Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль индикации отдельных специфических маркеров вируса гепатита B в обеспечении вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов

Актуальность проблемы

Вирусная безопасность препаратов из плазмы крови обеспечивается многоступенчатым комплексом мер, включающих: отбор доноров; проверку индивидуальных порций плазмы на отсутствие вирусных маркеров; введение в технологический процесс стадий инактивации вирусов и контроль готовых продуктов. Для обнаружения маркеров вирусных инфекций в плазме и препаратах крови в настоящее время используется иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы основаны на разных принципах обнаружения возбудителя и взаимно дополняют друг друга.

Однако несмотря на такой контроль сохраняется риск инфицирования пулов плазмы вирусом гепатита В (Kleinman S.H. et al., 2005; Alvarez do Barrio M. et al., 2005; Soldan K. et al. 2005). Это связано с широким распространением заболевания, малой инфицирующей дозой и высокой устойчивостью вируса гепатита В (ВГВ). Для снижения этого риска рекомендовано расширить перечень обязательных тестов при обследовании доноров и контроле готовых продуктов, в частности Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) рекомендовано проводить контроль уровня антител к HBsAg (анти-HBs), концентрация которых в препаратах иммуноглобулинов нормируется. Введение этого дополнительного контроля в нашей стране сдерживается отсутствием отечественных тест-систем для количественного определения анти-HBs. Как показал многолетний опыт, анти-HBs являются фактором защиты. Однако связывание анти-HBs с HBsAg может влиять на результаты анализа, экранируя HBsAg в составе иммунных комплексов.

Учитывая погрешности лабораторной диагностики (Джумагулова А.Б. и др., 2001; Нетёсова И.Г. и др., 2005) нерешённой остаётся также проблема по созданию алгоритма тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов. В монографии «Плазма человека для фракционирования» в Европейской фармакопее 4-го издания предусмотрено тестирование первого гомогенного пула плазмы на HBsAg. Пул плазмы считается пригодным для дальнейшей работы, если в нём не выявлен HBsAg. Национальная фармакопейная статья этого требования не предусматривает. Поэтому усовершенствование алгоритма обследования на присутствие маркеров вируса гепатита В пулов плазмы для фракционирования, используемых для получения препаратов иммуноглобулинов, является актуальным.

Цель работы - разработка оптимального алгоритма обеспечения вирусной безопасности готовых препаратов в отношении гепатита В на основе изучения эффективности тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов на HBsAg, анти-HBs и ДНК ВГВ.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние иммунной нейтрализации на обнаружение HBsAg методом ИФА и количественно охарактеризовать способность специфических антител экранировать HBsAg в пулах плазмы для фракционирования и в препаратах иммуноглобулинов.

2. Изучить влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs на возможность выявления ДНК ВГВ.

3. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения анти-HBs.

4. Исследовать уровень анти-HBs в индивидуальных образцах плазмы крови, пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.

Научная новизна.

Изучена эффективность выявления HBsAg в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.

Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления HBsAg методом ИФА в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов является иммунная нейтрализация HBsAg антителами.

В опытах in vitro показано, что в оптимальных температурных условиях при равновесной концентрации антигена и антител в системе достигается наиболее полная иммунная нейтрализация. В этом случае анти-HBs в количестве 1 ME способны связывать не менее 50 нг HBsAg.

Исследовано влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/aHra-HBs на особенности выявления HBsAg и ДНК ВГВ. Продемонстрировано, что процесс формирования иммунных комплексов не влиял на эффективность выявления генома вируса гепатита В методом ПЦР.

Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-HBs и рабочий стандарт для калибровки с концентрациями 10, 50 и 100 МЕ/л, для стабилизации которого использована мальтоза.

Разработан оригинальный способ очистки HBsAg из сформированного иммунного комплекса HBsAg/aHTH-HBs.

Практическая значимость и внедрение результатов.

В результате проведённых исследований разработана технология производства иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Для упрощения расчета количественного содержания антител наряду с традиционным использованием калибровочного графика предложена формула, позволяющая определять содержание анти-HBs только по одному контрольному образцу с концентрацией антител (50 МЕ/л). Тест-система успешно прошла апробацию на базе цеха гаммаглобулинов Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» и государственные испытания в ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Проект нормативной документации находится на утверждении в Фармакопейном Государственном комитете. На изобретение «Тест-система для определения анти-HBs в биологическом образце» получена приоритетная справка № 2005107749 от 21.03.05. Сравнение разработанного диагностического набора с зарубежными аналогами показало высокую специфическую активность разработанной тест-системы и целесообразность её использования для количественного определения анти-HBs в плазме (сыворотке) крови при обследовании доноров, для определения напряжённости иммунитета, а также для определения соответствия препаратов иммуноглобулинов стандартам ВОЗ.

В фармакопейную статью предприятия на «Имбиоглобулин» (ФСП 420504-4266-04) внесены дополнительные показатели, улучшающие безопасность препарата: контроль уровня антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.

Основываясь на изученных закономерностях «экранирования» HBsAg специфическими антителами, показано, что определение HBsAg не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов. Рекомендовано внести дополнение в алгоритм мониторинга препаратов иммуноглобулинов - определение анти-HBs. В случае выявления концентрации антител, не соответствующей международным требованиям, необходимо проводить тестирование препаратов иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР.

Положения, выносимые на защиту

1. Определение HBsAg, являющееся обязательным при тестировании пулов плазмы для фракционирования, не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов в отношении вируса гепатита В, что позволяет внести дополнение в алгоритм их контроля — определение уровня анти-HBs.

2. Создана иммуноферментная тест-система для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.

Апробация работы.

Результаты работы представлены на 10-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2002); на II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (С.-Петербург, 2003); на Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004); на научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (Н.Новгород, 2004); на VI Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблема эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005).

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной с участием сотрудников Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» 24 ноября 2005 г.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления HBsAg в пулах плазмы для фракционирования является присутствие анти-HBs.

2. В модельных опытах показано, что процесс нейтрализации HBsAg специфическими антителами зависит от концентрации антигена в смеси. В оптимальных условиях анти-HBs в количестве 1 ME способны связывать не менее 50 нг HBsAg.

3. На основе изученных закономерностей «экранирования» HBsAg анти-НВз-антителами следует считать недостаточным критерием отсутствие HBsAg в препаратах иммуноглобулинов. В связи с этим в алгоритм мониторинга препаратов необходимо ввести определение анти-HBs. В случае несоответствия уровня анти-HBs международным требованиям проводить тестирование иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР.

4. Экспериментально продемонстрировано, что формирование иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs не оказывает влияния на способность метода ПЦР выявлять ДНК ВГВ в препаратах иммуноглобулинов.

5. Разработан оригинальный способ получения HBsAg осаждением из иммунных комплексов.

6. Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-HBs в плазме (сыворотке) крови и препаратах иммуноглобулинов. Стабилизация жидкого рабочего стандарта для калибровки с концентрацией анти-HBs 10, 50 и 100 МЕ/л мальтозой позволила сохранять его активность на протяжении срока наблюдения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Необходимость контроля пулов плазмы для фракционирования на присутствие HBsAg и исключения из производства контаминированной плазмы не вызывает сомнений. Эта процедура позволяет контролировать качество скрининга индивидуальных донаций плазмы, поступающей на предприятия фракционирования, минимизировать присутствие вируса гепатита В в производственных пулах плазмы и снизить вероятность попадания его в конечные препараты иммуноглобулинов. Однако связывание HBsAg со специфическими антителами может влиять на результаты анализа, экранируя HBsAg в иммунных комплексах. Прямым показанием к отбраковке плазмы является присутствие в ней структурных единиц вируса, в том числе фрагментов нуклеиновых кислот, что касается продуктов иммунного обмена -антител, то здесь нет однозначных решений. В связи с трудностями обнаружения в плазме структурных единиц вирусов гепатита С и ВРИ, отбраковка проводится по наличию антител к этим вирусам и по фрагментам нуклеиновых кислот. Для гепатита В, как показал многолетний опыт, антитела к поверхностному антигену гепатита В являются фактором защиты и в то же время, вызывая иммунную нейтрализацию вирусов в плазме, они могут влиять на результаты анализа.

Учитывая погрешности лабораторной диагностики [Джумагулова А.Б. и др., 2001; Нетёсова И.Г. и др., 2005], усовершенствование алгоритма обследования на присутствие маркеров вируса гепатита В мини-пулов плазмы для фракционирования, используемых для получения препаратов крови, прежде всего иммуноглобулинов, является чрезвычайно актуальной задачей. Нами преследовалась цель повысить вирусную безопасность препаратов иммуноглобулинов в отношении гепатита В.

Предварительный анализ состояния рынка тест-систем показал, что, несмотря на имеющийся широкий выбор иммуноферментных тест-систем, отсутствуют наборы с декларированной возможностью определения поверхностного антигена гепатита В в пулах плазмы для фракционирования, количественного определения анти-НВs-антител для оценки потенциала иммунной нейтрализации в пулах плазмы и иммуноглобулинах.

Последовательность действий при выполнении этой задачи включала модификацию производимых Нижегородским филиалом «НПО Микроген» тест-систем таким образом, чтобы сделать их пригодными для определения HBsAg в пулах плазмы для фракционирования, и с этой целью в модельных опытах установить факторы, влияющие на специфичность и чувствительность тест-систем.

На первом этапе необходимо было установить, влияет ли смешивание индивидуальных донаций на специфичность тест-систем «ИФЛ-HBsAg». За мини-пул был принят объем плазмы 5,0+0,5л от 20-28 доноров. Объем минимального плазменного пула, подлежащего тестированию на маркеры ВГВ, был обоснован особенностями технологического процесса, а также тем, что часть плазмы поступает на предприятие в пятилитровых пластиковых емкостях. Для оценки специфичности ИФА-тест-систем при тестировании пулов смешивали предварительно проверенные и негативные по HBsAg индивидуальные образцы плазмы от 20-28 доноров. Смешивание проводили в равных объемах, формируя производственные пулы в пятилитровых емкостях и аналогичные модельные пулы. Показано, что смешивание индивидуальных образцов плазмы, предварительно проверенных и не содержащих HBsAg, не приводило к появлению неспецифических реакций при тестировании пулов, т.е. не оказывало влияния на специфичность тест-систем «ИФА-HBsAg». В то же время, как и следовало ожидать, смешивание одного заведомо положительного по HBsAg индивидуального образца донорской плазмы с 19 или 27 нормальными (негативными) образцами влияло на возможность выявления HBsAg в пулах. Показано, что эффективность выявления HBsAg для всех пулов, контаминированных HBsAg-содержащими образцами с концентрацией HBsAg более 100 нг/мл, и для пулов из 19 донаций, контаминированных положительными образцами плазмы с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл, составляла 100 %. При внесении плазмы с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл в пул из 27 донаций, HBsAg обнаруживался только в 80 % случаев.

Как показали наши исследования, основной причиной этого явления было присутствие в плазме анти-HBs, которые при формировании пулов нейтрализовали HBsAg, тем самым исключая его из реакционной смеси. Чтобы определить степень риска контаминации пулов плазмы, необходимо было определить, насколько часто встречаются донации, с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл. Как показали наши исследования, среди отбракованных по HBsAg донаций в более чем 85 % случаев концентрация HBsAg была выше 100 нг/мл и только 9,3 % доноров-вирусоносителей имели концентрацию HBsAg в плазме менее 100 нг/мл. Таким образом, по результатам распределения концентрации HBsAg у доноров-вирусоносителей, а также, учитывая, что на предприятия фракционирования обычно поступает плазма, прошедшая первичный скрининг, нами рассчитан риск получения плазмы с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл. Он является достаточно низким и составляет 1 случай на 92150 индивидуальных донаций. Учитывая, что эффективность выявления таких образцов в пулах плазмы от 24+4 доноров находится на уровне 80 %, риск контаминации плазменного пула поверхностным антигеном вируса гепатита В ниже уровня детекции составлял по нашим данным приблизительно 1 случай на 19197 мини-пулов.

Для исключения экранирования антигена антителами мы попытались использовать метод ПЦР. Однако результаты предварительного исследования модельных пулов, контаминированных HBsAg- и ДНК ВГВ-позитивными образцами с невысокой концентрацией антигена (менее 1000 нг/мл), показали, что эффективность выявления маркеров ВГВ не улучшилась. При тестировании модельных пулов методом ИФА и ПЦР выявление HBsAg в пробах составило 85 %, а выявление ДНК ВГВ менее 30 %. Это можно объяснить ингибированием полимеразы, а также тем, что концентрация HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей обычно многократно превышает концентрацию полных вирусных частиц [Майер К.-П., 1999]. Это привело к тому, что ПЦР-тестирование пулов плазмы на ДНК ВГВ в большинстве стран мира не является обязательным и применяется только отдельными производителями [Carol К., Meirione С., 2003].

Таким образом, в результате выполненной работы установлено, что метод иммуноферментного анализа (ИФА) может быть использован для контроля пулов плазмы при условии, что лицензированные коммерческие наборы дополнительно валидированы, а размеры плазменных пулов и стратегия их тестирования определена. Стратегия мини-пул тестирования обычно определяется производителями препаратов крови, исходя из технологических особенностей производства и чувствительности метода. С учетом рекомендаций Европейского агентства медицинских продуктов и официальной медицинской контрольной лаборатории (Official Medicines' Control Laboratory - OMCL) размер плазменного пула, подлежащего контролю на HBsAg, должен быть таким, чтобы позволять в 100 % случаях выявлять образцы плазмы с исходным титром HBsAg выше 1:250000 (с учетом чувствительности ИФА тест-системы концентрация HBsAg в таких образцах должна составлять около 12500-25000 нг/мл) и в 59% случаев выявлять образцы плазмы с исходным титром HBsAg менее 1:10000 (концентрация HBsAg менее 500-1000 нг/мл) [EMEA/CPMP/BWP/1737/02]. По результатам наших исследований размер плазменного пула от 20-28 донаций объемом 5,0+0,5 л можно признать оптимальным, а тест на HBsAg обязательным для оценки вирусной безопасности пулов плазмы.

Как уже упоминалось выше, одной из основных причин снижения эффективности выявления HBsAg явилось присутствие вируснейтрализующих анти-НВБ-антител. Поэтому перед нами стояла задача в опытах in vitro изучить динамику образования иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs и количественно охарактеризовать способность специфических антител экранировать HBsAg в пулах плазмы и препаратах иммуноглобулинов. Для этой цели в качестве источника антител были использованы препараты иммуноглобулинов с содержанием анти-HBs (770+20 МЕ/л), предварительно разбавленные нормальной донорской плазмой до содержания анти-HBs 10 МЕ/л, а в качестве источника HBsAg использован отраслевой стандарт «ОСО-HBsAg» (ОСО 42-28-311-03П), приготовленный в соответствии с инструкцией по применению. Затем растворы иммуноглобулина и ОСО смешивали в соотношении 1/10. Эффективность нейтрализации оценивали по ингибированию иммуноферментной реакции. Как свидетельствовали полученные результаты, нейтрализация антигена зависела от концентрации HBsAg в системе и времени инкубации исследуемых проб. Наиболее полно нейтрализация HBsAg происходила через 24 часа при температуре 37 °С при условии равновесной концентраций антигена и антител в системе, в этом случае 1 ME анти-HBs был способен связывать до неопределяемого методом ИФА уровня не менее 50 нг HBsAg. При избытке антигена в системе, несмотря на иммунную нейтрализацию, HBsAg выявлялся в растворах.

Аналогичные результаты были получены с препаратами иммуноглобулинов, в которые добавляли вируссодержащую плазму. В соответствии с классическими закономерностями процесса формирования иммунных комплексов при низкой концентрации HBsAg (менее 49 нг) и существенном избытке специфических антител происходила полная его нейтрализация до неопределяемого методом ИФА уровня. Дальнейший рост концентрации антигена (от 49 до 1562-3125 нг) способствовал увеличению количества сформированных иммунных комплексов до тех пор, пока не достигал зоны эквивалентности: количество антигена примерно равнялось количеству доступных мест связывания на антителах. При существенном избытке антигена (более 25 мкг/мл) процесс нейтрализации был неэффективным и не приводил к статистически значимому изменению концентрации HBsAg в реакционной смеси.

Учитывая, что в процессе выделения иммуноглобулинов происходит концентрирование анти-НВБ-антител и, одновременно, очистка от вирусов и HBsAg [Анастасиев В.В., 2000] ставится под сомнение корректность применения теста на HBsAg в ИФА для контроля вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов согласно отечественных Фармакопейных статей.

Нами были проведены сравнительные исследования определения HBsAg в ИФА и ДНК ВГВ в препаратах иммуноглобулинов, контаминированных вируссодержащей плазмой с высоким содержанием HBsAg (около 1 мг/мл) и о

ДНК ВГВ (9,3*10 копий/мл). В препараты иммуноглобулинов вносили плазму донора-вирусоносителя, разведенную в 50000 - 400000 раз. Тестирование опытных проб проводили через 15 минут и после 24 часов инкубации при 37°С. ДНК ВГВ была обнаружена во всех пробах. В то же время через 24 часа HBsAg не выявлялся ни в одной из проб, а при немедленном тестировании только в пробах с меньшими разведениями вируссодержащей плазмы. Таким образом, моделируя искусственно контаминацию препаратов иммуноглобулинов маркерами вируса гепатита В, выявлено, что специфические антитела в иммуноглобулинах находились в избытке и активно связывали HBsAg. В то же время процесс формирования иммунных комплексов не влиял на возможность выявления ДНК ВГВ методом ПЦР. Поэтому введение мониторинга анти-HBs и ДНК ВГВ в готовых препаратах даст большую информацию о вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

Кроме того, опыт производства и применения иммуноглобулинов свидетельствовал, что присутствие анти-HBs является обязательным фактором защиты против инфицирования вирусом гепатита В. В соответствии с требованиями Европейской фармакопеи иммуноглобулиновые препараты должны содержать анти-HBs в концентрации не менее 0,5 МЕ/г белка.

Поэтому для определения уровня анти-HBs в сыворотке (плазме) крови человека и в препаратах иммуноглобулинов была разработана иммуноферментная тест-система, в основу которой положен принцип одностадийного прямого «сэндвич»-анализа. Особенностью тест-системы явилось то, что для изготовления иммуносорбента и конъюгата использован высокоочищенный плазменный антиген (HBsAg), свободный от ДНК вируса гепатита В, позволяющий с максимальной чувствительностью и специфичностью выявлять анти-HBs. Для этого разработан оригинальный способ приготовления очищенного HBsAg из плазмы крови доноров-вирусоносителей. Он включал инактивацию вирусов в плазме пастеризацией, очистку HBsAg физико-химическими методами, выделение комплекса HBsAg/aHTH-HBs, очистку HBsAg из комплекса с помощью гидролиза пепсином и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

При изготовлении иммуносорбента была проведена сравнительная оценка чувствительности тест-систем при нанесении на планшеты антигенов в трех вариантах: только HBsAg, выделенного из плазмы крови доноров-вирусоносителей; «плазменного» HBsAg в сочетании с рекомбинантным HBsAg субтипа ad; рекомбинантного HBsAg субтипов ау и ad в разных соотношениях. Чувствительность тест-системы оценивали по калибровочным кривым, построенным по отраслевому стандартному образцу иммуноглобулина человека против вируса гепатита В (ОСО 42-28-320-00). Чувствительность тест-системы, изготовленной с использованием только «плазменного» HBsAg была достоверно выше, чем при использовании «плазменного» антигена в комбинации с рекомбинантным или только рекомбинантного. Чтобы выбрать оптимальные условия сорбции, оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях антигена в растворе. Концентрация 2 мкг/мл была сочтена оптимальной и использована в дальнейшей работе.

На следующем этапе работы подбирали оптимальные разведения конъюгата - HBsAg - пероксидаза хрена. Контрольные образцы должны были иметь следующие показатели оптической плотности: ОП К+ не ниже 0,500 о.е., ОП К' - не выше 0,150 о.е. Первоначально для приготовления конъюгата использовали тот же антиген, что и для приготовления иммуносорбента. Однако при оптимальном рабочем разведении конъюгата 1:20 значение ОП К+ составило менее 0,300 о.е., что не соответствовало заданным условиям. Вероятно, это было связано с тем, что при физико-химическом способе очистки HBsAg могли повреждаться участки связывания с пероксидазой хрена. В связи с этим нами был использован HBsAg, очищенный оригинальным способом осаждения иммунного комплекса. При исследовании конъюгата, приготовленного с использованием очищенного данным способом антигена, результаты, соответствующие заданным условиям были получены при рабочем разведении 1:500.

Для изготовления контрольных положительных образцов (К+ю, К+50, К+10о) нами предложен состав стабилизирующего матричного раствора, содержащий нормальную донорскую плазму и мальтозу в концентрации 2-10%, позволивший сохранять их активность на протяжении срока наблюдения (9 месяцев). В матричный раствор добавляли иммуноглобулин человека нормальный (ФСП 42-0504-4266-04), откалиброванный по ОСО 42-28-320-00 до концентраций анти-HBs 10, 50, 100 МЕ/л соответственно.

При определении концентрации анти-HBs с целью упрощения интерпретации результатов предложено использование формулы. При сравнении двух способов определения концентрации анти-HBs: с помощью построения графика и с использованием предложенной формулы показано, что относительная разность между значениями концентраций анти-HBs, полученных по графику и по формуле, была статистически не значима и не превышала для плазмы крови 5,3 % (t=0,698; р=0,05), а для препаратов иммуноглобулинов 1,84 % (t=l,394; р=0,05).

С целью апробации разработанной тест-системы мы исследовали уровень поствакцинального иммунитета в образцах сыворотки крови здоровых вакцинированных против гепатита В детей й сравнивали полученные данные с результатами, полученными на тест-системе для количественного определения антител к HBsAg «MONOLISA ANTI-HBs 3.0». При тестировании на двух тест-системах были получены совпадающие результаты.

Таким образом, по результатам оценки специфической активности с использованием ОСО иммуноглобулина человека, а также по результатам сравнительных испытаний с тест-системой «MONOLISA ANTI-HBs 3.0» показано, что разработанная тест-система может быть использована для количественного определения анти-HBs в сыворотке, плазме крови и препаратах иммуноглобулинов. В настоящее время тест-система успешно прошла государственные испытания в ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Далее с помощью разработанной тест-системы была определена концентрация анти-HBs в индивидуальных образцах донорской плазмы крови, мини-пулах плазмы для фракционирования объёмом 5,0±0,5 л, в производственных пулах плазмы и в препаратах иммуноглобулинов отечественного и зарубежного производства.

Показано, что анти-НВв-позитивными были 32,4 % индивидуальных образцов плазмы крови, концентрация анти-HBs в которых распределялась следующим образом: 23 % имели низкую концентрацию анти-HBs - от 2-5 до 10 МЕ/л, 32 % - среднюю концентрацию (от 10 до 100 МЕ/л), 42 % высокую концентрацию (от 101 до 1000 МЕ/л) и 3 % - концентрацию анти-HBs более 1000 МЕ/л. Анти-HBs были выявлены в 96,16 % мини-пулах плазмы для фракционирования. Все производственные пулы, как и следовало ожидать, также содержали анти-HBs, но в разной концентрации - от 99 до 1655 МЕ/л (средняя концентрация 431±311 МЕ/л).

Учитывая, что концентрация специфических антител к вирусу гепатита В при производстве иммуноглобулинов увеличивается в 2,6 - 6,2 раза, в зависимости от вида препарата, было закономерным, что все исследованные серии иммуноглобулинов содержали анти-HBs в концентрации более 0,5 МЕ/г белка. Кроме того, показано, что уровни анти-HBs в отечественных препаратах практически не отличались от аналогичных показателей качества зарубежных препаратов и соответствовали требованиям Европейской фармакопеи. Однако, существенные колебания концентрации анти-HBs в производственных пулах, а также риск, связанный с возможностью контаминации исходной плазмы и формирования иммунных комплексов анти-HBs/HBsAg, свидетельствовали о том, что для того, чтобы гарантировать это соответствие, необходимо в алгоритм контроля качества иммуноглобулинов ввести обязательный тест на анти-HBs.