Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Роль грибов в иммунном ответе у больных хроническим рецидивирующим полипозным риносинуситом

На правах рукописи

ПРОТАСОВ ПАВЕЛ ГЕННАДИЕВИЧ

РОЛЬ ГРИБОВ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ РЕЦИДИВИРУЮЩИМ ПОЛИПОЗНЫМ РИНОСИНУСИТОМ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

3 О МАЙ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва, 2013

005060453

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» РАМН и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-клинический центр оториноларингологии Федерального медико-биологического агентства России»

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Мокроносова Марина Адольфовна

доктор биологический наук Желтикова Татьяна Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой детской оториноларингологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России Карпова Елена Петровна

доктор биологический наук, профессор, заведующая лабораторией физиологии грибов и бактерий ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН Арзуманян Вера Георгиевна

Ведущая организация: ФГБУ "ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России

Защита диссертации состоится « 20 » июня 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН (г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).

Автореферат разослан «

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Острый и хронический риносинусит - наиболее распространенная патология JTOP-органов, доля которой составляет от 15 до 33,5 % [Дайняк Л.Б., 1978, Bent J.P., Kuhn F.A., 1994, de Shazo R.D., Swain R.E., 1996, Fokkens W.J. et al., 2007, 2012]. Хронический риносинусит (XPC) - это воспаление слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, практически всегда связано с застоем секрета и нарушением аэрации [Пискунов С.З. с соавт., 2005, Иванченко О.А. с соавт., 2012]. ХРС представляет собой разнородную группу состояний. Среди ХРС особое положение занимает хронический рецидивирующий полипозный риносинусит (ХРПР), этиология и патогенез которого изучены недостаточно. Основными этиологическими факторами ХРПР считают вирусную, бактериальную и грибную инфекции [Пискунов С.З. с соавт., 2005, Белобородова Н.В. с соавт., 2009, Лопатин А.С., 2011, Иванченко О.А. с соавт., 2012, Crampette L., 2001, Fokkens W.J. et al., 2007, 2012].

Среди множества теорий патогенеза ХРПР приобрела популярность «грибная гипотеза», предложенная ещё в 1983 г. профессором A.L. Katzenstein [Katzenstein A.L. et al., 1983]. В настоящее время эта гипотеза активно поддерживается и разрабатывается группой исследователей под руководством профессора J.U. Ponikau [Ponikau J.U. 1999, 2002, 2006, 2009, 2012]. Согласно этой гипотезе, не менее чем у 80-90% больных ХРПР причиной развития заболевания являются мицелиальные (плесневые) грибы [Ponikau J.U. et al., 2006]. Было предложено выделить самостоятельную форму ХРС - «аллергический грибной риносинусит» ("allergic fungal rhinosinusitis") [Kern R.C., Conley D.B. ét al., 2008]. Остается не ясным, какие таксоны микромицетов могут служить триггерным фактором в развитии ХРПР. Так, одни авторы предполагают, что эта роль принадлежит грибам рода Alternaría {Alternaría altérnala) [Ponikau J.U. et al., 2006, Sabirov A. et al.,

2008, Ponikau J.U. et al., 2009], тогда как другие считают, что это могут быть преимущественно грибы рода Aspergillus [Katzenstein A.L. et al., 1983, Schubert M.S., 2009].

В настоящее время диагностические критерии ХРПР, в этиологии которого принимают участие грибы, сводятся к обязательному выявлению самих грибов и эозинофилов в муцине околоносовых пазух (муцин -слизистые выделения, обогащенные гликопротеинами) и IgE антитела (АТ) к микогенным аллергенам в сыворотке крови. Кроме того, есть данные литературы об использовании некоторых биомаркеров в сыворотке крови (эозинофилы и эозинофильный катионный протеин (ЕСР - eosinophil cationic protein), цитокины (IL-5), антитела класса Е и G и т.д.) для дифференциальной диагностики различных форм ХРС [Иванченко О.А. с соавт., 2012, Pérez-Novo С.A. et al., 2006, Van Zele Т. et al., 2006, Patou J. et al., 2008, Fokkens WJ. et al., 2007, 2012]. Однако часто при микроскопировании окрашенных срезов полипов или высеве гомогената ткани полипов на питательные среды грибы не обнаруживают [Дайняк Л.Б. с соавт, 1989, Bent J.P., 1994 ,Cody D.T.,1994, Morpeth J.F., 1996, Rózañska M. et al., 2009].

Для диагностики бронхолегочного аспергиллеза традиционно в сыворотках крови больных выявляют галактоманнан - полисахаридный антиген клеточной стенки грибов рода Aspergillus. В ткани полипов больных ХРПР присутствие галактоманнана до сих пор не было исследовано. Метод выявления галактоманнана в ткани полипов для подтверждения присутствия микогенных антигенов, что наряду с другими методами (микологический анализ, гистоморфология биоптатов полипов, рентгенологическое исследование), может стать существенным дополнением в диагностике триггерных факторов ХРПР.

В этой связи, цель работы: исследование роли грибов и их антигенов в иммунном ответе у больных ХРПР.

Задачи исследования:

1) Изучить микобиоту полости носа у больных с ХРПР, аллергическим персистирующим ринитом (АПР) и здоровых людей, а также ткани полипов у больных с ХРПР.

2) Провести сравнительный анализ клеточного и гуморального иммунного ответа на микогенные антигены, в том числе Aspergillus fumigatus (Asp fl, Asp f2), в сыворотке крови, назальном секрете пациентов с ХРПР и АПР, а также ткани полипов у больных ХРПР.

3) Оценить частоту обнаружения галактоманнана и выявить его корреляцию с другими иммунологическими маркерами (IgG-AT, IgE-AT, IL-5, ЕСР) у больных с ХРПР и АПР в сыворотках крови, назальном секрете, а также ткани полипов у больных ХРПР.

4) Провести сравнительный анализ гистоморфологии полипов у пациентов с ХРПР с галактоманнаном в полипах и без него.

5) Разработать дополнительные дифференциально-диагностические критерии ХРПР, в патогенезе которого принимают участие грибы рода Aspergillus.

Научная новизна работы

Впервые обосновано значение галактоманнана в полипах для диагностики ХРПР.

Впервые проведен сравнительный анализ локального и системного иммунного ответа у больных ХРПР с галактоманнаном в ткани полипов и без него. Выявлена положительная корреляция между частотой выявления и концентрацией галактоманнана в полипах и IgG-, IgE-AT к A. fumigatus, а также IgE — AT к основным клинически значимым аллергенам A. fumigatus 1 и 2 групп (Asp fl и Asp f2).

Впервые предложено для диагностики фенотипа ХРПР и прогноза развития заболевания выявлять различные иммунологические маркеры (IgE-AT к микогенным аллергенам, в том числе A. fumigatus и его аллергенам

Asp fl и Asp f2, а также ECP и IL-5) в ткани полипов, а не в сыворотках крови больных.

Впервые в ткани полипов больных ХРПР выявлены дрожжи Pichia farinosa в высокой концентрации 104-10б КОЕ/г полипа.

Практическая значимость работы

Метод выявления галактоманнана может быть использован для дифференциальной диагностики триггерных факторов ХРПР.

Адаптирована методика стандартизации биологического материала по концентрации мочевины. Это позволило провести сравнительный анализ присутствия различных биомаркеров (галактоманнана, IgG-, IgE-AT, ECP, IL-5 и т.д.) в сыворотке крови, назальном секрете, гомогенате ткани полипов.

Для диагностики фенотипа ХРПР и прогноза развития заболевания следует выявлять различные иммунологические маркеры (IgE-AT к микоаллергенам, в том числе A. fumigatus и его основным аллергенам Asp fl и Asp f2, а также ECP, IL-5) в ткани полипов, а не в сыворотках крови больных.

Данные, полученные в результате проделанной работы, используются при чтении лекций для клинических ординаторов в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-клинический центр оториноларингологии Федерального медико-биологического агентства России».

Основные положения, выносимые на защиту

1) Галактоманнан - полисахаридный антиген клеточной стенки грибов, выявленный в ткани полипов, может быть использован для дифференциальной диагностики ХРПР.

2) Особенности локальной и системной иммунной реакции у больных ХРПР заключаются в:

- более высокой частоте выявления и концентрации IgE-AT к смеси микогенных аллергенов, A. fumigatus и его основным, клинически значимым аллергенам 1 и 2 групп (Asp fl и Asp f2), ЕСР, IL-5 в ткани полипов по сравнению с сыворотками крови;

- положительной корреляции между присутствием в полипах галактоманнана и IgG-, IgE-AT к A. fumigatus, IgE-AT к Asp fl и Asp f2.

Апробация материалов диссертации и публикации

Работа доложена на XVII съезде оториноларингологов России (Нижний Новгород, 2006), 53 конференции молодых учёных оториноларингологов по актуальным вопросам оториноларингологии (Санкт-Петербург, 2006), EAACI GA2LEN Allergy School (Germany, 2006), XXIII International Conference of Young Otorhinolaryngologists (Санкт-Петербург, 2006), 7th Symposium on experimental rhinology and immunology of the nose (SERIN) by ENT section of EAACI (Croatia, 2008), конференции молодых учёных НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009).

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 7 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ. Издано одно методическое пособие для врачей.

Апробация диссертации состоялась в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН 12.12.2012.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, шести глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка используемой литературы. Диссертация изложена на 121 странице, иллюстрирована 9 таблицами, 34 рисунками. Список литературы содержит 304 источника (65 отечественных и 239 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты. Были сформированы группы: 29 пациентов с ХРПР (возраст 42,8±2,3 года), 29 больных с АПР без полипов в полости носа и околоносовых пазухах (возраст 38,4±2,6 года). Группу контроля составили 17 практически здоровых пациентов (возраст 41,1±2,5 года).

Биологические материалы. У больных ХРПР проанализированы образцы сывороток крови, назального секрета, гомогенаты ткани полипов. У больных АПР и здоровых лиц исследованы образцы сывороток крови и назального секрета.

Стандартизация биологических материалов осуществлялась по концентрации мочевины [Бака1а К., 2000, Вауа! Б. е! а1., 2004, Кочетова Ю. И., 2005]. Коэффициент разведения назального секрета (К разв. н.с) высчитывали исходя из формулы:

К разв. н.с. = С моч. сыв./ С моч. н.с., где С моч. сыв. - концентрация мочевины в сыворотке крови, С моч. н.с. — концентрация мочевины в назальном секрете.

Коэффициент разведения супернатанта гомогената ткани полипов (К разв. пол.) высчитывали исходя из формулы:

К разв. пол. = С моч. сыв./ С моч. пол., где С моч. сыв. - концентрация мочевины в сыворотке крови, С моч. пол. — концентрация мочевины в супернатанте гомогената ткани полипов. Окончательные результаты получали путем умножения полученных данных на коэффициент разведения.

Получение образцов сыворотки крови. Забор крови из локтевой вены проводили в процедурном кабинете с соблюдением правил асептики и антисептики. Для отделения сыворотки кровь центрифугировали 10 минут при скорости 1000 оборотов в минуту, хранили при -20° С до 6 месяцев.

Метод сбора назального секрета. Назальный секрет забирали абсорбционным способом по методу Klimek L., Rasp G. (1999), в модификации Ю.И. Кочетовой [Кочетова Ю. И., 2005].

Получение супернатанта гомогената ткани полипа. Биоптат полипов помещали в стерильную стеклянную тару и немедленно замораживали при -20°С. Гомогенизацию ткани полипа проводили в физиологическом растворе в микроизмельчителе ткани РТ-2 в течение 10 мин.

Определение общего IgE и специфических IgE-AT в биологических материалах проводили с помощью прибора ImmunoCAP® (Thermo Fisher Scientific/Phadia AB, Швеция) в соответствии с инструкцией производителя:

- Phadiatop® - IgE-AT к комплексу ингаляционных аллергенов (кошка, собака, лошадь, тимофеевка, береза, лещина, полынь, Cladosporium herbarum, и клещи домашней пыли (Dermatophagoides pteronyssinus)),

- mx2 - IgE-AT к смеси микогенных аллергенов: Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Alternaría altérnala (tenuis), Helminthosporium halodes,

— IgE-AT к аллергенам Aspergillus fumieatus.

— IgE-AT к рекомбинантным аллергенам Asp fl и Asp f2.

Определение сывороточных JgG-AT к антигенам грибов рода

Aspergillus в биоматериалах проводили с использованием наборов ЗАО "Хема", Россия.

Определение галактоманнана в биоматериалах проводили с помощью тест системы Platelia® Aspergillus Ag (Bio-Rad Laboratories, Франция).

Определение интерлейкина-5 (IL-5) в биоматериалах проводили с применением коммерческих наборов фирмы BioSource (США).

Определение эозинофильного катионного протеина (ЕСР) проводили с помощью прибора ImmunoCAP® (Thermo Fisher Scientific/Phadia AB, Швеция) в соответствии с инструкцией производителя.

Цитологический анализ назального секрета проводили по стандартной методике с окрашиванием по методу Романовского-Гимза с подсчётом относительного количества эозинофилов [Протасов П.Г. с соавт., 2006].

Гистологическое и морфометрическое исследование срезов ткани парафинизированных полипов осуществляли по стандартной методике [Автандилов Г. Г. 1990, Автандилов Г.Г., 2007].

Микологическое исследование. Биоматериалы (назальный секрет, гомогенат ткани полипов) высевали на питательные среды сусло-агар и среду Сабуро [Потекаев Н.С., 2001]. Видовую идентификацию проводили сотрудники лаборатории экологической биотехнологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН А.Б. Антропова и A.M. Глушакова по морфологическим и физиологическим признакам (Kurtzman, Fell, 1998, 2011) и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей D1/D2 региона 26S (LSU) рДНК.

Статистическую обработку проводили с помощью программ Statistica® 6.0.437.0 (StatSoft) и Microsoft®Excel 2003 (11.8307.8221).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинико-иммунологическая характеристика обследованных пациентов

Всего было отобрано и обследовано 58 пациентов (29 — с ХРПР, 29 - с АПР) и 17 здоровых людей. У 6 из 29 (21%) больных с ХРПР зарегистрировано проявление респираторных аллергических реакций, причём у 2 больных из этой группы выявлено сочетание аллергического ринита и непереносимости препаратов группы НПВП (аспирина). Также в этой группе преобладали больные с тяжёлым — 13 (44%) и среднетяжелым - 9 (31%) течением заболевания, у остальных 7 (24%) пациентов полипоз носа протекал в лёгкой степени. У 5 больных ХРПР (17%) при осмотре выявляли искривление носовой перегородки. Наиболее часто (17 (58%) пациентов) выявляли ХРПР с толерантностью к НПВП без сопутствующей атопии. У 12 (41%) больных констатировали сочетание ХРПР и бронхиальной астмы.

Диагноз бронхиальной астмы подтверждали на основании анамнестических, функциональных и лабораторных данных.

В группу сравнения вошли 29 больных с АПР по данным анамнеза и обследования (положительные кожные пробы со спектром основных ингаляционных аллергенов, повышенного уровня общего IgE, наличие IgE-AT к ингаляционным аллергенам в сыворотке крови) [ARIA, 2008]. В группе больных АПР отмечено: у 12 (41%) больных - тяжелое, у 10 (34%) - среднетяжелое, у 7 (24%) - лёгкое течение. Выявлена прямая корреляция частоты выявления IgE-AT к смеси ингаляционных аллергенов (Phadiatop) с тяжестью течения как ХРПР (г = 0,87), так и АПР (г = 0,99).

Микромицеты в полости носа и ткани полипов Из полости носа больных с ХРПР и АПР выделено 5 родов мицелиальных грибов: Pénicillium был выявлен у 4 больных (14 %), Aspergillus - у 3 (10%), Botrytis, Cladosporium и Alternaria только у 1 больного (2%). Дрожжи представлены только 1 родом — Candida, который зарегистрирован у 3 (11%) больных. В полости носа как у больных ХРПР, так и АПР доминировали Pénicillium и Aspergillus. Однако у больных с ХРПР грибы рода Pénicillium выявляли почти в 2 раза чаще (в 14%), чем у пациентов с АПР и здоровых (у 7% и 8% соответственно). Тем не менее, микобиота назального секрета статистически достоверно не отличалась у больных ХРПР и АПР.

При посеве гомогенизированной ткани резецированных полипов больных ХРПР грибы выявлены у 6 из 29 больных (21%). Выделены мицелиальные грибы 3 родов Aspergillus, Cladosporium, Pénicillium, а также Mycelia sterilia. Численность этих грибов была низкой, что свидетельствует об их случайном обнаружении. Нами впервые из ткани полипов двоих больных с ХРПР были выделены дрожжи Pichia farinosa, численность

4 6

которых достигала 10 - 10 КОЕ/г полипа, что свидетельствует о персистировании этих грибов в ткани полипов.

Таким образом, с помощью микологического анализа грибы в ткани полипов выявляли всего в 21% случаев. В этой связи актуален поиск других методов, подтверждающих или опровергающих присутствие грибов в полипах.

Локальный и системный иммунный ответ на микогенные антигены у больных ХРПР

Проведен сравнительный анализ локального и системного иммунного ответа у пациентов с ХРПР и АПР.

Повышенный уровень общего IgE в сыворотках крови выявлен у 11 (38%) больных ХРПР. При этом средняя концентрация его составила 181,07±62,20 МЕ/л; у больных АПР повышенный уровень общего IgE зарегистрирован у 17 (59%) больных, а средняя концентрация была в 3,5 раза выше, чем у больных ХРПР - 642,03±99,56 МЕ/л.

У 7 (24%) больных ХРПР выявлен атопический фенотип - в сыворотках крови выявлены специфические IgE-AT к различным ингаляционным аллергенам, а у 4 (14%) пациентов - к различным грибным аллергенам (рис. 1). Учитывая то, что грибы Aspergillus являются одним из доминирующих родов мицелиальных грибов в средней полосе России, а А. fumigatus имеет большое эпидемиологическое значение как возбудитель микозов во всем мире, нами более детально был изучен иммунный ответ больных ХРПР на аллергены этого гриба. Группой сравнения служили сыворотки крови больных АПР и здоровых. В сыворотках крови больных ХРПР IgE-AT к А. fumigatus обнаруживали в 2,4 раза реже, а IgG-AT - более, чем в 11 раз чаще, чем у больных АПР (рис.2).

В гомогенатах ткани полипов у больных ХРПР IgE-AT к А. fumigatus, а также к основным, клинически значимым аллергенам Asp fl и Asp f2 выявляли в 2 - 6 раз чаще, чем в сыворотках крови (рис. 1,2).

■ полипы сыворотки

17

I

1 7 1 1 1 '

1 1 1

Р ...........1

1$Е-А Т к снеси Е-АТ к А./ипнцШм Е-АТ к А$р /1 микоамергенов

IgE-.4TKc.4ecu %Е-АТ к смеси ф-АТкА^пщаШ ^Е-АТ к Ау А %Е-АТкАир}2 иштщошш аллергенов

Рисунок 1. Частота выявления (%) ^Е-АТ к микогенным аллергенам у больных ХРПР (п=29) (* - статистически достоверные различия (р<0,05) между ^Е-АТ в полипах и сыворотках крови).

%

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

35

28

17

Гомогенаты полипов больных ХРПР

Сыворотки крови больных ХРПР

Сыворотки крови больных ЛИР

Сыворотки крови здоровых

Рисунок 2. Частота выявления (%) ^Е- АТ и 1§С-АТ к А. fumigatш у больных ХРПР (п=29), АПР (п=29) и здоровых (п=17) (* - статистически достоверные различия (р<0,05) между сыворотками крови ХРПР и АПР).

13

В основе воспаления оболочки носа при ХРГТР и АПР, как правило, лежит инфильтрация эозинофилами [Пискунов С.З. с соавт., 2005, Белобородова Н.В. с соавт., 2009, Лопатин A.C., 2011, Иванченко O.A. с соавт., 2012, Fokkens WJ. et al., 2007, 2012]. Был проведен сравнительный анализ количества эозинофилов у больных ХРПР и АПР в сыворотках крови и назальном секрете. У больных ХРПР более высокая концентрация эозинофилов зарегистрирована в крови, а у больных АПР — в назальном секрете (табл. 1). При этом частота выявления эозинофилии крови (количество эозинофилов от общего числа лейкоцитов в процентах, превышающий 5%) у больных ХРПР и АПР статистически достоверно не отличалась и составила соответственно 41% и 52%, а в назальном секрете - 59% и 66% соответственно (р>0,05).

Таким образом, отсутствие статистически достоверной разницы в эозинофилии крови и назального секрета как у больных ХРПР, так и у больных АПР, определило целесообразность исследования концентрации ЕСР - маркера активации эозинофилов. Частота выявления ЕСР в сыворотках крови, назальном секрете и полипах больных ХРПР представлена на рисунке 3.

Таблица 1. Содержание эозинофилов (%) в крови и назальном секрете у больных ХРПР, АПР и в группе здоровых.__

Исследуемые группы Количество эозинофилов (%) Достоверность различий

В крови В назальном секрете

min шах Среднее (М±т) min max Среднее (M±m)

Больные ХРПР 1 15 12,5 ± 0,7 0 57 12,9 ± 2,9 р>0,05

Больные АПР 5 20 4,5 ± 0,7 0 72 18,6 ± 2,2 р<0,05

Здоровые 1 5 4,6 ± 0,6 0 5 1,0 ± 0,4 р<0,05

%

100 80 60 40 20 0

ЕСР ЕСР ЕСР ткани ЕСР ЕСР

сывороток назального полипов сывороток назального

крови секрета больных больных секрета

больных больных ХРПР АПР больных

ХРПР ХРПР АПР

Рисунок 3. Частота выявления (%) ЕСР в сыворотках крови, назальном секрете и полипах у больных ХРПР (п=29) и АПР (п=29) Достоверность различий: * - между сыворотками крови и назальным секретом больных ХРПР (р<0,05), ** - между сыворотками крови больных ХРПР и сыворотками больных крови АПР (р<0,05), *** - между гомогенатами ткани полипов и сыворотками крови больных ХРПР (р<0,05), между гомогенатами ткани полипов и сыворотками крови больных АПР(р<0,05), между гомогенатами ткани полипов и назальным секретом больных ХРПР (р<0,05).

Частота выявления ЕСР в сыворотках крови больных ХРПР была ниже более, чем в 2 раза ниже, чем у больных АПР (рис. 3), тогда как средняя концентрация статистически достоверно не отличалась. В ткани полипов, как частота выявления, так и средняя концентрация ЕСР статистически достоверно превышала частоту выявления и среднюю концентрацию, как в назальном секрете, так и в сыворотках крови больных ХРПР.

В патогенезе ХРПР IL-5 является одним из главных цитокинов [Огородова Л.М., 2000, Пискунов С.З. с соавт., 2005, Лопатин A.C., 2011, Иванченко O.A. с соавт., 2012, Mould A.W., 1997, Bachert С., 1997, 1998, Olze Н.,2006, Fokkens W.J. et al., 2007, 2012].

Наши данные также подтверждают это: в ткани полипов повышенное содержание IL-5 выявлено у 25 больных (86%), тогда как в сыворотках крови

15

этих же пациентов этот цитокин был зарегистрирован только у 1 больного (рис. 4). Частота выявления 1Ь-5 в сыворотках крови больных ХРПР и больных АПР статистически достоверно не отличалась (рис. 4).

сыворотка ткань полипа сыворотка крови больных крови больных

АПР ХРПР

Рисунок 4. Частота выявления (%) 1Ь-5 в сыворотках крови и полипах у больных ХРПР (п=29) и АПР (п=29) (* - статистически достоверные отличия между сыворотками крови больных АПР и ХРПР и гомогенатами ткани полипов больных ХРПР (р<0,05)).

Таким образом, при обследовании больных ХРПР биомаркеры (1§Е-АТ, ЕСР, 1Ь-5 и т.д.), в первую очередь, следует исследовать в гомогенате тканей полипов, а не в сыворотках крови и назальном секрете.

Одним из ключевых является вопрос: есть ли взаимосвязь иммунологических показателей и присутствием в ткани полипов грибных антигенов. Поскольку грибы в ткани полипов методом посева выявляли не часто, мы решили использовать галактоманнан в качестве маркера присутствия грибов. Галактоманнан - полисахаридный антиген клеточных стенок грибов. Например, выявление галактоманнана в сыворотке крови больных аспергиллёзом является одним из главных критериев для постановки диагноза. Логично предположить, что обнаружение

галактоманнана в ткани полипов может помочь при диагностике патогенетически значимых факторов ХРПР.

На рисунке 5 представлена частота выявления галактоманнана в назальном секрете и сыворотках крови пациентов с ХРПР, АПР и здоровых лиц, а также ткани полипов больных ХРПР.

"/о

Больные Больные Здоровые

ХРПР АПР (п=29) (ч=17) (п=29)

Рисунок 5. Частота выявления (%) галактоманнана у больных ХРПР и АПР и здоровых.

Частота выявления галактоманнана в назальном секрете составляет 7180%, что объясняется постоянным заносом грибов в верхние дыхательные пути. В сыворотках крови положительный уровень галактоманнана, был зарегистрирован нечасто. В ткани резецированных полипов частота выявления (рис.5) и концентрация галактоманнана (рис.6) была статистически достоверно выше, чем в сыворотках крови, что свидетельствует о присутствии микогенных антигенов в ткани полипов этих пациентов.

ЕИ

2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1.2 1,0 0,8 0,6 0,4 0.2 0,0

1 * ]

-.1 , -...... ........................................1.........X ......1...............

12 3

Mean ' ±0,95 Conf. Interval

Рисунок 6. Концентрация галактоманнана (Единицы Индекса - ЕИ) в полипах и сыворотках крови больных ХРПР и АПР (р<0,05) (1 -ткань полипов, 2 - сыворотки крови больных ХРПР, 3 - сыворотки крови больных АПР).

Для изучения иммунной реактивности на галактоманнан у больных ХРПР всех обследованных пациентов разделили на две подгруппы: 1 подгруппа - 18 (62%) больных, в полипах которых выявлен галактоманнан (концентрация варьировала от 0,52 до 6,82 ЕИ/мл); 2 подгруппа - 11 (38%) больных ХРПР, в полипах которых галактоманнан не обнаружен (0,0 - 0,49 ЕИ/мл).

В ткани полипов, взятой у этих двух подгрупп больных, был проведён сравнительный анализ частоты выявления и концентрации иммунологических маркеров: специфических IgE-AT к смесям ингаляционных и грибных аллергенов, IgG- и IgE-AT к A. fumigatus, Asp fl, Asp f2, а также ECP, IL-5 (рис.7).

Частота выявления и концентрация специфических IgE-AT к различным микогенным аллергенам, IgE-AT к A. fumigatus, а также IgE-AT к Asp fl и Asp £2 в 1,8-2,4 раза выше в подгруппе больных ХРПР с повышенным содержанием галактоманнана в ткани полипов (рис. 7).

IgG-A Т к A. fumigatus

IgE—A '/" к- смеси ингаляционных

il /1 / "/>.'<■'// О в

IgE-AT к cjvtecu грибных ал л t'prfrt с? о

IgE-AT к A. fumigatus

IgE-A Т к Asp fl

IgE-A Т к Asp f2

ILS

O 20 40 60 80 ÎOO %

О галактоманнан выявлен " галактомйннаи не выявлен

Рисунок 7. Частота выявления (%) основных маркеров воспаления в гомогенатах ткани полипов больных ХРПР (* - статистически достоверные отличия между подгруппой 1 и подгруппой 2 (р<0,05)).

Таким образом, галактоманнан в ткани полипов может быть использован для дифференциальной диагностики ХРПР.

Гистоморфология полипов больных ХРПР

При сравнительном морфометрическом анализе полипов у больных ХРПР в 1-ой подгруппе (с выявленным галактоманнаном в полипах) и 2-ой подгруппе (галактоманнан не выявлен) зарегистрированы некоторые различия. Отмечены признаки десквамации эпителия у 13 (45%) пациентов.

19

При этом выраженность процесса (длина участка, мкм) статистически достоверно различается в подгруппах: в 1-ой подгруппе - 7,2±2,3 мкм (р>0,05), во 2-ой — 21,0±10,1 мкм (р<0,05). Отсутствие галактоманнана в полипах отрицательно коррелирует с выраженностью десквамации эпителия (г = - 0,63, р=0,03). Иными словами, у пациентов без галактоманнана в полипах наблюдается более выраженная десквамация эпителия. Количество нейтрофильных лейкоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки полипов также статистически достоверно отличается по подгруппам: в 1-ой подгруппе - 21,2±8,4 клеток, во 2-ой подгруппе - 7,6±1,7 клеток. Присутствие галактоманнана положительно коррелирует с количеством нейтрофильных лейкоцитов (г=0,67, р=0,02), что свидетельствует о развитии преимущественно нейтрофильного воспаления в слизистой оболочке полипа.

Другие гистоморфологические показатели: мононуклеарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки полипов, выраженность эозинофильной инфильтрации, плоскоклеточная метаплазия не зависят от присутствия галактоманнана в ткани полипов.

В результате проделанной работы изучены микромицеты полости носа и ткани полипов, а также локальные и системные иммунные реакции на микромицеты. При выявлении грибов из назального секрета больных ХРПР, АИР и здоровых людей нами, как и многими другими исследователями, не выявлено статистически достоверных различий как в таксономическом разнообразии, так и численности грибов. Из ткани полипов грибы высевали нечасто, что сопоставимо с данными литературы. В этой связи для дифференциальной диагностики ХРПР мы предложили использовать галактоманнан — полисахаридный антиген клеточной стенки грибов. Галактоманнан был выявлен в ткани полипов у 18 (62%) больных ХРПР. При сравнительном анализе особенностей локального и системного иммунного ответа у больных ХРПР, выявлена статистически достоверная положительная корреляция между присутствием в полипах галактоманнана, частотой

выявления и концентрацией антител класса G и Е к A. fumigatus и его основным клинически значимым аллергенам 1 и 2 групп (Asp fl, Asp f2). Все это свидетельствует в пользу того, что у этих больных развивается «аллергический грибной риносинусит».

Таким образом, галактоманнан — полисахаридный антиген клеточной стенки грибов, выявленный в ткани полипов, может быть использован для дифференциальной диагностики ХРПР помимо клинического и рентгенологического обследования. Кроме того, в дополнение к уже используемым иммунологическим методам (определение ЕСР, IL-5 и т.д.) желательно определять IgE-AT к микогенным антигенам. Однако измерять эти показатели следует в первую очередь не в сыворотках крови больных, а в ткани полипов. Все это позволит проводить более точную диагностику фенотипа ХРПР, назначать адекватное лечение, а также прогнозировать течение заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Таксономическое разнообразие и численность грибов, выделенных из полости носа больных ХРПР, АПР и здоровых лиц невысоки. Выделено б родов микромицетов: Alternaría, Aspergillus, Botrytis, Candida, Cladosporium, Pénicillium. Статистически достоверного различия между частотой выявления грибов в назальном секрете и их численностью всех обследованных пациентов и здоровых людей не выявлено.

2. Таксономическое разнообразие и частота выявления грибов, выделенных из ткани полипов больных ХРПР невысоко. Грибы высеяны из ткани полипов 6 больных (21%) ХРПР, численность их была низкой.. Впервые выявлена колонизация тканей полипов дрожжами Pichia farinosa, численность которых была высокой и достигала 104-106 КОЕ/г полипа.

3. В ткани полипов 18 (62%) больных ХРПР выявлен галактоманнан - полисахаридный антиген клеточной стенки грибов рода Aspergillus.

Выявлена статистически достоверная положительная корреляция между присутствием в полипах галактоманнана, частотой выявления и концентрацией антител класса G и Е к A. fumigatus и его основными клинически значимыми аллергенами 1 и 2 групп (Asp fl, Asp f2), а также ECP и IL-5 .

4. При морфометрическом анализе ткани полипов у больных ХРПР выявлено, что повышенные значения галактоманнана положительно коррелируют с уровнем нейтрофильной инфильтрации собственной оболочки ткани полипа (г = 0,67, р=0,02), и отрицательно - с выраженностью десквамации эпителия (г = - 0,63, р=0,03).

5. Галактоманнан - полисахаридный антиген клеточной стенки грибов, выявленный в ткани полипов, может быть использован для дифференциальной диагностики ХРПР

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Протасов П.Г. Эксфолиативный цитологический анализ в дифференциальной диагностике ринитов / Протасов П.Г., Тарасова Г.Д., Мокроносова М.А. // Материалы XI конгресса оториноларингологов с международным участием - Москва. - 2005.- С.112.

2. Мокроносова М.А. Определение IgG- и IgE-антител к Aspergillus fumigatus и галактоманнана у больных с хроническим рецидивирующим полипозным синуситом / Мокроносова М.А., Протасов П.Г.. Смольникова Е.В., Ханова Ф.М., Дайхес Н.А. // Российская оториноларингология. -2006.-2(21).-С.53-56.

3. Протасов П.Г. Галактоманнан в экспресс диагностике инвазивного аспергиллёза ЛОР - органов / Протасов П.Г., Мокроносова М.А., Дайхес Н.А. // Материалы XVII съезда оториноларингологов России. - Нижний Новгород. -2006.-С. 89.

4. Protasov P. Incidence of antibodies to moulds allergen Aspergillus fumigatus and rAsp fl, rAsp f2 in patients with an allergic rhinitis / Protasov P., Mokronosova M. // Abstract book EAACIJMA. - Vienna. - 2006. - P.38.

5. Протасов П.Г. Роль плесневых грибов Aspergillus spp. в патогенезе хронического полипозного риносинусита / Протасов П.Г., Мокроносова М.А. // Тезисы 53 конференции молодых учёных оториноларингологов по актуальным вопросам оториноларингологии - Санкт-Петербург.- 2006. - С. 156.

6. Protasov P. Incidence of antibodies to moulds allergen Aspergillus fumigatus and rAsp fl, rAsp f2 in patients with an allergic rhinitis / Protasov P., Mokronosova M. // Abstract book. XXIII International Conference of Young Otorhinolaryngologists. - S. Petersburg. - 2006. - C. 44.

7. Протасов П.Г. Галактоманнан в экспресс диагностике инвазивного аспергиллеза JIOP органов / Протасов П.Г., Дайхес Н.А., Мокроносова М.А. // Российская оториноларингология. - 2006. - 2(21). - С. 66-69.

8. Protasov P. Incidence of antibodies to Aspergillus fumigatus and rAsp fl, rAsp f2 in patients with allergic rhinitis and nasal polyposis / Protasov P., Mokronosova M. // EAACIGA2LEN Allergy School. - Germany. - 2006. - P. 33.

9. Мокроносова М.А. Эозинофильный катионный протеин как маркёр аллергического воспаления слизистой оболочки носа / Мокроносова М.А., Тарасова Г .Д., Протасов П.Г.. Смольникова Е.В., Сергеев А.В. // Медицинская иммунология. - 2007 (т.9). - №4-5. - С. 467-472.

10. Sergeyev A. Serum and polyp's markers of eosinophil's inflammation in chronic allergic nasal polyposis / Sergeyev A., Mokronosova M., Smolnikova E., Protasov P. // Allergy. - 2007. - Vol. 62. - Suppl. 83. - P. 229.

11. Мокроносова М.А. Свободный гемоглобин, эозинофилы и эозинофильный катионный белок в назальном секрете у пациентов с аллергическим или инфекционным ринитом / Мокроносова М.А., Кочетова Ю.И., Смольникова Е.В., Протасов П.Г. // Российский аллергологический журнал. - 2007 . - 3 . - С. 20-24.

12. Sergeyev A. Serum and polyp's markers of eosinophil's inflammation in chronic allergic nasal polyposis / Mokronosova M., Smolnikova E., Sergeyev A., Protasov P. // Abstract book. XXVI Congress of EAACI. - Sweden. - 2007 - P. 71

13. Protasov P. Sensitization to Aspergillus fumigatus in patients with nasal polyposis / Protasov P., Mokronosova M. // Abstract book. XXVI Congress of EAACI. - 2007. - Sweden. - P.55.

14. Протасов П.Г. Значение плесневых грибов в иммунопатогенезе хронического рецидивирующего полипозного риносинусита (ХРПР) / Протасов П.Г., Мокроносова М.А. // Материалы VII Всероссийской конференции отоларингологов. Вестник оториноларингологии. - №5. -2008,-С. 213-214.

15. Protasov P. Cytokines and IgE-antibodies to Staphylococcal enterotoxins and moulds in nasal polyps / Protasov P. Smolnikova E., Mokronosova M. // Abstract book. The XXVII Congress of EAACI. - Spain. - 2008. - P. 98.

16. Protasov P. Aspergillus spp. are one of triggering factors of nasal polyposis / Protasov P., Antropova A., Mokronosova M., Zheltikova T. // 7th Symposium on experimental rhinology and immunology of the nose (SERIN) by ENT section of EAACI. Abstract book. - Croatia. - 2008. - P. 53.

17. Protasov P. Trigger factors and inflammatory mediators in the tissue of a nasal polyp / Protasov P., Mokronosova M. // Abstract book. XXVIII Congress of EAACI. - Poland. - 2009. - P. 37.

18. Дайхес H.A. Влияние стафилококковых и грибных аллергенов на локальное воспаление слизистой оболочки полости носа у больных хроническим полипозным риносинуситом / Дайхес Н.А, Мокроносова М.А, Протасов П.Г.. Смольникова Е.В., Мустафаева Д.М., Куян Ю.С. // Российская оториноларингология. - 2009. - № 6 (43). - С. 33-40.

19. Мокроносова М.А. Клинико-иммунологические фенотипы хронического полипозного риносинусита / Мокроносова М.А., Смольникова Е.В., Куян Ю.С., Мустафаева Д.М., Протасов П.Г. // Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 4. - С. 3-9.

Методическое пособие для врачей.

Протасов П.Г.. Тарасова Г.Д., Мокроносова М.А., Бейлина В.Б., Казначеева Е.И. Эксфолиативный цитологический анализ в дифференциальной диагностике заболеваний JIOP-органов. - Метод, пособие. - Москва. - 2006. - 26 стр.

Заказ № 23-р/05/2013 Подписано в печать 16.05.2013 Тираж 85 экз. Усл. п.л. 1.4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru