang et al, 1989). Большой интерес в этом плане вызывает такие медиаторы иммунитета как интерлейкины и интерфероны ( De Mayer et al, 1987, Borden et al. 1990 ).факторы тимуса (Арион ЕЯ ,

1990) и препараты,созданные на основе костного мозга (Петров Р. Е , Шхайлова А. А. , 1990, Степаненко Р. Е и др. , 1990, Степаненко P. а , 1992).

Следует отметить, что приоритет в области изучения роли костного мозга в иммунных реакциях принадлежит отечественным ученым. Широко известны в этом направлении работы Р. Е Петрова, А. А. Михайловой, Уаитова Р.Ы. и И.Г.Сидоровича (Петров Р.Е, Михайлова А.А. и др., 1972- 1990, Хаитов P.M. И др., 1975-1977, Сидорович ЯГ. И др., 1987-1990, Сидорович И. Г. , 1992), посвященные изучению медиаторов костномозгового происхождения. В опытах, проведенных как в культуре in vitro, так и in vivo было установлено, что костномозговые клетки интактных животных вырабатывают фактор, стимулирующий реакции клеточного и гуморального иммунного ответа в период их максимального развития (Петров Р. Е и др., 1975, Шхайлова А. А., Захарова ДА., 1985). Кроме того, клетки костного мозга при культивировании секрегируют супрессорный медиатор, оказывающий ингибирущее действие на развитие иммунных реакций в индуктивном периоде (Петров P. R и др. , 1977, Сидорович ЯГ., 1992).

Продуцируемые клетками костного мозга стимуляторные факторы пос-лузшли основой для создания нового лекарственного иммунокорригнрующе-го препарата - миелолида, успешно прошедшего различные фазы клинических испытаний и хорошо зарекомендовавшего себя при лечении различных патологий (Степаненко Р. Н., 1992). Однако, в экспериментах было установлено, что клетки костного мозга, выделенные от .иммунизированных животных, значительно снижают, а в некоторых случаях полностью утрачивают свою способность стимулировать антителогенез в продуктивном периоде (Петров Р.В., . Михайлова A.A. , 1974). Причем'процесс утраты стимуляторной активности зависел от антигена, применяемого для иммунизации доноров костного мозга и клеток-мишеней, на которые воздействуют костномозговые эйфекторы. Поскольку_сам антиген не попадает в костный мозг, а выявляемые при иммунизации изменения в стимуляторной активности клеток этого органа указывают на антигенную специфичность происходящих процессов можно предположить, что существенную, если не определяющую роль в них играет клетки лимфатических ув лов,дренирующих область введения антигена. Как известно, клетки этих органов накапливают (поглощают) до 99Х чужеродного материала (Drinker et al, 1934). Вполне вероятно, что клетки этих органов и определяют изменения,наблюдающиеся в других органах иммунитета и, в частности, в костном мозге.

В настоящей работе были предприняты попытки исследования взаимосвязи периферических (лимфатические узлы) и центральных (костный мозг) органов т....,унной системы в продукции клетками последних иммуно-регуляторных факторов.- Это принципиально новое направление актуально, так как позволит не только расширить теоретические представления о регуляторных механизмах, лежащих в основе выработки данных медиаторов в иммунном организме, но и ответить на принципиальный вопрос как же на организменном уровне происходит взаимодействие клеток костного мозга с клетками-мишенями, находящимися, как правило в периферических

органах иммунитета.

Цели и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью нас тоящей работы явилось выяснение роли клеток лимфатических узлов и вырабатываемых ими факторов в регуляции продукции клетками костного мозга различных иммуномодуляторов (миелопида и супрессорного фактора) в индуктивной и продуктивной фазах иммуногенеза.

В процессе проведения исследований решались следующие задачи:

1) Выяснить природу клеток, участвующих- в реализации феномена "кооперации клеток на уровне зрелых антигелопродуценгов", провести разработку способа тестирования биологической активности лекарственного препарата миелопида;

2) Выявить регуляторную роль клеток лимфатических узлов в иммунном . организме в ~ продукции различных иммуномодуляторов (миелопида и суп-рессорного фактора) клетками костного мозга;

3) Изучить биологические свойства фактора лимфатических узлов, осуществляющего регуляцию продукции костномозговых иммуномодуляторов;

4) Определить возможные пути миграции клеток, секретирующих стимуля-торные миелопептиды (миелопид), после антигенного воздействия;

5) Изучить свойства клеток и секретируемых ими медиаторов в лимфати-. ческих узлах на пике иммунной реакции.

Научная новизна исследований. Впервые продемонстрировано, что лимфатические узлы играют важную регуляторную роль в продукции иммуномодуляторов клетками костного мозга. Впервые был выявлен и охарактеризован фактор,секретируювдйся клетками лимфатических узлов в ранней стадии иммунной реакции, который и осуществляет контроль за выработкой миелопида и супрессорного фактора клетками костного мозга.

Впервые было показано, что медиатор, секретируемый клетками лимфатических узлов в раннем периоде иммуногенеза, при его одновременном введении с антигеном обладает выраженной адьювантной активностью: он стимулирует интенсивность клеточных и гуморальных иммунных реакций, а г-дв

также активирует систему мононуклеарных'фагоцитов.

Впервые установлено, что в периферической крови на 2-3 сутки и в самих . лимфатических узлах на 4-5 сутки после иммунизации появляются клетки, секретирующие антиген-специфический гуморальный фактор, стимулирующий антителогенез в продуктивном периоде. Клетками-мишенями действия этого медиатора являются, как установлено, те же клетки-мишени, на которые влияет лекарственный препарат-миелопид.

На основании полученного экспериментального материала впервые была сформулирована гипотеза о коммуникативно-регуляторн'ой роли клеток лимфатических узлов в продукции миелопида и супрессорног.о . фактора клетками костного мозга в иммунном организме.

Практическая значимость работы, расшифровка механизмов регулятор-" ного воздействия клеток лимфатических узлов на продукцию костномозговых иммуномодуляторов имеет важное практическое значение для разработки методов получения лекарственного препарата миелопида.'

Получен ряд гибридом, которые защищены авторскими свидетельствами N 1577356 "Штамм гибридных клеток животных-продуцент моноклональных антител к детерминанте 2 антигена чумного микроба" и N 1577357 "Штамм гибридных клеток животных - продуцент моноклональных антител к детерминанте 3 антигена чумного микроба". Цри использовании клеток полученных штаммов был разработан и включен в фармакопейную статью как метод оценки биологической активности лекарственного препарата миелопида N 4690401 с положительным решением от 20.12.1989 "Способ определения иммуностимулирующего действия миелопида".

Выявление в самих лимфатических узлах на пике иммунной реакции гуморального фактора, обладающего выраженными иммуностимуляторными свойствами создает • предпосылки для получения нового лекарственного, препарата(ов), оказывающего действие на интенсивность иммунных реакций в продуктивном периоде.

Полученная в работе совокупность экспериментальных данных и поло-

жений послужила основой для разработки нового иммуностимулятора, использующегося в иммунотерапии опухолевых заболеваний, что отражено в "Способе лечения злокачественных новообразований челюстно-лицевой области" заявки N 4763584 с положительным решением от 28.06.1991.

Основные положения выносимые на защиту:

1) Лимфатические узлы играют важную регуляторную роль в продукции иммуномодуляторов клетками костного мозга, которая подтверждается следующими положениями:

а) клетки лимфатических узлов, дренирующие область введения антигена, в ранние сроки после иммунизации вырабатывают гуморальный фактор. В состав этого фактора входят по крайней мере, три различных компонента: детерминанты антигена, детерминанты II класса главного комплекса гистосовместимости (I-A) и детерминанты.иммуноглобулина Q. Молекулярная масса секретируемого медиатора зависит от антигена, использованного для получения медиатора.

б) введение фактора, секретируемого клетками лимфатических узлов в раннем периоде развития иммунной реакции, интактным животным вызывает изменения в продукции иммуномодуляторов клетками костного мозга, подобные изменениям при инъекции самих антигенов: отмечается антиген-зависимая утрата стимулирующей (миелопидпой) активности и возрастание неспецифической супрессорной активности.

2) Утрата стимулирующей активности клеток костного мозга после введения интактным животным фактора, секретируемого клетками лимфатических узлов в раннем периоде развития иммунной реакции, сопровождается появлением клеток, обладающих подобной стимуляторной активностью, в крови животных на 2-3 сутки после иммунизации и на пике иммунной реакции в самих лимфатических узлах, дренирующих область введения антигена.

3) Клетки лимфатических узлов на пике иммунной реакции вырабатывают гуморальный фактор,обладающий антигенной специфичностью,который подобно лекарственному препарату миелопиду способствует : включению "молчащих" антителообразуювдх клеток в секрецию антител,усиливает формирование клеток иммунологической памяти при гуморальных иммунных реакциях,блокирует функцию Т-супрессоров и усиливает эндогенное коло-ниеобразование. Молекулярная масса вырабатываемого, медиатора оказалась сходной с таковой у миелопида.

4) Фактор-комплекс, секретируемый клетками лимфатических узлов Б раннем периоде после иммунизации, обладает выраженными стимуляторными свойствами: он имеет митогенное влияние на иммунокомлетентные клетки, при введении фактора одновременно с антигеном происходит 2-4 кратное усиление ка^ клеточных, так и гуморальных иммунных реакций-, медиатор. ингибирует миграцию макрофагов, стимулирует фагоцитоз и секрецию отдельных ферментов клетками этой.системы и направляет дифференцировку предшественников по моноцитарному пути развития.

5) Разработан высокочувствительный, надежный и легковоспроизводимый способ, оценки биологической активности лекарственного препарата миелопида, выпускаемого промышленным способом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Шдиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике" (Горький, 1983), республиканской конференции "Механизмы иммуностимуля-ции" (Киев, 1985),международном симпозиуме "Структура и биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Еущино, 1987), Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии, иммунодефици-ты и иммунокорректоры" (Владивосток, 1987), IX и X конференциях "®ак-

торы клеточного и гуморального иммунного ответа при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1988, 1990), 1 Всесоюзном съезде иммунологов (Москва, 1989), международной конференции "Реабилитация иммунной системы" (Цхалтубо, 1990), на международном симпозиуме "Иммуномодуляторы: биология и терапевтическое применение" (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1987), на IX Европейском симпозиуме (Рим, Италия, 1988), на симпозиуме "Регуляция иммунитета" (Польша, 1988), международном симпозиуме "Интернациональные проблемы имму-нофармакологии" (Тбилиси, 1990), Европейском съезде- иммунологов (Эдинбург, ФРГ, 1990), заседании секции N 1 Ученого Совета Института иммунологии Минздрава СССР, состоявшемся 13 декабря 1991 года.

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 52 публикациях: 24 журнальных статьях, 23 тезисах докладов и 5 авторских свидетельствах на изобретения.

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, проиллюстрирована таблицами и рисунками. Состоит из двух частей, заключения, выводов, списка литературы, включающего отечественных и зарубежных источников.

Место выполнения работы. Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования

Линии клеток и условия их культивирования. В работе использовали следующие линии клеток человека: зритромиелолейкоза К-562, лейке-мические клетки НЬ-60, клетки лимфомы ,1игка1, и мышей - мастоцитомы Р-815, Т-лимфомы УАС-1, тимомы Е1-4, миеломоноцитомы УЕН1-1640. ин-терлейкин-2-зависимой линии СТЬЬ-2, плавмацитоми Аё. 8. Р63. Х653.

¿■92

Животные. Работа проведена на мышах инбредных линий СВА, DBA/2, BALB/c, C3H/HeJ и мышах-гибридах первого поколения (СВА х C57BL/6), полученных из питомника "Столбовая" АМН СССР. В отдельных опытах использовали кроликов породы Шншилла

Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавками - 0-20% фе-тальной телячьей сыворотки, 4 мМ глютамина, 10 мМ 'HEPES-буфера и 40-50 мкг/мл гентамицина. Инкубация проводилась в атмосфере, содержащей 5-7% СО-2.

Антигены и способы иммунизации. Для иммунизации животных в 'зависимости от целей проводимых опытов использовали следующий,набор антигенов: корпускулярные - эритроциты барана (ЭВ), клетки мастоцитомы Р-815, клетки эритромиелолейкоза К-562, и растворимые - бычий сывороточный альбумин СБСА), гамма-глобулин лошади, фракцию 1 капсульного антигена чумного микроба, овальбумин, гемоцианин. О-антиген сальмонелл. В зависимости от задач эксперимента иммунизацию проводили подкожно в подушечки конечностей животных, внутриСрюшинно или внутривенно.

Антисыворотки и моноклональные антитела Антиглобулиновую сыворотку для выявления 7 S антителообраэуюшях клеток в реакции Ерне получали по методу Potter et al (1965) и Гусева и Язовой (1970). Абсолютное число антител определяли с помощью специфического иммуносор-бента, приготовленного по методу Гурвича и др. (1962).

Антисыворотку кролика против Ig S мышей готовили после многократной иммунизации кроликов по методу Еу et al (1978).

Анти-б-сыворотку получали после 6-кратной иммунизации мышей линии AKR клетками тимуса мышей линии СВА, по методу Lindholm, Strannegard (1974).

В отдельных экспериментах использовали моноклональные антитела против I-A-k (источником антител служила гибридома 10.2.16) и против 1-Е-к (14.4). Указанные гибридомы были предоставлены Р. Г. Василовым.

Способы обработки культивируемых клеток. С целью отделения популяции прилипающих клеток от неприлипающих проводили часовую инкубацию исходных суспензий клеток в стеклянных (пластиковых) матрацах при плотности клеток 1-2 млн. в 1 мл. Клетки, неприлипшие к стеклу или пластику, сливали и использовали в качестве неприлипающей популяции, а клетки, оставшиеся на стекле смывали с помощью rubber policeman и использовали в качестве прилипающей популяции.

Обработка клеток антисыворотками. Для удаления Т-клеток, несущих на поверхности в-антиген, суспензию клеток лимфатических узлов или костного мозга обрабатывали либо анти-0 сывороткой в разведении 1:8, а для удаления В-клеток - анти-Ig сывороткой в разведении 1:10 и комплементом в разведении 1:10. В качестве комплемента использовали сыворотку морской свинки, адсорбированную на клетках мышиной лимфомы (Boyse et al, 1968).

^акционирование клеток на колонке с сефадексом G-10 проводили с использованием маленькой пластиковой колонки,промытой предварительно стерильной средой 199. На колонку наносили в объеме 1-2 мл 100-120 млн. клеток лимфатических узлов или костного мозга и помещали колонку в термостат при 37-о С. Шсле инкубации свежими порциями среды вымывали содержимое колонки и использовали в качестве неприлипающей популяции клеток.

Облучение клеточных суспензий проводили гамма-лучами Со-60 на установке ЭГО-2 в дозе 20 кР (мощность дозы 5 кР/мин). Перед дальнейшим использованием клеток в опытах их дважды отмывали свежими порциями среды.

Оценку пролиферативной активности клеток как после культивирования in vitro, так и после воздействий in vivo проводили по включению Н-3 тимидина в ДНК Клетки культивировали в среде, содержащей 1 мкКи/мл меченого тимидина в течение 4 часов, после чего их переносили на фильтры с помощью харвестера ("Скатрон", Норвегия) и просчитывали

включение метки в сцинтилляционном счетчике "Интертехник" (Франция).

Определение числа антителообразующих клеток проводили модифицированным методом Ерне (Dresser, Wortis, 1965), используя для выявления Ig G-секретирующих клеток антисыворотку кролика против Ig G мыши в разведении 1:80 за 40 мин до обработки клеток комплементом (Михайлова А. А., 1979).

Для выявления количества клеток, секретирукщх антитела к 0-ан-тигену сальмонелл перед постановкой реакции Ерне осуществляли' конъюгацию эритроцитов барана с Оантигеном по методу ' Соловьева и др. (1966). . •.■:.'

Эффект взаимодействия клеток в смешанной культуре выражали в виде коэффициента стимуляции, который рассчитывали как' отношение количества антителопродуцентов в смешанной культуре к сумме показателей, рассчитанных из монокультур.

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови осуществляли по методу Воуига (1966) в градиенте фиколл-гипака.

Для активации клеток в культуре in vitro и in vivo использовали конканавалин А ("Серва", ФРГ), фитогемагглотинин (ФГА) ("Серва", ФРГ), липополисахарид (ЛПС) (Серва", ФРГ). Для активации неспецифических Т-супрессоров применяли конканавалин А (кон А) в дозе 25 мкг/мышь, который вводили через 1- 2 часа после инъекции антигена.

Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела к F-1 антигену чумного микроба, проводили общепринятым способом (Keller, Milstein, 1075). Гибридизацию осуществляли с помощью полиэтйленглико-ля 4000 по методу Давидсона (1976). С помощью методов селекции, рек-лонирования и иммуноферментного сканирования продуктов, секретирувмых клетками полученных штаммов, получен ряд гибридом, секретирующих антитела заданной специфичности.

Для оценки влияния лимфатических узлов, дренирующих область введения антигена, на продукцию костномозговых иммуномодуляторов был

разработан метод получения факторов иммунных лимфатических узлов. Для этого мышам-гибридам (СБА х C57BL/6) в подушечки всех конечностей вводили различные антигены (ЭБ или клетки мастоцитомы р-815, или клетки плазмацитомы Ag. 8. Р63. Х653) в концентрации 20 млн. в мл в объеме 0,1 мл/конечность) или БСА в дозе 1 мг/мл. Через 6 часов после иммунизации выделяли клетки паховых,подколенных и подмышечных лимфатических узлов, готовили клеточную суспензию и культивировали клетки в течение 16-18 часов в безсывороточной среде. Полученный рупернатант использовали после замораживания при -20-о С.

Фактор иммунных лимфатических узлов, секрегируемый в продуктивном периоде иммуногенеза получали следующим образом. Клетки лимфатических узлов выделяли от животных на пике иммунной реакции к различ ным антигенам (ЭБ, БСА, О-антигену сальмонелл или клеткам опухоли Р-815). После разделения суспензии клеток на прилипающую и неприлипа-ющую популяции их инкубировали в концентрации 5 млн в 1 мл в течение 18-20 часов. Надосадочную жидкость культур концентрировали в 20 раз и фракционировали на колонке с сефадексом 6-25. В опытах использовали фракции,элюирующиеся в области выхода миелопептидов костного мозга (Михайлова A.A., 1979). Гель-фильтрацию факторов лимфатических узлов осуществляли с использованием хроматографической колонки ("Фармация", Швеция), содержащей сефадекс S-200, уравновешенной 0,2 М фос4втным буфером с рН=7,2, содержащим 0,15 мМ NaCl. На колонку наносили 3 мл в 10-20 раз сконцентрированного препарата и элюиповали со скоростью 2 мл/час. Оптическую плотность регистрировали при помощи Увикорда "ЛКБ" (Швеция), а профиль элюции регистрировал самописец той т фирмы.

Оценк.а взаимодействия клеток на уровне зрелых антителопродуцен-тов в системе in vivo проводилась следуквдм образом. Была использована модель,применяемая при изучении реакций трансплантационного иммунитета в регионарных лимфатических- узлах при локальном введении алло генных клеток (Haskova et al, 1975). На 4 сутки вторич!юго иммунного '/- 02

ответа в подушечку одной из задних конечностей мыши вводили исследуемые факторы. Через 1 сутки после введения в подколенных лимфатических узлах этой конечности определяли число антителообразующих клеток, которое сравнивали с количеством антителообразующих клеток в лимфатических узлах противоположной конечности,в которую вводили в качестве контроля культуральную среду. Из полученных результатов рассчитывали коэффициент стимуляции, представляющий собой отношение числа антителообразующих клеток в контроле (в лимфатическом узле в который вводили фактор) по отношению к числу тех же клеток конечности, в которую вводили в качестве контроля либо культуральную среду, либо .суперна-тант клеток интактных клеток лимфатических узлов).

Генерация аллореактивных перитонеальных киллеров! Для получения первичных аллореактивных киллерных клеток в брюшной полости использовали метцд Берке (Berke et al, Í975). Для этого клетки мастоцитомы мышей Р-815 в количестве 15 млн/мышь вводили внутрйбрюшинно. Через 10 суток выделяли содержимое брюшной полости,удаляли макрофаги 2-х часовой инкубацией на чашках Петри и оценивали киллерную активность оставшихся клеток в отношении ряда клеток-мишеней: мастоцитомы Р-815, плазмацитомы Ag, 8. РбЗ. ХБ53 и лимфомы YAC-1, меченых Сг-51, Генерация аллореактивных киллеров в подколенных лимфатических узлах осуществлялась по методу Lynch et al (1981). Для этого клетки мастоцитомы Р-815 в дозе 2 млн вводили в 0,1 мл в задние конечности мышей-гибридов первого поколения (СВА х C57BL/6). Через 8 суток выделяли клетки подколенных лимфатических узлов и культивировали их в течение 3 суток без антигена в концентрации 3 млн/1 мл. После окончания инкубации определяли киллерную активность этих клеток против меченых Сг-51 клеток-мишеней. Препараты, которые тестировали данным способом, вводили в объеме 0,1 мл в одну из конечностей одновременно с антигеном.

Цитотоксичеекий тест, который позволял оценить активность киллерных клеток, генерированных как in vivo,так и in vitro проводился

общепринятым способом (Barke et al, 1975). Для этого клетки-эффекторы добавляли в различных соотношениях к клеткам-мишеням, меченым Сг-51. При оценке киллерной активности перитонеальных лимфоцитов нами было введено условное понятие "логическая единица", принятое для культур клеток и отражающее увеличение общего числа цитотоксических киллеров в брюшной полости одного животного.

Биологические и иммунологические тесты оценки активности медиаторов лимфатических узлов. Определение активности подобней интерлей-кину-1 проводили общепринятым способом (Smith et al, 1S81). Для этого использовали тимоциты мышей СЗН/Не, добавляя к ним испытуемый препарат или' различные разведения стандартного супернатанта, содержащего интерлейкин-1.

Определение активности, подобной интерлейкину-2, проводили при добавлении исследуемых супернатантов к клеточной линии CTLL-2, рост которой зависит от наличия в среде интерлейкина-2. Через 2-3 суток после внесения испытуемых препаратов и контрольных супернатантов, содержащих интерлейкин-2, оценивали пролиферативную активность клеток (Droege, 1984).

Определение активности, подобной гамма-интерферону, проводили при добавлении различных разведений испытуемых супернатантов к мышиным фибробластам, зараженным вирусом Sendai (Soki et al, 1986). Контролем служили стандартные препараты, содержащие интерферон-гамма По ингибиции цитопатического действия вируса на кпетки-мишени судили о наличии в супернатантах активности,подобной гамма-интерферону.

Определение цитостатической активности медиаторов проводили ь отношении двух линий опухолевых клеток-мишеней: плазмацитош Ag8. Р63. Х653 и мастоцитомы Р-815. Для этого к клеткам в дозе 20 тысяч/лунку вносили различные разведения исследуемых супернатантов и через 24 часа определяли пролиферативную активность клеток по вюшче -нию тимидина-Н-3.

йммуноадсорбцию супернатантов клеток лимфатических узлов осуществляли на пластиковых чашках Петри с диаметром 40 мм. Чашки предварительно обрабатывали либо кроличьими антителами к Ig 0 мыши в дозе 25-30 мкг/мл, либо моноклональными анти1-А-к или анти- I-E-к антителами в дозе 10-30 мкг/мл (Wisohí, Sato, 1978). Антитела наносили на чашки и инкубировали в течение ночи при 4-о С, а затем чашки отмывали 0,2 М фосфатным буфером с рН=7,2. Испытуемый супернатант (а также контроль) наносили на чашки и инкубировали 2 часа в термостате. После инкубации супернатанты сливали и по приведенным выше тейтам оценивали их активность. Контролем служили супернатанты интактных. клеток лимфатических узлов.

Оценку активности медиаторов в инфекционной модели проводили с помощью вирулентного штамма Salmonella typhy Ту N 4446, инкубируемого в агаре ^оттингера. Мышей заражали внутрибрюшинным введением 18-часовой культуры возбудителя в 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Дозу зар&тения определяли традиционным способом,используя оптический стандарт. Учет гибели животных проводили в течение 3 суток. Неспецифическую иммуностимулирующую активность супернатантов клеток иммунных лимфатических узлов оценивали при внутрибрюшинном введении до заражения сальмонеллами супернатантов, содержащих медиатор (по 0,5 мл/мышь), либо при введении фактора о молекулярной массой 110-120 кД (300 мкг по белку). Коэффициент стимуляции неспецифической протектив^ ной активности медиатора рассчитывали как описано в монографии (Ашма-рин, Воробьев, 1*62).

Микрокапиллярный тест. Влияние медиаторов на миграцию перитоне-альных макрофагов мышей определяли в микрокапиллярном тесте (Суслов, Черноусов, 1979). Для этого перитонеальные макрофаги выделяли из. брюшной полости мышей,которым за 4 дня до этого вводили внутрибрюшин-но 1 мл стерильного вазелинового масла. Готовили суспензию с высокой концентрацией клеток и засасывали в стеклянные капилляры диаметром 55

нмк. Затем капилляры разрезали на участки длиной 2 мм и помешали в лунки 96-луночного планшета Туда же вносили 150 мкл супернатантов в различных разведениях. Контролем служила среда для культивирования, ».лграция макрофагов определялась через 18 часов после инкубации в термостате.

Хемилюминесцентный метод. Воздействие медиаторов на функциональную активность макрофагов мышей и моноцитов человека изучали методом хемилюминесценции (Земсков, Барсуков, 1988). Фагоцитирующие клетки культивировали в присутствии супернатантов, содержащих медиаторы. В качестве контроля использовали среду для культивирования. Затем клетки отмывали,ресуспендировали в 500 мкл раствора Хенкса без фенолового красного,добавляли к ним 50 мкл суспензии зимозана (20 мг/мл)и 50 мкл люминола (56 мМ) и регистрировали пик хемилюминесценции на приборе "Люминометр 1£51" ("ЛКБ", Швеция). Также в камере Го-ряева подсчитывали число клеток, фагоцитировавших зимозан. Далее проводили пересчет имп/мин на 1 клетку и условно выражали интенсивность хемилюминесценции в иш/мин/клетка.

Определение активации макрофагов с помощью ферментной тест-системы проводили методом Ляшенко и др. (1988). С помощью данного теста определялась активность кислой фосфомонозстеразы.

Оценку стимулирующей активности медиаторов по - пролиферации клеток проводили на модели подколенных лимфатических узлов контралате-ральных конечностей (Haskova et al, 1975). Для этого 0,1 мл суперна-танта, полученного после инкубации клеток иммунных лимфатических узлов, вводили подкожно в одну из подушечек задних конечностей синген-ных животных. В другую в качестве контроля вводили тот же обьем среды или супернатанта клеток интактных лимфатических узлов. Клетки подколенных лимфатических узлов каждой конечности раздельно выделяли в разные сроки и по включению Н-З-тимидина определяли пролиферативнум активность. Коэффициенты стимуляции пролиферации рассчитывали как

соотношение соответствующего показателя в опытном лимфатическом узле (конечности в которую вводили исследуемый препарат) к показателю контрольного узла.

Результаты всех проведенных "экспериментов обрабатывали статистически в соответствии с руководством Адаарина, Воробьева (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Экспериментальные доказательства наличия кодауникатквно-регуляторной функции клеток лимфатических узлов в продукции юалуномодулятсров клетками костного шага.

P. R Петров и А. А. Михайлова в 1971-1972 г. г. открыли новый, неизвестны^ ранее феномен- кооперацию клеток на уровне зрелых антите-лопродуцентов. Ими было установлено,что взаимодействие клеток иммунной системы происходит не только в момент индукции иммунной реакции, но и на пике ее развития. Б этом взаимодействии, имеющем место как в культуре in vitro, так и in vivo (Сергеев U О., 1981), принимают участие клетки двух органов: интактного костного мозга и гипериммунных лимфатических узлов. Эффект кооперации заключается в том, что под влиянием секретируемого клетками костного мозга фактора (миелопида) в. популяции клеток лимфатических узлов, находящихся на пике иммунной реакции происходит накопление в 2-3 раза большего числа антителообра-зующих клеток (Aorf) и количества специфических секретируемых антител. (Петров Р. В. и др., 1971-1975, Petrov et al, 1975, Михайлова А. А., Захарова А А., 1988). Причем усиление антителообразования в смешанной культуре клеток интактного костного мозга и иммунных лимфатических узлов было связано с появлением дополнительного числа АОК, а не с интенсификацией синтеза антител в уже секретирующих клетках (Михайлова А. А., 1979, Стрелков Л. А. , Михайлова А. А. , 1987). Однако еще в 1974 голу Р. В. Петров и А. к. Михайлова обнаружили интересное свойство при

реализации данного феномена: клетки костного мозга, выделенные от животных на пике иммунной реакции утрачивают способность стимулировать продукцию антител в популяции клеток иммунных лимфатических узлов. Авторы предположили, что после иммунизации жиеотных происходит миграция клеток, секретирующих миелолид, в периферические лимфоидные органы. Учитывая тот факт, что лимфатические узлы являются практически первыми органами иммунитета, которые вступают в контакт с антигеном, попавшим в организм, становится ясна их важная роль в ; последующем развитии иммунных реакций.

Исходя из вышеизложенного становится понятной одна из важных задач исследования - определение природы клеток мишеней и клеток-эффекторов феномена "кооперации клеток на уровне зрелых антителопродуцен-тов".

Основной моделью данных экспериментов являлась смешанная культура клеток интактного костного мозга, используемая в качестве эффекторов, и клеток лимфатических узлов, выделенных на пике вторичного иммунного ответа, используемая в качестве клеток-мишеней. В обычных, т.е. • классических условиях под влиянием костного мозга происходило 2-3 кратное усиление образования АОК и секреции антител в клетках-мишенях. При обработке популяции клеток-мишеней различными способами (Рис.1) выяснилось,' что ни анти-е.ни анти-Ig сыворотки и комплемент не влияют на последующий эффект кооперации (часть А рис.1). Однако, предварительно проведенная сорбция клеток-мишеней на сефадексе G-10 или на стекле значительно увеличивают коэффициент стимуляции. Известно, что подобная сорбция гипериммунной популяции клеток позволяет обогатить суспензии, так называемыми, "молчащими" АОК (Ly, Mishell, 1975). По-видимому, они и являются основными мишенями действия костномозговых эффекторов.

Однако из ранее проведенных работ Степаненко Р. а и др. (1975) и Сорокина С.Е (1987) было известно, что в культуре in vitro происхо дит конкурентное взаимодействие костномозговых эффекторов с суп-

Рис.1. Влияние различных способов обработки взаимодействующих клеток на эффект кооперации на уровне зрелых антитело-продуцентов.

А - обработка клеток иммунных лимфатических узлов; Б - обработка клеток интактного костного мозга.

1 - контроль (необработанные клетки);

2 - обработка клеток анти-Э (анти-ТИу~1.1. сывороткой и

комплементом)

3 - обработка клеток анти-1е сывороткой и комплементом;

4 - адсорбция клеток на стеклянной вате;

5 - адсорбция клеток на сефадексе 6-10

6 - обработка клеток частицами латекса.

рессорными Т-лимфоцитами. Учитывая, что не всегда в модельных системах in vitro отражается реальное поведение клеток в условиях цельного организма были проведены опыты в системе in vivo, ..в которых было установлено, что действительно миелопид отменяет действие супрессор-ных Т-клеток, что и обеспечивает в итоге наблюдаемый прирост количества АОК и числа секретируемых ими антител.

При обработке клеток костного мозга теми же способами (часть Б рис.1) установлено, что ни один из типов обработки, за .исключением сорбции на стекле,не влиял на активность костномозговых эффекторов. Обработка клеток частицами латекса незначительно снижала стимулятор-ные свойства клеток костного мозга, однако полностью их не отменяла. Можно было предположить, что клетками-эффекторами данного типа взаимодействия являются предшественники мононуклеарной фагоцитирующей системы, которые способны прикрепляться к стеклу, но еще не имеют фагоцитарных свойств. О наличии такой популяции свидетельствуют данные (Van Furth et al, 1982). Не исключен вариант того, что функция продукции медиаторов этими клетками не связана с выполнением ими фагоцитарных функций.

Для решения второй и основной задачи исследования - а именно выявления роли клеток лимфатических узлов в регуляции продукции иммуно-модуляторов клетками костного мозга была разработана следующая схема экспериментов. Животных иммунизировали подкожно, во все конечности различными антигенами (ЭВ, БСА или клетками опухоли Р-815), через 6 часов выделяли клетки лимфатических узлов, дренирующих область введения антигена, и культивировали эти клетки в течение 16- 18 часов. Полученный супернатант использовали в качестве источника медиаторов и вводили интактным сингенным мышам. Через 4 суток от этих мышей выделяли клетки костного мозга и использовали их в качестве клеток-эффекторов в описанном выше типе кооперации на уровне зрелых антителопро-дуцентов. Полученные результаты представлены на рис 2.

В) И

а

Ь!

ч ь

Я и О

и

И <р

м и и >9« >8< л о

з ■

"О 12 3 4

Рис. 2. Изменение стимулирующей активности клеток костного мозга мдаей после введения им фактора(ов) иммунных лимфатических узлов.

1 - контроль(коэффициент стимуляции антителогенеза ин-

тактньми клетками костного мозга)

2 - стимулирующая активность клеток костного мозга,вы-

деленных на 4 сутки после введения супернатанта клеток иммунных лимфатических узлов (доноров лимфатических узлов иммунизировали ЭВ);

3 - стимулирующая активность клеток костного мозга,вы-

деленных на 4 сутки после введения супернатанта клеток иммунных лимфатических узлов (доноров лимфатических узлов иммунизировали ВСА);

4 - стимулирующая активность клеток костного мозга ма-

йей на 4 сутки после введения им супернатанта ин-тактных клеток лимфатических узлов.

I

Как видно из рисунка 2, клетки костного мозга животных, которым вводили супернатант клеток иммунных лимфатических узлов (доноров иммунизировали ЭБ), утрачивали свою способность стимулировать антитело-генез в популяции клеток гипериммунных лимфатических узлов, активированных. тем же антигеном. Б то же время клетки костного мозга мышей, которым вводили супернатанты контрольных факторов лимфатических узлов (иммунизация либо БСА, либо интактных клеток, соответственна столбики 3 и 4 на рис. 2), оказывали такое же стимулирующее действии, как и клетки интактного костного мозга (столбик 1). Адсорбция клеток лимфатических узлов на пластике перед их культивированием для получения медиаторов показала,что именно прилипающие клетки являются источниками гуморального фактора(ов), способствующего утрате стимуляторных функций клеток костного мозга.

Следует отметить, что помимо стимуляторного медиатора(миелопи-да), клетки костного мозга выделяют супрессорный фактор, который эффективно работает в индуктивном периоде иммунных реакций и основным механизмом действия которого является подавление пролиферации любой, активированной в данный момент популяции клеток, включая клетки различных опухолевых клеточных линий (Петров Р. В. и др. 1977, Сидорович И. Г. и др. 1987, Сидорович И. Г. 1992). В следующей серии опытов проводили оценку супрессорных свойств костного мозга,выделенного от интактных животных, а также от тавотных, которым вводили супернатанты клеток иммунных лимфатических узлов, полученных вышеописанным способом. Определение активности костномозговых супрессоров проводили по подавлению пролиферации клеток мастоцитомы Р-815(Сидорович И. Г. и др. 1987). Данные этих экспериментов представлены на рис. 3.

Как видно из рис.3, супресеорная активность костного мозга значительно повышается, если клетки выделяются от животных, иммунизированных ЭВ или супернатантом клеток лимфатических узлов, полученным от

полученных от интактных и иммунных доноров на пролиферацию клеток-мишеней.

1 - контроль (пролиферация клеток маетоцитомы Р-815);

2 - ингибирующее действие костного мозга интактных

доноров;

3 - ингибирующее действие костного мозга,выделенного

от животных, которым вводили супернатант неприли-паюдах клеток иммунных лимфатических узлов;

4 - ингибирующее действие костного мозга, полученного

от мышей, которым вводили супернатант прилипающих клеток иммунных лимфатических узлов;

5 - ингибирующее действие костного мозга мышей,иммуни-

зированных ЗЕ.

* - супернатанты прилипающих и неприлипающдх клеток лимфатических узлов получали от животных, иммунизированных ЭБ.

доноров, активированных тем же антигеном. Причем также как и в случае стимуляторной (миелопидной) активности, действующее начало содержится в супернатанте прилипающих клеток иммунных лимфатических узлов.

Таким образом, фактор, еекретируемый клетками лимфатических узлов в раннем периоде развития иммунной реакции способен не только отменять продукцию стимулирующего миелопида, но и усиливает продукцию супрессорного фактора клетками костного мозга. Для определения взаимоотношений в продукции стимуляторной и супрессорной активностей костного мозга проводили определение динамики их изменений в различные интервалы времени после введения животным факторов иммунных лимфатических узлов. Основные результаты опытов представлены на рис. 4.

Как видно из рис. 4 супрессорная активность клеток костного мозга в . первые сутки после иммунизации (введения фактора иммунных лимфатических уепов) значительно снижается, а затем резко возрастает, тогда как стимуляторная активность постепенно снижается вплоть до полной утраты к пику иммунной реакции. При этом, как показали данные специально проведенных экспериментов, утрата стимулирующей активности зависела от антигена, использованного для получения фактора иммунных лимфатических узлов. То есть, если один и тот же антиген-применяли для получения фактора иммунных лимфатических узлов и клеток-мязеней для действия клеток.костного мозга,выделенного от животных после инъекции им этого фактора,то снижение и утрата активности наблюдались. Если же для получения фактора иммунных лимфатических узлов использовался другой антиген (БСА или клетки опухоли) - это не отменяло стимулирующего действия клеток костного мозга,полученного от животных, которым вводились данные факторы. Супрессорная же активность костного мозга возрастала независимо от антигена,использованного для получения фактора иммунных лимфатических узлов.

Был проведен всесторонний анализ природы и биологических свойств медиатора,секретируемого клетками лимфатических узлбв в раннем периоде развития иммунной реакции. Полученные данные суммированы в табл.1.

А

Рис.4. Динамика изменений етимуляторной (2) и супреесорной(1) активности клеток костного мозга после введения донорам костномозговых клеток супернатантов иммунных лимфатических узлов.

1 - изменение супрессорной активности, оценивалось по подав-

лению пролиферации клеток мастоцитомы Р-815;

2 - изменение етимуляторной активности (оценивалось по спо-

собности стимулировать формирование АОК в гипериммунной , популяции клеток лимфатических узлов).

А-супернатанг клеток лимфатических узлов получали после инкубации выделенных через 6 ч после иммунизации ЭБ клеток подмышечных, паховых и подколенных узлов.

Таблица 1. Пзирода и функциональные свойства фактора инмунньм

лимфатических уэлов(ЧУИУ), секретмруемого в ранней периоде иммуногенеза, и контролирующего продукцию костноиозговь« ипнуноиоодлпггоров.

Свойства и функ1ф«ональнап Суперна т а н т м

активность интактнъм клеток ЛУ итцннэировавпи:

клеток ЛУ Р-8151 К-5621« *g8.P63C653 ЭВ

1.Состав педеатора - комплексы,соотояше иа детерми-

нант антигена I-A и 18 в-

2.Молекулярная пасса - 110-120 - 110-120 70-90

kD kD kD

3. Мггагенияя активность - ♦ + +

4.Цитп токсическая актио- - - - - -

ность

AtTMOKCIb, подобна«; - - - - -

5.интс(»ейкину - 1

в.интерлейкину-2 - - - - -

7.гаима-интерферону - - - - -

8.Супрессия пролиферации !

олухолевьм кле-гак-иитенейг

a) Ag8P63*653 + + + +

в) Р-в15 ♦ - + + *

о.стпуляут иомонуклеармой

фагоцитируншей системы;

а)фагоц?ггт)эа - + + + +

Й продукции фермента - +■ + и.о.

в Направления риффе-

ремцироохи - и.о. н.о. +

г)неспе1ф|фетеской реаи-

сгагтжхгга - + и.о. н.о. -h

Ю.ЭЬиление клеточные ин-

. пуммм реакций In -vitro и

in vivo при одновременной

введении с антигеном - + + + +

И.Мжлеиие гуморальюм

ияиунньм реакцмй in vitro ■ ;

и in vivo при oflMospemm-

ном введении с антигеном - + + + +

12-Мжление формирования

клеток имнуноло гической

лапши при гуморальные

режцмм - + н.о. н .о. +

«Гужпечаиия - ЛУ - лимфатические уэлы; и.о.- не определяли;

- отсутствие активности; "+"~наличме активности

- 28 - -

Итак, из табл.1 видно, что медиатор,оказывающий регуляторное воздействие на продукцию медиаторов клетками костного мозга, является комплексной молекулой, в состав которой входят по крайней мере 3 различных компонента: детерминанты антигена, детерминанты II класса главного комплекса гистосовместимосги (I-A) и детерминанты Jg G. Помимо регулирующего воздействия на секрецию различных активностей костного мозга он оказывает выраженное воздействие на систему моно-нуклеарных фагоцитов, интенсивность гуморальных и клеточных иммунных реакций как в культуре in vitro, так и in vivo. С здэй точки зрения он может быть полезен для разработки способов его практического использования.

Итак, если считать фактор, секретируемый клетками лимфатических узлов сигналом,достигающим костного мозга и определяющим изменения в продукции клетками последнего различных иммуномодуляторов, возникает вопрос сами ли клетки, выделяющие стимуляторные факторы (миелопид) мигрируют из костного мозга или происходит лишь усиление секреции вырабатываемого ими медиатора? Для решения этого вопроса были проведены следующие серии опытов. В первой из них изучалось стимуляторное действие прилипающей популяции клеток периферической крови на антите-логеиез в продуктивном периоде. Как оказалось (рис.5) эти клетки, выделенные на 2-3 сутки после подкожной иммунизации значительно стимулируют формирование АОК в гипериммунной популяции клеток лимфатических узлов (т.е. обладают тем же эффектом, что и клетки интактного костного мозга).

Таким образом, в крови иммунизированных животных на 2-3 сутки после иммунизации появляются прилипающие клетки, которые подобно клеткам интактного костного мозга, способны осуществлять эффект кооперации на уровне зрелых ангитедопродуцентов. Можно было предположить, что после активной пролиферации под влиянием сигнала, поступившего а костный мозг от клеток лимфатических узлов, поглотивших и пе-

« ч

Я

я ч о

и

и ф

«

а м в<

>е< <т> о к

I 2 12 "12 1 Т

12 3 4

оу пн после иммунизации

Рис. 5. Стимуляция образования АОК в продукг «ном периоде в клетках гипериммунных лимфатических узлов прилипающими клетками периферической крови иммунизированных сингенных доноров.

1 - контроль ( стимулирующий эффект прилипающих клеток

периферической крови интактных мышей)

2 - эффект прилипающих клеток крови иммунных доноров.

★Примечание: клетками-мишенями служили клетки лимфатических

узлов, выделенные на 4 сутки после повторной иммунизации ЭБ;

прилипающие клетки выделяли из периферической крови мышей, иммунизированных тем же антигеном, что я клетки-мишени.

Рис.6. Эффект стимуляции секреции антител в популяции гипериммунных клеток лимфатических узлов, обога -ценных "молчашлми" АОК, супернатантами клеток иммунных лимфатических узлов,выделенных на пике первичного (2) и вторичного иммунного ответа к ЭБ.

1- контроль (число АОК в популяции, обогащенной "молчащими" АОК);

2- то же, что и 1 +0,1 мл сконцентрированного в 10 раз супернатанта клеток иммунных лимфатических узлов,выделенных на пике первичного иммунного ответа (5 сутки к ЭБ);

3- то же, что и 1 + 0,1 мл сконцентрированного в 10 раз супернатанта клеток иммунных лимфатических узлов, выделенных на пике вторичного иммунного ответа к ЭБ

(4 сутки).

реработавших антиген, клетки костного мозга, вырабатывающие стимуля-торный фактор( миелопид), мигрируют через кровь в органы, в которых протекает непосредственная реакция по элиминации чужеродного материала, то есть в лимфатические узлы. Для проверки этого предположения были проведены попытки обнаружения клеток, еекретирующих медиаторы, подобные миелопиду, в самих лимфатических узлах на пике иммунной реакции.

Как свидетельствуют результаты, представленные на рис. б, клетки, обладавшие активностью,присущей клеткам интактного костного мозга, а также прилипающим клеткам периферической крови на 2-3 сутки после иммунизации, выявляются на 4-5 сутки (т.е. на пике иммунной реакции) в лимфатических узлах.

Был проведен детальный сравнительный анализ свойств стимулятор-ного препрата костного мозга миелопида и медиатора, секретируемого клетками иммунных лимфатических узлов в продуктивном периоде иммуногенеза

Основные характеристики этих факторов приведены в таблице 2.

Как видно из представленной таблицы оба сравниваемых медиатора имеют единое происхождение (из прилипающих клеток), одинаковую молекулярную массу и одни и те т клетки-мишени для своего воздействия. Следует подчеркнуть, что и эффект этих факторов на интенсивность иммунных реакций проявляется в продуктивном периоде иммуногенеза. Однако существенное отличие в антигенной специфичности действия с учетом слишком низкого молекулярного веса факторов не позволяет провести между ними знак тождественности. С другой стороны, если ввести предположение о клональной природе клеток, секретирующих стимуляторный препарат миелопид в костном мозге, то все обнаруженные экспериментальные факты легко объясняются.

Полученные в работе данные, а также сведения,имеющиеся в настоящее время в научной литературе, позволили объединить их в гипотети-

Таблица 2. Сравнительный анализ свойств миелопида и фактора, секретируемого клетками иммунных лимфатических узлов в продуктивном периоде иммунной реакции.

СВОЙСТВА МЕДИАТОРОВ Миелопид (секрети- ССактор .лимфати-

руется клетками ин- ческих уз лов( вы-

- тактного костного рабатывается на

мозга) пике иммунной реакции)

1. Продуцируется популяцией

прилипающих клеток + +

2. Молекулярная масса, опре-

деленная гель-фильтраци-

•ей на сефадексе 6-25 1-2 кД 1-2 КД

3. Основные клетки-мишени

воздействия :

а) "молчащие" АОК + +

б) Т-супрессоры + +

в) эндогенные КОБ + +

г) клетки-памяти при

гуморальных иммунных

реакциях +

4. Проявление основного эффекта на пике иммунной реакции

я. Антигенная специфичность

действия - +

* Примечание : АСК -антителообразующие клетки; КОЕ - колониеобра-зухчгля единица; "-" - отсутствие активности; "+" -наличие активности.

- 33 -

чеекуга схему, представленную на рис. 7.

Костный мозг является одним из центральных органов иммунной системы. Он не только поставляет полипотентные стволовые клетки, дающие начало всем росткам кроветворения, включая лимфопозз, но и осуществляет регуляторные функции в иммунном ответе С Петров Р. В. и др. , 1971-1990, Хаитов P.M. и др., 1977, 1978, Михайлова А.А., 1979, Захарова Л. А., 1985, Степаненко Р. Е , 1992, Сидорович И. Г., 1992). Причем функции костного мозга изменяются в процессе развития иммунной реакции. В работе было установлено, что регуляция продукции иммуномодуля-торов клетками костного мозга в иммунном организме осуществляется клетками лимфатических узлов, .дренирующих область введения антигена. Из схемы 7 видно, что клетки лимфатических узлов, поглотившие антиген, перерабатывают его до форм,циркулирующих в периферической крови (Lee, P^raskevas, 1985, 1988, Maeba et al, 1986, 1988). Установлено, что в образовании этого медиатора-комплекса.принимают участие Т-клет-ки и макрофаги (Maeba et al, 1988). ГЬ-видимому,в этом виде (в виде фактора, выявленного и названного нами ФИЛУ) информация о захваченном антигене поступает в костный мозг. В костном_ моз/е после получения информации об антигене начинают активно размножаться клетки-предшественники (Drayson, 1986), в том числе и клетки,секретирующие стимуля-торный медиатор миелопид. Известно, что они относятся к популяции незрелых бластных Форм (Михайлова А. А., 1979). Предполагается, что происходит размножение (а следовательно увеличивается абсолютное число мигрирующих из костного мозга клеток) антиген-специфического клона (ов) клеток, секретируюшрго миелопид, способный вызвать усиление иммунной реакции именно к тому антигену,' который был использован для иммунизации. В связи с этим на пике иммунной реакции активность этого клона в самом костном мозге утрачивается, а стимулирующая способность клеток костного мозга по отношению к другим антигенам сохраняется (Петров Р. В., Михайлова А. А., 1974, рис. Z автореферата).

ЛИМФАТИЧЕСКИЙ УЗЕЛ

Т-клетка + Макрофаг

АНТИГЕН

(через 3-6 часов)

КРОВЬ

ФИЛУ -г» фактор-комплекс -----

КОСТНЫЙ МОЗГ

КЛЕТКИ, СЕКРЕТИРУЮЩИЕ МИЕЛОПЕПТВДЫ

(через 6 часов)

ПРИЛИПАЮЩИЕ КЛЕТКИ (На пике иммунной реакции)

I

ПРШШПШЩЕ

КЛЕТКИ ( На 2-3. сутки после- иммунизации )

/

пролиферация.

НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СУПРЕС-СОРНЫЕ КЛЕТКИ (Максимальная активность на 2-4 сутки после иммунизации)

АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ФАКТОР (имеет те же мишени, что и миело-пид интактного костного мозга)

Рис.7.. Гипотетическая схема взаимодействия клеток

лимфатических узлов с клетками костного мозга в иммунном организме.

КлоЦы) клеток, секрети-рующих набор антиген-специфических миелопеп-тидов(на пике иммунной реакции активность отсутствует)

\

Клетки данного клона мигрируют в кровь и выявляются в ней на на 2 - 3 сутки развития иммунной реакции. С током крови они достигают органов, в которых происходит избирательная селекция клеток, принимающих участие в работе по элиминации чужеродного материала, в частности лимфатических узлов, поглотивших антиген. В этих узлах на пике иммунной реакции обнаруживаются прилипающие клетки, секретирующие антиген-специфический медиатор, способствующий включению "молчащих" АОК в секрецию антител. При этом в самом костном мозге активация пролиферации предшественников приводит к интенсификации работы неспецифических супрессоров, которые посредством выделения медиатора ингибируют пролиферацию любого активированного в данный момент клона клеток, в том числе, по-видимому, и клеток, секретирующих стимуляторный миелопид. В связи с этим на пике иммунной реакции в костном мозге выявляется ан-тиген-заг:'симая утрата стимуляторных свойств и возрастание неспецифической супрессорной активности.

- 36 -ВЫВОДЕ *

1. Лимфатические узлы играют важную регуляторнуга роль в продукции .иммуномодуляторов клетками костного мозга в иммунном организме. Клетки лимфатических узлов, дренирующих область введения антигена, в ранние сроки после иммунизации вырабатывают гуморальный фактор. В состав, этого фактора входят, по крайней мере, три различных компонента: детерминанты антигена, детерминанты !I класса главного комплекса гистосовыестимости (I-A) и детерминанты иммуноглобулина S. Шлекуляр-ная масса секретируемого фактора зависит от природы антигена, использованного для его получения.

2. Введение фактора, секретируемого клетками лимфатических узлов в раннем периоде развития иммунной реакции, интактным животным вызывает изменения в продукции иммуномодуляторов-костного мозга, подобные изменениям, наблюдающимся при введении самих антигенов: отмечается антиген-зависимая утрата стимулирующей активности и возрастание неспецифической супрессорной активности.

3. Утрата стимулирующей активности клеток костного мозга после введения интактным животным фактора, секретируемого клетками лимфатических уалов в раннем периоде иммунной реакции, сопровождается появлением клеток, обладающих подобной активностью в периферической крови животных на 2-3 сутки после иммунизации и на пике иммунной реакции в самих лимфатических узлах.

4. Прилипающие клетки лимфатических узлов, выделенные от животных на пике иммунного ответа, секретируют гуморальный антиген-специфический фактор. Этот фактор, подобно стимуляторному медиатору,вырабатываемому интактными клетками костного мозга, способствует включении) "молчащих" АОК в секрецию антител, усиливает формирование клеток иммунологической памяти, блокирует функцию Т-супрессоров' и усиливает

пнд^г^нное колониеобразование. Шлекулярная масса стимуляторного ме-

диатора составляет 1-2 кД.

5. Неприлипающие клетки лимфатических узлов на пике иммунной реакции секретируют гуморальный фактор,который при гель фильтрации на сефадексе 6-25 элюируется в области -выхода веществ с молекулярной массой 1-2 кД. Этот медиатор ингибирует формирование АОК к различным антигенам независимо от природы антигена, который был использован для его получения. Ингибирующее действие фактора реализуется в продуктивном периоде иммунной реакции.

6. Наряду с регуляцией продукции иммуномодуляторов клетками костного мозга фактор, секретируюшийся клетками лимфатических узлов в ранней стадии развития иммунной реакции, обладает выраженными стиму-ляторными свойствами. Введение этого медиатора одновременно с различными антигенами вызывает 2-4-кратное усиление как гуморальных, так и клеточных иммунных реакций против вводимых антигенов.

7. 4актор-комплекс, секретируемый клетками лимфатических узлов в раннем периоде иммуногенеза, обладает выраженным воздействием на систему мононуклеарных фагоцитов: он ингибирует миграцию, стимулирует фагоцитоз и секрецию отдельных ферментов этими, клетками, способствует 3-4-кратному увеличению числа макрофагов в брюшной полости при одновременном введении с антигеном по сравнению с иньекцией одного антигена, и направляет дифференцировку предшественников по моноцитарному пути развития.

8. Профилактическое введение данного медиатора.мышам, заражаемым летальными дозами сальмонелл, способствует значительному повышению неспецифической резистентности и снижению уровня гибели животных.

9. Клетками-эффекторами феномена "кооперации на уровне зрелых антителопродуцентов", имеющими костномозговое происхождение, не являются ни Т-, ни В-клетки. Они радиорезистентны, эффективно прилипают к стеклу,блокада фагоцитарных свойств этих клеток не отменяет их стимулирующей активности. У иммунизированных животных наблюдается значи-

тельное снижение стимуляторных свойств эффекторов. Действие эффекторов костного мозга в конечном итоге направлено на субпопуляцию, так называемых, "молчащих"АОК, содержащуюся в популяции гипериммунных клеток лимфатических узлов. Однако, процесс реализации стимуляторной активности костного мозга опосредован их влиянием на функции. Т-суп-рессоров.

10. Для повышения чувствительности способа оценки биологической активности костномозгового иммунокорригирующего препарата миелопида были, получены два штамма гибридомных клеток, «третирующих монокдо-нальные антитела к Г-1 белку чумного микроба Использование клеток этих штаммов в качестве клеток-мишеней для действия миелопида привело к разработке надежного, чувствительного и воспроизводимого теста. Разработанный метод включен в фармакологическую статью как способ оценки биологической активности данного лекарственного препарата,выпускаемого промышленным путем.

11. Разработана гипотетическая схема регуляции продукции костномозговых иммуномодулягоров (миелопида и супрессорного фактора) клетками лимфатических узлов в иммунном организме. Основная суть схемы заключается в том, что клетки лимфатических узлов на ранних стадиях развития иммунной реакции с помощью вырабатываемого ими сигнала определяют поведение клеток костного мозга, секретирующих различные имму-номодуляторы. На пике же иммунной реакции лимфатические узлы, по видимому, являются органом, в котором происходит накопление клеток, имеющих костномозговое происхождение, и осуществляющих свое иммунорегу-ляторное воздействие на интенсивность иммунных реакций с помощью вырабатываемых ими факторов.

СГМСОК ГЪЪОКАНИЯ ПО ТЕ ht 01ССЕРТАЦИИ.

1, Петров Р.В.,Новиков 8.П.,Захарова Л.А.,Степаненко Р.Н. "Изучение природы гуморального фактора костного мозга,стимулирумшего продукции антител " ,Б*и л .экспер.Биол .и иед4Ц.,1976,т.86, N 11,с.563-566.

2. rtixaà/msa А.А.,Захарова Л.А.>Стрпаненко Р.Н.,Новиков В.И."Гуморальный <рак тор костного мозга,стимулирукхшй антителообразование в продуктивную фазу иммунного ответа", в км.:"Криоконсервирование имму-иокомпетентной -ткани",Киев,"Наук .Думка",197Э,с.. 42-43.

3« ГОгтроо P.Ö.,Новиков В.И., Михайлова A.A. "Включение синтеза антител в "молчащей "популядии антителопродуцрнтов под влитием костномозгового «еялатора-САП",Докл_ЯН СССР.1981,т.258, К 5,с. 1258-1260.

4. Новиков 9.И. ,И*хайлоеа A.A."Взаимодействие клеток на уровне зрелых антит .^продуцентов : изучение природы клеток -эффекторов и клеток-ми-шеней",^Ьмунология, 1982, N3,с.22-25.

5. Петров Р.В.,М»хайлова A.A.,Захарова Л.А.,Ствпаненко Р.Н„,П1маев А.И. „Сычева З.П. ,Солдатов В.И.,Алферова Е Л.,Сергеев HL0. ,Новиков О.И., "Способ получения костномозгового стимулятор? антмтелопродуцентов", Авторское свидетельство H 1005790.

,6. М*хайлова А.А.,Нзвиков В.И.,Чеботарев 8 .Ф.»Ермакова Н. В. "Влитие костномозгового c-rvmyn*rropa антитепопрояуки?*^-С?Л на клетчи иммунологической памятиИммунология, 1983, H 4,с.40-42-

7» Сергеев Ю.О., Алферова Е.М.,Новиков В »И. "Влитие костномозгового стимулятора антителопроду центов на функциональную активность иммуно-компетентньк клеток**, в сб.;'Т*?диаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике",Горький Д9£Ю,с. 144.

в. Новиков 8.И..Сергеев W.О."Антиген-специфический гуморальный фактор иммунньк лимфатических узлов,сткмулируюш*й активность "молчаинх "анти-телообраэумымх клеток ",в сб. : "Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике*',Горький ,1983,с. 117.

9. Новиков В.И.,Оргеео W.O.,Сорокин C.B. .Кузнецова С"Медиаторы, регулирующие взаимодействие клеток в продуктивную фазу иммунного от-

ueы", в с£ .: "Механизмы иимуностинуляции",Киев,1935,с.174-175. 10.Новиков В.И..Петров Р.В..Сергеев Ю.О."Гуморальные факторы,«цра£а-тываеные клетками ипмунньк лимфатических узлов" »Xftjpu .никробиол . апи-демиол. и имиунобиол. alS84,H 1,с.68-71.

И.Сидорович И. Г. .Игнатьева Г.А. ,Лнхов В .В. .Новиков В .И. "Исследование функциональной активности костномозговом супрессоров",е сб.: "Противоопухолевой иммунитет. Гибри доны",М. ,1985,с.53-54.

12 >Ь пиков В.И.'Тегуля^я ипмуиного ответа различным сублопуляцитои клеток мононуклеёфной фагоцитирушлей системы",Мед.Pi *фер.Ж., 21 раздал, 1936, В 3,с.13-16.

13.М<хайлава A.A..№ibhkob В.И. .Сорокин С .В.,Кузнецова С.Ф."Медиаторы взаимодействия клеток в продуктивную фазу иммунного ответа", УЬмуно-логия.1987, H 4,0.40-43. ;

И.Новиков В.И. .Сорокин C.B. .Сидерович И.Г ."Отмена способности клеток костного мозга спекулировать антитело генеэ после введений фактора им-иунньк, лимфатических узлов",141иуиология, 19Ô7, H 2,с. 47-49. 15/kixoB В.В.,Новиков В.И.,Сидорович И.Г."Усиление лроодкЦР" суп-рессорного фактора клетками костного мозга после иммунизации и крово-потери",1*У1мунология, 1967,N 4,с.,69-71 .

1в.Сидорович И.Г. ,Лнхоа В.0.,Власов A.A..Новиков В.И."Характеристика и клетки-мишени супрессорного фактора,секретируемого клетками костного мозга",1*1мунология, 1987, H 4,с.67-69.

17-Сидорович И.Г./taxoB В.В.,Игнатьева Г .А., Новиков В .И. "Характеристика супрессорного фактора,продуцируемого клетками костного мозга м гибридньии клетканп,получекньмм на основе ииеломы Х63 и супрессор-ны< клеток костного мозга",в сб.:"Структура,биосинтез и функции моле-кулгфньк элементов иммунной системы",Г\)иино, 1987,с. 36, löyfcwoa B.B. ,ЬЬвиков В.И..Власов А.А.,Сидорович И.Г."Характеристика и с»оДстаа супрессорного фактора,оьрабатъс»аеиога клетками костного мозга",я сб .:"Актуальны? вопросы иммунологии,иимунодефициты,имиуно-

корректоры",Владивосток ,1987,с. 161-162.

19-Новиков 8.И.,Лихов В.8. ,Сидорозич И.Г„ "Факторы иимунньи лимфатических узлов,регулирующее продукцию иммунамодуляторав клетками костного мозга",в сб. ; "Актуальные вопросы иммунологии, имму но дефициты,им ~ мунокорректоры,*ТЗлаяиаосток ,1987,с. 170-171.

20. Из вин ов В.И., Лях со В .В. ^Сидррооич И.Г, "Усиление суп рессорной активности костного мозга после введения фактора иммунных лимфатических

узлов",Иммунология,19eô,R 1,с. 30-32.

21. Лох о в В.В., Новиков В.И.,Власов АжА.,Сидорович И.Г."УЬиление гуморального и клеточного иммунного ответа медиаторами имнунньк лимфатических узлов^^Ьнунология, H 6,c.3Z-34,<S££.

22.Сидоровим И.Г.,Власов А_А.,/Trkgd Q.B. .Новиков О.И."Свойства суп-рессорного фактора,проецируемого клетками костного мозга при культивировании ",в сб. ; "Механизмы инпунорегул яции и иммунная биотехнология",М., 1989,с .75-79.

23. Си до ро вич И.Г. ,1-Ьвикоэ В .И. 'Тканевая и функциональная гетерогенность клеток мононуклеармой фагоцитирующей системы" в кн.; "Г^эоблемы и перспективы современной иммунологии .Методологический анализ", 1988» "Наук а *' ,Нэвосибирск ,с . 133-154..

24.Власов A.A.,Новиков В .И.,Сидоровым И.Г. "Фактор(ы) иммуннь« лимфатических узлов,усиливавший реакции гуморального иммунного ответа",в сб. ; "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при раз л ич ник физиологических и патологических состояниях", Челябинск, 1988»с.23-24.

25-Новиков В.И.,Власов A.A.,Шанин С.С.,Сорокин C.B."Влитие факторов иммунных лимфатических узлов на формирование иммунологической паия— тм*%Бкил.эксяер.биол .и недиц.,1989» N 7,с.77-79.

26.Новиков В.И., Сорокин С.В. » Михайлова A.A., "Влияние ииелопептидов на синтез Д-К,белка и секрецию антител гибридомньии В-клеточмыми линиями ж»и*й",6кил.экспер.биол.и мел«Ц_,1989, N 6,с.724-726.

27.Нзвиков В.И. .Власов A.A."Природа факторов иннунньк лимфатических

узлов,стимулирукимх гуморальные и клеточные иммунные реакции",Бюлл. экслер.биол.и иедиц.,198Э,Н 4,с.460-462.

28.Новмков В .И. ,Ковальчук А./1."Роль клеток лимфатических уэлов в ин-здктивноп периоде иммуногенеза",! Всесокезн .иммунол . съезд,1969, М.,т.1,с.89.

29.Новиков В.И..Власов A.A. .Ковальчук А./).,Раевская М.В.,Шанин С.С., Барсуков A.A. "Природа фактора иипунньи лимфатических узлов и его воздействие на клетки иононуклеарной фагэд^тирукдой системы", №муноло-тип,1990, Я 1,с.31-34.

30.Скюккин М.Н).,власов A.A..Новиков Б.И.,Ковальчук А.Л."Действие факторов имнунньк лимфатических узлов на Ig К ответ", Тезисы докл. конф.иммунологов Эстонии,Тарту ,1989,с.78.

31.Нгаиков В .И. .Сидорович И.Г.,Сорокин С.В.,Михайлова A.A."Способ определения иммуностипулируккшго действия миелопида",Заявка на изобретение В 4690401 с полошит .решением от 20.12.1969.

32.Нориков 0.И.,Власов А.А..Ковальчук -А.Л."Сравнительная характеристика и некоторые аспекты биологического действия антигенспецифи-ческих факторов инмунньк лимфатических узлов"№1нунология, 1990, Н 2,с.32-35.

33.Снсмкин li.ffl.,Власов А.А.,Ноомков В.И.,Ковальчук й.Л."Сравнение действия на Ig К ответ мвдшторов инмунньк лимфатических узлов и ин-тактного костного нозга",в сб"Теоретические и экспериментальные исследования биологических систен",М.,1990,с. 151-153.

34.Н>виков 8.И.,Сидарсвич И.Г ."Коммуникативная и регуляторная функции клеток лимфатических узлов в иммуногенезе",Успехи совр. биологии , 1990.Т . 110,еьп .2(5) ,е .219-230.

35.Мовиков В .И. ,Си дорович И.Г."Роль клеток лимфатических узлов в про-едктипнои периоде иммуногенеза",в сб.; "Реабилитация иммунной системы" ,Цх ал rySo , 1990 ,с. 37-30.

ЗСЛшьчьчук А.я.,Волков В.И.,Литрин П.Г .'Ткшыдение противоинЗекци-

онной резистентности мьией ,заражение Salmonella typhy факторами ип~ нунньк лимфатических узлов%Журн.никробиол .эпидемиол .и иммуноби-ол . ,1990, Н 9.С.77-В0.

37.Новиков Ö .И. .Власов A.A. .Сидорович И.Г. "Влияние фактора иммунных лимфатических уэлоэ на функциональную активность клеток иононуклеар-ной фагоцитируклаей системы"^ сб.:"Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различна* патологических и физиологических состояниях **,Челябинск,19Э0,с.105.

38 - Си до ро вич И.Г.,Павликов С „П. f Николаева И.А.,Игнатьева Г .А., Нэви-ков В »И. "Штамп гибриздьк культивируемые клеток животных - продуцент ионоклональньы антадтел к детерминанте II F-1 антигена чумного ми к раба",Авторское свидетельство N 1577355.

Си до ро вич И.Г. »Николаева И.А.,Павликов С .П. ,Игнатьеоа Г»А„ Нзвиков В .И. "UhratiM гибридных хультивируепьм клеток мивотных - продуцент мо-ноклональньм антител к детерминант» III F антигена чумного микроба", Авторское свидетельство Н 1577356.

40-Новиков В .И.,Си доровнч И.Г _, Власов A.A. "Гуморальные меяиагоры, секре тируемые клетками лимфатических узлов в продуктивном периоде иммуногенеза", о сб.: "14»муномодуляторы природного происхождения" .Владивосток, 1990, с. 105.

41.Новиков В.И.,Власов A.A.,Сидоровым И»Г."Влияние прилипании* клеток крсви и факторов иммунмьк лимфатических узлов на антителогенеэ в продуктивном периоде",Лпмунология,1991,К 2,с. 18-20.

42.ЬЬвиков В.И.уКараиоашов В.И.,Рязанов HJC.,Власов A.A."Способ лечения злокачественны« новообразований челюстно-лицрвой области "Заявка на изобретение N 4763554 с положит .решением от 2В. 06.1991.

43.Petror R.V. »ffihhaUova A.A. .Zakharova L.A.,Sergeev J.O., Haviccv V.l. "Regulation function of the bone narrow un the iarranogenetiis", Develop.Comp. ДЭ79,п 3(3),p.4í)9-508-

44.Petrov R.V. »Zakharova L.A.,Ser#?ev J.O.,Novicov V.l."Cell

Interaction at the level of mature antibody producers : pro- parties of the bone marrow humoral factor stimulating aati- tody production".Ann.Iomunol.(Inat.Pasteur),1980,v.131 D, p.171-177. 45.Hcwlcov V.I-,Eidorovich I.Q. "Iiauuue lyaph nodes faotor{s) regulating production of iranuoomodulators by bone marrow cells",in Abstract of Int. Symph." Tnnmnrmodulatora : biology and therapeutic application" .Brasil,1387,p.183.

46.Ijachov V.V.,8ovicov ¥.1.,Vlasov A-A."Enhancement of tumor-specific killer activity of lymifcocytea by immune lymph node supernatanta", 1X Kur.Meeting Abstract,Roma,Italy,1988,p.295. 47.Navicov V.I.,Sorofcin E.7.,Sidorovich I.G."The influence of nyelopeptidea on the secretion of antibodies by bybrldoma B cells of mice",IX Eur.Meeting Ahatract.Boaa,Italy,1988,p.271. , 4B.Hovicov V.I..Ljachov V.^-.'Vlasov A. A. "Regulation of humoral ianunological reaction by mediators of imnuna lymph nodes", IX Eur.Meeting Abstract,Roma,Italy,1988,p.301. ■

49.Ljacbov V.V..Novicuv V. I. ,Vlasov A.A. "Enhancement of tumor-specific killer activity of lymphocytes by ismune lymph node supernatanta (1LUS ) " , IU1S Symjioaium "Regulation of immunity", Poland,1988,p.168.

50.Hovicov V.I.,Ljachov V.V.,Ylasov A.A."Regulation of humoral irasunologieaJ. reaction by mediator of ismune lymph nodes", IUIS Synphosiun "Regulation of iaounity",Poland,1988,p.232. Sl.Sidorovich I.G.,Kovicov tf.I."Hybridoma induced on the basis of intact bone marrow cells secreting a suppressor factor", Int. Symph. Problems of lonunopharmacology,Tbiliai,USGli,1990, p.59. 52.Kovalchuk A.L..Hovicov V.I..Sidorovich I.G."Hybridoma tech- nique application to the bone narrow mediator activity research", Abstract Eur.Feder.of Iaounol.Soc.10 Meeting,Edinburgh,1990,n 2S.