Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Роль гемодинамических и молекулярно-биологических факторов рецептивности эндометрия в программах экстракорпорального оплодотворения

На правах рукописи

ШАРФИ Юлия Нажибовна

РОЛЬ ГЕМОДИНАМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ В ПРОГРАММАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 МАЙ 2015

00556В5ЬЬ

Санкт-Петербург - 2015

005568566

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Гзгзян Александр Мкртичевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава РФ, профессор кафедры акушерства и гинекологии

доктор медицинских наук, заместитель главного врача по репродуктивной медицине ООО "Ава-Петер"

Тапильская Наталья Игоревна

Калугина Алла Станиславовна

Ведущая организация: ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны РФ.

Защита диссертации состоится « ¿70» У2015 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта».

Автореферат разослан«,*^? » ¿¿-¿¿¿ге^й/ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

^Кузьминых Татьяна Ульяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении более 30 лет методы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) являются единственным решением проблемы бесплодия многих ранее обреченных на бездетность супружеских пар. По последним данным каждая шестая супружеская пара в мире, желающая иметь детей, оказывается бесплодной (Farquhar С., 2013). В Европе ежегодно отмечается рост использования методов ВРТ (886 случаев на 1 миллион населения в 2007 году, 947 в 2008 году, 1067 в 2009 году и 1221 в 2010 году). Однако, несмотря на совершенствование протоколов ЭКО, разнообразие технических и лабораторных методов, применяемых при проведении этих программ, частота наступления беременности остается в пределах от 24,1% до 48,1% (Kupka M.S., 2014). До сих пор процесс имплантации эмбриона остается не до конца изученным этапом вспомогательных репродуктивных технологий, лимитирующим частоту успешных исходов циклов ЭКО (Diedrich К. , 2007; Kupka M.S., 2014).

Несомненно, результативность циклов ЭКО во многом зависит от качества перенесённого эмбриона в полость матки, структурно-функциональной полноценности эндометрия и его готовности к имплантации эмбриона, а так же от синхронности их взаимодействий в период предполагаемого «окна имплантации». На сегодняшний день общепринятой методикой определения качества эмбриона является его морфологическая оценка в соответствии с длительностью культивирования. Развитие методов преимплантационной генетической диагностики позволяет исследовать эмбрионы на наличие хромосомных нарушений (Brezina P.R., 2013). В то же время отсутствуют стандартизованные методы определения периода оптимальной рецептивности эндометрия для проведения переноса эмбрионов в полость матки с целью достижения максимальной частоты наступления беременности в циклах ЭКО. Изучение процесса имплантации у человека in vivo связано с рядом ограничений этического, практического и методического характера. В связи с этим большинство исследований, направленных на изучение процесса имплантации, проводятся на экспериментальных моделях или in vitro, что ограничивает экстраполяцию полученных результатов на человека.

С момента появления иммунологической теории имплантации (Wegmann T.G., 1993) роль цитокинов, факторов роста, молекул адгезии и др. в центре внимания многих исследователей (Aghajanova L., 2003; Cheng L.H., 2005; Diedrich К., 2007; Dimitriadis Е., 2010; Berlanga О., 2011; Díaz-Gimeno P., 2011). Согласно современным представлениям о процессе имплантации на ее ранних этапах, между эмбрионом и эндометрием

происходят различные молекулярные взаимодействия, которые регулируются многочисленными паракринными факторами: цитокинами, хемокинами, факторами роста, простагландинами, молекулами адгезии и их рецепторами, определяющими процессы дифференцировки, адгезии и инвазии трофобласта.

В этой связи в последние годы внимание исследователей было направлено на изучение влияния на процесс имплантации лейкемия ингибирующего фактора (LIF), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), гранулоцитарно-макрофагального фактора роста (GM-CSF), трансформирующего фактора роста бета! (TGF-ßl). Экспрессия этих молекул клетками эндометрия наиболее выражена в период предполагаемого «окна имплантации» (Shifren J.L., 1996; Zhao Y., 1999; Aghajanova L., 2003; Stoikos C.J., 2008), что отражает их значительную роль в регуляции процесса имплантации эмбриона как в физиологических условиях, так и в циклах ЭКО.

Наибольшее распространение получил иммуногистохимический метод изучения экспрессии молекулярных факторов, однако он связан с инвазивной процедурой - биопсией эндометрия, что ограничивает его применение в циклах ЭКО (Karimzade M.А., 2010). По этой причине продолжается интенсивный поиск возможностей неинвазивной оценки рецептивности эндометрия непосредственно в цикле стимуляции суперовуляции.

В ряде работ (Mikolajczyk M., 2006; Girling J.E., 2009; Hannan N.J., 2011) была выявлена взаимосвязь между экспрессией разных иммунологических молекулярных факторов в ткани эндометрия, секрете из полости матки и слизи цервикального канала.

Учитывая значимость адекватного кровообращения в функционировании любой ткани организма, среди неинвазивных методов оценки рецептивности эндометрия в последние годы широко применяется допплерометрическая характеристика кровотока в сосудах матки (Chien L.W., 2002; Puerto В., 2003; Dechaud H., 2008; Ng E.H.Y., 2008). Однако на сегодняшний день не выработаны четкие нормативы допплерометрических показателей кровотока в сосудах матки, определяющие рецептивность эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), а также не определено оптимальное время для проведения этого исследования.

Таким образом, разработка достоверных неинвазивных методов оценки рецептивности эндометрия заслуживает особого внимания, ввиду доступности применения непосредственно в протоколах ЭКО и возможности прогнозировать время оптимальной готовности эндометрия к имплантации.

Цель исследования состояла в определении роли гемодинамических и молекулярных факторов рецептивности эндометрия в качестве предикторов

наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения.

Задачи исследования

1. Разработать подходы к информативному использованию неинвазивных методов оценки рецептивности эндометрия в циклах ЭКО.

2. Выделить ультразвуковые и допплерометрические критерии кровотока в сосудах матки, характеризующие рецептивность эндометрия и их сопряженность с результативностью программ ЭКО.

3. Определить связь экспрессии ЫР (лейкемия ингибирующий фактор), ТОР-Р1 (трансформирующий фактор роста Р1), УЕСР-А (сосудистый эндотелиальный фактор роста, подтип А) в эндометрии женщин в период предполагаемого «окна имплантации» с результативностью программ ЭКО.

4. Установить связь содержания УЕОР (сосудистый эндотелиальный фактор роста), ОМ-СБР (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор роста) и ТСР-Р1 (трансформирующий фактор роста-р1) в цервикальной слизи с результативностью программ ЭКО.

5. Выявить прогностически наиболее значимые параметры оценки рецептивности эндометрия в циклах ЭКО у обследованных женщин на основе логистического регрессионного анализа.

6. Разработать прогностическую модель эффективности программ ЭКО у обследованных женщин на основе выбранных параметров рецептивности эндометрия.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

По результатам проведенного исследования впервые представлена многофакторная оценка рецептивности эндометрия в цикле стимуляции суперовуляции с использованием допплерометрических показателей кровотока в сосудах матки, уровня экспрессии цитокинов и факторов роста в цервикальной слизи и тканевых структурах эндометрия. Обоснована методология и предложены неинвазивные методы оценки маркеров, определяющих рецептивность эндометрия в циклах ЭКО. Впервые выделены и идентифицированы по оптимальным условиям определения на ключевых этапах протокола ЭКО прогностически наиболее значимые допплерометрические показатели кровотока в сосудах матки, иммуногистохимические и иммунологические характеристики рецептивности эндометрия, дано аргументированное теоретическое обоснование их решающего влияния на процесс имплантации эмбриона. Логистический регрессионный анализ, включавший данные оптической плотности экспрессии ЬШ в поверхностном и железистом эпителии эндометрия, полученного в период предполагаемого «окна имплантации», содержание УЕСР в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции,

систоло-диастолическое отношение и индекс резистентности в спиральных артериях в день введения триггера овуляции, позволил впервые установить статистически значимую закономерность взаимосвязанного влияния гемодинамических и молекулярных факторов на рецептивность эндометрия. Практическая значимость исследования

На основании результатов проведенного исследования разработан метод комплексной клинической оценки рецептивности эндометрия с учетом показателей, полученных непосредственно в циклах стимуляции суперовуляции. Создана математическая модель, позволяющая с высокой достоверностью прогнозировать имплантацию эмбрионов в полость матки на основе выделенных интервалов значений допплерометрических показателей кровотока в сосудах матки (S/D и IR спиральных артерий), уровней экспрессии LIF в эндометрии и VEGF в цервикальной слизи. Установлены предиктивные пороговые значения этих показателей, с высокой достоверностью лимитирующие положительные результаты переносов эмбрионов в проводимых циклах ЭКО. Высокая чувствительность 82%, специфичность - 89,4% и общая точность предсказания (85,6%) предложенного метода определяют его значимость и целесообразность внедрения в клиническую практику центров ЭКО. Основные положения, выносимые на защиту

1. Одним из основных условий наступления беременности при проведении циклов ЭКО является достижение адекватной рецептивности эндометрия. Для объективной и прогностически значимой характеристики состояния эндометрия наиболее результативной является его комплексная оценка на основе допплерометрических показателей кровотока в сосудах матки, иммуногистохимических и иммунологических показателей.

2. Наряду с общепризнанными инвазивными методами оценки показателей рецептивности эндометрия, включающими иммуногистохимические и морфологические показатели, в комплексной оценке состояния эндометрия значительная роль принадлежит неинвазивным методам исследования: определению факторов роста мультиплексным методом в цервикальной слизи и исследованию систоло-диастолического отношения и индекса резистентности спиральных артерий матки.

3. Применение математической модели комплексной оценки рецептивности эндометрия, основанной на логистическом регрессионном анализе, позволяет с высоким уровнем значимости провести прогностическую оценку эффективности программ экстракорпорального оплодотворения у обследованных женщин.

Апробация и внедрение результатов работы в практику Материалы диссертационной работы доложены на XV Юбилейной Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей

(с международным участием). «Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2012; на региональной общественной организации «Санкт-Петербургское радиологическое общество», Санкт-Петербург, 2013; I международном форуме «молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование», Санкт-Петербург, 2013; V ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых - 2014», Санкт-Петербург, 2014.

Разработанные методы обследования внедрены в практику отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», в учебный процесс кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет» и ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта».

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации статей.

Подана заявка на патент по предложенному изобретению № 2014121625 от 27.05.2014.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автором работы были проанализированы и обобщены данные отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Разработан дизайн исследования и карты обследования пациентов. Автор самостоятельно проводила анкетирование, обследование и наблюдение пациентов, самостоятельно выполняла инвазивные манипуляции.

Первичная статистическая обработка полученных данных выполнена автором с помощью методов описательной статистики. Дальнейшая статистическая обработка материала была проведена с личным участием автора. Анализ, интерпретация, изложение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций большей частью выполнены автором лично. Доля участия автора: в сборе информации и составлении дизайна исследования - 100%, в проведении клинических исследований - 99%, в обобщении и анализе материала - 90%, в формулировании выводов и практических рекомендаций - 90%.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение), а также выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 9 таблиц и 26 рисунков. Список литературы включает 299 источников, в том числе 34 отечественных и 265 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Основой для настоящего исследования явились данные, полученные в результате обследования 97 супружеских пар, которые проходили лечение бесплодия с применением метода ЭКО на базе ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта». Методической основой диссертационного исследования явилась разработка и применение модели оценки рецептивности эндометрия в циклах ЭКО. Работа представляет собой проспективное когортное клиническое исследование с использованием клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов исследования.

Критерии включения в исследование: возраст женщин от 21 до 35 лет; уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в крови не более 11 МЕ/л, определенный на 2-5 день менструального цикла у всех обследованных женщин, антимюллеров гормон в пределах 1-2,5 нг/л; наличие при ультразвуковом исследовании на 3-5 день менструального цикла от 6 до 12 антральных фолликулов в максимальном эхографическом срезе яичников; перенос только морфологически качественных эмбрионов.

Критерии исключения из исследования: гинекологические и экстрагенитальные заболевания, при которых проведение базовой программы ЭКО противопоказано; гипо- и гипергонадотропная недостаточность функции яичников; гиперандрогенемия любого происхождения; синдром поликистозных яичников, наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) Ш-ГУ степени распространённости; ожирение у пациенток с ИМТ более 35 кг/м2.

Для достижения поставленных задач, в зависимости от исхода лечения, ретроспективно были сформированы 2 группы. В I группу вошли 50 женщин с эхографически подтвержденной беременностью в результате ЭКО, II группа состояла из 47 женщин, у которых беременность в результате ЭКО не наступила. Исследование проводилось с мая 2011 г. по июль 2013 г.

Стандартное клиническое и гормональное обследование проводилось всем супружеским парам в рамках подготовки к программе ЭКО в соответствии с действующим в период набора материала приказом № 107н от 30 августа 2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».

В зависимости от основного фактора бесплодия в каждой группе женщин, сравниваемых по результату исхода программы ЭКО, были сформированы подгруппы (таблица 1).

Таблица 1 - Распределение обследованных женщин в зависимости от основного фактора бесплодия

Фактор бесплодия 1 группа (п=50) II группа (п=47)

Трубно-перитонеальный фактор бесплодия 21 26

Мужской фактор бесплодия 18 11

НГЭ 1-Н степени 11 10

Ультразвуковое и допплерометрическое исследование выполнялось с помощью ультразвукового сканера Samsung Medison SonoAce Х6 (Республика Корея) с использованием трансвагинального датчика с частотой 4-9 МГц. Проводили оценку толщины эндометрия и качественных кривых скоростей кровотока (КСК - Систоло-диастолическое отношения (S/D), индекс резистентности (IR) и пульсационный индекс (PI)) в маточных артериях и ее ветвях на 2-3 день менструального цикла, в день введения триггера овуляции и в день переноса эмбрионов.

С помощью иммуногистохимического метода проводили исследование экспрессии цитокина LIF и факторов роста VEGF-A и TGF-pi в ткани эндометрия, полученной на 20-23 день менструального цикла в цикле перед проведением протокола ЭКО с использованием моноклональных антител к соответствующим факторам. Для оценки полученных результатов использована система компьютерного анализа микроскопических изображений Морфология 5.2.

Исследование содержания факторов роста (VEGF, TGF-pi и GM-CSF) в цервикальной слизи (ЦС) в день трансвагинальной пункции фолликулов (ТВП) и в день переноса эмбрионов (ПЭ) проводилось методом мультиплексного анализа с использованием стандартизованных коммерческих наборов "Flexset" (BD Bioscience). Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы "СВА Array" (BD Bioscience). Для нормирования содержания в полученном материале исследуемых факторов определяли количество белка в соответствующей анализируемой жидкости спектрофотометрическим методом с использованием аппарата NanoDrop 1 ООО.

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием стандартного пакета «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» версия 6.0, StatSoft Inc. (США) и SPSS-19 с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Различия считались статистически значимыми при р<0,05 (95% - уровень значимости) и р<0,01 (99% - уровень значимости). Данные представлены в виде процентных соотношений, среднего и 95% доверительного интервала. Для выявления основных

факторов, влияющих на наступление беременности в результате цикла ЭКО, был проведен логистический регрессионный анализ. Был использован ЯОС-анализ. Представлены следующие показатели информативности: коэффициент Нейджелкерка, АЬГС (площадь под кривой), чувствительность, специфичность, предсказательная ценность положительного и отрицательного теста и прогностическая ценность теста.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты клинико-лабораторного обследования пациенток и проведенного протокола ЭКО

По результатам клинико-анамнестического и клинико-лабораторного обследования, показателям менструальной и репродуктивной функции, данным о перенесенных гинекологических и соматических заболеваниях, выполненных оперативных вмешательствах по поводу бесплодия, методах ранее проведенного лечения бесплодия, показателях гормонального статуса и овариального резерва обследованные женщины в обеих клинических группах были сравнимы (р>0,05).

В день ТВП у 50 (51,54%) женщин оплодотворение было проведено методом ИКСИ в связи с наличием мужского фактора бесплодия. Остальным женщинам проводился стандартный протокол ЭКО.

Средняя доза рекомбинантных гонадотропинов, количество растущих фолликулов по данным УЗ мониторинга, пунктированных и полученных ооцитов, полученных и перенесенных морфологически качественных эмбрионов в исследуемых клинических группах, а также подгруппах достоверных отличий не имели (р>0,05). Оставшиеся морфологически качественные эмбрионы были криоконсервированы методом витрификации (таблица 2).

Таким образом, по основным показателям проведения протокола ЭКО достоверных отличий у женщин обеих клинических групп выявлено не было (р>0,05), аналогичные данные получены и при сравнительном анализе в подгруппах.

Из общего числа эмбрионов (178), перенесенных в полость матки, имплантировали 68, частота имплантации эмбрионов составила 38,2% (68/178).

Частота наступления клинической беременности на перенос составила 51,55% (50 женщин). У 17 женщин (17,5%) наступила беременность двойней. У 29 женщин (29,9%) состоялись срочные роды и у 15 (15,46%) -преждевременные. Неразвивающаяся беременность имела место у 6 женщин (6,18%).

Таблица 2 - Основные показатели протоколов ЭКО у женщин I и II группы

Параметры Группа I (п=50) Группа II (п=47) Р

Доза препаратов гонадотропных гормонов 1530,75±62,63 1521,65±83,99 0,79

День менструального цикла, приходившегося на день введения триггера овуляции 10,90±0,17 10,74±0,21 0,33

Количество растущих фолликулов по данным ультразвукового мониторинга в день введения триггера овуляции 10,84±0,69 9,49±0,58 0,07

Количество пунктированных фолликулов 12,54±0,94 10,64±0,73 0,08

Количество полученных ооцитов 11,14±0,93 9,66±0,75 0,28

Количество полученных эмбрионов на 3-ий день культивирования 7,08±0,63 6,08±0,49 0,55

Количество морфологически качественных полученных эмбрионов в день ПЭ в полость матки 4,80±0,41 4,17±0,41 0,19

Количество перенесенных эмбрионов 1,84±0,05 1,83±0,07 0,88

День культивирования эмбрионов при их переносе в полость матки 4,14±0,07 3,98±0,10 0,28

День менструального цикла, приходившийся на день ПЭ в полость матки 17,04±0,19 16,72±0,20 0,22

Количество криоконсервированных эмбрионов 2,96±0,42 2,34±0,43 0,19

Оплодотворение методом ЭКО 46,8% 53,2% 0,37

| Оплодотворение методом ЭКО/ИКСИ 56% | 44% 10,37

С целью повышения достоверности результатов исследования исходные условия были стандартизированы по клинико-анамнестическим данным, условиям применения единых протоколов стимуляции суперовуляции с переносом только морфологически качественных эмбрионов, с соблюдением одинаковых методов специального обследования для всех женщин и с использованием компьютерной системы подсчёта данных для каждого из применяемых методов оценки рецептивности эндометрия.

Результаты ультразвукового исследования органов малого таза и допплерометрической оценки кровотока в сосудах матки в цикле ЭКО

Первый этап ультразвукового исследования органов малого таза и допплерометрической оценки кровотока в сосудах матки проводили на 2-3 день менструального цикла в протоколе ЭКО. На момент исследования у всех женщин толщина М-эхо не превышала 5 мм, составила в среднем 3,49±0,084 мм и достоверно не отличалась в сравниваемых клинических группах.

Исследуемые допплерометрические параметры сопротивления сосудов матки на 2-3 день менструального цикла (S/D, IR, PI) в маточных, аркуатных и радиальных артериях достоверно не отличались у женщин обеих клинических групп (р>0,05), хотя имели тенденцию к снижению у женщин с наступившей беременностью, что согласуется с результатами R.L. Schild и соавторов (2000).

Второй этап исследования проводили всем женщинам в день введения триггера овуляции (за 9-12 часов до введения триггера овуляции), который дополняли исследованием допплерометрических параметров сопротивления в базальных и спиральных артериях. Толщина М-эхо на момент исследования достоверно не отличалась у женщин обеих клинических групп (р>0,05) и в среднем составила 9,40±0,16 мм.

Было отмечено значительное снижение всех исследуемых допплерометрических индексов сопротивления в базальных и спиральных артериях у женщин I группы по сравнению с аналогичными показателями у женщин II группы (р<0,01). Наиболее значительно в сравниваемых группах отличались показатели КСК спиральных артерий (таблица 3).

Таблица 3 - КСК кровотока в маточных, аркуатных, радиальных, базальных и спиральных артериях в день введения триггера овуляции у женщин I и II группы

S/D IR PI

I групп (п=50) II группа (п=47) I групп (п=50) II группа (п=47) I групп (п=50) II группа (п=47)

ПрМа 5,90±0,20 6,15±0,19 0,82±0,01 0,82±0,01 2,13±0,05 2,23±0,06

ЛевМа 6,08±0,20 6,40±0,19 0,83±0,01 0,83±0,01 2,22±0,06 2,30±0,0б

Аа 3,48±0,11 3,57±0,09 0,70±0,01 0,70±0,01 1,36±0,04 1,42±0,04

Ра 2,57±0,07 2,64±0,05 0,60±0,01 0,62±0,01 1,01 ±0,03 1,06±0,03

Ба 2,05±0,04** 2,21 ±0,04 0,50±0,01** 0,54±0,01 0,76±0,02** 0,86±0,02

Ca 1,71±0,03** 1,90±0,02 0,40±0,01** 0,46±0,01 0,57±0,03** 0,68±0,01

Примечания 1 * отличия в сравниваемых группах достоверны при р<0,05. 2 ** отличия в сравниваемых группах достоверны при р<0,01.

У 95% женщин беременность наступила при попадании S/D базальных артерий в интервал от 1,96 до 2,14, IR - от 0,48 до 0,52 и PI - от 0,72 до 0,81; для спиральных артерий S/D варьировал от 1,65 до 1,77, IR- от 0,38 до 0,42 и PI - от 0,53 до 0,60, соответственно (доверительный интервал 95%).

Третий этап исследования проводили за 1-2 часа до переноса эмбрионов в полость матки.

Толщина М-Эхо в день переноса эмбрионов в полость матки достоверно не отличалась у женщин обеих клинических групп (р>0,05).

Было отмечено достоверное снижение S/D, IR и PI в базальных и спиральных артериях у женщин I группы по сравнению с аналогичными показателями у женщин II группы (р<0,05). Наиболее значительно (р<0,01) в сравниваемых группах отличался IR спиральных артерий (таблица 4).

Таблица 4 - КСК кровотока в маточных, аркуатных, радиальных, базальных и спиральных артериях в день переноса эмбрионов в полость матки у женщин I и II группы

S/D IR PI

I групп (п=50) II группа (п=47) I групп (п=50) II группа (п=47) I групп (п=50) II группа (п=47)

ПрМа 5,56±0,20 5,52±0,24 0,81±0,01 0,80±0,01 2,09±0,06 2,07±0,07

ЛевМа 5,42±0,17 5,59±0,26 0,80±0,01 0,80±0,01 2,10±0,06 2,10±0,06

Аа 3,65±0,11 3,77±0,12 0,71 ±0,01 0,72±0,01 1,48±0,05 1,56±0,04

Ра 2,88±0,10 2,77±0,09 0,63±0,01 0,62±0,01 1,14±0,04 1,14±0,04

Ба 2,0б±0,05* 2,21±0,05 0,50±0,01* 0,54±0,01 0,76±0,02* 0,86±0,03

Ca 1,78±0,04* 1,92±0,03 0,42±0,01** 0,47±0,01 0,61±0,02* 0,70±0,02

Примечания 1 * отличия в сравниваемых группах достоверны при р<0,05. 2 ** отличия в сравниваемых группах достоверны при р<0,01.

У 95% женщин беременность наступила при попадании S/D базальных артерий в день ПЭ в интервал от 1,97 до 2,15, IR - от 0,48 до 0,52 и PI - от 0,71 до 0,81, для спиральных артерий S/D варьировал от 1,70 до 1,86, IR - от 0,40 до 0,45 и PI - от 0,56 до 0,65, соответственно (доверительный интервал 95%).

На всех этапах ультразвукового исследования органов малого таза и допплерометрической оценки кровотока в сосудах матки достоверных отличий изучаемых показателей внутри клинических групп обследованных в зависимости от основного фактора бесплодия не выявлено.

Исходя из результатов нашего исследования значимым для прогнозирования результата ЭКО оказалось определение индексов сопротивления (S/D, IR, PI) базальных и спиральных артерий, которые достоверно отличались в день введения триггера овуляции (р<0,01) и в день ПЭ (р<0,05) у женщин с наступившей беременностью по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила. Однако наиболее выраженные отличия имели изучаемые показатели в день введения триггера овуляции, аналогичные результаты приводит и Н. Dechaud (2008).

Таким образом, очевидно, что уже в день проведения ТВП фолликулов есть возможность оценить рецептивность эндометрия, позволяющую принять решение о целесообразности переноса эмбрионов в полость матки в проводимом цикле ЭКО.

Результаты гистологического и иммуиогистохимического исследования эндометрия

Показатели экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия, полученного в период «окна имплантации» в цикле перед проведением программы ЭКО у женщин с наступившей беременностью (относительная площадь - 12,88±0,66% и оптическая плотность -0,245±0,009 у.е.), были значительно выше, чем у женщин, у которых беременность в результате ЭКО не наступила (относительная площадь -8,63±0,65%; и оптическая плотность - 0,167±0,006 у.е., р<0,01) (рисунок 1).

Внутри клинических групп обследованных в зависимости от основного фактора бесплодия показатели экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия достоверно не отличались.

Наши результаты согласуются с данными полученными P.C. Serafini и соавторами (2009) показавшими, что вероятность наступления беременности в результате ЭКО в 6,4 раза больше у женщин с высокой экспрессией LIF в ткани эндометрия, полученной в период «окна имплантации» в цикле перед проведением программы ЭКО.

U- г

s S 0,22

= ® 0,18 |1

□ Mean i I ±SE ~Т~ ±1,96"SE

Рисунок 1 - Сравнение среднего показателя оптической плотности экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия среди женщин I и II группы.

W.S. Seo и соавторы (2011) выявили значительное повышение экспрессии VEGF-A в эндометрии у женщин с наступившей беременностью

по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила в результате ЭКО, что соответствует полученным в нашей работе результатам (0,192±0,010 у.е. и 0,143±0,008 у.е., соответственно; р<0,01) (рисунок 2).

0,22 0,21

о 0,19 о.

С 0

f 0,18 U-

О IU

> 0,17

| 0,16

У 0,15

х

S

§ 0,14

I группа

□ Меап I I ±SE ~Г ±1,96*SE

Рисунок 2 - Сравнение среднего показателя оптической плотности экспрессии УЕОБ-А в строме эндометрия среди женщин I и II группы.

Результаты исследования факторов роста в цервикальиой слизи методом мультиплексного анализа

Содержание GM-CSF и VEGF в цервикальной слизи, как в день ТВП, так и в день ПЭ у женщин с наступившей беременностью в результате ЭКО было гораздо больше (в 1,6 раз), чем в группе женщин, у которых беременность не наступила (таблица 5). Полученные результаты отражают прогностическую ценность указанных параметров и согласуются с ранее полученными выводами других авторов, которые отметили снижение уровня этих факторов у женщин с привычным невынашиванием (Perricone R., 2003; Jasper M.J., 2007), идиопатическим бесплодием (Calogero А.Е., 1998) и неудачными попытками ЭКО (Spandorfer S.D., 1998) в различном биологическом материале (ткань эндометрия, фолликулярная жидкость, венозная кровь). Однако, следует подчеркнуть, что эти данные авторы получили не в циклах стимуляции суперовуляции, поскольку работы, подобные настоящему исследованию, в циклах ЭКО не проводились.

Таблица 5 - Результаты определения содержания ОМ-С8Р, УЕОР и ТСР-Р1 в цервикальной слизи у женщин I и II группы

Содержание (пг/мг) В день ТВП В день ПЭ

I группа (п=50) II группа (л=47) I группа (п=50) II группа (п=47)

GM-CSF 58,99±7,76** 35,24±7,59 31,49±3,66** 19,39±2,46

VEGF 182,33±21,67** 112,37±16,82 131,50±14,56* 79,71 ±7,05

TGF-ßl 1016,83±188,43 719,17±115,05 647,99±103,53 544,33±92,38

Примечания 1 * отличия в сравниваемых группах достоверны при р<0,05. 2 ** отличия в сравниваемых группах достоверны при р<0,01.

По изучаемым молекулярным показателям в цервикальной слизи не было выявлено значимых отличий внутри обследованных клинических групп в зависимости от основного фактора бесплодия.

Исходя из результатов проведенного нами исследования у женщин с наступившей после ЭКО беременностью отмечалась тенденция к повышению экспрессии TGF-ßl всеми структурами эндометрия и увеличению его содержания в ЦС как в день ТВП, так и в день ПЭ, что свидетельствует о благоприятном влиянии TGF-ßl на имплантацию эмбриона и наступление беременности. Однако эти различия не были статистически достоверными (р>0,05) и поэтому, на наш взгляд, оценка экспрессия TGF-ßl в структурах эндометрия, полученного в период «окна имплантации» в цикле перед проведением ЭКО, и его содержание в ЦС на ключевых этапах протокола ЭКО не являются прогностическими критериями рецептивности эндометрия.

Разработка математической модели оценки рецептивности эндометрия

Разработанная модель оценки рецептивности эндометрия построена на основании анализа широкого спектра признаков (69 признаков) рецептивности эндометрия у достаточного количества женщин и отличается высоким коэффициентом Нейджелкерка (равным 0,74), была построена кривая ROC, с AUC (площадь под кривой) - 0,987 (рисунок 3), что показывает высокую точность прогнозирования результатов и дает возможность заключить, что достаточно четырех признаков (относительная плотность экспрессии LIF в поверхностном и железистом эпителии эндометрия, полученного в период предполагаемого «окна имплантации» в цикле перед проведением ЭКО, содержание VEGF в ЦС в день ТВП фолликулов, S/D и IR спиральных артерий в день введения триггера овуляции), позволяющих на этапе трансвагинальной пункции фолликулов

провести оценку рецептивности эндометрия непосредственно в цикле ЭКО и принять решение о переносе эмбрионов в полость матки или отложить перенос эмбрионов и провести подготовительную этиотропную терапию.

Кривые ROC

1 - Специфичность

Рисунок 3 - ROC кривая для предложенной модели.

ВЫВОДЫ

1. Неинвазивные методы оценки состояния эндометрия в циклах ЭКО адекватно отражают его рецептивность и включают: исследование допплерометрических показателей кровообращения в базальных и спиральных артериях матки в день введения триггера овуляции, определение содержание GM-CSF и VEGF в цервикальной слизи в день проведения трансвагинальной пункции и в день переноса эмбрионов.

2. Рецептивность эндометрия достоверно отрицательно сопряжена с показателями кровотока (S/D, IR и PI) в базальных и спиральных артериях матки, определяемых в день введения триггера овуляции и в день переноса эмбрионов. Наиболее выраженная отрицательная корреляционная зависимость выявляется между наступлением беременности и показателями кровотока в спиральных артериях матки в день введения триггера овуляции: S/D (r=-0,43, р<0,05), IR (r=-0,49, р<0,05), PI (г=-0,47, р<0,05).

3. В цикле ЭКО содержание GM-CSF и VEGF в цервикальной слизи достигает максимальных значений в день трансвагинальной пункции, значительно превышая их уровень, определяемый в день переноса эмбрионов (в 1,8 раза и 1,4 раза, соответственно, р<0,01). В то же время у женщин с наступившей беременностью в результате ЭКО содержание

GM-CSF и VEGF в цервикальной слизи, полученной в день трансвагинальной пункции фолликулов, значительно превосходит эти показатели у женщин с отсутствием беременности (58,99±7,76 пг/мл и 35,24±7,59 пг/мл; 182,33±21,67пг/мл и 112,37±16,82 пг/мл, соответственно, при р<0,01).

4. Иммуногистохимические показатели относительной площади и оптической плотности экспрессии LIF в железистом эпителии и VEGF-A в строме эндометрия, доступные к оценке в период имплантационного окна в цикле, предшествующем проведению ЭКО, оказывают непосредственное влияние на результативность программ ЭКО (р<0,01). Наибольшая сопряженность с наступлением беременности отмечается в отношении оптической плотности экспрессии LIF в железистом эпителии эндометрия (г=0,60, р<0,05).

5. Содержание в цервикальной слизи TGF-ßl как в день трансвагинальной пункции, так и в день переноса эмбрионов достоверно положительно коррелирует с уровнями VEGF (г=0,50 и г=0,47, соответственно, р<0,05) и GM-CSF (г=0,47 и г=0,36, соответственно, р<0,05). Однако ни уровень экспрессии TGF-ßl в ткани эндометрия в период имплантационного окна в цикле, предшествующем проведению ЭКО, ни его содержание в цервикальной слизи как в день трансвагинальной пункции фолликулов, так и в день переноса эмбрионов, не являются предикторами наступления беременности в циклах ЭКО.

6. Разработанная на основе регрессионного логистического анализа математическая модель прогнозирования наступления беременности в цикле ЭКО у обследованных женщин является адекватной (коэффициент Нейджелкерка (0,74) и AUC (площадь под кривой) - 0,987) и включает следующие критерии: оптическая плотность экспрессии LIF в железистом эпителии, полученная в период предполагаемого «окна имплантации» предыдущего цикла, содержание VEGF в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции, S/D и IR в спиральных артериях в день введения триггера овуляции.

7. Чувствительность прогнозирования беременности с помощью предложенной модели и установленной регрессионной функции составляет 82%. Специфичность - 89,4%. Предсказательная ценность положительного результата - 89,1%, предсказательная ценность отрицательного результата -82,3%, общая точность предсказания - 85,6%. При положительном значении Z регрессионного уравнения вероятность наступления беременности в результате ЭКО у обследованных женщин в 4,8 раза превосходит ее отсутствие.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Программирование переноса эмбриона в полость матки в цикле ЭКО целесообразно проводить на основе показателей комплексной оценки рецептивности эндометрия.

2. При планировании протокола ЭКО иммуногистохимическую оценку рецептивности эндометрия в период предполагаемого «окна имплантации» в цикле, предшествующем проведению протокола ЭКО, целесообразно проводить с учетом экспрессии LIF. При значениях, выходящих за приделы 95% доверительного интервала (от 0,227 у.е. до 0,263 у.е.), целесообразно модифицировать проведение последующего протокола ЭКО с учетом достоверного снижения рецептивности эндометрия.

3. Неинвазивные методы оценки рецептивности эндометрия в цикле ЭКО, включающие исследование качественных кривых скоростей кровотока в базальных и спиральных артериях матки в день введения триггера овуляции, определение содержание GM-CSF и VEGF в цервикальной слизи целесообразно проводить в день трансвагинальной пункции фолликулов.

4. Оценка рецептивности эндометрия может быть проведена с использованием регрессионной функции (Z) включающей:

LIF — оптическая плотность экспрессии лейкемия ингибирующего фактора в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период предполагаемого «окна имплантации» в цикле, предшествующем проведению ЭКО (у.е.);

VEGF - Содержание сосудистого эндотелиального фактора роста в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции фолликулов (пг/мг);

S/D - Систоло-диастолическое отношение спиральных артерий в день введения триггера овуляции;

IR - индекс резистентности спиральных артерий в день введения триггера овуляции.

Z = (LIF*44,832) + (VEGFx0,006) + (S/D х 40,379) - (IR х 152,351) -15,799,

При Z>0 прогнозируем, что эндометрий рецептивен, перенос эмбрионов в цикле ЭКО возможен.

5. При Z<0 - эндометрий нерецептивен, проведение переноса эмбрионов не целесообразно. Возможна криоконсервация эмбрионов с последующим проведением курса этиотропной терапии заболевания эндометрия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Айламазян, Э.К. Маркеры имплантационной восприимчивости эндометрия: роль и значение в циклах экстракорпорального оплодотворения / Э.К. Айламазян, М.А. Пальцева, Ю.С. Крылова, Ю.Н. Шарфи, В.О. Полякова, И.М. Кветной [и др.] // Молекулярная медицина. - 2014. - № 3. - С. 3-8.

2. Внноходов, А.Д. Результативность переносов эмбрионов в циклах экстракорпорального оплодотворения в зависимости от содержания цитокинов в цервикальной слизи / А.Д. Виноходов, Ю.Н. Шарфи // Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: тезисы XVII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых исследователей (с международным участием). -СПб.: Изд-во СПбГУ, 2014. - С. 82-83.

3. Гзгзян, A.M. Допплерометрические показатели сосудов матки в оценке имплантационной способности эндометрия при проведении программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) / A.M. Гзгзян, Д.А. Ниаури, И.Ю. Коган, Л.Х. Джемлиханова, И.О. Крихели, И.Д. Федорова, Е.А. Лесик, Ю.Н. Шарфи, Е.М. Шильникова // Журнал акушерства и женских болезней. -2013. - № 4. - С. 29-36.

4. Гзгзян, A.M. Персонализированная тактика ведения женщин, планирующих лечение бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) / A.M. Гзгзян, И.Ю. Коган, Л.Х. Джемлиханова, И.О. Крихели, Ю.Н. Шарфи //Материалы национального конгресса «Дискуссионные вопросы современного акушерства». Акушерство и гинекология. Спец. выпуск. - 2011. -ТОМ LX. - С. 29-30.

5. Гзгзян, A.M. Ультразвуковые критерии имплантационной способности эндометрия в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) / A.M. Гзгзян, Ю.Н. Шарфи // Материалы II Национального конгресса «Дискуссионные вопросы современного акушерства» и обучающего преконгресс-курса XI Всемирного конгресса по перинатальной медицине. - СПб., 2013. - С. 51-52.

6. Крылова, Ю.С. Иммуногистохимические критерии имплантационной восприимчивости эндометрия / Ю.С. Крылова, Ю.Н. Шарфи, А.М. Гзгзян, А.К. Соснина, И.М. Кветной [и др.] // Молекулярная медицина. - 2014. - № 5. - С. 24-28.

7. Крылова, Ю.С. Прогнозирование исхода ЭКО: значение экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона, лейкемию ингибирующего фактора и анамнестических особенностей пациенток / Ю.С. Крылова, Ю.Н. Шарфи // Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века - технологии, экономика, образование: материалы I международного форума. - СПб., 2013. - С. 247-254.

8. Ниаури, Д.А. Иммуногистохимическая характеристика рецептивности эндометрия в циклах ЭКО / Д.А. Ниаури, A.M. Гзгзян, И.М. Кветной, И.Ю. Коган, Л.Х. Джемлиханова, И.О. Крихелк, И.Д. Федорова, Е.А. Лесик, Ю.Н. Шарфи, Ю.С. Крылова, Е.М. Шильникова // Акушерство и гинекология. -2014. - № 9. - С. 44-50.

9. Ниаури, Д.А. Факторы роста как прогностические критерии наступления беременности в циклах ЭКО / Д.А. Ниаури, A.M. Гзгзян, И.Ю. Коган, Л.Х. Джемлиханова, И.О. Крихели, И.Д. Федорова, Е.А. Лесик, Ю.Н. Шарфи, Е.М. Шильникова, A.B. Селютин, С.А. Сельков П Акушерство и гинекология. — 2014. -№ 10.-С. 41-47.

10. Шарфи, Ю.Н. Иммуногистохимические критерии рецептивности эндометрия в циклах ЭКО / Репродуктивная медицина - взгляд молодых - 2013: материалы V ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов. - СПб., 2013. - С. 75-77.

11. Шарфи, Ю.Н. Иммунологические показатели рецептивности эндометрия в циклах ЭКО // Ю.Н. Шарфи, Д.А. Ниаури, A.M. Гзгзян, И.М. Кветной, А.И. Меркулова // Материалы VIII Международного конгресса по репродуктивной медицине. - Москва, 2014. - С. 260-261.

12. Критерии индивидуального подхода к лечению бесплодие методами вспомогательных репродуктивных технологий у больных с наружным генитальным эндометриозом / Ю.Н. Шарфи // Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: тезисы XIV Всероссийской медико-биологической

13. конференции молодых исследователей (с международным участием). -СПб.: Изд-во СПбГУ, 2011. - С. 300.

14. Шафи, Ю.Н. Определение иммунологических маркеров рецептивности эндометрия в циклах стимуляции суперовуляции / Ю.Н. Шарфи // Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: тезисы Материалы тезисы XVII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных исследователей (с международным участием). «Фундаментальная наука и клиническая медицина». - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2014. - С. 508-509.

15. Шарфи, Ю.Н. Определения факторов роста в цервикальной слизи в качестве маркеров имплантационной способности эндометрия в циклах ЭКО / Ю.Н. Шарфи // Бюллетень Федерального центра сердца, крови, эндокринологии им. В.А. Алмазова. - 2013. - прилож.2. - С. 88-89. (тезисы VIII междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный»),

16. Шарфи, Ю.Н. Цитокины и факторы роста как маркеры имплантационной способности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) / Ю.Н. Шарфи // Журнал акушерства и женских болезней. — 2013. - № 4. - С. 88-96.

17. Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: тезисы XV Юбилейной Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). -СПб.: Изд-во СПбГУ, 2012.-С. 315-316.

18. Sharfi, Y.N. Criteria of the approach to individual infertility treatment by art for patients with external genital endometriosis / Y.N. Sharfi // 10th Congress of MSRM, Budva (Montenegro). - 2011. - P. 8.

Подписано в печать 20.04.15. Авт. л. 1,0. Усл. печ. л. 1,5. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Заказ № 0254/15. Отпечатано с готового оригинал-макета. ООО «КОПИЦЕНТР», Санкт-Петербург, В.О., 21-я линия, 8а.