Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Влияние преждевременной лютеинизации на эффективность лечения бесплодия в программе экстракорпорального оплодотворения в протоколах с агонистами гонадотропии-рилизинг гормона

На правах рукописи

МИТЮРИНА Елена Викторовна

ВЛИЯНИЕ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ ЛЮТЕИНИЗАЦИИ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ В ПРОТОКОЛАХ С АГОНИСТАМИ ГОНАДОТРОПИН - РИЛИЗИНГ

ГОРМОНА 14.01.01 — Акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соисканне ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 АПР 2015

005567986

Москва-2015

005567986

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Краснопольская Ксения Владиславовна - доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ Московской области "Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии", отделение репродуктологии, руководитель

Серебренникова Клара Георгиевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, кафедра семейной медицины, профессор

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится 19 «мая» 2015 года в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 на базе федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» по адресу: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, Д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

http://sciense.ncagp.ru/upfiles/pdf/MitviirinaEV.pdf.

Автореферат разослан «_»_2015 года

доктор медицинских наук

Перминова Светлана Григорьевна

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) приобретают все большее значение в лечении различных форм бесплодия. Однако частота наступления клинической беременности и частота родов после ВРТ не превышает 33% и 24,8% соответственно (А. Ferrareti et al., ESHRE, 2013).

Одной из возможных причин низкой эффективности программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является преждевременная лютеинизация (ПЛ) - повышение концентрации сывороточного прогестерона (Р) в день введения триггера овуляции выше порогового уровня, который по разным данным варьирует от 0,4 до 3,0 нг/мл, однако наиболее значимой считают концентрацию Р>1,5 нг/мг (Е. Bosch, 2010, С. Venetis et al., 2013, О. Hamdine et al., 2014). Некоторые авторы в качестве маркера ПЛ используют соотношение Р/Е2>1 (J. S. Younis, 2001, Т.Н. Lai et al., 2009).

Частота встречаемости ПЛ в циклах стимуляции суперовуляции варьирует от 5 до 71% и зависит от используемого исследователями порогового значения Р, аналога гонадотропин - рилизинг гормона (ГнРГ) и характеристик выборки (Е. Bosch, 2010, Е. Papaleo, 2014).

Несмотря на существенную распространенность ПЛ, в литературе продолжаются дебаты о ее влиянии на исходы программ ЭКО. В то время, как некоторые исследователи не находят существенной взаимосвязи между ПЛ и вероятностью наступления беременности (С. A. Venetis et al., 2007), другие подтверждают ее неблагоприятный эффект на исходы ВРТ за счет негативного влияния либо на параметры оогенеза и эмбриогенеза (I. Yovel et al., 2007), либо на рецептивность эндометрия (Е. Labarta et al., 2011). Причины повышения уровня Р в день введения хорионического гонадотропина человека (ХГч) являются предметом дискуссии. Обсуждается роль повышения лютеинизирующего гормона (ЛГ) как следствие неполной десенситизации гипоталамо-гипофизарно-яичниковой (ГГЯ) системы, повышенной чувствительности ЛГ-рецепторов

гранулезных клеток к стимуляции препаратами фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), «бедного» овариального ответа в развитии ПЛ (А.В. Copperman et al., 1995, F. Ubaldi et al., 1996, R. Huang et al„ 2012, Z. Bu et al., 2014).

В последние годы появились данные о том, что повышение уровня Р в день введения ХГч в программе ЭКО является следствием стимуляции суперовуляции и зависит от интенсивности овариального ответа (Е. Bosch, 2010, Н. Fatemi et al. 2013).

Известно, что эффективность программы ЭКО во многом зависит от функциональной зрелости и готовности эндометрия к имплантации, а также от синхронизации с развитием эмбриона. В качестве одного из таргетных механизмов влияния ПЛ на исходы циклов ВРТ обсуждается преждевременное воздействие высоких концентраций Р на эндометрий, что приводит к асинхронному взаимодействию эндометрия с эмбрионом и, как результат, к неудачам имплантации (С. Huang et al., 2012). Прямые доказательства негативного влияния повышенных концентраций преовуляторного Р на эндометрий были показаны лишь в единичных исследованиях при анализе профиля экспрессии мРНК генов маркеров имплантации (Е. Labarta et al., 2010, R. Li et al., 2011, I. Van Vaerenberg et al., 2011), что требует продолжения исследований.

Несмотря на интенсивное изучение ПЛ в последние годы, остаются дискуссионными многие аспекты этого феномена. Требует уточнения частота развития повышения Р в день введения ХГч в протоколах с агонистами ГнРГ (аГнРГ) в зависимости от используемого индуктора (рФСГ или ЧМГ) и овариального ответа на стимуляцию. Несмотря на обсуждаемую негативную ассоциацию ПЛ с исходами программ ВРТ, до настоящего времени не уточнен таргетный механизм неблагоприятного влияния ПЛ на эффективность программы ЭКО - влияние на параметры оогенеза и эмбриогенеза или неудачи имплантации вследствие нарушения рецептивности эндометрия. Не определены наиболее оптимальные подходы предотвращения и коррекции преждевременного

повышения Р в день назначения ХГч в программе ЭКО. Необходимость решения этих вопросов послужила основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения на основании изучения причин и механизмов влияния преждевременной лютеинизации на исходы циклов в протоколах с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику концентраций половых стероидных гормонов и выявить риск преждевременной лютеинизации в протоколах с аГнРГ и стимуляции яичников препаратами рФСГ и ЧМГ.

2. Оценить влияние преждевременной лютеинизации на параметры оогенеза и раннего эмбриогенеза.

3. Проанализировать влияние концентраций сывороточного прогестерона в день назначения ХГч на эффективность программы ЭКО.

4. Оценить влияние уровня сывороточного прогестерона в позднюю фолликулярную фазу на рецептивность эндометрия.

5. Разработать алгоритм ведения женщин в протоколах с аГнРГ в программе ЭКО в зависимости от наличия преждевременной лютеинизации.

Научная новизна

Определена частота встречаемости ГШ в программе ЭКО в протоколах с аГнРГ. Установлены параметры овариальной стимуляции, предрасполагающие к повышению сывороточных концентраций Р в день назначения ХГч, такие как интенсивная и длительная стимуляция с использованием препаратов рФСГ. Показано, что повышение уровня сывороточного Р в день назначения ХГч зависит от суммарной дозы индуктора и коррелируют с уровнем Е2 в день введения триггера овуляции и количеством полученных ооцитов.

Установлено, что при предполагаемом субоптимальном ответе на стимуляцию соотношение Р/Е2>1, а при умеренном и чрезмерном ответе — абсолютное значение Р>4,77 нмоль/л могут быть прогностическими факторами неудач имплантации при проведении программы ЭКО.

Доказано, что повышение концентраций сывороточного Р>4,77 нмоль/л в день назначения ХГч негативно влияет на эффективность программы ЭКО в протоколах с аГнРГ, что проявляется снижением частоты имплантации в 3,3 раза, клинической беременности в 2,6 раз, частоты родов в 2,5 раз.

Дано клинико — патогенетическое обоснование влияния ПЛ на исход цикла ЭКО. Установлено, что ПЛ не оказывает негативного влияния на качество ооцитов и параметры раннего эмбриогенеза.

Впервые на основании морфологического, иммуногистохомического (ИГХ) и молекулярно-генетических методов исследования проведена комплексная оценка состояния эндометрия в день трансвагинальной пункции (ТВП) в сравнении с «окном имплантации» естественного цикла. Показано, что овариальная стимуляция приводит к опережению созревания эндометрия на 2,6 дня по критериям Noyes и более раннему открытию «окна имплантации». Впервые установлено, что в стимулированном цикле экспрессия мРНК генов маркеров рецептивности эндометрия (IGF1, PGR, MSX/HOX7, НОХАЮ, НОХА11, IL8, CD56 и CD68) сопоставима с «окном имплантации» естественного цикла.

Показано, что ПЛ потенцирует негативное влияние овариальной стимуляции на эндометрий и приводит к опережению созревания эндометрия в среднем на 3,9 дня. Повышение сывороточных концентраций Р в день назначения ХГч приводит к изменению экспрессии мРНК 22 генов маркеров имплантации и к существенному снижению экспрессии мРНК гена TNFa. Впервые показано, что при опережении развития эндометрия в день ТВП более чем на 3 дня снижается экспрессия мРНК генов НОХА11, IGFBP1 и CD68, что является подтверждением нарушения рецептивности в эндометрии у пациенток с уровнем Р>4,77 нмоль/л в день введения триггера овуляции.

Доказано, что как овариальная стимуляция, так и повышение сывороточных концентраций Р в день введения триггера овуляции, приводят к существенному опережению созревания эндометрия и более раннему открытию «окна имплантации».

Практическая значимость В результате проведенного исследования доказана целесообразность измерения сывороточных концентраций Е2 и Р в день назначения овуляторной дозы чХГ при проведении стимуляции суперовуляции в рамках программы ЭКО.

Определены маркеры развития ГШ в цикле стимуляции суперовуляции: высокая суммарная доза индуктора, продолжительная стимуляция, повышенные уровни Р на 6-ой день стимуляции и высокие концентрации Е2 в день введения триггера овуляции, количество полученных ооцитов.

Пороговый уровень Р>4,77 нмоль/л в день назначения овуляторной дозы ХГч у пациенток с умеренным и чрезмерным ответом на стимуляцию и соотношение Р/Е2>1 при субоптимальном ответе следует рассматривать как фактор прогноза неудач имплантации в программе ЭКО.

Обосновано использование «мягких» протоколов стимуляции, индивидуального подбора стартовых доз и снижение суммарных доз гонадотропинов, а также доказана нецелесообразность продолжительной стимуляции и преимущества использования препаратов ЧМГ.

Разработан и рекомендован для применения в клинической практике алгоритм ведения пациенток в программе ЭКО, с учетом уровня Р в день введения триггера овуляции, в котором отражены профилактические мероприятия, препятствующие развитию феномена ГШ. В случае констатации ПЛ целесообразна отмена переноса эмбрионов с лечебном цикле, их криоконсервация с целью переноса в следующих циклах.

Положения, выносимые на защиту 1. Преждевременная лютеинизация осложняет 15% протоколов с аГнРГ, встречается в 3 раза чаще при использовании препаратов рФСГ по сравнению с препаратами ЧМГ и зависит от овариального ответа.

Риск развития преждевременной лютеинизации при проведении овариальной стимуляции ассоциирован с суммарной дозой индуктора, уровнем эстрадиола в день введения триггера овуляции и количеством полученных ооцитов.

2. Отсутствие значимых различий в качестве ооцитов, частоте оплодотворения, дробления и формирования бластоцист в зависимости от уровня прогестерона в день введения триггера овуляции исключает влияние преждевременной лютеинизации на параметры оогенеза и раннего эмбриогенеза.

Повышенные уровни сывороточного прогестерона в день введения овуляторной дозы чХГ приводят к снижению частоты имплантации в 3,3 раза, клинической беременности в 2,6 раз, прогрессирующей беременности в 2,8 раза, частоты родов в 2,5 раза, что подтверждает негативное влияние преждевременной лютеинизации на исходы программы ЭКО.

3. Овариальная стимуляция приводит к опережению созревания эндометрия на 2,6 дня, а при преждевременной лютеинизации - к смещению «окна имплантации» вперед на 3,9 дня, что подтверждается обнаружением в день аспирации ооцитов секреторного эндометрия, зрелых пиноподий, нарушением экспрессии прогестероновых рецепторов и а также изменением профиля экспрессии мРНК 22 генов маркеров имплантации. При опережении развития эндометрия более, чем на 3 дня значительно уменьшается экспрессия мРНК генов НОХА11, ЮРВР1 и СБ68, что свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия и является причиной неудач имплантации у пациенток с преждевременной лютеинизацией в программе ЭКО.

Личный вклад автора

Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления исследования, разработке цели и задач исследования, анализе и статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом ЭКО и переноса эмбрионов.

Соответствие диссертации паспорту полученной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация работы

Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на V Всероссийском Конгрессе «Амбулаторно - поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья» (Москва, 2013 г), XIV и XV Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2013 г., 2014г.), сертификационном цикле с международным участием: «ВРТ в лечении женского и мужского бесплодия» (Москва, 2013г, 2014г). Работа обсуждена на межклинической конференции сотрудников 1-го гинекологического отделения (09.10.2014г.) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ (07.11.2014г., протокол № 14).

Внедрение результатов исследования в практику Разработанный на основании полученных результатов алгоритм ведения пациенток в программе ЭКО в зависимости от концентрации прогестерона в день введения ХГч внедрен в практическую деятельность 1-го гинекологического отделения ФГБУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Материалы работы используются для практических занятий и лекций со слушателями семинаров, аспирантами и клиническими ординаторами ФГБУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова».

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 5 - в ведущих рецензируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста, состоит из введения и 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение), выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 17 рисунками. Использованная литература включает 142 источника, в том числе 6 на русском и 136 источников на английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

В соответствии с целью и задачами исследования были обследованы 323 пациентки, обратившиеся для проведения программы ЭКО в 1-ое гинекологическое отделение (заведующий - к.м.н. Абубакиров А.Н.) ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в период с октября 2011 по май 2014 года. Основную группу исследования составили 274 женщины с трубно-перитонеальным и/или мужским (субфертильная сперма) факторами бесплодия и 19 доноров ооцитов, которым проведена программа ЭКО в протоколе с аГнРГ со стимуляцией суперовуляции препаратами рФСГ и ЧМГ.

Аспирационная пайпель-биопсия эндометрия в лечебном цикле ЭКО была выполнена в день ТВП у 17 пациенток основной группы, которым был отменен перенос эмбрионов, и у 19 доноров ооцитов. Группой сравнения для изучения состояния эндометрия в «окно имплантации» явились 30 пациенток, которые планировали проведение программы ЭКО.

Всем женщинам основной группы помимо общеклинического обследования проведен гормональный мониторинг цикла, который включал определение уровней ФСГ, ЛГ, Е2, Р на 2-3-й день после десенситизации ГГЯ системы; ЛГ, Е2, Р на 6-й день стимуляции и в день введения ХГч.

Пациентки основной группы (п=293) были разделены в зависимости от используемого для стимуляции суперовуляции гонадотропина: 1-ю группу (п=151) составили женщины, которым проводили стимуляцию овуляции препаратом рФСГ и 2-ю группу (п=142) - пациентки, у которых в качестве индуктора использовали препарат ЧМГ.

Для верификации ПЛ использовали: 1) пороговое значение сывороточного уровня Р в день введения триггера овуляции >4,77 нмоль/л (1,5 нг/мл; коэффициент пересчета 3,18); 2) соотношение Р/Е2>1, которое вычисляли по формуле: Р(нг/мл)х1000/Е2 (пг/мл).

В зависимости от уровня Р в день введения ХГч пациентки основной группы были разделены на 2 подгруппы: I (п=44) - Р >4,77 нмоль/л и II (п=249) - Р<4,77

нмоль/л. В зависимости от значения соотношения Р/Е2: А (п=28) - Р/Е2>1 и В (п=265) - Р/Е2<1.

Для оценки состояния эндометрия проведены морфологическое (датирование эндометрия по критериям Noyes, оценка процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий), иммуногистохимическое (определение экспрессии рецепторов эстрадиола (ЭРа), прогестероновых рецепторов (ПР), лейкемия-ингибирующего фактора (LIF)) и молекулярно-генетическое исследования (уровень экспрессии мРНК генов IGF1, ESR1, PGR, MSX1/HOX7, НОХАЮ, НОХА11, VEGF общ, VEGF 189, ILlb, IL2, LIF, LIF R, IL8, IL15, IL18, TNFa, CD56, COX2, MMP11, HB EGF, IGFBP1, CD 68) с помощью количественной полимеразной цепной реакции с предварительной стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени).

Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы IPM SPSS Statistics, версия 21. Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95% уровень значимости).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Возраст пациенток основной группы с бесплодием колебался от 20 до 38 лет, медиана (Me) - 32 года (интерквартильный интервал 30-35 лет). Исследуемая группа была представлена соматически здоровыми женщинами репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным и/или мужским факторами бесплодия, нормальными показателями овариального резерва.

Частота встречаемости уровня сывороточного Р>4,77 нмоль/л в день введения ХГч в нашем исследовании составила 15%, при этом ПЛ отмечена в 3 раза чаще в группе рФСГ в сравнении с группой ЧМГ (22,5% и 7,04% соответственно; р=0,0001). Частота ПЛ, определяемая как Р/Е2>1, составила 9,6%. Полученные данные согласуется с результатами других авторов (A. Andersen, 2006, Е. Bosch, 2010, Е. Papanikolaou, 2012).

Результаты гормонального мониторинга стимулированного цикла в зависимости от уровня Р в день введения ХГч не выявили значимых различий в

концентрациях ФСГ, ЛГ, Е2, Р на 2-3-й день после десенситизации ГГЯ системы в группах женщин с нормальным и повышенным Р (таблица 1).

Таблица 1

Гормональные параметры индуцированного цикла в зависимости от

концентрации Р в день введения ХГч

Параметры Исследуемая группа

Р>4,77 нмоль/л (п=44) Р<4,77 нмоль/л (п=249) Р

2-3-й день после десенситизации ГГЯ системы: ФСГ, МЕ/л ЛГ, МЕ/л Е2, пмоль/л Р, нмоль/л 3,6 (2,9-4,2)* 1,9(1,4-2,6) 73 (23,5-101,0) 1,5 (0,9-2,3) 3,3 (2,5-4,2) 1,8 (1,2-2,4) 73 (64,4-91,0) 1,2 (0,8-1,7) 0,265 0,309 0,677 0,384

6-ой день стимуляции: ЛГ, МЕ/л Е2, пмоль/л Р, нмоль/л 1,1 (0,7-2,02) 1132,5 (946-2072,2) 1,7(1,3-2,2) 1,4 (0,8-2,1) 1406 (810-2272) 1,2 (0,8-1,7) 0,403 0,798 0,0001

День введения чХГ: ЛГ, МЕ/л Е2, пмоль/л Р, нмоль/л 1,8(1,2-3,2) 8569 (6565,2-13839,5) 5,8 (4,8-7,0) 1,8(1,1-2,8) 6351 (4402-10285) 2,3 (1,6-3,0) 0,327 0,001 0,0001

* показатели представлены в виде Ме (Ь-Н), где Ме - медиана, Ь - 25 (нижний) квартиль, Н -75 (верхний) квартиль.

В группе пациенток с ПЛ концентрация Р на 6-ой день стимуляции (Ме 1,7 и 1,2 нмоль/л; р=0,0001) и уровни Е2 в день введения триггера овуляции (Ме 8569 и 6351 пмоль/л; р=0,001) были существенно выше, чем в группе с нормальным уровнем преовуляторного Р. Корреляционный анализ показал умеренную положительную взаимосвязь между уровнем Р на 6-ой день стимуляции суперовуляции и аналогичным показателем в день назначения ХГч (г=0,462; р=0,0001), а также между концентрацией Р и Е2 в день введения триггера овуляции (г=0,379; р=0,0001). Полученные результаты позволяют считать повышенные концентрации Р на 6-ой день стимуляции и высокий уровень Е2 в

1В

день введения ХГч предикторами развития ГШ, что согласуется с данными D. Kyrou et al. (2012).

Концентрации ЛГ на 6-ой день стимуляции (Me 1,1 и 1,4 МЕ/л; р=0,403) и в день введения ХГч (Me 1,8 и 1,8 МЕ/л; р=0,327) не имели значимых отличий между группами, что свидетельствует о стойкой десенситизации ГГЯ системы и об отсутствии вклада ЛГ в повышении преовуляторного Р в программе ЭКО (J. Younis, 2001, Е. Bosch, 2003).

Анализ гормональных параметров стимулированного цикла в зависимости от используемого индуктора показал, что концентрации Е2 (Me 1567,5 и 1182 пмоль/л; р=0,0001) и Р (Me 1,5 и 1,2 нмоль/л; р=0,026) на 6-ой день стимуляции были существенно выше в группе с рФСГ по сравнению с показателями группы с ЧМГ. В день введения ХГч в группе пациенток с ЧМГ несмотря на более высокие уровни Е2 (Me 7606 пмоль/л) по сравнению с группой рФСГ (Me 6191 пмоль/л; р=0,040), концентрации Р в этой группе были значительно ниже (Me 2,3 и 2,7 нмоль/л; р=0,002), что свидетельствует о благоприятном воздействии препаратов ЧМГ на гормональные параметры стимулированного цикла и доказывают целесообразность использования для стимуляции суперовуляции препаратов с ЛГ/ХГ активностью (A.N. Andersen et al., 2006, J. Smitz, 2007).

Оценка параметров овариальной стимуляции в зависимости от уровня Р в день введения ХГч показала, что при сопоставимой стартовой дозе гонадотропина и продолжительности стимуляции в обеих группах, суммарная доза индуктора на курс лечения в группе с ГШ была существенно выше (2768,2±140,4 и 2303,2±49,0 ME; р=0,0001), что свидетельствует о необходимости стимуляции умеренными дозами гонадотропинов как профилактической мере развития ПЛ в программе ЭКО.

Анализ параметров оогенеза и раннего эмбриогенеза в зависимости от уровня Р в день введения триггера овуляции показал, что число полученных ооцитов было существенно выше в группе женщин с ГШ (12,9±0,7 и 9,8±0,3; р=0,0001), при этом отмечена умеренная положительная корреляция между концентрацией сывороточного Р в день введения ХГч и количеством полученных ооцитов (г

=0,333; р=0,0001). Число полученных ооцитов было выше в группе с рФСГ (11,8±0,4 и 8,75±0,3; р=0,0001), что объясняет более высокую частоту встречаемости ПЛ в данной группе женщин и подтверждает данные С. УепеИв е1 а1. (2013).

Следует отметить, что частота повышения уровня Р>4,77 нмоль/л напрямую зависела от количества полученных ооцитов и составила при получении <7 ооцитов - 5,7%, 8-14 ооцитов - 14,5%, а при получении > 15 ооцитов достигала 37,5% (р=0,007). Таким образом, число полученных ооцитов является прогностическим фактором развития ПЛ.

Не выявлено различий в количестве зрелых ооцитов (9,8±0,6 и 8,7±0,2; р=0,806), зигот (7,8±0,5 и 7,1±0,2; р=0,205), эмбрионов на стадии дробления (7,05±0,3 и 6,38±0,2;р=0,138) и бластоцист (3,2±0,4 и 4,1±0,2;р=0,203) у пациенток с повышенным и нормальным уровнем Р, что подтверждает отсутствие влияния ПЛ на качество ооцитов и параметры раннего эмбриогенеза.

Анализ основных параметров стимулированного цикла в зависимости от значения соотношения Р/Е2 показал, что в группе женщин с ПЛ (Р/Е2>1) наряду с сопоставимой между группами стартовой дозой индуктора, суммарная доза была значительно выше (2704,4±178,7 и 2338,01±48,7; р=0,025), и отмечалась более продолжительная стимуляция (10,75±0,3 и 10,05±0,08; р=0,050), а также получено меньшее количество ооцитов (7,4б±0,7 и 10,6±0,3; р=0,002).

Выявлена обратная зависимость значения соотношения Р/Е2>1 от количества полученных ооцитов: при получении <7 ооцитов частота ПЛ составила - 22,8%, 814 ооцитов - 8,2%, тогда как, при получении >15 ооцитов соотношение Р/Е2>1 не наблюдалось ни у одной пациентки.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что соотношение Р/Е2>1 отражает низкие уровни Е2, сопутствующие им малое количество полученных ооцитов при высоком значении Р, что является прогностическим маркером развития ПЛ у пациенток с субоптимальным овариальным ответом на стимуляцию.

Результаты сравнительной оценки эффективности программы ЭКО в зависимости от уровня Р в день введения ХГч показали, что частота имплантации (9% и 30%; р<0,05), клинической беременности (16,1% и 42,7%; р=0,005), прогрессирующей беременности (12,9% и 36,8%; р=0,010), родов (12,9% и 31,8%; р=0,011) была существенно ниже у пациенток с ПЛ (таблица 2).

Таблица 2

Частота наступления беременности на перенос эмбрионов у пациенток с

нормальным и повышенным Р в день назначения ХГч

Параметры Исследуемая группа

Р >4,77 нмоль/л (п=31) Р<4,77 моль/л (п=220) Р

Положительный анализ крови на рХГч 5 (16,1%) 108 (49,1%) 0,001

Частота имплантации 9% 30% <0,05

Клиническая беременность 5 (16,1%) 94 (42,7%) 0,005

Прогрессирующая беременность 4 (12,9%) 81 (36,8%) 0,010

Прерывание беременности 1 (3,2%) 13 (5,9%) 0,277

Многоплодная беременность 1 (3,2%) 32 (14,5%) 0,004

Частота родов 4 (12,9%) 70(31,8%) 0,011

Полученные результаты подтверждают негативное влияние ПЛ на исходы циклов ЭКО (М. Kolibianakis, 2011, С. Venetis, 2013)

В работах последних лет обсуждается неблагоприятное влияние овариальной стимуляции в программе ЭКО на имплантационный потенциал эндометрия, что проявляется преждевременной секреторной трансформацией и дискоординацией созревания эндометрия, нарушением рецептивности в «окно имплантации», и как следствие - к неудачам имплантации даже при переносе эмбрионов высокого качества (В. Shapiro, 2011, Е. Labarta, 2011).

В связи с этим, важным этапом нашей работы явилось комплексное изучение состояния эндометрия на основании морфологического, ИГХ, молекулярно —

генетического исследований образцов эндометрия, полученных в день ТВП у пациенток с отменой переноса. На первом этапе проведена оценка рецептивности эндометрия в стимулированном цикле в сравнении со спонтанным независимо от уровня Р в день введения ХГч.

Результаты морфологического исследования эндометрия показали, что при проведении овариальной стимуляции в день аспирации ооцитов секреторная трансформация наблюдалась в 80,5% случаев, у 100% пациенток на поверхностном эпителии выявлялись пиноподии, что сопоставимо с «окном имплантации» спонтанного цикла и является достоверным признаком опережения развития эндометрия в стимулированном цикле. По критериям Noyes эндометрий в день ТВП соответствовал 1б,4±0,4 дню условного 28-дневного цикла, т.е. наблюдалось опережение его развития на 3,1±0,4 дня, что согласуется с результатами Е. Kolibianakis (2002), I. Van Vaerenberg (2009).

При ИГХ исследовании эндометрия выявлена умеренная и высокая экспрессия ПР в железах и в строме эндометрия в день ТВП, что было сопоставимо с аналогичным показателем в «окно имплантации» естественного цикла. Обнаружено снижение экспрессии ЭРа в строме эндометрия в стимулированном цикле, что свидетельствует о раннем открытии «окна имплантации» и согласуется с результатами J; Chai et al. (2011). Экспрессия ЛИФ в день аспирации ооцитов наблюдалась в 75% случаев, при этом на поверхностном эпителии и в строме эндометрия была сопоставима с «окном имплантации» спонтанного цикла, что является достоверным признаком преждевременного созревания эндометрия в стимулированном цикле.

Результаты молекулярно-генетического исследования эндометрия показали, что экспрессия мРНК генов IGF1, PGR, MSX1/HOX7, НОХАЮ, НОХА11, IL8, CD56, CD68 в день ТВП была сопоставима с «окном имплантации» естественного цикла (р>0,05). Вместе с тем, в индуцированном цикле наблюдалась более низкая экспрессия мРНК генов VEGF общий, VEGF 189, ILlb, IL2, LIF, IL15, IL18, TNFa, НВ EGF, IGFBP1 и более высокая - мРНК генов ESR1, LIFR, СОХ2, ММР11 в сравнении с «окном имплантации» естественного цикла (р<0,05). Полученные

данные отражает нарушение рецептивности эндометрия при проведении овариальной стимуляции.

Таким образом, секреторная трансформация эндометрия, обнаружение зрелых пиноподий, снижение экспрессии ЭР в строме, ранняя экспрессия LIF в эпителии и строме, а также экспрессия мРНК генов маркеров имплантации в день аспирации ооцитов, сопоставимая с «окном имплантации» спонтанного цикла свидетельствуют об опережении созревания эндометрия в стимулированных циклах.

Сравнительная оценка состояния эндометрия в цикле ЭКО в зависимости от уровня Р в день введения ХГч показала, что ПЛ потенцирует негативное влияние овариальной стимуляции на эндометрий.

Так, по данным морфологического исследования эндометрия (таблица 3) выявлено, что при развитии ПЛ ни у одной пациентки эндометрий не соответствовал дню цикла, в 93,6 % случаев наблюдалось опережение созревания эндометрия и в 6,3% - отставание. При этом по критериям Noyes эндометрий в день аспирации ооцитов соответствовал 17,6±0,6 дню цикла, т.е. наблюдалось более существенное опережение его развития, чем в группе с нормальным уровнем Р (3,9±0,6 и 2,3±0,3дней; р=0,048 ).

Таблица 3

Датирование эндометрия по критериям Noyes в зависимости от уровня Р в день

введения ХГч

Параметры Р >4,77нмоль/л п—16 Р<4,77нмоль/л п=20 Р

Концентрация Р в день введения триггера овуляции, Me (L-H) 4,9 (4,2-7,7) 2,7 (2,1-3,0) 0,0001

День цикла по критериям Noyes, которому соответствует эндометрий в день ТВП, (М±ш) 17,6±0,6 15,4±0,4 0,023

Опережение развития эндометрия, на дней, (М±т) 3,9±0,6 2,3±0,3 0,048

Зрелые пиноподии в день аспирации ооцитов выявлялись с одинаковой частотой у пациенток с нормальным и повышенным Р (95% и 93,7%; р=0,918), при этом их количество было существенно выше у пациенток с ПЛ (Ме 25 и 15%; р=0,026), что можно расценить как достоверный признак раннего открытия «окна имплантации».

Анализ результатов ИГХ исследования показал, что более выраженная экспрессия ПР как в железах, так и в строме эндометрия наблюдалась при развитии ПЛ, чем при нормальном уровне Р в день введения ХГч. Экспрессия ЭРа не зависела от концентраций Р и была сопоставима между группами. Полученные данные об экспрессии стероидных рецепторов в день ТВП свидетельствуют о смещении «окна имплантации» вперед при повышенных концентрациях Р в день введения триггера овуляции, что согласуется с результатами других исследователей (Е. Papanikolaou et al., 2005, J. Chai et al., 2011). Экспрессия ЛИФ в строме эндометрия зависела от уровня Р в день введения триггера овуляции и была в 2,5 раза выше в группе женщин с концентрацией Р>4,77 нмоль/л, по сравнению с аналогичным показателем в группе с нормальным уровнем Р, что отражает нарушение рецептивности эндометрия при развитии ПЛ.

Результаты молекулярно-генетического исследования показали, что при развитии ПЛ наблюдается менее активная экспрессия мРНК 19 (86,3%) генов и более активная мРНК 3 (13,6%) генов маркеров имплантации. При этом экспрессия мРНК гена TNFa была снижена в 1,4 раза (р=0,042) (рисунок 1).

19(W.Í*«> i шов | ]C1J*CK.\C.\IIW.IIUV М 1.Ч<-Г 1« 1ШЫ

13*1. но*.«», сох:

Е Л»» Z нем

I

Эксгтрсссп* мРНК гене TNFa при >ро«нг Р>4.77 кмаль я екмжгнои 1.4 рам (р- 0.W2)

Рисунок 1. Экспрессия в эндометрии мРНК генов маркеров имплантации в зависимости от уровня Р в день введения ХГч.

В ряде работ показано, что опережение созревания эндометрия более чем на 3 дня (по критериям Noyes) является критическим и негативно влияет на эффективность программы ЭКО (A. Tavaniotou et al., 2001, F. Ubaldi et al.,1997, I. Van Vaerenberg et al., 2011). В связи с этим нами был проведен сравнительный анализ профиля экспрессии мРНК генов маркеров рецептивности в эндометрии при опережении развития эндометрия более (n=l 1) и менее чем на 3 дня (п=25).

Было выявлено, что при опережении развития эндометрия более чем на 3 дня существенно снижается экспрессия мРНК ключевых генов маркеров имплантации: НОХА11 - в 1,8 раз, IGFBP1 - в 5 раз, CD68 - в 1,7 раз (рисунок 2). Экспрессия остальных маркеров рецептивности была сопоставима между группами.

Рисунок 2. Экспрессия мРНК генов маркеров рецептивности при опережении развития эндометрия более и менее чем на 3 дня по критериям Noyes.

Таким образом, оценка эндометрия в день аспирации ооцитов показала, что у пациенток с ПЛ наблюдается опережение созревания эндометрия в среднем на 3,9±0,6 дней, ранняя экспрессия LIF преимущественно в строме эндометрия, умеренная экспрессия ПР в железах и строме, появление зрелых пиноподий более чем на 20% поверхности эпителия, изменение профиля экспрессии мРНК генов маркеров имплантации, что подтверждением нарушения рецептивности эндометрия и прогностическими факторами неудач имплантации в программе ЭКО.

Результаты проведенного исследования показали высокую частоту развития ПЛ в программе ЭКО. Прогностическими факторами повышения уровня Р день введения чХГ являются использование препаратов без ЛГ/ХГ активности, высокая суммарная доза индуктора, более продолжительная стимуляция, повышение уровня Р на 6-ой день стимуляции и концентрации Е2 в день введения триггера овуляции, большое число полученных ооцитов. Выявлено негативное влияние ПЛ на эффективность программы ЭКО в протоколах с аГнРГ. Высокие уровни Р в день введения триггера овуляции не оказывают негативного влияния на параметры оогенеза и раннего эмбриогенеза. ПЛ потенцирует негативное влияние овариальной стимуляции на эндометрий и приводит к нарушению его рецептивности за счет существенного опережения его созревания, более раннего открытия «окна имплантации», что является причиной неудач имплантации в программе ЭКО. На основании результатов исследования разработаны меры предотвращения ПЛ. При констатировании ПЛ показана отмена переноса эмбрионов в лечебном цикле, их криоконсервация для переноса в последующих циклах, что позволит оптимизировать исходы программы ЭКО.

ВЫВОДЫ

1. Преждевременная лютеинизация (уровень Р>4,77 нмоль/л в день введения триггера овуляции, Р/Е2>1) в протоколах с аГнРГ в программе ЭКО достигает 15%, преобладая при стимуляции функции яичников препаратами рФСГ по сравнению с ЧМГ (22,5% и 7,04%; р=0,0001).

2. Факторами риска развития преждевременной лютеинизации являются уровень Р на 6-ой день стимуляции (г=0,462; р=0,0001), концентрации Е2 в день назначения ХГч (г=0,379; р=0,0001) и суммарная доза индуктора овуляции (г=0,211; р=0,0001).

3. Частота преждевременной лютеинизации (уровень Р>4,77 нмоль/л в день введения триггера овуляции) напрямую зависит от ответа яичников на гонадотропную стимуляцию и составляет при субоптимальном - 5,7%, умеренном - 14,5% и чрезмерном ответе - 37,5% соответственно (р=0,007). Соотношение

Р/Е2>1 наиболее объективно отражает ответ яичников на стимуляцию у пациенток с субоптимальным овариальным ответом ( < 7 ооцитов - 22,8%, 8-14 ооцитов - 8,2%; р=0,003).

4. При уровне Р в день введения триггера овуляции >4,77 нмоль/л получено достоверно большее количество ооцитов (12,9±0,7 и 9,8±0,3; р=0,0001), что является прогностическим фактором развития преждевременной лютеинизации.

5. Преждевременная лютеинизация не влияет на параметры оогенеза и эмбриогенеза, что подтверждается сопоставимым числом полученных зрелых ооцитов (9,8±0,6 и 8,7±0,2; р=0,806), зигот (7,8±0,5 и 7,1±0,2; р=0,205), эмбрионов на стадии дробления (7,05±0,3 и 6,38±0,2;р=0,138) и бластоцист (3,2±0,4 и 4,1±0,2;р=0,203).

6. Преждевременная лютеинизация снижает эффективность программы ЭКО, что подтверждается уменьшением частоты имплантации в 3,3 раза (9% и 30%; р=0,001), клинической беременности в 2,6 раз (16,1% и 42,7%; р=0,0001), прогрессирующей беременности в 2,8 раз (12,9% и 36,8%; р=0,010) и частоты родов в 2,5 раза (12,9% и 31,8%; р=0,011).

7. Стимуляция суперовуляции в программе ЭКО приводит к опережению созревания эндометрия, что подтверждается обнаружением в день ТВП секреторной трансформации эндометрия (80,5%), зрелых пиноподий (94,4%), снижением экспрессии ЭРа в строме, ранней экспрессией ЛИФ в эпителии и строме, а также экспрессией мРНК генов маркеров рецептивности (IGF1, PGR, MSX1/HOX7, HOXAIO, НОХА11, IL8, CD56, CD68) сопоставимой с «окном имплантации» естественного цикла.

8. Повышенные концентрации Р в день назначения чХГ приводят к опережению развития эндометрия в день ТВП в среднем на 3,9±0,6 дней, ранней экспрессии ЛИФ в строме, изменению экспрессии ПР, появлению зрелых пиноподий более чем на 20% поверхности эпителия и снижению в 1,4 раза экспрессии мРНК гена TNFa. При опережении развития эндометрия более чем на 3 дня наблюдается уменьшение в 1,8 раз экспрессии мРНК генов рецептивности

Н0ХА11, в 5 раз - ЮРВР1 ив 1,7 раз - СЭ68, что свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия и является неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Необходимо определять сывороточные концентрации Е2 и Р в день назначения овуляторной дозы ХГч при проведении стимуляции суперовуляции в рамках программы ЭКО.

2. У пациенток с предполагаемым субоптимальным ответом на стимуляцию для определения развития ПЛ необходимо использовать соотношение Р/Е2>1

3. У пациенток с предполагаемым умеренным и/или чрезмерным ответом на стимуляцию для определения развития ПЛ достаточно использовать только концентрацию Р, при его пороговом значении >4,77 нмоль/л (1,5 нг/мл).

4. Следует использовать «мягкие» протоколы стимуляции с индивидуальным подбором стартовых доз и длительности введения гонадотропинов, в особенности при использовании препаратов рФСГ и у пациенток с феноменом ПЛ в предыдущих неэффективных программах ЭКО.

5. При выборе гонадотропина для овариальной стимуляции следует включать в схемы стимуляции препараты с ЛГ/ХГ активностью.

6. Обнаружение концентрации сывороточного Р в день назначения чХГ >4,77 нмоль/л (1,5 нг/мл) или значение соотношения Р/Е2>1 свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия и может быть аргументом в пользу отмены переноса и криоконсервации эмбрионов.

На основании полученных данных разработан алгоритм ведения пациенток в программе ЭКО в зависимости от уровня Р в день введения триггера овуляции (рисунок 3).

Выбор типа и стартовой дозы гонадотропииа

~1

препараты с ЛГ/ХГ апувкетые

■ юге*! ■вд-оесг» СТОМЖр* Ч5М1 стопи» ми «►С/ггооа

■«ВОЖГОТВ^чЮ ГГМЙ.ПЦЛ)

АМГ. ОСГ Е2.Р «а 2-3 г^с -1«па

Субоптимальный ответ на стимуляцию

Стимуляция суперовуляции

I

Определение уровня Е2 и Р вдень введения чХГ

Умеренный и чрезмерный ответ на стимуляцию

Перенос эмбрионов

Рисунок 3. Алгоритм ведения пациенток в программе ЭКО в зависимости от

Страт«п>* «(гвегми» -отч«*а переноса »кбргамов. *х фксооерва^кя * псрскх: Б сладующга ЛНГЛХ.

уровня Р в день введения триггера овуляции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Митюрина, Е.В. Преждевременная лютеинизация в программах вспомогательных репродуктивных технологий в протоколах с аналогами гонадотропин-рилизинг гормона / Е.В. Митюрина, С.Г. Перминова, Э.Р. Дуринян //Акушерство и гинекология. -2012. - №8 (2). - С. 16-20.

2. Феномен преждевременной лютеинизации и эффективность программ ВРТ / Е. В. Митюрина, С. Г. Перминова, Э. Р. Дуринян, А.Н. Абубакиров // Репродуктивные технологии сегодня и завтра : материалы XXIII международной конференции РАРЧ. - Волгоград, 2013. - С. 43-44.

3. Роль повышения уровня сывороточного прогестерона в день введения триггера овуляции в длинных протоколах программ ВРТ / С. Г. Перминова, Е. В. Митюрина, Э. Р. Дуринян // Мать и дитя: материалы XIV Всероссийского научного форума. - Москва, 2013. - С. 543-544.

4. Современные подходы к ведению лютеиновой фазы в программе экстракорпорального оплодотворения / Е.М. Галлямова, С.Г. Перминова, Э.Р. Дуринян, Е.В. Митюрина // Акушерство и гинекология. - 2014. - №1. - С. 15-22.

5. Рецептивность эндометрия в программе экстракорпорального оплодотворения / Е.В. Митюрина, С.Г. Перминова, Т.А. Демура, Е.М. Галлямова //Акушерство и гинекология.-2014. -№2.-С. 14-20.

6. Влияние повышенных концентраций прогестерона в день введения триггера овуляции на исходы циклов ЭКО в протоколах с агонистами ГнРГ/ Е.В. Митюрина, С.Г. Перминова, Э.Р. Дуринян, Т.Ю. Иванец, А.Н. Абубакиров // Акушерство и гинекология. - 2014. - № 6. - С. 53-59.

7. Влияние овариальной стимуляции и уровня прогестерона в день введения триггера овуляции на морфофункциональное состояние эндометрия в программе ЭКО / Е. В. Митюрина, С. Г. Перминова, Т. А. Демура, А. Н. Абубакиров // Репродуктивные технологии сегодня и завтра : материалы XXIV международной конференции РАРЧ. — Ярославль, 2014. - С. 20-22.

8. Морфофункциональное состояние эндометрия в стимулированных циклах программы экстракорпорального оплодотворения / Е.В. Митюрина, С.Г.

Перминова, Т.А. Демура, Е.М. Галлямова // Акушерство и гинекология. - 2014. -№11.-С. 80-87.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

аГнРГ - агонист гонадотропин - рилизинг гормона

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ГГЯ система - гипоталамо - гипофизарно — яичниковая система

ГнРГ - гонадотропин - рилизинг гормон

Е2 - эстрадиол

ИГХ исследование — иммуногистохимическое исследование JIT - лютеинизирующий гормон Me - медиана

ГШ - преждевременная лютеинизация ПР - прогестероновые рецепторы

рФСГ — рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон

ТВП - трансвагинальная пункция

ФСГ — фолликулостимулирующий гормон

ХГч — хорионический гонадотропин человека

ЧМГ — человеческий менопаузальный гонадотропин

ЭКО и ПЭ - экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов

ЭРа - эстрогеновые рецепторы

СОХ2 - циклооксигеназа

ESR1 — ген эстрогеновых рецепторов

IGF1 — инсулиноподобный фактор роста 1

IGFBP1 - инсулиноподобный фактор роста связывающий белок 1 IL - интерлейкин

НВ EGF — гепарин - связывающий фактор роста

НОХАЮ, НОХА11, MSX1/ НОХ7 - гены гомеобокса

LIF - лейкемия - ингибирующий фактор

LIFR - рецептор лейкемия - ингибирующего фактора

ММР - матриксная металопротеиназа

Р — прогестерон

PGR — ген прогестероновых рецепторов

TNFa - фактор некроза опухоли

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

Подписано в печать 17.03 2015 г. Формат 60x84/16. Объем 1,0 печ. л. Тираж 120 экз. Заказ 9938.

Издательство «Тровант» J1P 071961 or01.09.1999 г.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства «Тровант». 142191, г. Москва, г. Троицк, м-н «В», д. 52.

Тел. (495) 775-43-35, 8 (495) 851-09-67 E-mail: trovanKftHrtk ru. httpv'.'www.trovant ru/