Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль иммунной системы в формировании задержки внутриутробного развития плода

На правах рукописи

Кудряшова Анна Владимировна РОЛЬ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ ЗАДЕРЖКИ ВНУТРИУТРОБНОГО РАЗВИТИЯ ПЛОДА

14.00.36. — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им.В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Н.Ю. Сотникова доктор медицинских наук, профессор Л.В. Посисеева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Л.А. Захарова доктор медицинских наук, профессор М.А. Стенина доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

Ведущая организация:

ГУ Научный центр акушерства, гинекологии перинатологии РАМН

Защита диссертации состоится « СУгУ_2006 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05

в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава России по адресу: 117997, г.Москва, ул.Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ РосздраваЛэссии

Автореферат разослан «"/ [у»___2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доцент ( / у/у--¿^--/Т^Т^Ё.Кузнецова

Актуальность работы

Синдром задержки развития плода (СЗРП) является одним из часто встречающихся патологических состояний во время беременности. По данным исследований, проведенных в различных странах, частота СЗРП варьирует от 3 до 8% и не имеет тенденцию к снижению, несмотря на успехи в разработке новых методов диагностики и профилактики заболевания (Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2000; Moodley S.J., 1997). СЗРП занимает важное место в структуре перинатальной смертности и оказывает неблагоприятное влияние на последующее развитие детей и подростков, определяя нарушения нервно-психического и соматического развития (Афанасьева Н.В., Игнатко И.В., 2003; Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998; Akisu М., е.а., 2004; Baschat A.A., Hecher К., 2004; Brodszki J., е.а., 2005; Hellström А., е.а., 2004; Jackson J.A., е.а., 2004).

В настоящее время рассматриваются несколько теорий развития СЗРП: теория нарушения клеточного роста, теория нарушения плацентарной перфузии в результате ишемических повреждений, теория нарушения гемодинамики и гемостаза, теория дезинтеграции метаболизма плода, теория хронической плацентарной недостаточности (ХПН), теория нарушения защиты трофобласта от апоптоза (Аржанова О.Н., и др., 2001; Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2000; Мерзлякова A.A., и др., 2002; Aban М., е.а., 2004; Austgulen R., е.а., 2004; Crocker 1.Р., е.а., 2003; Dai S.Y., е.а., 2004; IshiharaN., е.а., 2002; Levy R., е.а., 2002; Miyakoshi К., е.а., 2001; Penchalaneni J., е.а., 2004). Однако все они имеют ряд недостатков и в большинстве случаев не рассматривают триггерных механизмов наблюдаемых явлений.

Существуют две формы СЗРП. Симметричная форма СЗРП часто сочетается с врожденными пороками развития. При асимметричной форме СЗРП реже встречаются генетические дефекты развития плода, что нивелирует роль генетического фактора, при этом на первый план выдвигаются иммунно-эндокринные нарушения. Патогенетические механизмы асимметричной формы СЗРП остаются мало изученными, однако, большинство авторов признает, что в

их основе лежит нарушение функции фето-плацентарной системы. Известно, что развитие беременности и формирование фето-плацентарного комплекса контролируются реакциями материнской иммунной системы на всем протяжении гестационного процесса (Сотникова Н.Ю., и др., 2005; Ширшев

C.B., 2002; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003; Chaouat G., е.а., 1999; Clark

D.A., 1999; Heikkinen J., е.а., 2004; Lim K.J., 2003; Moffett-King A., 2002; Sacks G.P., e.a., 2003; Somerset D.A., e.a., 2004). В последнее время в работах ряда авторов появляются данные, позволяющие предположить, что в основе нарушений функции фето-плацентарной системы при СЗРП лежат изменения механизмов иммунорегуляции гестационного процесса (Сотникова Н.Ю., и др., 2005; Филинова Н.Ю., 2000; Tjoa M.L., е.а., 2004). Исследованиями различных авторов было показано, что при СЗРП в периферической крови матери и в децидуальной оболочке плаценты нарушается соотношение клеточных популяций лимфоцитов, изменяется характер экспрессии ряда активационных и адгезионных молекул, усиливается продукция иммуноглобулинов и аутоантител, снижается содержание лимфоцитов, экспрессирующих молекулы Fas, изменяется функциональная активность фагоцитарных клеток, нарушается синтез и продукция цитокинов (Мерзлякова A.A., и др., 2002; Сухих Г.Т., и др., 2004; Филинова Н.Ю., 2000; Arslan M., е.а., 2004; Banerjee S., е.а., 2005; Bersinger N.A., Odegard R.A., 2004; Hanh-Zoric M., e.a., 2002; Karowicz-Bilinska A. 2004; Lof M., e.a., 2005; Miyakoshi K., e.a., 2001; Omu A.E., e.a., 2004; Stallmach T., e.a., 1999; Tjoa M.L., e.a., 2004; Vives A., e.a., 1999). Экспериментальные исследования показали, что при СЗРП нарушается ответ децидуальных лимфоцитов на стимуляцию белками плодово-плацентарного происхождения (Филинова Н.Ю., 2000; Сотникова Н.Ю., и др., 2005). Однако имеющиеся в литературе данные об изменении соотношения клеточных популяций и характере продукции цитокинов не позволяют сделать однозначных выводов о формировании того или иного типа иммунного ответа при СЗРП, так как в одних работах отмечается усиление Th2 иммунного ответа, в других - активация продукции Thl цитокинов, а в некоторых случаях -

одновременный рост влияния гуморальных и цитотоксических реакций (Мерзлякова A.A., и др., 2002; Пелёвина М.И., 2005; Сухих Г.Т., и др., 2004; Филинова Н.Ю., 2000; Omu А.Е., е.а., 2004). Все исследователи изучали изменения иммунологических параметров в группах женщин с СЗРП, формирующимся на фоне какой-либо акушерской патологии (угроза невынашивания, гестоз). Это не позволяет утверждать, что установленные авторами нарушения иммунных реакций определяются именно патологией развития плода. В работах большинства авторов не дифференцируется форма задержки развития плода, что, возможно, определяет противоречивость полученных результатов. Практически полностью отсутствуют данные о ранних нарушениях механизмов иммунорегуляции, способствующих развитию СЗРП.

Наиболее изученным аспектом участия иммунной системы в формировании СЗРП является исследование продукции факторов роста, регулирующих ангиогенез в плаценте и рост трофобласта (Ahmed A., Perkins J., 2000; Torry D.S., е.а., 2004). Однако, результаты исследования содержания факторов роста при СЗРП как на системном, так и на локальном уровнях часто противоречат друг другу (Arslan M., е.а., 2004; Banerjee S., е.а., 2005; Bersinger N.A., е.а., 2004; Clark D.E., е.а., 1998; Hanh-Zoric M., е.а., 2002; Helske S., е.а., 2001; Khaliq A., е.а., (999; Lash G., е.а., 2001; Lof M., е.а., 2005; Omu A.E., е.а., 2004; Reuvekamp A., е.а., 1999; Shibata E., е.а., 2005; Somerset D.A., е.а., 2004; Tjoa M.L., е.а., 2004; Tse J.Y., е.а., 2001; Vives A., e.a., 1999). Исследования характера продукции факторов роста проводятся на экспериментальных моделях СЗРП, различающихся по технологии, что может обусловливать различия в полученных данных.

В последнее время большое внимание уделяется изучению роли апоптоза в развитии СЗРП (Aban M., е.а., 2004; Austgulen R., е.а., 2004; Crocker I.P., е.а., 2003; Dai S.Y., е.а., 2004; Ishihara N., е.а., 2002; Levy R., е.а., 2002), но все исследователи рассматривают апоптоз только с точки зрения ограничения роста

плаценты и плода, и не исследуют характер апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови и лейкоцитарного инфильтрата плаценты.

Таким образом, изучение особенностей системных и локальных иммунных нарушений, сопровождающих развитие СЗРП, и ответа мононуклеарных клеток на активирующие стимулы позволит расширить наши представления об иммунных механизмах формирования СЗРП и позволит разработать ранние прогностические критерии патологии плода. Цель работы

На основании выявления закономерностей нарушения иммунорегуляции на системном и локальном уровнях создать патогенетически обоснованную концепцию участия иммунной системы в формировании асимметричной формы задержки внутриутробного развития плода и разработать новые подходы к прогнозированию и диагностике данной патологии. Задачи исследования

1. Выявить закономерности изменений фенотипа, активации и дифференцировки мононуклеарных клеток периферической крови, в динамике гестационного процесса, и лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки зрелой плаценты при асимметричной форме СЗРП.

2. Установить закономерности нарушений в работе цитокиновой сети на системном и локальном уровнях, и их значение в развитии асимметричной формы СЗРП.

3. Выявить закономерности изменений апоптоза и особенностей его регуляции эндогенными факторами в различных популяциях мононуклеарных клеток периферической крови в динамике гестационного процесса и лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки зрелой плаценты при асимметричной форме СЗРП.

4. Разработать концепцию участия иммунных механизмов в развитии асимметричной формы СЗРП.

5. Разработать ранние прогностические и диагностические критерии асимметричной формы СЗРП. Научная новизна исследования

Впервые установлено, что развитие асимметричной формы СЗРП сопровождается нарушением процессов межклеточного взаимодействия и иммунного ответа материнских мононуклеарных клеток на системном и локальном уровнях на всем протяжении гестационного процесса.

Показано, что в основе нарушений иммунорегуляторных процессов при асимметричной форме СЗРП лежит стимуляция материнской иммунной системы инфекционными антигенами и неадекватный ответ периферических и децидуальных мононуклеарных клеток на антигенную стимуляцию.

Показано, что на всем протяжении гестационного процесса формирование СЗРП сопровождается аутоиммунным процессом, поддерживаемым на системном и локальном уровнях усиленной продукцией 1Ь-6, а также в ранние сроки гестации ростом пула В1 лимфоцитов и снижением уровня Тг на системном уровне, а в поздние сроки гестации на локальном уровне - снижением содержания Тг.

Впервые установлено, что развитие асимметричной формы СЗРП в ранние сроки гестации на системном уровне ассоциируется с низким уровнем активации периферических мононуклеарных клеток, активацией ТЫ и угнетением апоптоза периферических цитотоксических клеток и моноцитов.

Показано, что развитие асимметричной формы СЗРП в поздние сроки гестации ассоциируется с формированием процесса по типу хронического воспаления, определяемого ростом уровня коммитированных лимфоцитов и усилением продукции большинства провоспалительных цитокинов на системном и локальном уровнях, активацией всех популяций мононуклеарных клеток в периферической крови и нарушением апоптоза децидуальных мононуклеарных клеток.

Установлено что при асимметричной форме СЗРП нарушаются естественные механизмы противовоспалительных реакций, определяемые

функциональной активностью Тг клеток, продукцией IL-I0 и IL-4; развитие воспалительного процесса в ранние сроки беременности сдерживается высоким уровнем TGFp2, а в поздние сроки гестации на системном уровне - усилением влияния Тг клеток и продукции IL-10 лимфоцитами, на локальном уровне — усилением продукции TGFP2.

Показано, что развитие асимметричной формы СЗРП на всем протяжении гестации сопровождается нарушением продукции факторов роста; в ранние сроки гестации снижается продукция основных факторов ангиогенеза, а в поздние сроки гестации снижается продукция факторов, регулирующих рост тканей мезенхимального происхождения, но усиливается секреция факторов активации эндотелия. Практическая значимость работы

Разработаны прогностические критерии развития асимметричной формы СЗРП, основанные на определении в ранние сроки гестации в периферической крови содержания VEGF и уровня HLA-DR+ моноцитов. Разработаны диагностические критерии СЗРП, основанные на определении в 32-40 недель гестации относительного содержания CD11Ь+ лимфоцитов. Реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в практику акушерской клиники и консультативно-диагностической поликлиники ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», 9 ж. консультации г.Иваново. Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 2-м Национальном конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1998), 7 Международном конгрессе по иммунологии репродукции (Нью Дели, Индия, 1998), 3 международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1999), Европейском Съезде по иммунологии и репродукции (Рим, Италия, 1999), 4 международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-

Петербурге» (Санкт-Петербург, 2000), 8 Международном конгрессе по иммунологии репродукции (Опатия, Хорватия, 2001), 6 Всероссийской конференции с международном участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002), 4 конгрессе Европейского общества по иммунологии репродукции и развития (Родос, Греция, 2003), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), 9 Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005). Основные положения, выносимые на защиту

Формирование асимметричной формы СЗРП, начиная с ранних сроков беременности и на протяжении всего периода гестации, связано с изменением механизмов иммунорегуляции гестационного процесса, проявляющимися нарушением активации и дифференцировки МНК, дисбалансом продукции факторов роста, развитием процессов по типу инфекционно-воспапителъного и аутоиммунного низкой интенсивности, взаимно потенцирующих друг друга.

В ранние сроки гестации формирование асимметричной формы СЗРП на системном уровне связано с недостаточным активационным сигналом и/или неадекватным ответом материнской иммунной системы на факторы фето-плацентарного комплекса с усилением цитотоксических и аутоиммунных реакций и нарушением продукции факторов ангиогенеза. В поздние сроки гестации формирование асимметричной формы СЗРП сопровождается развитием извращенного вторичного иммунного ответа, проявляющегося на системном уровне нарушением активации МНК, на локальном уровне угнетением активации децндуальных МНК и нарушением продукции факторов, регулирующих рост трофобласта.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 283 страницах машинописного

текста. Работа состоит из Введения, обзора литературы по теме диссертации, главы «Материалы и методы исследования», 3 глав собственного исследования,

главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 422 источника. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (директор - заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Посисеева J1.B). Исследования проводились в акушерской клинике и в лаборатории клинической иммунологии — зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н,, профессор Сотникова Н.Ю.

Всего было обследовано: 40 небеременных женщин репродуктивного возраста без отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза; 118 женщин с неосложненным течением беременности на всем ее протяжении, и родивших детей без СЗРП из них 49 женщин обследовались в 1 триместре беременности и 69 женщин — в 3 триместре беременности (группа без СЗРП); 75 женщин, родивших детей с СЗРП, не имевших во время беременности средней и тяжелой степени гестоза, не лечившихся в стационаре по поводу угрозы невынашивания беременности, гестоза и преждевременных родов из них 37 женщин обследовались в 1 триместре беременности и 38 женщин - в 3 триместре беременности (группа СЗРП).

Исследования в 1 триместре проводились в 5-12 недель гестации, в 3 триместре в 32-40 недель гестации. Материалом для исследования служили периферическая кровь из локтевой вены и децидуальная ткань зрелой плаценты. Плацента была получена при своевременных родах в 38-40 недель беременности: 26 плацент от женщин из группы без СЗРП; 21 плацента от женщин из группы СЗРП.

Для проведения исследований методом проточной цитометрии получали обогащенные фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови и децидуальиой оболочки плаценты (ДО), для проведения культивирования

клеток выделяли чистые популяции лимфоцитов и моноцитов периферической крови, и общую фракцию МНК лейкоцитарного инфильтрата ДО, для выделения мРНК получали чистые популяции лимфоцитов и моноцитов/макрофагов периферической крови и ДО плаценты. Выделение МНК из децидуальной ткани осуществляли безферментативным механическим способом (Chernyshov V.P., 1993). Обогащенную фракцию МНК получали стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина. Разделение мононуклеарных клеток на фракции лимфоцитов и моноцитов/макрофагов производили методом адгезии монослоя моноцитов/макрофагов на пластике (Фримель Г., 1987).

Поверхностный фенотип клеток, внутриклеточную экспрессию цитокинов, содержание AnnexinV-позитивных и пропидиум иодид окрашиваемых клеток определяли методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (F1TC) и фикоэритрин (РЕ).

Стимуляцию экспрессии активационных молекул на поверхности лимфоцитов проводили эмбриональным антигеном (ЭАГ) и супернатантами 24-часовых культур мононуклеарных клеток децидуальной оболочки плаценты (СН МНК ДО). В качестве контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в аналогичных условиях в среде RPMI-1640 с глютамином.

Спонтанную внутриклеточную продукцию цитокинов оценивали в свежевыделенных клетках. Стимулированную внутриклеточную продукцию цитокинов исследовали в клеточной суспензии инкубировавшейся при 37°С и 5%С02 в течение 5 часов в среде RPM1 1640, содержащей 10% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 2 тМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина, 10 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА) (Sigma, США), 1 jiM иономицина (Sigma, США) и 2 цМ моненсина (Sigma, США).

Оценку снонтанной секреции цитокинов и ростовых факторов проводили по их содержанию в супернатантах клеточных культур после 24-часовой

инкубации при 37°С и 5% С02 в среде RPMM640, содержащей 2mM L-тютамина. Для оценки индуцированной секреции в культурапьную среду добавляли ФГА в концентрации 4 мкг/мл или 0,05% раствор продигиозана. Для инкубации использовали конечную концентрацию клеток: для лимфоцитов периферической крови и МНК ДО - 2 х 106 кл/мл или 1 х 10 кл/мл для моноцитов. Супернатанты (СН) клеточных культур соответствующих групп пулировали (не менее 10 индивидуальных СН в каждом пулированном образце) и хранили в стерильных флаконах при -20°С.

Эмбриональный антиген выделяли из эмбриональных тканей 10 эмбрионов, полученных при медицинских абортах в 10-12 недель беременности от женщин с неосложненным течением беременности. Кусочки эмбрионов гомогенизировали до однородной массы и заливали PBS в объеме равном исходному весу эмбриональных тканей (на 1 г эмбриональной ткани - 1 мл PBS). Полученный объем гомогената помещали в пластиковый флаконы и подвергали замораживанию на 1-2 суток при температуре -20°С, затем размораживали, фильтровали через 8 слоев плотной марли и ультрацентрифугировали 30 мин при 8000 об/мин при температуре +4°С в рефрижераторной центрифуге. Надосадочную жидкость, содержащую ЭАГ, фильтровали через миллипоровые фильтры диаметром 0,22|лм (Synpor, Чехословакия), разливали мелкими аликвотами и замораживали при -20°С.

Экстракты децидуальной ткани получали из зрелой плаценты. Децидуальную оболочку срезали небольшими пластинами и отмывали физиологическим раствором, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 минут. Кусочки децидуальной ткани взвешивали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли PBS в объеме равном изначальному весу децидуальной ткани (на 1 г ткани - 1 мл PBS). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток. Гомогенат размораживали, фильтровали через 8 слоев плотной марли и ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об/мин при температуре +4°С.

Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и замораживали при -20°С до проведения иммуноферментного анализа.

Содержание цитокинов и растворимых форм их рецепторов, факторов роста, эндотелина, Вс1-2, р53 в крови и в экстрактах децидуальной ткани оценивали методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия).

Для определения экспрессии специфической мРНК лимфоцитами и моноцитами/макрофагами периферической крови и децидуальной оболочки плаценты использовали полуколичественный метод RT-PCR в реальном времени.

Процедуру выделения тотальной РНК из клеток проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом с использованием набора реагентов «Онкоскрин» ООО «ГеноТехнология» (Россия). Данная тест-система позволяет выделить тотальную РНК и получить при помощи неспецифической обратной транскрипции кДНК из клеток, лизированных в растворе, содержащем гуанидин тиоцианат, цитрат натрия, саркозил и 2-меркаптоэтанол. Полуколичественное определение экспрессии мРНК цитокинов проводили с использованием стандартного протокола BIOSOURCE INTERNATIONAL. Для определения интенсивности флюоресцентного сигнала использовался прибор iCycier (BIO-RAD, США). Во всех случаях результаты были представлены как п-кратные различия транскрипционного уровня специфического гена в группе СЗРП по отношению к соответствующим показателям в группе без СЗРП.

Содержание иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM определяли методом радиальной иммунодиффузии в агаре (Manchini G., е.а., 1965) с использованием наборов реактивов НПБП «ИмБио» (Россия).

В мазках-соскобах из цервикального канала методом ПЦР в реальном времени определяли наличие ДНК HSV 1, 2, CMV, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и Mycoplasma genitalium с использованием коммерческих систем НПФ «ДНК-Технология» (Россия) на приборе ¡Cycler (BIO-RAD, США). В периферической крови методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) с

использованием коммерческих систем ЗАО «Вектор-Бест» определяли уровень IgM и IgG антител к HSV 1, 2, CMV, Chlamydia trachomatis, и содержание IgG AT к Ureaplasma urealyttcum и Mycoplasma hominis.

Содержание антифосфолипидных антител определяли методом твердофазного ELISA с использованием коммерческих тест-систем анти-фосфолипид скрининг фирмы Orgentec Diagnostika GmbH (Германия).

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000 и программы STUD ВАТ из комплекта «Statistica». Достоверность различий сравниваемых показателей определялась по t-критерию Стьюдента. Результаты работы и их обсуждение

Проведенные нами исследования выявили взаимосвязь между характером развития плода и особенностями иммунологических реакций на всем протяжении беременности.

Известно, что беременность ассоциируется с активацией иммунной системы матери, начиная с самых ранних сроков гестации (Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005). По нашим данным неосложненное развитие плода в 1 триместре беременности сопровождалось повышением уровня CD25- и HLA-DR-позитивных лимфоцитов по сравнению с показателями небеременных женщин (р<0,001 и р<0,05, соответственно), следовательно, позитивные эффекты, способствующие прогрессированию беременности и развитию плода, определялись усилением процессов активации периферических лимфоцитов.

При СЗРП, как и при неосложненном развитии плода, в периферической крови матери увеличивалось содержание С025-позитивных клеток по сравнению с показателями небеременных женщин (р<0,001). Однако, в отличие от параметров группы женщин с неосложненным развитием плода, в группе СЗРП показатель содержания HLA-DR-позитивных лимфоцитов в периферической крови в ранние сроки гестации не изменялся по сравнению с показателями небеременных женщин (р>0,05) и был достоверно ниже, чем в

группе с неосложненным развитием плода (р<0,01). При этом в группе СЗРП отмечались более низкие значения содержания HLA-DR-позитивных Т-лимфоцитов, Т-хелперов и В-лимфоцитов по сравнению с показателями группы женщин без СЗРП (р<0,05, р<0,05, р<0,01, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют, что при СЗРП в ранние сроки гестации в основном отмечалось угнетение процессов активации периферических лимфоцитов.

Усиление экспрессии активационных молекул лимфоцитами матери в ранние сроки гестации, по-видимому, является адекватной реакцией иммунной системы, определяющей новый уровень регуляции гомеостаза в материнском организме (Sotnikova N. Yu., е.а., 1999). Возможно, изменение уровня активации лимфоцитов определяется особенностями гормонального фона в ранние сроки гестации (Савельева Г.М., с соавт., 19991; Piccinni М.-Р., 2004) Большинство гормонов ранней беременности, продуцируемых плацентой (хорионический гонадотропин, пролактин, эстрогены), способны активировать клетки и стимулировать их пролиферацию, активировать клеточно-опосредованные и гуморальные иммунные реакции (Ширшев C.B., 2002; Gala R.R., Shevach Е.М. 1993; Lahat N., е.а., 1993). Однако стимулирующие эффекты гормонов ранней беременности проявляются в основном на малых дозах и зависят от наличия или отсутствия костимулирующих сигналов (Ширшев C.B., 2002), что ставит под сомнение ведущую роль гормонального сигнала в активации периферических лимфоцитов матери при повышении их концентрации в крови с наступлением беременности.

По данным литературы в материнском кровотоке в ранние сроки беременности выявляются отдельные клетки плода и частицы ворсин хориона (Knight M., е.а., 1998; Sacks G., е.а., 1999), что может способствовать активации мононуклеарных клеток периферической крови матери. В связи с этим мы исследовали возможность активации лимфоцитов небеременных доноров антигеном эмбрионального происхождения. Проведенный эксперимент показал, что факторы плодового происхождения стимулируют активацию

клеток, так как in vitro ЭАГ достоверно усиливал экспрессию CD25 и HLA-DR молекул лимфоцитами доноров (до инкубации 3,58±0,26 и 11,20+0,71; после инкубации 4,84±0,17 и 14,60±1,39, р<0,001 и р<0,05, соответственно). Вероятно, при СЗРП отмечается недостаточная стимуляция материнских лимфоцитов АГ плодового происхождения. Кроме того, низкий уровень активации лимфоцитов при СЗРП мог определяться генетическими нарушениями ответа матери на антигены плода, отцовского происхождения, так как в литературе имеются данные, что лимфоциты женщин с СЗРП проявляют сниженный ответ в СКЛ на лимфоциты мужа, но не донора (Tsushima R., е.а.. 1995).

Наряду с изменениями параметров активации в ранние сроки гестации, нами были отмечены изменения популяционного состава лимфоцитов. В ранние сроки беременности и при неосложненном развитии плода, и при СЗРП отсутствовали достоверные различия в содержании общих популяций Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) по сравнению с показателями небеременных женщин (р>0,05 во всех случаях), но для обеих групп беременных женщин было характерным достоверное повышение уровня CD4+CD25+ (р<0,001 для группы без СЗРП и р<0,01 для группы с СЗРП) и CD4+IL-10+ Тг клеток (р<0,001 в обоих случаях) по сравнению с показателями небеременных женщин. Однако в группе СЗРП изменения уровня CD4+CD25+ клеток были менее выраженными, что определило достоверное снижение их содержания относительно показателей женщин без СЗРП (р<0,05).

Полученные нами данные совпадают с результатами исследований других авторов, которые показали, что на ранних сроках гестации в крови и в децидуальной оболочке плаценты повышается содержание Тг клеток (Heikkinen J., е.а., 2004; Sasaki Y„ е.а., 2004; Somerset D.A., е.а., 2004). По данным Polanczyk M.J. с соавт. (2004), повышение уровня экспрессии Foxp3 лимфоцитами при беременности происходит под влиянием 17-Р-эстрадиола. Известно, что Тг лимфоциты, способны подавлять иммунный ответ и контролировать активность аутореактивных Т-клеток (Roncarolo M.G., е.а., 2001; Sasaki Y., е.а., 2004; Shevach Е.М. 2002). Достоверное уменьшение

содержания CD4+CD25+ клеток позволяет нам предположить, что при задержке развития плода мы наблюдали недостаточное увеличение пула Тг клеток с наступлением беременности. Следовательно, при СЗРП сохранялись механизмы, способствующие прогрессивному развитию беременности и препятствующие развитию патологического иммунного ответа, но их действие было менее эффективным, чем при неосложненном развитии плода.

Исследуя особенности содержания различных субпопуляций Т-хелперов в периферической крови в ранние сроки гестации, нами было установлено, что и при неосложненном развитии плода, и при СЗРП возрастало содержание CD4+IL-2+, CD4+IFNy+, CD4+1L-4+ клеток по сравнению с показателями небеременных женщин (р<0,001 во всех случаях). Однако при неосложненном развитии плода в ранние сроки гестации в популяции Th преобладали CD4+IL-4+ клетки (содержание CD4+1L-4+ клеток составило 26,18% от общего содержания Т-хелперов, CD4+IL-2+ - 11,06%, CD4+IFNy+ - 21,79%, CD4+IL-6+

- 11,80%). Одновременно в сыворотке периферической крови данной группы отмечался повышенный уровень 1L-4 (р<0,01) и сниженное содержание IFNy (р<0,05). Это подтверждало мнение других авторов о шифте дифференцировки Т-хелперов в ранние сроки неосложненной беременности в сторону Th2 типа (Elson L.H., е.а., 1995; Nakazawa М., е.а., 1997; North М.Е., е.а., 1996; Openshaw Р.,е.а. 1995; SaitoS., 1999).

В группе женщин с СЗРП в периферической крови уровень CD4+IL-4+ лимфоцитов, был достоверно более низким, чем в группе женщин без СЗРП (р<0,05), но было отмечено достоверное повышение содержания другой фракции Th2, продуцирующих IL-6, по сравнению с показателями небеременных женщин (р<0,05). При этом, в ранние сроки гестации группа женщин с впоследствии развившимся СЗРП отличалась от группы женщин без СЗРП преобладанием lFNy+ лимфоцитов в общей популяции периферических Т-хелперов (содержание CD4+IFNy+ клеток составило 20,63% от общего содержания Т-хелперов, CD4+IL-2+ - 10,32%, CD4+1L-4+ - 18,47%, CD4+IL-6+

- 11,80%). Одновременно в сыворотке периферической крови женщин с СЗРП в

ранние сроки гестации отмечалось повышенное содержание IHN у и IL-12, но более низкий уровень IL-4 по сравнению с таковыми в группе женщин без СЗРП (р<0,05, р<0,05, р<0,01, соответственно).

Известно, что IL-6 является одним из основных факторов поликлональной активации B-лимфоцитов, провоцирующим развитие аутоиммунных реакций (Назаров П.Г., 2001). Увеличение периферических IL-6+ Т-хелперов в группе с СЗРП хорошо сочеталось с отмеченным нами ростом популяции В1 лимфоцитов (CD20+CD5), ответственной за продукцию аутоантител как по сравнению с показателями небеременных, так и беременных женщин без СЗРП (р<0,05 и р<0,001 соответственно). Наряду с этим в группе СЗРП в ранние сроки гестации возрастало содержание сывороточных IgG и IgM (р<0,001 и р<0,05 соответственно), что подтверждает активацию гуморального иммунитета.

Любой активационный сигнал, определяющий характер иммунного ответа, предполагает изменение характеристик не только специфического иммунного ответа, но и реакции врожденного иммунитета. Традиционно считается, что ЕК играют важную роль при беременности (Bulmer J.N., Lash G.E., 2005; Moffett-King А,, 2002). Наше исследование показало, что содержание CD 16+ ЕК в группе с неосложненным развитием плода не отличалось от такового у небеременных женщин (р>0,05), однако в группе СЗРП достоверно повышалось содержание этой популяции клеток по сравнению с показателями небеременных женщин (р>0,01) и отмечался рост уровня CD16+CD3+ ЕК-Т-лимфоцитов по сравнению с показателями женщин без СЗРП (р<0,05). Следовательно, отмеченное нами повышение сывороточного содержания IFNy и IL-I2 могло отражать не только активацию ТЫ, но и свидетельствовать об активации ЕК при СЗРП в ранние сроки гестации. В то же время, при СЗРП в крови достоверно повышался уровень CD16+IFNy+ ЕК относительно показателей женщин с неосложненным развитием плода. Это хорошо согласуется с установленным при СЗРП повышением уровня ЕК-Т лимфоцитов, так как именно ЕК-Т клетки являются

наиболее активными продуцентами цитокинов, в то числе IFNy (Baxter A.G., 2000). Кроме того, результаты исследований ряда авторов показали, что низкий уровень ЕК-Т в крови определяет развитие аутоиммунных реакций (Baxter A.G., 2000; Ikehara Y., е.а., 2000; Nicol А., е.а., 2000). Таким образом, повышение содержания ЕК-Т клеток при СЗРП можно рассматривать как компенсаторную реакцию, сдерживающую развитие аутоиммунного процесса в периферической крови матери и преждевременное прерывание беременности. Возможно, в ранние сроки гестации при СЗРП именно этим определялось отсутствие достоверных различий в содержании антифосфолипидных IgM AT в периферической крови по сравнению с показателями женщин без СЗРП (р>0,05), несмотря на достоверное повышение уровня В1-клеток.

Важную роль в обеспечении пролонгирования ранней беременности играет и другой пул клеток врожденного иммунитета — моноциты/макрофаги. По данным некоторых авторов макрофаги беременных женщин находятся в активированном состоянии (Sacks G.P., е.а., 2003). Однако, как показывают исследования, в том числе и наши собственные, во время гестационного процесса в периферической крови происходило некоторое смещение акцентов в выполняемых функциях клетками моноцитарно/макрофагального ряда. По нашим данным периферические моноциты беременных женщин с неосложненным развитием плода в ранние сроки гестации слабее экспрессировали функциональные и адгезионные молекулы (HLA-DR, CD 16, CD lib), чем клетки небеременных женщин (р<0,01, р<0,001, р<0,001, соответственно). При этом в группе женщин без СЗРП возрастало содержание моноцитов внутриклеточно продукцирующих IFNy и IL-10 (р<0,001 и р<0,05) по сравнению с показателями небеременных женщин.

В группе женщин с СЗРП в 1 триместре беременности было достоверно снижено содержание HLA-DR+ и CD 16+ моноцитов (р<0,01, р<0,05, соответственно) и значительно снижалось содержание моноцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-10 и IFNy, по сравнению с показателями женщин из группы без СЗРП (р<0,05 во всех случаях). Учитывая тот факт, что

продукция IL-10 периферическими моноцитами способна усиливаться при воздействии различных изоформ специфических для беременности гликопротеинов (На С.Т., е.а., 2005), можно предположить, что одним из факторов нарушения активации моноцитов при СЗРП может быть нарушение продукции специфических белков беременности плацентарными тканями, так как при СЗРП их уровень достоверно снижается (Татаринов Ю.С,, с соавт., 1998; Савельева Г.М., с соавт., 1991). Нарушения антигенпрезентирующей функции и продукции регуляторных цитокинов при СЗРП могло способствовать снижению иммунорегуляторного потенциала моноцитов.

Мигрируя в плаценту и приобретая свойства зрелых макрофагов, моноциты могли сохранять низкий уровень своей активации и продукции IFNy в результате снижения уровня плацентарного активационного сигнала. Учитывая тот факт, что IFNy является ключевым фактором модификации спиральных артерий (Chaouat G., е.а., 2004; Croy В.А., е.а., 2003), можно предположить, что недостаток продукции интерферона

моноцитами/макрофагами мог определять нарушение процессов модификации спиральных артерий матки, характерное для СЗРП (Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998; Милованов А.П., 1999; Сидорова И.С., Макаров И.О. 2000; Sebire N.J., е.а., 2004).

В то же время, несмотря на общую гипоактивацию моноцитов крови, при СЗРП повышался уровень 1L-6+ моноцитов по сравнению с таковым у женщин с неосложненным развитием плода (р<0,05), что могло приводить к активации воспалительных и аутоиммунных реакций. IL-6 способен не только стимулировать развитие воспалительных и аутоиммунных реакций, но и подавлять обмен веществ, вызывать нарушение питания, а также подавлять обмен железа и вызывать развитие анемии (Heinrich P.C., е.а., 1995). Следует отметить, что СЗРП часто сопровождается развитием анемии и гипоксии плода (Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998; Савельева Г.М., с соавт., 1991).

Установленные изменения параметров активации моноцитов позволили разработать способ прогнозирования развития СЗРП по определению в 6-12

недель гестации в периферической венозной крови относительного содержание HLA-DR+ моноцитов и при его значениях равных или меньших 57,90% прогнозировать развитие СЗРП с точностью 75,00%, чувствительностью 70,59% и специфичностью 78,95% (Патент №2265224).

Активация клеток тесно связана с процессами апоптоза (Ярилин А.А., с соавт., 2000). Как показали исследования, в группе женщин без СЗРП в 1 триместре беременности наибольшую готовность к вступлению в апоптоз проявляли CD56+ ЕК клетки (74,57% от общей популяции CD56+ клеток), а наименьшую — CD4+ клетки (3,81% от общей популяции CD4+ лимфоцитов). При СЗРП в ранние сроки гестации низкий уровень активации лимфоцитов и моноцитов сочетался с более низкой их готовностью к апоптозу (р<0,05 в обоих случаях). Наиболее выраженное снижение Fas+ клеток отмечалось в популяциях CD8+ ЦТЛ и CD56+ ЕК (р<0,05 в обоих случаях).

Учитывая тот факт, что осложнения беременности часто ассоциируются с усилением активности цитотоксических клеток (Berkowitz R. et al., 1988; Chaouat G. et al., 1990; Coulam C.B. et al., 1995), можно предположить, что их повышенная готовность к апоптозу в ранние сроки гестации способствует своевременной элиминации выполнивших свою функцию эффекторных клеток, тем самым, блокируя развитие неблагоприятного для беременности и плода цитотоксичсского ответа. Возможное накопление ЦТЛ и ЕК, на фоне роста пула ЕК, внутриклеточно продуцирующих IFNy, может быть одним из патогенетических факторов повреждения тканей плаценты и развития фето-плацентарной недостаточности.

Угнетение экспрессии Fas молекул моноцитами при СЗРП сочеталось с уменьшением содержания AnnexinV+Pl- моноцитов (р<0,05), что могло способствовать накоплению клонов IL-6-продуцирующих моноцитов.

Отмеченное нами угнетение активации мононуклеарных клеток периферической крови при СЗРП могло быть одним из решающих механизмов нарушения формирования сети плодово-плацентарного кровообращения, поскольку они синтезируют факторы, непосредственно регулирующие

ангиогенез в плаценте (Ковальчук Л.В. с соавт., 2001; Moffett-King А., 2002), к которым относят VEGF и P1GF (Ahmed A., Perkins J., 2000; Torry D.S., e.a., 2004).

Результаты наших исследований показали, что в I триместре беременности при СЗРП снижалось содержание VEGF (р<0,01) и P1GF (р<0,05). Наряду с этим в периферической крови женщин с СЗРП в 1 триместре беременности снижалось содержание растворимой формы VEGF RI по сравнению с аналогичным показателем женщин без СЗРП (р<0,001). Установленные изменения позволили разработать способ раннего прогнозирования развития СЗРП по определению в периферической крови женщин в 6-12 недель гестации уровня VEGF в сыворотке периферической крови при значениях которого равных или меньших 20пг/мл с точностью 81,25%, чувствительностью 75%, специфичностью 87,50% прогнозировать развитие СЗРП (приоритетная справка №2005118699 от 16.06.2005).

Экспериментальные исследования вазомоторного ответа изолированных плацентарных сосудов показывают, что и VEGF, и P1GF обладают способностью расширять сосуды (Szukiewicz D. с соавт. 2005). Установленные нами изменения в содержании VEGF и P1GF свидетельствовали о том, что уже в ранние сроки беременности при СЗРП имелись предпосылки к нарушению формирования и функционирования системы плодово-плацснтарного кровообращения, как в результате нарушения роста сосудов, так и в результате недостаточного вазодилятационного эффекта, определяющего проницаемость сосудов для питательных веществ и кислорода.

Наряду с факторами ангиогенеза в периферической крови женщин в ранние сроки гестации нами определялось содержание регуляторного цитокина - TGFß2. Установлено, что в периферической крови женщин с СЗРП был достоверно повышен уровень TGFß2 по сравнению с показателями женщин без СЗРП (р<0,001), что выдвигает этот цитокин на роль главного фактора, сдерживающего патологические реакции при СЗРП и способствующего пролонгированию беременности. В то же время TGFß способен усиливать

продукцию плацентарными фибробластами различных компонентов экстрацеллюлярного матрикеа (Chen С.Р., е.а., 2005). Увеличение содержания компонентов ЭЦМ может затруднять процессы инвазии трофобласта, диффузии кислорода и питательных веществ от матери к плоду. Таким образом, биологические эффекты TGF могли с одной стороны блокировать развитие патологических иммунных реакций, а с другой стороны определять ряд негативных процессов, нарушающих развитие плаценты и плода.

Таким образом, формирование СЗРП в ранние сроки гестации сопровождалось недостаточным активационным сигналом, определяющим слабую выраженность иммунорегуляторных процессов, и появлением признаков аутоиммунного и воспалительного процессов, сдерживаемых усиленной продукцией TGFß2. Вероятно, все эти изменения способствовали раннему развитию фето-плацентарной недостаточности и развитию СЗРП.

Известно, что развитие аутоиммунных и воспалительных реакций в значительной степени определяется инфекционным процессом (Прозоровский C.B., с соавт., 1995; Ярилин A.A., 1999). Нами было показано, что в группе женщин с СЗРП достоверно чаще, чем в группе без СЗРП, выявлялась ДНК U.urealyticum в 1 триместре беременности (р<0,05). На всем протяжении беременности в группе женщин с СЗРП достоверно чаще выявлялись IgG антитела к CMV (р<0,01), и отмечалась устойчивая тенденция к увеличению частоты выявления IgG AT к Chi. trachomatis по сравнению с показателями группы с неосложненным развитием плода (р>0,05). В 3 триместре беременности в периферической крови женщин с СЗРП достоверно чаще, чем в группе женщин без СЗРП, выявлялись IgG AT к M. hominis (р<0,05).

Таким образом, на всем протяжении беременности при СЗРП отмечалось усиление активности представителей класса Mollicutes, которые, вступая во взаимодействие с инфицированной клеткой, способны изменять структуру ее плазматической мембраны. В результате этого нарушается процесс распознавания антигенов иммунной системой хозяина и индуцируется выработка аутоантител против собственных тканей и клеток (Прозоровский

C.B., с соавт., 1995). Вероятно, именно этот фактор является основным в инициации аутоиммунных реакций при СЗРП.

Известно, что CMV способен непосредственно подавлять рост клеток трофобласта и угнетать продукцию противоспалительного IL-10 (Fisher S., е.а., 2000; Hemmings D.G., е.а., 1998; Pereira L., е.а., 2003), чем могло определяться снижение содержания регуляторных Т-лимфоцитов и уровня IL-10+ моноцитов при СЗРП.

Отмеченные нами при СЗРП нарушения иммунных реакций в ранние сроки гестации сохранялись и на поздних сроках беременности, но принимали несколько иной характер.

Анализ параметров активации периферических лимфоцитов в поздние сроки гестации показал, что для группы женщин с СЗРП было характерным повышение содержания CD25+, HLA-DR+, CD3+HLA-DR+ и CDllb+ клеток (р<0,05, р<0,001, р<0,05, р<0,01, соответственно), но снижалось количество CD3+CD40L+ и CD4+CD71+ клеток (р<0,05 в обоих случаях) по сравнению с показателями женщин без СЗРП. Наряду, с этим в периферической крови женщин с СЗРП увеличивалось содержание пула коммитированных лимфоцитов (р<0,05), что скорее всего свидетельствовует об усилении реакций, определяемых активацией пула клеток памяти. Усиление активации периферических лимфоцитов при СЗРП могло быть результатом неадекватного формирования плацентарных барьеров и поступлением в кровоток матери деструктивного материала в результате развития воспалительных процессов в плаценте (Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998; Филинова Н.Ю., 2000; Милованов А.П., 1999). Рост пула клеток памяти на фоне усиления экспрессии маркеров поздней активации скорее всего свидетельствует о переходе патологических процессов при СЗРП в хронические.

Исследования популяционного состава периферической крови женщин с СЗРП и без СЗРП в 3 триместре беременности показало, что сравниваемые группы не различались по содержанию CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов (р>0,05 во всех случаях). Несмотря на отсутствие различий по содержанию

CD4+CD25+ Тг клеток (p>0,05), в периферической крови женщии с СЗРП по сравнению с таковым у женщин без СЗРП, достоверно повышался уровень CD4+1L-10+ Тг клеток (р<0,001).

В поздние сроки гестации в периферической крови женщин с СЗРП достоверно увеличивалось содержание CD20+ B-лимфоцитов (р<0,05) и отмечался повышенный уровень сывороточного IgM (р<0,05). Отмеченное нами достоверное снижение содержания CD3+CD40L+ лимфоцитов в поздние сроки гестации и стабильно повышенный уровень IgM на всем протяжении беременности позволяют предположить, что при СЗРП нарушались механизмы переключения синтеза иммуноглобулинов. Это могло способствовать поддержанию аутоиммунных реакций, что подтверждается результатами исследований других авторов, которые отмечали в периферической крови женщин с СЗРП высокий уровень гетерофильных гемолизинов, аутолимфоцитотоксических антител и антител к Р2-гликопротеину-1 (Назаренко H.A., Антипенская Н.В., 1992; Яроцкая Н.Е., с соавт. 1991; Сухих Г.Т. с соавт. 2004).

В периферической крови женщин с СЗРП в поздние сроки гестации отмечалось повышенное содержание CD16+ ЕК на фоне усиления ими экспрессии активационных (CD16+CD25+) и адгезионных молекул (CD16+CD11Ь+), а также роста пула CD16+IFNy+ клеток по сравнению с показателями группы женщин без СЗРП (р<0,01, р<0,05, р<0,001, р<0,01, соответственно).

Сравнительный анализ содержания различных популяций Т-хелперов показал, что при неосложненном развитии плода в крови матери в поздние сроки беременности преобладали Thl, в то время как в группе СЗРП их уровень был снижен и содержание Thl соответствовало уровню Th2 (CD4+IL-2+ -8,09+0,46% и 6,45+0,40%, CD4+IFNy+ - 9,23+0,89% и 6,93±0,44%, CD4+IL-4 -7,12±0,49% и 7,79±0,76%, CD4+IL-6+ - 6,29±0,48% и 6,55+0,53%, р<0,05, р<0,05, р>0,05, р>0,05, соответственно). Вероятно, при СЗРП нарушаются процессы диффсрснцировки Т-хелперов. Изменения в содержании Thl клеток в

группе женщин с неосложненным развитием плода хорошо укладываются в общую концепцию, предлагаемую различными авторами об усилении цитотоксического иммунного ответа перед родами (Сотникова Н.Ю. 2005; Науапо С., е.а. 2001). Можно предположить, что этот феномен имеет отношение к защите плода от инфекции при его прохождении через родовые пути в момент родов. Известно, что при СЗРП уровень инфицирования новорожденных повышен (Медведев М.В., Юдина Е.В., 1998), что может быть обусловлено ослаблением данного защитного механизма.

В поздние сроки гестации при СЗРП увеличивалось содержание HLA-DR+, CD11Ь+ и CD16+ моноцитов (р<0,01, р<0,05, р<0,001, соответственно), но снижался уровень CD71+ и IL-10+ моноцитов (р<0,01, р<0,001, соответственно). По-видимому, при СЗРП также как и в ранние сроки гестации в конце беременности также отмечается дисбаланс активации моноцитов.

Проведенные исследования параметров апоптоза показали, что при СЗРП в крови матери в поздние сроки гестации росла готовность лимфоцитов и моноцитов к апоптозу (р<0,05 в обоих случаях), увеличивалось содержание AnnexinV+PI-, AnnexinV+PI+ лимфоцитов (р<0,05 в обоих случаях) и AnnexinV+PI- моноцитов (р<0,05) по сравнению с показателями женщин без СЗРП. Вероятно, это было обусловлено одновременным усилением экспрессии мРНК р53 лимфоцитами и моноцитами (р<0,001 в обоих случаях), ростом пула лимфоцитов и моноцитов, экспрессирующих FasL (р<0,05 в обоих случаях).

В конце гестации развитие СЗРП на системном уровне сопровождалось увеличением содержания в периферической крови 1L-4, 1L-8 и 1L-10 (р<0,01, р<0,05, р<0,01, соответственно); возрастающим уровнем спонтанной секреции IL-6, 1L-10 (р<0,001 в обоих случаях), сниженным уровнем спонтанной секреции TNFa и IFNy лимфоцитами (р<0,05 в обоих случаях); усилением спонтанной секреции 1L-6 (р<0,001), но снижением спонтанной секреции IL-ip и IL-10 моноцитами (р<0,001 в обоих случаях).

Данные RT-PCR показали, что для группы СЗРП в поздние сроки беременности было характерно достоверное усиление экспрессии лимфоцитами

мРНК 1Ь-6 и (р<0,01 и р<0,05, соответственно). В моноцитах при СЗРП в поздние сроки гестации достоверно снижалась экспрессия мРНК IЬ-1 р (р<0,001) и усиливалась экспрессия мРНК 1Ь-б (р<0,001) по сравнению с показателями группы без СЗРП.

Таким образом, для СЗРП в поздние сроки гестации в целом было характерно одновременное усиление продукции как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов. Угнетение при СЗРП продукции моноцитами 1Ь-1Р, на фоне повышения синтеза и секреции 1Ь-6 могло свидетельствовать о переходе воспалительных процессов в хроническое состояние. Отмеченное нами при СЗРП снижение продукции 1РЫу и ТЫ Ра лимфоцитами могло определяться снижением уровня ТЫ.

Стимуляция клеток ФМА, иономицином и моненсином при неосложненном развитии плода вызывала рост содержания С04+1Ь-2+ и С04+1Ь-4+ Т-хелперов, С04+1Ь-10+ Тг лимфоцитов и СЭ1б+1РМу+ ЕК (р<0,001, р<0,001, р<0,001, р<0,05, соответственно). Можно предположить, что в крови женщин с неосложненным развитием плода в конце гестации присутствовало большое количество ТЬО клеток, необходимое для быстрой смены клеточного репертуара при возникновении гестационных осложнений. Дополнительная нагрузка в виде стимуляции клеток при неосложненном развитии плода провоцировала усиление внутриклеточной продукции 1РЫу+ ЕК, характерное для СЗРП в поздние сроки гестации. Стимуляция клеток при СЗРП не приводила к усилению внутриклеточной продукции цитокинов периферическими С04+1Ь-2+, СЭ4+1РЫу+, СЭ4+1Ь-4+ Т-хелперами (р>0,05 во всех случаях), т.е. биологические эффекты большинства субпопуляций Т-хелперов проявлялись на пределе их компенсаторных возможностей. Возможно, при нарушении развития плода и в 3 триместре беременности отмечается слабо выраженное, но постоянное раздражающее воздействие на иммунную систему матери инфекционных агентов. При этом длительное воздействие активирующего сигнала могло приводить к истощению компенсаторных возможностей Т-хелперов.

При СЗРП дополнительная стимуляция клеток определяла рост только популяции Т-хелперов и моноцитов, продуцирующих IL-6 (р<0,01, р<0,05, соответственно). Вероятно, именно поэтому СЗРП очень часто сопровождается срывом компенсаторных реакций и развитием гестоза с мощным проявлением аутоиммунных и воспалительных процессов (Сидорова И.С., Макаров И.О., 2 ООО).

Таким образом, нарушение развития плода на системном уровне к концу гестации определялось формированием вяло текущих воспалительных и аутоиммунных реакций в результате постоянной активации МНК, роста пула клеток памяти, усиления синтеза IL-6 лимфоцитами и моноцитами, угнетения цитокин-продуцирующей активности моноцитов. Относительный баланс между развитием и блокированием патологических реакций на системном уровне, по-видимому, определялся действием таких супрессорных механизмов как высокий уровень Tri клеток, увеличение сывороточного содержания IL-10 и усиление апоптоза клеток. В то же время, избыток IL-10 может оказывать и негативное воздействие на характер течения воспалительного процесса, способствуя снижению противоинфекционной защиты и развитию хронических инфекций (Berger S., е.а., 1996). Этот факт вполне согласуется с нашими выводами о хроническом характере патологических процессов при СЗРП на поздних сроках гестации.

Хорошо известен тот факт, что иммунологические реакции на системном уровне не всегда адекватно отражают характер процессов на уровне плаценты. Это определяется наличием особой «барьерной» функции плаценты, сдерживающей поток антигенов плода, особенно усиливающийся при развитии патологических изменений в плацентарных структурах (Савельева Г.М. с соавт., 1991; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2000; Милованов А.П., 1999). Кроме того, клетки децидуальной оболочки и трофобласта продуцируют широкий спектр растворимых факторов, обладающих иммуномодулирующими свойствами (Hanh-Zoric M., е.а., 2002). Децидуальная оболочка плаценты является в некоторой степени аналогом регионарных лимфатических узлов, что

определяет возможность самостоятельной экстратим и ческой дифференцировки Т-лимфоцитов непосредственно в плаценте (Науакауга Б., е.а., 1996). В связи с этим исследование особенностей фенотипа и параметров активации мононуклеарных клеток плаценты позволяет глубже понять особенности локальных механизмов формирования патологии плода.

Результаты исследований показали, что при СЗРП по сравнению с показателями группы без СЗРП лимфоциты и макрофаги лейкоцитарного инфильтрата ДО плаценты в меньшей степени экспрессировали МЬА-ВЯ молекулы (р<0,05 в обоих случаях), но больше С011Ь молекулы (р<0,01 в обоих случаях). Показатели содержания С011Ь+ лимфоцитов в периферической крови большие или равные 20% позволяют с высокой точностью - 85,9%, чувствительностью - 77% и специфичностью - 94% диагностировать СЗРП в 3 триместре беременности во всех случаях (Патент №2188427). В группе женщин с СЗРП увеличивалось содержание С071 + лимфоцитов (р<0,05). Изменения в содержании НЬА-ГЖ и С071 позитивных лимфоцитов были наиболее выраженными в популяции Т-хелперов (р<0,001 в обоих случаях). В популяции децидуальных ЕК при СЗРП отмечалось снижение уровня СШ6+С025+, С016+1РЫу+, С056+ [РК'у+ клеток, по сравнению с показателями группы без СЗРП (р0,05, р<0,01, р<0,01, соответственно).

Подобный дисбаланс активации МНК при СЗРП мог свидетельствовать о развитии процессов, не требующих предварительной презентации антигена, а формирующихся при длительной активации клонов клеток-памяти. Так, при СЗРП в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочки плацент снижался уровень наивных, но увеличивалось содержание коммитированных Т-хелперов и В-клеток памяти по сравнению с показателями группы с неосложненным развитием плода (р<0,05, р<0,001, р<0,05, соответственно). Кроме того, при СЗРП в децидуальной оболочке плаценты достоверно снижалось содержание С04+С025+ и СО4+1Ы0+ Тг лимфоцитов (р<0,01, р<0,001, соответственно), а также ТС1*у5+ Т-лимфоцитов (р<0,001).

Известно, что при физиологической беременности происходит существенное повышение содержания СОЗ+ТСИ.у5+ клеток в интерфазе мать-плод, способных связывать непроцессированные суперантигены, особенно инфекционного происхождения, и распознавать эндогенные тканеспецифичные пептиды, появляющиеся при деструктивных процессах (НеуЬогпе К.й., е.а., 1992; Мееихеп Е., е.а., 1993). По-видимому, при СЗРП увеличивался пул клеток, реагирующих только на процессированный антиген, и уменьшался пул клеток, способных воспрепятствовать развитию инфекционного и аутоиммунного ответа. При нарушении процессов презентации антигена, как при СЗРП, это может вести к ослаблению в плаценте процессов элиминации процессированных и непроцессированных антигенов с последующим развитием хронического воспаления или аутоиммунного процесса. Вероятно, при СЗРП на локальном уровне нарушаются процессы экстратимической дифференцировки и активации клеток, а также механизмы иммунного надзора, позволяющие сдерживать развитие воспалительных и аутоиммунных реакций.

При СЗРП в децидуальной оболочке плаценты снижалось содержание как С04+1Ь-2+, С04+1РМу+ ТЫ, так и СЭ4+1Ь-4+ ТИ2, но возрастал уровень С04+1Ь-6+ клеток, по сравнению с показателями группы без СЗРП (р<0,001, р<0,001, р<0,01, р<0,05, соответственно). Изменения в содержании ТЫ при СЗРП сопровождались уменьшением уровня СЭ8+ лимфоцитов (р<0,05). В то же время рост популяции 1Ь-б продуцирующих Т-хелперов и В-клеток памяти при СЗРП сопровождался повышением уровня антифосфолипидных

антител в экстрактах ДО плаценты (группа без СЗРП — отсутствие ^О антифосфолипидных АТ в экстрактах ДО; группа СЗРП - 1,35±0,18 МЕ/мл), что подтверждает предположение о развитии аутоиммунных реакций на локальном уровне.

Изменения популяционного состава МНК лейкоцитарного инфильтрата ДО сочетались с нарушением синтеза, продукции и секреции целого ряда цитокинов. Сравнительный анализ данных показал, что в экстрактах децидуальной ткани плацент группы СЗРП было достоверно сниженным

содержание 1Ь-1р, 1Ь-8, 1Ь-10 и (р<0,001, р<0,01, р<0,001 и р<0,001,

соответственно), но достоверно повышен уровень И.-2 и 1Ь-12 по сравнению с показателями группы без СЗРП (р<0,001 и р<0,05, соответственно).

Также как и в экстрактах децидуальной ткани, при СЗРП достоверно снижалась спонтанная секреция 1Ь-1р и №N7 децидуальными МНК (р<0,001 и р<0,01, соответственно). Наряду с этим при СЗРП отмечалось снижение секреции 1Ь-4 и 1Ь-2, и повышение секреции 1Ь-6 и ТЫРа МНК ДО плаценты по сравнению с показателями группы без СЗРП (р<0,001 во всех случаях). В отличие от показателей содержания цитокина в экстрактах децидуальной ткани, в СН МНК лейкоцитарного инфильтрата ДО плаценты содержание 1Ь-8 не снижалось, а достоверно повышалось относительно значений группы без СЗРП (р<0,001).

Экспрессия мРНК цитокинов лимфоцитами лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки плаценты в группе СЗРП отличалась от таковой в группе без СЗРП активацией генов IЬ-6 (р<0,01) и небольшим уменьшением содержания мРНК 1Ь-10 (р<0,01) и №N7 (р<0,05). Макрофаги децидуальной оболочки в группе СЗРП, также как и лимфоциты сильнее, чем клетки в группе без СЗРП, экспрессировали мРНК 1Ь-6 (р<0,001) и менее - 11.-10 (р<0,01). В то же время в группе СЗРП была снижена экспрессия мРНК (р<0,001) и 1Ь-1р (р<0,05), но повышена экспрессия мРНК ТОРр| (р<0,001) макрофагами децидуальной оболочки плацент по сравнению с показателями группы без СЗРП.

Известно, что 11_-1 способен индуцировать экспрессию рецепторов к 1Ь-2 (СЭ25) и активировать лимфоциты (Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000). Сниженное содержание 1Ь-1 р в супернатантах клеточных культур децидуальных МНК, в экстрактах децидуальной ткани и низкий уровень экспрессии мРНК 1Ь-1р децидуальными макрофагами при СЗРП могли приводить к нарушению экспрессии активационных молекул лимфоцитами при патологии развития плода. Кроме того, нарушение продукции 1Ь-1р при СЗРП могло определять не только снижение активации децидуальных лимфоцитов,

но и непосредственно формировать недостаточный пролиферативный сигнал для плацентарных клеток, определяя развитие плацентарной недостаточности (Хамоева Ю.А., 1992).

Аналогичное угнетение синтеза и продукции IFNy мононуклеарными клетками лейкоцитарного инфильтрата ДО при СЗРП также могло вносить свой вклад в нарушение процессов дифференцировки клеток. Причем, как показали проведенные исследования, стимуляция макрофагов ФМА, иономицином и моненсином приводила к уменьшению пула клеток, продуцирующих IFNy (р<0,01). По данным литературы IFNy способен усиливать экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости 2 класса, опосредованное активацией трансактиватора И класса (CIITA) (Lee Y.-J., е.а., 1997). Вероятно, при СЗРП сниженный синтез IFNy в плаценте обусловливал нарушение активационных сигналов в цепи взаимодействия IFNy— CIITA - HLA-DR.

Подобное ингибирующее воздействие на продукцию цитокинов могут оказывать гормоны (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000), уровень которых при СЗРП значительно изменяется (Савельева Г.М., с соавт., 1991; Fowden A.L., Forhead A.J., 2004; Li J., е.а., 1998; McCormick J.A., е.а., 2000). Среди гормонов, играющих важную роль в регуляции функциональной активности клеток иммунной системы во время беременности, выделяются глюкокортикоиды, которые способны ингибировать рост и развитие всех тканей и систем, действуя на эмбриональный рост, и непосредственно, через гены, и косвенно, через изменения плацентарного роста, эмбрионального метаболизма, и/или продукции факторов роста и других гормонов фето-плацентарными тканями (Fowden A.L., Forhead A.J., 2004; Li J., е.а., 1998; McCormick J.A., е.а., 2000; Slotkin Т.А., е.а., 1998). Значимость этих гормонов в маточно-плацентарном компартменте возрастает с увеличением срока гестации, особенно при формировании плацентарной недостаточности и развитии СЗРП (Fowden A.L., Forhead A.J., 2004; Jensen Е.С., е.а., 2002). Глюкокортикоиды подавляют продукцию широкого спектра цитокинов (IL-12, IFNy, IFNa и др.) антигенпрезентирующими и Thl клетками, но усиливают IL-6

индуцированную транскрипцию генов реактантов острой фазы воспаления (Назаров П.Г., 2001; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000; Ripperger J., е.а., 1995). Таким образом, снижение продукции цитокинов и параметров активации децидуапьных макрофагов могло быть результатом повышенного содержания глюкокортикоидов в маточно-плацентарном кровотоке при напряженной или неустойчивой гормональной функции плаценты и патологическом типе адаптации плода (Савельева Г.М., с соавт., 1991).

Полученные нами данные свидетельствовали о дисбалансе между продукцией 1L-2, IL-6, IL-8 и IL-12 децидуапьными МНК и их содержанием в экстрактах децидуальной ткани при СЗРП. Данное несоответствие могло определяться быстрой реализацией цитокинов в ходе иммунных реакций, либо влиянием на их продукцию in vivo особого микроокружения клеток, имеющего место в плаценте.

Это предположение в значительной степени подтверждалось исследованиями стимулированной внутриклеточной продукции цитокинов децидуальными лимфоцитами и макрофагами при неосложненном развитии плода и при СЗРП. Так, нами было показано, что при неосложненном развитии плода стимуляция децидуальных лимфоцитов ФМА, иономицином и моненсином вызывала повышение содержания CD4+1L-4+, CD4+1L-6+ и CD4+1L-10+ клеток (р<0,001, р<0,05, р<0,05 соответственно), в то время как при СЗРП стимуляция вызывала повышение содержания CD4+IL-2+ и CD4+IFNy+ клеток, но снижала уровень CD4+1L-6+ Th2, а также угнетала внутриклеточную продукцию макрофагами IL-6 и IFNy (р<0,05, р<0,05, р<0,05, р<0,001, р<0,01, соответственно). По-видимому, in vivo существует подобная ситуация, когда специфическое микроокружение клеток в плаценте оказывает регулирующее влияние на продукцию цитокинов, in vitro, при отсутствии этого эффекта, картина может меняться. Эти результаты свидетельствуют о том, что в ДО при СЗРП действуют дополнительные факторы, которые могут изменять цитокиновый каскад.

Известно, что клетки иммунной системы способны не только к синтезу цитоккнов, но и продуцируют широкий спектр факторов роста. Исследуя содержание факторов роста и эндотелина в экстрактах децидуальной ткани, мы установили, что при СЗРП усиливалась продукция VEGF и эндотелина по сравнению с показателями группы с неосложненным развитием плода (р<0,05, р<0,01, соответственно). Эти факторы обладают выраженной способностью к активации клеток эндотелия, что наряду с усилением экспрессии лимфоцитами и макрофагами адгезионных молекул создают серьезные предпосылки к нарушению циркуляции крови, к развитию тромбозов и ишемическому повреждению тканей плаценты при СЗРП (Милованов А.П., 1999; Miyakoshi К., е.а,, 2001). Наряду с этим при СЗРП отмечалось снижение содержания факторов, в наибольшей степени способных регулировать рост трофобласта (EGF и FGF) в экстрактах децидуальной ткани (р<0,05 в обоих случаях) и их секреции децидуальными МНК (р<0,01 в обоих случаях).

Также как и в периферической крови, в ранние сроки гестации, в экстрактах децидуальной ткани при СЗРП повышалось содержание TGFp2 по сравнению с показателями группы без СЗРП (р<0,01), что хорошо сочетается с наблюдавшимся усилением экспрессии мРНК TGFp децидуальными макрофагами.

Особый характер активации лимфоцитов и макрофагов в зоне контакта материнского и плодового кровотока предполагает иной характер их апоптоза, чем в периферической крови. Проведенные нами исследования показали, что при СЗРП по сравнению с показателями группы без СЗРП усиливалась экспрессия Fas молекул децидуальными лимфоцитами и макрофагами (р<0,05 в обоих случаях), а в экстрактах децидуальной ткани увеличивалось содержание проапоптотического белка р53 (р<0,05). Следует отметить, что при неосложненном развитии плода в децидуальной оболочке плаценты, максимальный уровень клеток готовых вступить в апоптоз отмечался в двух популяциях ЕК клеток (CD95+ клетки в популяции CD16+ клеток составляли 38,53%, в популяции CD56+ клеток - 52,54%). В отличие от группы с

неосложиенпым развитием плода, в группе с СЗРП был снижен процент клеток готовых к апоптозу клеток в популяциях CD16+ (18,49%) и CD56+ ЕК (43,80%).

Однако при СЗРП не отмечалось увеличения содержания AnnexinV+Pl- и AnnexinV+PI+ децидуальных лимфоцитов (р>0,05 в обоих случаях), а уровень децидуальных макрофагов, подвергнувшихся необратимому апоптозу (AnnexinV+Pl+) был достоверно снижен (р<0,05) по сравнению с показателями группы без СЗРП. При этом, только децидуальные лимфоциты экспрессировали повышенный уровень мРНК р53 (р<0,001), в то время как экспрессия мРНК р53 децидуальными макрофагами была достоверно снижена (р<0,001).

Полученные результаты с одной стороны свидетельствуют о повышении готовности к апоптозу, с другой стороны это не подтверждается данными аннексинового теста. Можно предположить, что при СЗРП в плаценте усиливалось влияние механизмов, сдерживающих развитие апоптоза лимфоцитов, особенно ЕК.

Так, при СЗРП достоверно снижалось содержание децидуальных лимфоцитов, экспрессирующих FasL (р<0,05), а в экстрактах децидуальной ткани группы СЗРП достоверно возрастал уровень растворимой формы FasL (р<0,05), способной блокировать развитие Fas-зависимого апоптоза (Олейник Е.К., с соавт., 2004).

Вероятно, механизмы регуляции апоптоза децидуальных лимфоцитов и макрофагов при СЗРП различались между собой. Сниженный уровень апоптирующих макрофагов с одной стороны мог определяться их гипоактивацией и недостаточной экспрессией р53, а с другой стороны мог быть обусловлен наличием блока при проведении сигнала к гибели макрофагов. Это хорошо согласуется с данными по снижению уровня IL-lp+ децидуальных макрофагов и уменьшению содержания цитокина в децидуальной ткани при СЗРП. В литературе имеются сведения о том, что IL-lp индуцирует синтез каспаз 8 и 9 в амниохорионе и повышает активность каспаз 2, 3, 8 и 9, усиливая процессы фрагментации ДНК (Fortunato S.J., Menon R. 2003). Вероятно,

снижение синтеза и секреции 1Ь-1р децидуальными макрофагами при СЗРП обусловливает недостаточную активацию каскада каспаз и угнетение завершающих этапов апоптоза клеток.

Проведенные исследования показали, что в децидуальной оболочке плацент при СЗРП отмечались иммунные реакции, свидетельствующие о развитии хронического воспаления с аутоиммунным компонентом, определяющиеся нарушением активации клеток, ослаблением иммунного надзора и ростом влияния пула клеток памяти. Нарушение механизмов элиминации активированных лимфоцитов и макрофагов в плаценте при СЗРП могло способствовать поддержанию локальных воспалительных и аутоиммунных реакций и вторичного иммунного ответа. Основным фактором, сдерживающим развитие иммунного ответа на локальном уровне при СЗРП и, вероятно, подавляющим процессы активации клеток, по-видимому, являлось усиление продукции ТСРр.

На схеме 1. приведены обобщенные данные, свидетельствующие о роли иммунной системы в патогенезе асимметричной формы СЗРП, начиная с ранних сроков гестации. В отличие от большинства авторов, предполагающих развитие плацентарной недостаточности, приводящей к формированию асимметричной формы СЗРП, во втором триместре беременности, мы установили, что в основе патогенеза асимметричной формы СЗРП лежит раннее, до 5 недель беременности, нарушение иммунорегуляции. На всем протяжении беременности, осложнившейся развитием СЗРП, на системном и локальном уровнях действуют 3 процесса, взаимно потенцирующие друг друга: инфекционный, воспалительный и аутоиммунный. В результате развития этих процессов изменяются механизмы функционирования материнской иммунной системы, что определяет формирование патологических реакций, непосредственно вызывающих развитие хронической фето-плацентарной недостаточности и формирование асимметричной формы синдрома задержки развития плода. В качестве триггерного фактора ранней плацентарной

недостаточности при СЗРП, вероятно, выступает инфицирование цитомегаловирусом и представителями класса МоШсгйев.

Иммунные механизмы развития СЗРП

1 триместр

Нарушение активации, дифференцировки ТЬ, иммунорегуляции, апоптоза цитотоксических клеток, нарушение продукции ростовых факторов, рост пула В1 "клеток

3 той место В крови:

усиление активации, рост пула клеток памяти, нарушение дифференцировки ТЫ и иммунорегуляции .

В ДО плаценты:

нарушение активации и дифференцировки < клеток; иммунорегуляции и аполтйза, продукции факторов роста, .усиление . адгезии и продукции лровосНалительных .

Развитие аутоиммунных и воспалительных реакций, угнетение роста трофобласта, нарушения ангиогенеза, фето-плацентарной циркуляции крови, трофической функции плаценты, эмбриотоксические реакции

Асимметричная форма СЗРП

Схема 1. Механизмы развития асимметричной формы СЗРП.

38

Выводы

1. Асимметричная форма СЗРП формируется на фоне нарушения процессов межклеточного взаимодействия и характера иммунного ответа материнских мононуклеарных клеток, начиная с 5-10 недель беременности и на всем протяжении гестационного процесса, что способствует развитию хронического инфекционно-воспалительного и аутоиммунного процессов.

2. В ранние сроки беременности СЗРП формируется на фоне недостаточной активации материнских периферических мононуклеарных клеток, нарушенной функции Тг и ТИ2, при усилении иммунного ответа В1 клеток, 1Ь-б+ моноцитов и ЕК-Т. В поздние сроки гестации СЗРП формируется на фоне дисбаланса активационных процессов, роста пула клеток памяти, В-лимфоцитов, ЕК и Тг, но при нарушении дифференцировки Т-хелперов и регуляторной функции моноцитов периферической крови.

3. На локальном уровне развитие СЗРП сопровождается нарушением презентации АГ, дифференцировки и активации Т-хелперов с увеличением пула СЕ)4+11_.-6+ клеток, ростом продукции аутоантител, усилением адгезионных свойств клеток, но уменьшением содержания ТСЯу5 лимфоцитов и Тг клеток, угнетением цитокинпродуцирующей функции ЕК и макрофагов.

4. В ранние сроки беременности СЗРП формируется на фоне усиления продукции цитокинов ТЫ типа (1РМу и 1Ь-12) и угнетения продукции 1Ь-4. В конце гестации развитие СЗРП на системном уровне сопровождается усилением продукции про- (1Ь-6, 1Ь-8) и противовоспалительных (1Ь-4, 1Ь-10) цитокинов, но снижением продукции цитокинов ТЫ типа (№N7 и ТОТа) лимфоцитами, и угнетением продукции моноцитами 1Ь-1(3 и И-Ю.

5. На локальном уровне при СЗРП угнетается синтез и секреция противовоспалительных (1Ь-10, 11.-4) и провоспалительных (1Ь-1р, 1Р>4у) цитокинов, усиливается секреция хемокинов (1Ь-8) и провоспалительных

цитокинов с дифференцировочной активностью (1Ь-6, ТЫРа), но снижается секреция 1Ь-2, отмечается дисбаланс между продукцией ряда провоспалительных цитокинов (1Ь-2, IЬ-6, 1Ь-8, 1Ь-12) и их содержанием в дец идуальной ткани.

6. В ранние сроки беременности при СЗРП на системном уровне угнетается продукция факторов ангиогенеза, но возрастает уровень ТСРр2. В конце гестации при СЗРП в крови и в плаценте снижается продукция факторов, регулирующих рост трофобласта (ЬРйР, ТйР), но в децидуальной оболочке увеличивается содержание факторов, активирующих эндотелий (эндотелии и УБОР) и ингибирующих развитие иммунного ответа (ТСРр2).

7. Периферические и децидуальные мононуклеарные клетки при СЗРП неадекватно реагируют на активационные сигналы. При СЗРП дополнительная стимуляция мононуклеарных клеток периферической крови определяет рост пула Т-хелперов и моноцитов, продуцирующих !Ь-6; плаценты — увеличение содержания ТЫ, синтез ТЫ цитокинов и ТСРР2, но угнетение продукции провоспалительных цитокинов макрофагами.

8. В ранние сроки беременности при СЗРП отмечается угнетение апоптоза периферических цитотоксических клеток и моноцитов. В конце гестации СЗРП развивается на фоне усиления апоптоза периферических МНК в результате стимуляции его комплексом синтезируемых лимфоцитами цитокинов и активацией гена р53. В децидуальной оболочке при СЗРП отмечается дисбаланс между повышенной готовностью клеток к вступлению в апоптоз и реальным уровнем апоптирующих клеток, определяемый нарушением синтеза цитокинов децидуальными мононуклеарными клетками, экспрессии мРНК и продукции р53, и увеличением тканевого содержания БразЬ.

9. Ранними прогностическими критериями СЗРП являются снижение содержания в периферической крови матери уровня УЕСР (< 20 пг/мл) и

уровня НЬА-ОЯ+ моноцитов (<57,9%). В 32-40 недель гестации дополнительным критерием диагностики СЗРП является увеличение относительного содержания периферических СОИЬ+ лимфоцитов (>20%).

Практические рекомендации

1. Для оценки состояния иммунной системы беременной женщины рекомендуется определять: на всем протяжении гестации - показатели активации и апоптоза периферических мононуклеарных клеток, уровень сывороточного 1Ь-4; в ранние сроки гестации — уровень периферических С04+1Ь-2+ и СЭ4+1Ь-4+ Т-хелперов, В1 клеток, С016+СЭЗ+ ЕК-Т клеток и 1Ь-6+ моноцитов, содержание в сыворотке периферической крови цитокинов ТЫ типа, Тврр2 и ростовых факторов, регулирующих ангиогенез; в поздние сроки гестации - содержание в крови коммутированных Т-лимфоцитов, ТЫ и Тг клеток, экспрессию адгезионных молекул клетками, содержание в сыворотке крови ЬРвР, а также оценивать спонтанную продукцию и экспрессию мРНК 1Ь-б лимфоцитами и моноцитами, спонтанную продукцию лимфоцитами и моноцитами 1Ь-10, уровень спонтанной секреции и экспрессии мРНК 1Ь-1Р моноцитами.

2. Для прогнозирования асимметричной формы СЗРП рекомендуется определять в ранние сроки гестации в периферической крови показатели содержания УЕйР (диагностический параметр < 20 пг/мл) и НЬА-ОК+ моноцитов (диагностический параметр <57,9%).

3. Для диагностики асимметричной формы СЗРП в поздние сроки гестации рекомендуется определять содержание в периферической крови СО 11Ь+ лимфоцитов (диагностический параметр >20%).

Публикации по теме диссертации

1. Сотникова Н.Ю., Перетятко Л.П., Мартенова А.Д., Кулида J1.В., Кудряшова А.В., Анциферова IO.C. Морфо-иммунологические механизмы задержки внутриутробного развития плода //Тез. 6 межд. симп. Иммунология репродукции.-Киев.-1996.- С.60.

2. Сотникова И.Ю., Кудряшова А.В., Филинов А.Г., Бакшт И.В., Крошкина Н.В. Характеристика иммунного статуса женщин и новорожденных при синдроме задержки внутриутробного развития плода // Тез. 6 межд. симп. Иммунология репродукции.-Киев,-1996- C.6I.

3. Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Кудряшова А.В., Кулиева Н.А., Филинов А.Г., Синицина М.Г., Райлян И.Б. Дифференцированный анализ состояния иммунной системы беременной женщины при физиологическом течении беременности // Сб. «Охрана здоровья семьи».- Иваново,- 1996,-С.61-65.

4. Крошкина Н.В., Сотникова Н.Ю., Букина Е.А., Анциферова Ю.С., Кудряшова А.В., Шмакова И.Е. Нормативные показатели содержания популяций иммунокомпетентных клеток периферической крови в динамике неосложненной беременности у женщин Ивановской области//Сб. «Новыетехнологии охраны здоровья семьи»,- Иваново,- 1997,-С. 72-75.

5. N.Yu. Sotnikova, A.V. Kudryashova, N.V. Kroshkina, N.Yu. Philinova, A.G. Philinov, I.A. Panova. Different subsets of lymphoid cells with cytotoxic activity in fetal growth retardation syndrome (FGRS) // AJRI.- 1998,- Vol.40, №4,- P.265.

6. Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Филинова Н.Ю.,. Филинов А.Г. Экспрессия активационных маркеров в популяциях CD3+, CD4+ и CD8+ децидуальных лимфоидных клеток при внутриутробной гипотрофии плода // Тез. 2 конгресса "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 1998,-С. 424.

7. Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Анциферова iO.C., Крошкина Н.В., Морозова И.М., Соловьева Т.А., Букина Е.А., Шмакова И.Е., Филинов А.Г. Возможности иммунологических методов в раннем прогнозировании осложнений беременности // Сб. «Современные аспекты лабораторной диагностики».- Ярославль,- 1998,- С.30-32.

8. Филинов А.Г., Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Анциферова Ю.С., Крошкина Н.В., Кулиева Н.А., Корнилова Н.В., Баранова О.О. Применение комплекса иммунологических методов обследования для создания прогноза характера течения беременности п ранние сроки гестащш Н Сб. "Мониторинг иммунной системы при инфекционной и неинфекционной патологии у детей и взрослых",- Иваново -1998,- С.94-96.

9. Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Крошкина Н.В., Панова И.А., Филинова Н.Ю. Иммунологические аспекты СЗРП при неосложненной беременности и гестозе // Russian J. of Immunology.-1999.-Vol.4, SuppI.1 .-P.207.

lO.Solnikova N.Yu., Antsiferova Yu.S., Kroshkina N.V., Kudryashova A.V., Astraukh N.V., Solovjeva T.A. Local immune response in the progress of nonnal gestation // Abstr. Of European Meeting of Immunology and Reproduction.- Rome.- 1999,- P. 101.

11.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Филинова Н.Ю., Панова И.А., Филинов А.Г. Состояние иммунитета у женщин с синдромом задержки развития плода // Ж. «Медицинская иммунология». - 1999,- т.1., №3-4,- С. 68-69.

12.Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V., Philinova N.Yu., Philinov A.G. Proinflammatory cytokines and activation of macrophages in 1UGR deciduas // Abstr. of Congress of ESRADI Poznan, Poland.- Sept. 19-21, 2000.- P. 79.

13.Кудряшова A.B., Сотникова Н.Ю., Филинова Н.Ю., Панова И.А., Филинов А.Г. Характеристика популяционного состава лейкоцитарного инфильтрата децидуальиой оболочки у женщин с гсстозом и гипотрофией плода // Ж. «Медицинская иммунология». -2000. — т.2, №2. - С. 170-171.

И.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Филинов А.Г., Филинова Н.Ю., Панова И.А. Особенности состояния периферических лимфоцитов при синдроме задержки внутриутробного развития плода // Сб. научных трудов «Актуальные проблемы здоровья семьи».- Иваново, 2000 г. - C.49-S 1.

15.Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Крошкина Н.В., Кудряшова А.В., Астраух Н.В., Соловьева Т.А., Букина Е.А. Локальный иммунный ответ в динамике неосложненной беременности//Ж. «Медицинская иммунология». -2000. — т,2, №2. - С.194-195.

16.Панова И.А., Филинова Н.Ю., Кудряшова А.В., Филинов А.Г. Роль иммунологических факторов в генезе задержки внутриутробного развития плода у беременных с гестозом // Тез. 11 межд. научно-практич. коиф. «Здоровье и образование в XXI веке».- Москва, 2001.-С.141-142.

17.Кудряшова А.В., Сотникова НЛО. Цитокиновый статус децидуальной оболочки плаценты при задержке внутриутробного развития плода // Ж. «Медицинская иммунология»,- 2001.-т.З., №2.- С.253.

18.Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Крошкина Н.В., Кудряшова А.В. Иммуномодуляция и иммунорегуляция на системном и локальном уровне при беременности // Ж. «Медицинская иммунология».- 2001.- т.З., №2,- С.259.

19.Кудряшова А.В., Филинов А.Г., Сотникова Н.Ю., Филинова Н.Ю. Иммунологические маркеры задержки внутриутробного развития плода // Сб. «Актуальные проблемы здоровья семьи, общественного здоровья и здравоохранения,- Иваново,- 2001.- С.56-57.

20.Sotnikova N.Yu., Antsiferova J.S., Kroshkina N.V., Kudryashova A.V. Systemic and local mechanisms of immunoregulation in normal pregnancy // Abstr. XXXIII NFOG Congress.,-Umea, Sweden.,- 1-4 June, 2002.,- P.120.

21.Кудряшова A.B., Сотникова Н.Ю. Параметры активации, апоптоза и продукции цитокинов мононуклеарными клетками децидуальной оболочки плаценты при задержке внутриутробного развития плода // Ж. «Цитокины и воспаление».- 2002.-т. 1, №2,- С. 150.

22.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Филинова Н.Ю., Филинов А.Г., Кулида J1.B. Иммунологические и морфологические характеристики синдрома задержки внутриутробного развития плода // Тез. III Всероссийской конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс»,- 14-6 мая 2002, Сочи,- С.59.

23-Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Филинов Л.Г., Филинова Н.Ю. Иммунологические диагностические критерии задержки внутриутробного развития плода // Тез. 5 конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии»,-12-14 ноября 2002, Москва,- С.74.

24.Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V., Panova I.A., Philinova N.Yu. The role of decidual ThI and Th2 in 1UGR development // J. of Reproductive immunology.- 2003.-vol.58, №2.- P. 151.

25.Kudryashova A.V., Sotnikova N.Yu., Panova I.A., Filinov A.G., Filinova N.Yu. Immunologic markers of intrauterine growth retardation in the third trimester of pregnancy complicated by gestosis // Environment and Human Health: The complete Works of International Ecologic Forum, June 29 - July 2, 2003, St.Petersburg, Russia / Editor in chief G.A. Sofronov. - SPb.: Speclit, 2003. - P. 398 - 399.

26.Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V. Parameters of activation and apoptosis of mononuclear decidual cells during intrauterine growth retardation // Environment and Human Health: The complete Works of International Ecologic Forum, June 29 - July 2,2003, St.Petersburg, Russia / Editor in chief G.A. Sofronov. - SPb.: Speclit, 2003. - P. 454 -455.

27.Кудряшова A.B., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Филинова Н.Ю. Значение субпопуляций децидуальных Т-хелперов в задержке внутриутробного развития плода // Ж. «Медицинская иммунология»,-2003,-т.5., №2.- С.337-338.

28,Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Панова И.А., Филинов А.Г., Филинова Н.Ю. Роль TGF-Р2 в регуляции иммунного ответа при задержке внутриутробного развития плода // Ж. «Ремедиум Приволжья»- 2003. — спец. выпуск. - Сборник тезисов докладов

Всероссийского конгресса «Медицина-детям», Н.-Новгород, 22-25 апреля, 2003.-С. 141142.

29,Сотникопа Н.Ю., Анциферова Ю.С., Кудряшова A.B., Крошкина Н.В., Астраух Н.В. Системная и локальная регуляция материнского иммунного ответа на ранних сроках физиологической беременности // Материалы V Российского форума «Мать и дитя» -Москва, 2003,- С.218.

30.Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V., Vedeneeva M.V., Panova I.A. Systemic and local mechanisms of immunoregulation in normal and IUGR pregnancy // Am. J. Reprod. Iinmunol.-2004.-Vol.51., №6.- P.468.

31.Кудряшова A.B., Сотникова Н.Ю., Веденеева M.B., Панова И.А. Особенности дифференцировки и активации Т-хелперов децидуальной оболочки плаценты при синдроме задержки развития плода (СЗРП) // Russian J. of Immunology.- 2004.-Vol.9, Suppl.I.- P.3I8.

32.Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Анциферова Ю.С. Системные и локальные механизмы регуляции иммунного ответа при неосложненной беременности // Russian J. of Immunology.- 2004.-Vol.9, Suppl.I.- P.323.

33.Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Веденеева М.В., Скрипкина И.Ю., Панова И.А., Борзова Н.Ю. Закономерности дифференцировки децидуальных Т-хелперов при СЗРП // Ж. «Фундаментальные исследования».- 2004,- Xsl.-C.86.

34.Кудряшова A.B., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мание С.С. Особенности внутриклеточного синтеза цнтокинов макрофагами децидуальной оболочки плаценты при физиологической беременности, гестозе и синдроме задержки внутриутробного развития плода //Ж. «Медицинская иммунология»,- 2004.- T.6., №3-5.- С. 381-382.

35.Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Кудряшова A.B., Крошкина Н,В., Веденеева М.В. Маркеры различных этапов апоптоза при беременности // Ж. «Медицинская иммунология»,- 2004,- т.6., №3-5,- С. 391.

36.Борзова Н.Ю., Сотникова Н.Ю., Гагаева Ю.В., Кудряшова A.B., Веденеева М.В. Особенности экспрессии активацинных маркеров на поверхности периферических моноцитов у женщин с синдромом задержки развития плода // Материалы VI Российского форума «Мать и дитя»,- Москва, 12-15 октября 2004 г.- С.ЗЗ.

37.Г1осисеева Л.В., Кудряшова A.B., Сотникова Н.Ю., Веденеева М.В. Особенности иммунорегуляции в децидуальной оболочке плаценты при синдроме задержки развития плода // Материалы VI Российского форума «Мать и дитя»,- Москва, 12-15 октября 2004 г.- С. 166.

38.Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Кудряшова A.B., Крошкина Н.В., Астраух Н.В. Регуляция материнского иммунного ответа на ранних сроках физиологической беременности // Материалы VI Российского форума «Мать и дитя».- Москва, 12-15 октября 2004 г.- С.211.

39.Борзова Н.Ю., Гагаева Ю.В., Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B. Роль некоторых иммунологических факторов в формировании синдрома задержки развития плода // Журнал Российского общества акушеров-гинекологов. - 2004,- №3.-С. 13-14.

40.Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Панова И.А., Борзова Н.Ю., Крошкина II.В., Астраух Н.В., Скрипкина И.Ю., Филинова Н.Ю., Филинов А.Г. Особенности дифференцировки Т-хелперов при синдроме задержки развития плода и гестозе // Нижегородский медицинский журнал - 2004. - №4. - С. 160-162.

41.Сотникова Н.Ю., Пелевина М.И., Кудряшова A.B. Возможности использования иммунологических параметров для раннего прогнозирования осложнений беременности // Ж. «Медицинская иммунология»,- 2005. -T.7., № 2-3. -С.190-191.

42.Сотникова Н.Ю., Веденеева М.В., Посисеева Л.В., Кудряшова A.B. Генная регуляция иммунного апоптоза в периферической крови при синдроме задержки развития плода // Ж. «Медицинская иммунология»,-2005.-т.7., № 2-3.-С. 191.

43. Кудряшова A.B., Сотникова И.Ю. Особенности системного и локального синтеза IFNy при кеосложненном развитии плода и при задержке его развития // Ж. «Медицинская иммунология»,- 2005. - т.7, № 2-3. - С.307.

44. Сотникова Н.Ю., Манне С.С., Борзова Н.Ю., Кудряшова A.B. Анализ синтеза IL-lß и его рецепторов на системном и локальном уровнях при неосложненной беременности // Ж. «Медицинская иммунология»,- 2005. - т.7, № 2-3. - С.323-324.

45.Борзова Н.Ю., Гагаева Ю.В., Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B. Особенности экспрессии функциональных молекул на поверхности децидуальных макрофагов при синдроме задержки развития плода// Russian J. of Immunology.- 2005.-Vol.9, Suppl. 2,- P. 156.

46. Веденеева M.B., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Кудряшова A.B. Цитокиновая и генная регуляция апоптоза в децидуальной оболочке плаценты при синдроме задержки развития плода // Russian J. of Immunology.- 2005.-Vol.9, Suppl. 2,- P. 158.

47. Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Панова И.А., Борзова Н.Ю., Крошкина Н.В., Астраух Н.В., Скрипкика И.Ю., Филикова Н.Ю., Филинов А.Г. Особенности гуморального иммунитета и дифференцировки Т-хелперов при гестозе и синдроме задержки развития плода // Russian J.l of Immunology.- 2005.-Vol.9, Suppl. 2,- P. 167-168.

48.Перетятко Л.П., Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Веденеева M.B. Морфо-функциональные взаимосвязи в последе при синдроме задержки развития плода // Russian J. of Immunology.- 2005.-VoI.9, Suppl. 2,- P. 177.

49.Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Веденеева M.B. Роль апоптоза в формировании синдрома задержки развития плода // Ж. «Аллергология и иммунология в педиатрии»,-2005,- №5,- Т.6 (приложение 1).- С.153.

50.Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Кудряшова A.B., Посисеева Л.В., Панова И.А., Малышкина А.И., Фетисова И.Н. Иммунологическая загадка беременности. - Иваново: Издательство МИК,- 2005.- 272с.

51. Патент №2265224. Российская федерация. Способ прогнозирования синдрома задержки развития плода. Борзова Н.Ю., Сотникова Н.Ю., Гагаева Ю.В., Кудряшова A.B. Бюллетень изобретения. Полезные модели.-2005.- №33.

52.Патент №2188427. Российская федерация. Способ диагностики задержки внутриутробного развития плода у женщин с гестозом. Кудряшова A.B., Панова И.А., Сотникова Н.Ю., Филинова Н.Ю., Филинов А.Г. Бюллетень изобретения. Полезные модели.-2002- №24.-с.357.

Формат 60x84/16 Объем 2,63 п.л. Печать офсетная Бумага офсетная Гарнитура Тайме Тираж 100 экз. Заказ № 68 Отпечатано в типографии РА «Энергия»

Актуальность работы

Синдром задержки развития плода (СЗРП) является одним из часто встречающихся патологических состояний во время беременности. По данным исследований, проведенных в различных странах, частота СЗРП варьирует от 3 до 8% и не имеет тенденцию к снижению, несмотря на успехи в разработке новых методов диагностики и профилактики заболевания (29, 48, 49, 290). СЗРП занимает важное место в структуре перинатальной смертности и оказывает неблагоприятное влияние на последующее развитие детей и подростков, определяя нарушения нервно-психического и соматического развития (1, 4, 29, 80, 96, 112, 173,194, 209, 265).

В настоящее время рассматриваются несколько теорий развития СЗРП: теория нарушения клеточного роста, теория нарушения плацентарной перфузии в результате ишемических повреждений, теория нарушения гемодинамики и гемостаза, теория дезинтеграции метаболизма плода, теория хронической плацентарной недостаточности, теория нарушения защиты трофобласта от апоптоза (8, 6, 16, 29, 48, 49, 32, 71, 93, 140, 143, 207, 208, 249, 287, 319, 392). Однако все они имеют ряд недостатков и в большинстве случаев не рассматривают триггерных механизмов наблюдаемых явлений.

Существуют две формы СЗРП: симметричная, при которой отмечается изменение всех фетометрических параметров плода, и асимметричная, характеризующаяся снижением массы тела за счет уменьшения массы паренхиматозных органов. В основе симметричной формы СЗРП чаще всего лежат генетические нарушения, недостаточное питание матери и воздействие факторов повышенной вредности (29, 48, 49). Патогенетические механизмы асимметричной формы СЗРП остаются мало изученными, однако, большинство авторов признает, что в их основе лежит нарушение функции фето-плацентарной системы.

Известно, что развитие беременности и формирование фето-плацентарного комплекса контролируются реакциями материнской иммунной системы на всем протяжении гестационного процесса (53, 65, 66, 122, 133, 191, 254, 278, 288, 350, 382, 409). В последнее время в работах ряда авторов появляются данные, позволяющие предположить, что в основе нарушений функции фето-плацентарной системы при СЗРП лежат изменения механизмов иммунорегуляции гестационного процесса (53, 61, 313, 395). Исследованиями различных авторов было показано, что при СЗРП в периферической крови матери и в децидуальной оболочке плаценты нарушается соотношение клеточных популяций лимфоцитов (41, 61, 387), изменяется характер экспрессии ряда активационных и адгезионных молекул (41, 61, 287), усиливается продукция иммуноглобулинов и аутоантител (31, 55, 35, 58), снижается содержание лимфоцитов, экспрессирующих молекулы Fas (41, 61), изменяется функциональная активность фагоцитарных клеток (61), нарушается синтез и продукция цитокинов (41, 61, 88, 95, 100, 187, 199, 216, 261, 313, 395,406). Экспериментальные исследования показали, что при СЗРП нарушается ответ децидуальных лимфоцитов на стимуляцию белками плодово-плацентарного происхождения (61, 53). Однако имеющиеся в литературе данные об изменении соотношения клеточных популяций и характере продукции цитокинов не позволяют сделать однозначных выводов о формировании того или иного типа иммунного ответа при СЗРП, так как в одних работах отмечается усиление Th2 иммунного ответа (31, 35, 55), в других - активация продукции Thl цитокинов (41, 313), а в некоторых случаях - одновременный рост влияния гуморальных и цитотоксических реакций (61). Все исследователи изучали изменения иммунологических параметров в группах женщин с СЗРП, формирующимся на фоне какой-либо акушерской патологии (угроза невынашивания, гестоз). Это не позволяет утверждать, что установленные авторами нарушения иммунных реакций определяются именно патологией развития плода. В работах большинства авторов не дифференцируется форма задержки развития плода, что, возможно, определяет противоречивость полученных результатов. Практически полностью отсутствуют данные о ранних нарушениях механизмов иммунорегуляции, способствующих развитию СЗРП.

Наиболее изученным аспектом участия иммунной системы в формировании СЗРП является исследование продукции факторов роста, регулирующих ангиогенез в плаценте и рост трофобласта (77, 399). Однако, результаты исследования содержания факторов роста при СЗРП как на системном, так и на локальном уровнях часто противоречат друг другу (41, 88, 95, 100, 135, 187, 195, 199, 216, 223, 240, 261, 313, 339, 373, 381, 395, 401, 406). Исследования характера продукции факторов роста проводятся на экспериментальных моделях СЗРП, различающихся по технологии, что может обусловливать различия в полученных данных.

В последнее время большое внимание уделяется изучению роли апоптоза в развитии СЗРП (71, 93, 140, 143, 207, 249), но все исследователи рассматривают апоптоз только с точки зрения ограничения роста плаценты и плода и не исследуют характер апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови и лейкоцитарного инфильтрата плаценты.

Таким образом, изучение особенностей системных и локальных иммунных нарушений, сопровождающих развитие СЗРП, и ответа мононуклеарных клеток на активирующие стимулы позволит расширить наши представления об иммунных механизмах формирования СЗРП и позволит разработать ранние прогностические критерии патологии плода.

Цель работы

На основании выявления закономерностей нарушения иммунорегуляции на системном и локальном уровнях создать патогенетически обоснованную концепцию участия иммунной системы в формировании асимметричной формы задержки внутриутробного развития плода и разработать новые подходы к прогнозированию и диагностике данной патологии.

Задачи исследования

1. Выявить закономерности изменений фенотипа, активации и дифференцировки мононуклеарных клеток периферической крови, в динамике гестационного процесса, и лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки зрелой плаценты при асимметричной форме СЗРП.

2. Установить закономерности нарушений в работе цитокиновой сети на системном и локальном уровнях, и их значение в развитии асимметричной формы СЗРП.

3. Выявить закономерности изменений апоптоза и особенностей его регуляции эндогенными факторами в различных популяциях мононуклеарных клеток периферической крови в динамике гестационного процесса и лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки зрелой плаценты при асимметричной форме СЗРП.

4. Разработать концепцию участия иммунных механизмов в развитии асимметричной формы СЗРП.

5. Разработать ранние прогностические и диагностические критерии асимметричной формы СЗРП.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что развитие асимметричной формы СЗРП сопровождается нарушением процессов межклеточного взаимодействия и иммунного ответа материнских мононуклеарных клеток на системном и локальном уровнях на всем протяжении гестационного процесса.

Показано, что в основе нарушений иммунорегуляторных процессов при асимметричной форме СЗРП лежит стимуляция материнской иммунной системы инфекционными антигенами и неадекватный ответ периферических и децидуальных мононуклеарных клеток на антигенную стимуляцию.

Показано, что на всем протяжении гестационного процесса формирование СЗРП сопровождается аутоиммунным процессом, поддерживаемым на системном и локальном уровнях усиленной продукцией IЬ-6, а также в ранние сроки гестации ростом пула В1 лимфоцитов и снижением уровня Тг на системном уровне, а в поздние сроки гестации на локальном уровне - снижением содержания Тг.

Впервые установлено, что развитие асимметричной формы СЗРП в ранние сроки гестации на системном уровне ассоциируется с низким уровнем активации периферических мононуклеарных клеток, активацией ТЫ и угнетением апоптоза периферических цитотоксических клеток и моноцитов.

Показано, что развитие асимметричной формы СЗРП в поздние сроки гестации ассоциируется с формированием процесса по типу хронического воспаления, определяемого ростом уровня коммитированных лимфоцитов и усилением продукции большинства провоспалительных цитокинов на системном и локальном уровнях, активацией всех популяций мононуклеарных клеток в периферической крови и нарушением апоптоза децидуальных мононуклеарных клеток.

Установлено что при асимметричной форме СЗРП нарушаются естественные механизмы противовоспалительных реакций, определяемые функциональной активностью Тг клеток, продукцией 1Ь-10 и 1Ь-4; развитие воспалительного процесса в ранние сроки беременности сдерживается высоким уровнем ТОР(32, а в поздние сроки гестации на системном уровне -усилением влияния Тг клеток и продукции 1Ь-10 лимфоцитами, на локальном уровне - усилением продукции Тврр2.

Показано, что развитие асимметричной формы СЗРП на всем протяжении гестации сопровождается нарушением продукции факторов роста; в ранние сроки гестации снижается продукция основных факторов ангиогенеза, а в поздние сроки гестации снижается продукция факторов, регулирующих рост тканей мезенхимального происхождения, но усиливается секреция факторов активации эндотелия.

Практическая значимость работы

Разработаны прогностические критерии развития асимметричной формы СЗРП, основанные на определении в ранние сроки гестации в периферической крови содержания VEGF и уровня HLA-DR+ моноцитов. Разработаны диагностические критерии СЗРП, основанные на определении в 32-40 недель гестации относительного содержания CD11Ь+ лимфоцитов.

Основные положения, выносимые на защиту

Формирование асимметричной формы СЗРП, начиная с ранних сроков беременности и на протяжении всего периода гестации, связано с изменением механизмов иммунорегуляции гестационного процесса, проявляющимися нарушением активации и дифференцировки МНК, дисбалансом продукции факторов роста, развитием процессов по типу инфекционно-воспалительного и аутоиммунного низкой интенсивности, взаимно потенцирующих друг друга.

В ранние сроки гестации формирование асимметричной формы СЗРП на системном уровне связано с недостаточным активационным сигналом и/или неадекватным ответом материнской иммунной системы на факторы фето-плацентарного комплекса с усилением цитотоксических и аутоиммунных реакций и нарушением продукции факторов ангиогенеза. В поздние сроки гестации формирование асимметричной формы СЗРП сопровождается развитием извращенного вторичного иммунного ответа, проявляющегося на системном уровне нарушением активации МНК, на локальном уровне - угнетением активации децидуальных МНК и нарушением продукции факторов, регулирующих рост трофобласта.

Реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в практику акушерской клиники и консультативно-диагностической поликлиники ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», 9 ж. консультации г.Иваново.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 2-м Национальном конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1998), 7 Международном конгрессе по иммунологии репродукции (Нью Дели, Индия, 1998), 3 международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1999), Европейском Съезде по иммунологии и репродукции (Рим, Италия, 1999), 4 международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2000), 8 Международном конгрессе по иммунологии репродукции (Опатия, Хорватия, 2001), 6 конференции с международном участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002), 4 конгрессе Европейского общества по иммунологии репродукции и развития (Родос, Греция, 2003), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), 9 форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005).

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 283 страницах машинописного текста. Работа состоит из Введения, обзора литературы по теме диссертации, главы «Материалы и методы исследования», 3 глав собственного

Выводы

1. Асимметричная форма СЗРП формируется на фоне нарушения процессов межклеточного взаимодействия и характера иммунного ответа материнских мононуклеарных клеток, начиная с 5-10 недель беременности и на всем протяжении гестационного процесса, что способствует развитию хронического инфекционно-воспалительного и аутоиммунного процессов.

2. В ранние сроки беременности СЗРП формируется на фоне недостаточной активации материнских периферических мононуклеарных клеток, нарушенной функции Тг и ТЬ2, при усилении иммунного ответа В1 клеток, 1Ь-6+ моноцитов и ЕК-Т. В поздние сроки гестации СЗРП формируется на фоне дисбаланса активационных процессов, роста пула клеток памяти, В-лимфоцитов, ЕК и Тг, но при нарушении дифференцировки Т-хелперов и регуляторной функции моноцитов периферической крови.

3. На локальном уровне развитие СЗРП сопровождается нарушением презентации АГ, дифференцировки и активации Т-хелперов с увеличением пула СЭ4+1Ь-6+ клеток, ростом продукции аутоантител, усилением адгезионных свойств клеток, но уменьшением содержания ТСЯу5 лимфоцитов и Тг клеток, угнетением цитокинпродуцирующей функции ЕК и макрофагов.

4. В ранние сроки беременности СЗРП формируется на фоне усиления продукции цитокинов ТЫ типа (№N7 и 1Ь-12) и угнетения продукции 1Ь-4. В конце гестации развитие СЗРП на системном уровне сопровождается усилением продукции про- (1Ь-6, 1Ь-8) и противовоспалительных (1Ь-4, 1Ь-10) цитокинов, но снижением продукции цитокинов ТЫ типа (№N7 и ШРа) лимфоцитами, и угнетением продукции моноцитами 1Ь-1Р и 1Ь-10.

5. На локальном уровне при СЗРП угнетается синтез и секреция противовоспалительных (IL-10, IL-4) и провоспалительных (IL-ip, IFNy) цитокинов, усиливается секреция хемокинов (IL-8) и провоспалительных цитокинов с дифференцировочной активностью (IL-6, TNFa), но снижается секреция IL-2, отмечается дисбаланс между продукцией ряда провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, IL-8, IL-12) и их содержанием в децидуальной ткани.

6. В ранние сроки беременности при СЗРП на системном уровне угнетается продукция факторов ангиогенеза, но возрастает уровень TGFP2. В конце гестации при СЗРП в крови и в плаценте снижается продукция факторов, регулирующих рост трофобласта (bFGF, TGF), но в децидуальной оболочке увеличивается содержание факторов, активирующих эндотелий (эндотелии и VEGF) и ингибирующих развитие иммунного ответа (TGFP2).

7. Периферические и децидуальные мононуклеарные клетки при СЗРП неадекватно реагируют на активационные сигналы. При СЗРП дополнительная стимуляция мононуклеарных клеток периферической крови определяет рост пула Т-хелперов и моноцитов, продуцирующих IL-6; плаценты - увеличение содержания Thl, синтез Thl цитокинов и TGFP2, но угнетение продукции провоспалительных цитокинов макрофагами.

8. В ранние сроки беременности при СЗРП отмечается угнетение апоптоза периферических цитотоксических клеток и моноцитов. В конце гестации СЗРП развивается на фоне усиления апоптоза периферических МНК в результате стимуляции его комплексом синтезируемых лимфоцитами цитокинов и активацией гена р53. В децидуальной оболочке при СЗРП отмечается дисбаланс между повышенной готовностью клеток к вступлению в апоптоз и реальным уровнем апоптирующих клеток, определяемый нарушением синтеза цитокинов децидуальными мононуклеарными клетками, экспрессии мРНК и продукции р53, и увеличением тканевого содержания БразЬ.

9. Ранними прогностическими критериями СЗРП являются снижение содержания в периферической крови матери уровня УЕвР (< 20 пг/мл) и уровня НЬА-£Ж+ моноцитов (<57,9%). В 32-40 недель гестации дополнительным критерием диагностики СЗРП является увеличение относительного содержания периферических СЭ11Ь+ лимфоцитов (>20%).

Практические рекомендации

1. Для оценки состояния иммунной системы беременной женщины рекомендуется определять: на всем протяжении гестации - показатели активации и апоптоза периферических мононуклеарных клеток, уровень сывороточного 1Ь-4; в ранние сроки гестации - уровень периферических С04+1Ь-2+ и С04+1Ь-4+ Т-хелперов, В1 клеток, СБ16+СВЗ+ ЕК-Т клеток и 1Ь-6+ моноцитов, содержание в сыворотке периферической крови цитокинов ТЫ типа, Тврр2 и ростовых факторов, регулирующих ангиогенез; в поздние сроки гестации -содержание в крови коммитированных Т-лимфоцитов, ТЫ и Тг клеток, экспрессию адгезионных молекул клетками, содержание в сыворотке крови ЬРСР, а также оценивать спонтанную продукцию и экспрессию мРНК 1Ь-6 лимфоцитами и моноцитами, спонтанную продукцию лимфоцитами и моноцитами 1Ь-10, уровень спонтанной секреции и экспрессии мРНК 1Ь-1|3 моноцитами.

2. Для прогнозирования асимметричной формы СЗРП рекомендуется определять в ранние сроки гестации в периферической крови показатели содержания УЕвР (диагностический параметр < 20 пг/мл) и НЬА-ВЯ+ моноцитов (диагностический параметр <57,9%).

Для диагностики асимметричной формы СЗРП в поздние сроки гестации рекомендуется определять содержание в периферической крови СБ11Ь+ лимфоцитов (диагностический параметр >20%).

233