Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Роль ангиогенных и провоспалительных факторов в развитии наружного генитального эндометриоза

я

на правах р/укописи

КОНДРАТЬЕВА Полина Георгиевна

РОЛЬ АНГИОГЕННЫХ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА

14.01.01 - акушерство и гинекология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2010

004601518

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учереждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Федерального агенства по образованию и в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-западного отделения РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ниаурн Дарнко Александровна доктор медицинских наук, профессор Сельков Сергей Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гайдуков Сергей Николаевич доктор медицинских наук, профессор Шабашова Надежда Венедиктовна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ

Защита диссертации состоится « » -¿-^¿^v* 2010 г. в -¿5 часов на заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН.

Автореферат разослан « у> 2010 ]

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук

Кузьминых Татьяна Ульяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) является распространенным заболеванием, частота которого достигает 50% среди женщин репродуктивного возраста. В 30-60% случаев заболевание сочетается с бесплодием (Давыдов А.И. и соавт., 2003, Адамян Л.В. и соавт., 2006, Ищенко А.И. и соавт., 2008). Клинические симптомы НГЭ часто рассматриваются специалистами как проявления воспалительных заболеваний органов малого таза и являются поводом к необоснованному назначению антибактериальной терапии, физиотерапевтического лечения, нередко провоцирующего прогрессирование основного заболевания.

В то же время, морфологические проявления НГЭ, по мнению ряда авторов, позволяют относить эндометриоз к категории опухолевых процессов (Gazvani R. et.al., 2002; McCarty M.F. et al., 2003; Brack S.S. et al., 2004). Ha фоне наружного генитального эндометриоза неоплазии развиваются в 1124% случаев (Баскаков В.П. и соавт., 2001; Ness R.B. et al., 2000). В связи с этим при интраоперационном выявлении эндометриом яичников объем оперативного вмешательства нередко расширяется, в том числе и у женщин репродуктивного'возраста. Кроме того, используемые комплексные схемы лечения НГЭ ожидаемый терапевтический эффект оказывают не всегда.

Большое количество работ посвящено изучению патогенеза наружного генитального эндометриоза, однако причины имплантации ткани эндометрия за пределами его обычной локализации, на брюшине органов малого таза, до конца не ясны. При этом гетеротопичные клетки не подвергаются элиминации, а, напротив, становятся активными и проявляют повышенную способность к пролиферации,- имплантации в брюшной полости и образованию эндометриоидных гетеротопий (Савицкий Г.А., 1997; Donnez J. et al., 1998; Tailor R.N. et al., 2002; Groothuis P.G. et al., 2005).

Брюшная полость не является нейтральной средой и в ответ на внедрение гетеротопичных клеток возникает местная реакция брюшины,

которая носит преимущественно неспецифический воспалительный характер. Большое влияние на эти процессы оказывают ростовые факторы и факторы воспаления в перитонеальной жидкости. Вокруг гетеротопий обнаружено достоверное увеличение числа тканевых базофилов (Алиханова З.М., 1991), повышение активности нейтрофилов и макрофагов (Lin Y.J. et al., 2006), что приводит к стимуляции воспалительной реакции и ангиогенеза на ранних стадиях развития НГЭ. Хемокины, цитокины и факторы роста, продуцируемые эндометриальными, мезенхимальными и эндотелиальными клетками, играют важную роль в физиологии и патологии женской репродуктивной системы. Они оказывают влияние на процессы ангиогенеза, апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток в эндометрии (Koninckx P.R. et al., 1998; Groothuis P.G. et al., 2005, Lashke M.V. et al., 2007). Однако динамика локальной продукции данных факторов при эндометриозе до конца не изучена, их определение очевидно актуально для оценки прогноза заболевания и его рецидивов, а также для выработки стратегии эффективного лечения пациенток с НГЭ.

Цель настоящей работы состояла в оценке роли факторов ангиогенеза, провоспалительных цитокинов и хемокинов в развитии и прогрессировании наружного генитального эндометриоза.

В соответствии с указанной целью были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Оценить содержание проангиогенных факторов VEGF, FGF и ангиогенина в перитонеальной жидкости и сопоставить с экспрессией этих факторов в ткани эндометриоидных гетеротопий у больных НГЭ различной степени тяжести.

2. Определить уровень хемокинов RANTES, IL-8, MIG, МСР-1, IP-10 в перитонеальной жидкости и уточнить особенности экспрессии этих факторов в ткани эндометриоидных гетеротопий у больных НГЭ различной степени тяжести.

3. Оценить содержание провоспалительных факторов Т№а, И^у, 1Ь-6 и 1Ь-4 и противовоспалительного цитокина 1Ь-10 в перитонеалыюй жидкости больных НГЭ различной степени тяжести.

4. Провести иммуногистохимический анализ и охарактеризовать особенности экспрессии ангиогенных факторов УЕвР и РвЕ в эндометриоидных гетеротопиях.

5. Сопоставить особенности клинических проявлений заболевания с характером продукции провоспалительных и ангиогенных факторов в перитонеальной жидкости и морфологическим строением гетеротопий у женщин с НГЭ.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые проведена комплексная оценка экспрессии проангиогенных и антиангиогенных, провоспалительных и противовоспалительных факторов в перитонеальной жидкости и эндометриоидных гетеротопиях больных НГЭ различной степени тяжести.

Обнаружено нарушение баланса ангиогенных и провоспалительных факторов в перитонеальной жидкости больных НГЭ в соответствии со степенью тяжести течения заболевания.

Установлено, что ведущий ангиогенный фактор УЕвР при НГЭ стимулирует ангиогенез на системном и локальном уровнях, в то время как РвР действует локально, непосредственно в эндометриоидном очаге.

Ангиогенный потенциал «красных» эндометриоидных гетеротопий выражен сильнее, чем в перитонеальной жидкости больных НГЭ и характеризуется высоким содержанием изученных ангиогенных факторов. Выявлены особенности распределения ангиогенных факторов непосредственно в ткани эндометриоидных гетеротопий.

Практическая значимость работы

Перитонеальная жидкость является важным объектом исследования для оценки ангиогенных, провоспалительных факторов, а также маркеров развития соединительной ткани, что может быть использовано для раннего

прогнозирования рецидивов наружного генитального эндометриоза и развития спаечной болезни, а также для подбора селективной иммуномодулирующей терапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. У больных НГЭ в перитонеальной жидкости и эндометриоидных гетеротопиях имеет место изменение баланса ангиогенных, провоспалительных, антиангиогенных и противовоспалительных факторов соответственно тяжести течения заболевания, их последовательное взаимодействие определяет развитие, прогрессирование и рецидивирование НГЭ.

2. Уровень ангиогенного и провоспалительного потенциала перитонеальной жидкости больных НГЭ коррелирует со степенью тяжести заболевания, антиангиогенный и противовоспалительный потенциал в исследуемой жидкости значительно снижен.

3. В перитонеальной жидкости больных НГЭ уровень изученных хемокинов ЫАМТЕБ, 1Ь-8, МЮ, МСР-1, 1Р-10 достоверно выше, чем у здоровых женщин. Содержание хемокинов в перитонеальной жидкости и эндометриоидных гетеротопиях зависит от степени тяжести наружного генитального эндометриоза и коррелирует с клиническими проявлениями НГЭ.

4. При НГЭ УЕОР обладает системным действием, отвечая за экспансию сосудистой сети в объеме гетеротопии, а РвР является локальным активатором неоангиогенеза и присутствует в значимых концентрациях непосредственно в эндометриоидных очагах.

Апробация и внедрение результатов работы в практику. Работа выполнена в гинекологическом отделении с операционным блоком (руководитель отделения - д.м.н., проф. В.Ф. Беженарь), в отделении гинекологической эндокринологии (руководитель отдела эндокринологии репродукции - з.д.н. РФ, проф. В.В. Потин), в лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД (зав. лаборатории - д.м.н., проф. С.А.

Сельков) и патологоанатомическом отделении (руководитель отделения -з.д.н. РФ., проф. И.М. Кветной) НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Результаты работы доложены на X и XII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в 2006 и 2009 году. Результаты работы внедрены в лечебно-диагностическую практику гинекологического отделения с операционным блоком и научно-поликлинического отделения, лаборатории иммунологии НИИАГ имени Д.О. Отта СЗО РАМН, отделения гинекологии городской больницы № 17, используются в учебном курсе для студентов V, VI курса и слушателей постдипломного образования кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии медицинского факультета СПбГУ. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками. В библиографический указатель включено 218 наименований, из них 34 работы принадлежит отечественным авторам, 184 - зарубежным.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Проведено обследование 51 женщины с НГЭ различной степени тяжести, находившейся на лечении в гинекологическом отделении с операционным блоком и в отделении гинекологической эндокринологии НИИАГ за период с 2004 по 2007 год. В исследование не включались женщины с сопутствующими пролиферативными заболеваниями (миомой матки, гиперпластическими процессами в эндометрии), воспалительными

процессами органов малого таза, а также женщины, получавшие гормональную терапию в течение шести месяцев до операции.

Обследование включало изучение клинико-анамнестичеких и клинико-лабораторных данных, показателей эхографии, проводилось бактериоскопическое, бактериологическое обследование, эндоскопическое обследование (лапароскопия и гистероскопия).

Степень тяжести НГЭ определялась в соответствии с пересмотренной в 1996 году классификацией Американского Общества Фертильности (RAFS).

Болевой синдром оценивали в баллах (0-2балла - слабо выражен, 3-5 баллов - умеренно выражен, 5- 9 баллов - выраженный болевой синдром) по MacLaverty,1983.

Выраженность спаечного процесса оценивали с помощью классификации Американского общества фертильности (RAFS) с учетом проходимости маточных труб.

В контрольную группу вошли 24 пациентки, обратившиеся для проведения диагностической лапароскопии в рамках планирования беременности с двухфазным менструальным циклом, у которых при проведении лапароскопии не было выявлено пролиферативных и воспалительных изменений органов малого таза.

Лапароскопическое и гистероскопическое обследование проводили с помощью оборудования фирмы "KARL STORZ" (Германия), «Аксиома» (СПб). Во время лапароскопии проводили тщательный осмотр брюшной полости и органов малого таза, производили забор перитонеальной жидкости для иммунологического исследования. Культивирование и гистологическое исследование проводили на «красных» эндометриоидных гетеротопиях как наиболее активных в отношении ангиогенеза (Nisolle М., et al., 1993, McLaren J., 2000, Khan K.N., et al., 2004).

Полученные образцы перитонеальной жидкости хранили до цитофлуориметрического анализа концентрации цитокинов при -20°С. Образцы «красных» очагов эндометриоза культивировали в лунках

плоскодонного 24-луночного планшета («Sarstedt», Австрия) в инкубаторе во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 24 часов в среде DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («ICN», США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина, 2 мл L-глютамина, HAT («ICN», США). После культивирования эксплантов собирали надосадочные жидкости и хранили до цитофлуориметрического анализа концентрации цитокинов при -20°С. Образцы «красных» очагов эндометриоза после культивирования взвешивали, фиксировали раствором формалина, после чего проводили морфологическое описание и иммуногистохимический анализ.

В полученном материале (перитонеальная и надосадочная жидкость) определяли содержание проангиогенных факторов VEGF, FGF, ангиогенина, хемокинов RANTES, IL-8, MIG, МСР-1, IP-10. В перитонеальной жидкости определяли также содержание провоспалительных факторов TNF а, IFNy, IL-6 и IL-4 и противовоспалительного цитокина IL-10. Для определения изучаемых факторов использовался метод мультиплексного анализа с помощью проточной цитофлуориметрии с применением стандартных тест-систем BD Cytometric Bead Array (BD, США) и проточный цитофлюориметр FACStrack (BD, США). Технология BD Cytometric Bead Array (СВА) позволяет достаточно точно обнаруживать даже небольшое количество различных биологически активных веществ в одном образце биологической жидкости объемом 50 мкл. Это черезвычайно важно для сопоставления биологических эффектов цитокинов, обладающих как синергичным, так и оппозитным действием. Исследования проведены в лаборатории иммунологии с группой диагностики СПИД НИИАГ имени Д.О. Отга СЗО РАМН.

Для оценки экспрессии ангиогенных факторв VEGF и bFGF в ткани эндометриоидных гетеротопий проводили иммуногистохимический анализ с использованием моноклональных мышиных антител VEGF (1:50, BD Biosciences), FGF (1:50, BD Biosciences). В качестве вторых антител

использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra). Использовали одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 M цитратном буфере рН 7.6. Морфометрическое исследование эндометриоидных гетеротопий проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0». Исследования проведены в лаборатории патологоанатомического отделения НИИАГ имени Д.О. Orra СЗО РАМН.

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере в среде MS Windows 2000 с использованием приложений Statistica v6.0, MS Accès 2000, MS Exel 2000.

Результаты исследования Клиническая характеристика обследованных женщин Обследована 51 пациентка с НГЭ различной степени тяжести. Средний возраст больных составил 30,1±1,9 лет. Диагноз и степень тяжести НГЭ верифицированы при лапароскопическом обследовании и подтверждены результатами гистологического исследования. I степень тяжести НГЭ определена у 14 больных (27,4%), II степень тяжести - у 15 больных (29,4%), III степень тяжести, как и IV степень тяжести верифицированы у 11 больных (21,6%).

Длительность заболевания варьировала от 5 месяцев до 11 лет, и коррелировала со степенью тяжести заболевания (г=0,97, р<0,05).

Среди обследованных женщин 24 пациентки (47%) страдали первичным бесплодием, и у 20 больных (39%) было диагностировано вторичное бесплодие.

При анализе менструальной функции выявлено: средний возраст наступления менархе составил 13,2±0,2 года, регулярный менструальный цикл отмечался у 27 больных НГЭ (53%), у 24 больных НГЭ (47%) имели место нарушения менструального цикла. Ановуляторные менструальные циклы были отмечены у 28 больных НГЭ и чаще встречались у больных с НГЭ ПНУ степени тяжести. Жалобы на олигоменорею предъявляли 9 больных НГЭ 1-П степени тяжести и б больных с НГЭ ПЫУстепени тяжести, гиперполименорея и ациклические кровотечения в основном наблюдались в группе больных с ПНУ степенью тяжести НГЭ.

При анализе болевого синдрома (МасЬауейу, 1983) установлено, что болевой синдром отсутствовал или был слабо выражен у 16 пациенток с НГЭ 1-П степени тяжести и у 4 больных с ПНУ степенью тяжести НГЭ. Выраженный болевой синдром был более характерен для больных НГЭ ПНУ степени тяжести по сравнению с больными НГЭ 1-П степени тяжести (Р<0,01).

Результаты анализа анамнестических данных не показали достоверных различий между акушерским анамнезом больных НГЭ и женщин контрольной группы. У 17 пациенток с НГЭ в анамнезе были роды (85%). В 17,2% случаев беременность протекала с осложнениями (преимущественно угроза прерывания беременности на различных сроках). Медицинский аборт был отмечен в анамнезе у 16 больных НГЭ, самопроизвольный аборт - у 6 больных НГЭ, неразвивающаяся беременность - у 5 больных НГЭ.

Среди обследованных пациенток с НГЭ экстрагенитальная патология отмечалась у 30 (58,8%) больных. В контрольной группе частота экстрагенитальных заболеваний составила 29,2%, что достоверно ниже по сравнению с группой больных НГЭ (р<0,01).

При проведении лапароскопического обследования обращали внимание на анатомические особенности органов малого таза, локализацию и распространенность эндометриоидных очагов, выраженность спаечного процесса.

Степень выраженности спаечного процесса коррелировала со степенью тяжести НГЭ (коэффициент корреляции г=0,94, р<0,05), наиболее выраженный спаечный процесс встречался достоверно чаще (р<0,01) в группе больных НГЭ Ш-1У степени тяжести по сравнению с 1-П степенью тяжести заболевания.

При визуальной оценке очагов эндометриоза наиболее частой локализацией были брюшина крестцово-маточных связок (80,4%), брюшина пузырно-маточного пространства (84,3%), брюшина прямокишечно-маточного пространства (74,5%). У 21 пациентки эндометриоидные гетеротопии локализовались на брюшине широких маточных связок, у 22 пациенток выявлены поверхностные повреждения яичников, и у 19 пациенток диагностированы эндометриоидные кисты яичников.

Патологические изменения брюшины малого таза при НГЭ характеризовались многообразием морфологических проявлений. Были отмечены пятнистые, поверхностные везикулезные и глубокие инфильтративные эндометриоидные очаги. Встречались очаги красного, белого, черного цвета, рубцовая ткань с пигментацией или без нее. Размеры поверхностных эндометриоидных гетеротопий варьировали от 1 до 5 мм в диаметре. Были отмечены и более обширные поражения с инвазивным ростом в подбрюшинную клетчатку. При НГЭ 1-И степени тяжести чаще встречались очаги красного или белесоватого цвета небольшого диаметра. Для пациенток с НГЭ И1-1У степени тяжести были характерны множественные поражения брюшины органов малого таза, наряду с красными очагами чаще встречались рубцовые изменения брюшины, более обширные инфильтративные изменения.

Содержание ангиогенных факторов в перитонеальной жидкости больных НГЭ и надосадочной жидкости, полученной после культивирования «красных» эндометриоидных гетеротопий

При оценке содержания ангиогенных факторов в перитонеальной жидкости и эндометриоидных гетеротопиях больных НГЭ установлено, что в перитонеальной жидкости больных НГЭ Ш-1У степени тяжести концентрация УЕОБ была в 2,4 раза выше, чем при 1-И степени тяжести НГЭ и в 6,5 раз выше, чем в группе контроля (табл. 1). В надосадочной жидкости, полученной после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетеротопий, обнаружен высокий уровень продукции УЕвР (табл. 1). Полученные нами данные в отношении динамики продукции данного фактора позволяют говорить об активном участии УЕСР в патогенезе НГЭ, а также превалировании процессов ангаогенеза на ранних этапах развития заболевания.

При исследовании концентрации ЬРСР в перитонеальной жидкости больных НГЭ не обнаружено значимого количества данного фактора. При оценке концентрации ЬБОР в надосадочной жидкости, полученной после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетеротопий, концентрация его составила 432,9±59,9 пг/мл. Таким образом, участие ЬРвР в патогенезе эндометриоза не вызывает сомнений, но реализуется преимущественно на локальном уровне.

При исследовании уровня ангиогенина даже небольшое количество наблюдений показало высокое его содержание (21378,8±1199,0 пг/мл) в перитонеальной жидкости больных НГЭ (табл. 1) по сравнению с контрольной группой (р<0,001). Полученные данные свидетельствуют о наличии высокой концентрации ангиогенина и в эндометриоидных гетеротопиях (29247,4± 1882,7 пг/мл). Рассмотренные выше факторы в совокупности обеспечивают мощный ангиогенный потенциал перитонеальной жидкости больных НГЭ, что может оказывать индуцирующее действие на ангиогенез и развитие НГЭ.

Таблица 1

Содержание ангиогенных факторов в перитонеапьной и надосадочной жидкости, полученной после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетеротопий больных НГЭ различной степени тяжести

фактор роста Контрольная группа (перитонеальная жидкость) М±ш (пг/мл) [1] Перитонеальная жидкость больных НГЭ М±т (пг/мл) [2] Надосадочная жидкость М±т (пг/мл) [3]

VEGF 207,0±14,0 (п=24) р***м 867,6±148,2 (п=42) р***2.3 1705,±299,6 (п=16)

Ангиогенин 9950,3±2385,9 (п=10) р***,.2 21378,8±1199,0 (п=10) р***2.з 29247,4± 1882,7 (п=1 б)

FGF Не обнаружено значимого количества 432,9±59,9 (п=16)

р***. <0,001

Содержание хемокинов перитонеапьной жидкости больных НГЭ и надосадочной жидкости, полученной после культивирования «красных» эндометриоидных гетеротопий

Хемокины играют важную роль в иммунологических процессах, привлекая в патологический очаг различные иммунокомпетентные клетки. При анализе содержания хемокинов в перитонеальной и надосадочной жидкости больных НГЭ было выявлено: в перитонеальной жидкости больных НГЭ уровень ИАЖЕБ превышал таковой в группе контроля (9,9±0,8 пг/мл и 4,1±1,6 пг/мл соответственно) и был выше при НГЭ 1-П степени тяжести по сравнению с НГЭ Ш-1У степени тяжести (13,2±1,1 пг/мл и 6,6±0,6 пг/мл, р<0,001). КАОТЕБ является хемоаттрактантом для моноцитов, лимфоцитов, ЫК-клеток и базофилов; увеличивает адгезию к эндотелию сосудов и способствует миграции лейкоцитов в очаг воспаления. Полученные данные относительно высоких значений КАОТЕБ при начальных стадиях заболевания могут указывать на усиление пролиферативного потенциала, что, возможно, необходимо для инициации эндометриоза, а снижение содержания данного фактора при прогрессировании НГЭ может свидетельствовать о переключении процессов

синтеза цитокинов в результате этапности развития заболевания, В литературе имеются данные о том, что рассматриваемый хемокин обеспечивает противоопухолевую защиту путем усиления активации и пролиферации NK-клеток. Концентрация RANTES в надосадочной жидкости, полученной после культивирования эндометриоидных гетеротопий, составила 5,5±0,9 пг/мл, что почти в 2 раза меньше аналогичного показателя в перитонеальной жидкости больных НГЭ (табл. 2). Полученные данные могут свидетельствовать о снижении антипролиферативного потенциала в эндометриоидных имплантах, что обеспечивает их жизнеспособность и распространение патологического процесса на брюшине органов малого таза.

Содержание МСР-1 в перитонеальной жидкости было выше при III-IV степени тяжести заболевания, чем при I-II степени тяжести НГЭ и в группе контроля (863,1±79,6 пг/мл, 294,3±39,5 пг/мл и 138,0±11,4 пг/мл соответственно, р<0,001). В надосадочной жидкости, полученной после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетеротопий концентрация МСР-1 была в 2 раза больше, чем в перитонеальной жидкости больных НГЭ (табл. 2). МСР-1 является хемоаттрактантом для моноцитов и макрофагов, обеспечивает их миграцию из кровеносного русла в очаг воспаления и, как следствие, приводит к развитию фиброза. Исходя из полученных нами данных, особенность продукции MCP-1 отражает участие данного фактора в локальной регуляции процессов, происходящих при НГЭ, в частности, адгезии эндометриоидных имплантов на брюшине малого таза. У больных НГЭ с выраженным спаечным процессом в области органов малого таза содержание данного хемокина в перитонеальной жидкости достоверно превышало аналогичные показатели перитонеальной жидкости больных НГЭ без спаечного процесса (1046,47±170,18 пг/мл и 267,55±79,2 пг/мл, р<0,01).

MIG является хемоаттрактантом для активированных Т-лимфоцитов, привлекая их в очаг воспаления, принимает активное участие в формировании фиброзных изменений. В перитонеальной жидкости больных

НГЭ III-IV степени тяжести концентрация MIG была в 2,5 раза выше, чем в контрольной группе (2932,1±3бб,8 пг/мл и 1133,4±132,5 пг/мл соответственно, р<0,001). При I-II степени тяжести НГЭ концентрация MIG (1708,4±78,8 пг/мл) превышала значения контрольной группы в 1,5 раза (р<0,05), но была ниже, чем при III-IV степени НГЭ (2932,1±366,8 пг/мл; р<0,01). Максимальные значения данного хемокина регистрировались у больных с НГЭ в сочетании с выраженным спаечным процессом. Концентрация MIG в надосадочной жидкости, полученной после культивирования «красных» эндометриоидных гетеротопий достаточно высока (1316,5±170,6 пг/мл), однако данный показатель в перитонеальной жидкости больных НГЭ более чем в 2 раза выше (р<0,001) ( табл. 2). В литературе имеются данные об антиангиогенных свойствах MIG (Lasagni et al., 2003). Результаты нашего исследования скорее могут говорить о преимущественной роли MIG в развитии воспаления и фиброза, нежели об участии его в инициации ангиогенеза и формировании гетеротопий.

Изучено содержание в перитонеальной жидкости больных НГЭ хемокина 1Р-10, обладающего помимо провоспалительного эффекта, выраженным антиангиогенным действием. Отмечено достоверное (р<0,05) увеличение концентрации IP-10 в перитонеальной жидкости больных НГЭ при 1-11 степени тяжести заболевания по сравнению со здоровыми. При прогрессировании заболевания (III-IV степень тяжести) концентрация IP-10 в перитонеальной жидкости больных НГЭ увеличивалась в 3 раза по сравнению с контролем (р<0,01).

Динамика изменения концентрации IP-10, MIG и МСР-1 отражает нарастание процессов воспаления и угнетение ангиогенеза при эндометриозе III-IV степени тяжести. Эти особенности соответствуют и морфологическим данным, свидетельствующим о снижении интенсивности ангиогенеза и нарастании процессов склерозирования гетеротопий у пациенток с эндометриозм III-IV степени тяжести.

В надосадочной жидкости, полученной после культивирования эндометриоидных гетеротопий, концентрация антиангиогенного хемокина IP-10 была минимальна по сравнению с аналогичным показателем в перитонеальной жидкости больных НГЭ (табл. 2).

IL-8, являясь провоспалительным фактором и фактором, принимающим участие в аншогенезе, был обнаружен в наиболее высоких концентрациях в перитонеальной жидкости больных НГЭ III-IV степени тяжести (39,7±4,4 пг/мл). Были выявлены достоверные отличия между уровнем данного хемокина в группе контроля и при 1-Й степени тяжести НГЭ (16,9±1,2 пг/мл и 24,0±3,1пг/мл соответственно, р<0,05).

Содержание IL-8 в надосадочной жидкости, полученной после культивирования «красных» эндометриоидных гетеротопий, было более чем в 800 раз выше, по сравнению с перитонеальной жидкостью (табл. 2), что может свидетельствовать о высоком ангиогенном и пролиферативном потенциале эктопических имплантов. При наличии спаечного процесса в малом тазу у больных НГЭ уровень IL-8 в перитонеальной жидкости достоверно выше, чем в перитонеальной жидкости больных НГЭ без спаечного процесса (22,5±3,55 пг/мл и 10,96±1,42 пг/мл соответственно, р=0,008).

Таблица 2

Содержание хемокинов в перитонеальной и надосадочной жидкости, полученной после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетеротопий больных НГЭ

различной степени тяжести

Хемокины Контрольная группа М±ш (пг/мл) (п=24) [1] Перитонеадьная жидкость больных НГЭ М±т (пг/мл) (п=40) [2] Надосадочная жидкость М±ш (пг/мл) (п=16) [3]

RANTES 4,1±1,6 Р***1-г 9,9±0,8 Р***2-3 5,5±0,9

МСР-1 138,0±11,4 Р***1-2 578,7±59,5 P***2-S 1361,5±145,9

MIG 1133,4±Щ5 Р***,-2 2320,2±276,1 Р***2.3 1316,5±170,6

IL-8 16,9±1,2 Р***,-2 31,8±3,7 Р**%3 25524,5±1710,1

IP-10 3013,0±331,1 Р**,-2 7040,8± 1233,7 Р***2-3 22,6±5,5

р**-<0,01,р***-<0,001

Таким образом, хемокины, принимающие участие преимущественно в регуляции ангиогенеза (ПАМТЕБ), в наибольших концентрациях обнаруживались при 1-Н степени тяжести НГЭ, и концентрация их снижалась при прогрессировании (Ш-1У степень тяжести) патологического процесса. Концентрации хемокинов, принимающих активное участие в большей степени в процессах воспаления и фиброза, чем ангиогенеза (МСР-1, МЮ, 1Ь-8), коррелировали со степенью тяжести НГЭ и достигали максимальных значений при Ш-1У степени тяжести заболевания.

Содержание провоспалительных цитокинов в перитонеалъной

жидкости больных НГЭ

Проведенные исследования содержания провоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости больных НГЭ показали, что уровень 11-4 в перитонеальной жидкости был более чем в 2 раза выше при ННУ степени тяжести НГЭ по сравнению с 1-П степенью тяжести заболевания и контрольной группой (табл. 3). Такая динамика продукции 1Ь-4 может указывать на преимущественную активацию гуморального иммунного ответа при ПНУ степени тяжести НГЭ.

При исследовании уровня 1Ь-6 в перитонеальной жидкости было обнаружено высокое его содержание при ПНУ степени тяжести НГЭ, достоверно превышающее (р<0,01) уровень 1Ь-б в перитонеальной жидкости больных НГЭ 1-П степени тяжести и в контрольной группе (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют об увеличении активности воспалительного процесса при ПНУ стадии НГЭ.

В перитонеальной жидкости больных НГЭ 1-И степени тяжести концентрация Т№а была выше, чем в перитонеальной жидкости больных НГЭ ПНУ степени тяжести (табл. 3). Ввиду малой выборки (данный фактор определяли у 10 больных НГЭ) можно говорить о тенденции к повышенному содержанию ТЫРа в перитонеальной жидкости больных с начальными проявлениями НГЭ.

ШЫу в проведенном исследовании не обнаружен в перитонеальной жидкости больных НГЭ. Возможно, данный фактор не принимает активного участия в изменениях, происходящих при НГЭ.

Таблица 3

Содержание провоспалительных факторов в перитонеальной жидкости больных НГЭ различной степени тяжести и контрольной группы

Цитокины Контрольная группа М±т (пг/мл) [1] НГЭ 1-Й ст.тяжесги М±ш (пг/мл) [2] НГЭ ПМУст.тяжести М±ш (пг/мл) [3]

IL-4 11,6±1,3 (п=12) Р* * 1-2 Р***1-3 17,7±1,3 (п=18) Р***2-3 40,5±3,6 (п=18)

IL-6 45,5±8,3 (п=12) Р***,-2 Р**1-3 114,9±19,2 (п=18) Р**2-3 710,1±204,8 (п=18)

TNFa Не обнаружено значимого количества 27,8±3,1 (п=4) Р*2-3 9,4±5,1 (п=6)

IFNy Не обнаружено значимого количества

р*<0,05, р**<0,01, р***<0,001

При исследовании содержания противовоспалительного цитокина ILIO не было обнаружено значимого уровня его в перитонеальной жидкости больных НГЭ, что может быть связано с высоким ангиогенным потенциалом при I-II степени тяжести заболевания и выраженностью фиброза при III-IV степени тяжести, а также с нарушением баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, приводящего к неконтролируемому развитию воспаления при НГЭ.

Проведенные нами исследования показали, что для НГЭ характерна определенная последовательность изменений, происходящих как на системном, так и на локальном уровне. При попадании эндометриоидных имплантов в брюшную полость, хемокины перитонеальной жидкости и брюшины индуцируют выработку ангиогенных и провоспалительных факторов иммунокомпетентными клетками, в результате чего нарушается баланс между ангиогенными и антиангиогенными, провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Эти нарушения способствуют развитию воспаления с исходом в фиброзирование на локальном уровне

непосредственно в местах локализации эндометриоидных гетеротопий, распространению патологического процесса, т.е. прогрессированию НГЭ, что соответствует клинической картине при данном заболевании.

Данные морфологического и иммуногистохимического исследования «красных» эндометриоидных гетеротопий

Для оценки роли различных клеточных популяций эндометриоидных гетеротопий в развитии эндометриоза проведен анализ микроструктуры 42 эндометриоидных гетеротопий. Выявлены единичные железы с явными признаками кистозной дилятации. В большинстве микропрепаратов в цитогенной строме были выявлены мелкоочаговые инфильтраты, состоящие из лимфоцитов, макрофагов и, в меньшем количестве, нейтрофилов и гистиоцитов. Инфильтраты были расположены по ходу сосудов периваскулярно. В то же время в цитогенной строме очагов эндометриоза наблюдались процессы фиброзирования и васкуляризации без признаков воспалительной реакции. В соединительнотканной основе брюшины, прилегающей к очагам эндометриоза, определялись признаки отечности ткани на фоне полнокровия капилляров.

При проведении имуногистохимического анализа установлено, что соотношение площади, занимаемой ЬРОР-позитивными клетками, к площади, занимаемой УЕОР-позитивными клетками, в эндометриоидных гетеротопиях составило 1:2 (4,38±0,5%, 7,9±0,35% соответственно, р<0,01). При этом характер расположения ЬРйР был более локальным, и определялись точечные реакции в эндотелии сосудов, макрофагах и фибробластах. УЕОР в ткани гетеротопий располагался диффузно и фиксировался в клетках эндотелия сосудов, железистого эпителия, плоского эпителия брюшины, а также в мононуклеарных лимфоцитах и макрофагах.

Таким образом, полученные результаты дают основание полагать, что ангиогенез в эндометриоидных гетеротопиях находится в непосредственной зависимостимости от преимущественно системного действия УЕвР и преимущественно локального действия ЬРОР.

ВЫВОДЫ

1. Перитонеальная жидкость больных НГЭ характеризуется высокими показателями концентрации УЕСР и ангиогенина по сравнению с контрольной группой. Уровень УЕСР в перитонеалыюй жидкости больных НГЭ Ш-1У степени тяжести в 2,4 раза выше чем при 1-П степени тяжести НГЭ и в 6,5 раз выше чем в контрольной группе. Уровень ангиогенина в перитонеальной жидкости больных НГЭ превышает аналогичный показатель в контрольной группе более чем в 2,5 раза. Не обнаружено статистически значимого количества ЬРОР в перитонеальной жидкости больных НГЭ.

2. Содержание ангиогенных факторов УЕОР, ЬРвР и ангиогенина в эндометриоидных гетеротопиях достоверно (р<0,001) превышает аналогичные показатели в перитонеальной жидкости больных НГЭ, что свидетельствует о высоком ангиогенном потенциале эндометриоидных гетеротопий, а также о преимущественно иаракринном характере регуляции изученных цитокинов.

3. В перитонеальной жидкости больных НГЭ уровень хемокинов КАМТЕБ, МСР-1, МЮ, 1Ь-8, являющихся факторами привлечения клеток иммунной системы в процесс воспаления, превышал аналогичные показатели в контрольной группе более чем в 2 раза.

4. Уровень хемокинов МСР-1 и ГЬ-8, был достоверно выше в эндометриоидных гетеротопиях, чем в перитонеальной жидкости больных НГЭ, а уровень ЯАМТЕЗ и МЮ в перитонеальной жидкости больных НГЭ превышал показатели в эндометриоидных гетеротопиях, что может свидетельствовать о переключении синтеза хемокинов в результате этапности развития НГЭ.

5. При НГЭ в перитонеальной жидкости содержание ИМ О, обладающего антиангиогенным действием, при ПНУ степени тяжести выше чем при 1-П степени тяжести, и в 3 раза выше, чем в контрольной группе. Содержание данного хемокина в эндометриоидных гетеротопиях в 300 раз меньше, чем в перитонеальной жидкости больных НГЭ, что может говорить

о системном характере действия 1Р-10. Полученные данные могут указывать на снижение ангиогенеза и нарастание процессов склерозирования эндометриоидных гетеротопий у больных НГЭ Ш-1У степени тяжести.

6. В перитонеальной жидкости больных НГЭ количество провоспалительных цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-6 достоверно выше, чем у здоровых женщин и достигает максимальных значений при Ш-1У степени тяжести НГЭ. Противовоспалительный фактор 1Ь-10 в перитонеальной жидкости больных НГЭ практически отсутствует.

7. Степень выраженности спаечного процесса в области малого таза при НГЭ коррелирует с уровнем МСР-1 и 1Ь-8 в перитонеальной жидкости (коэффициент корреляции £>0,7).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Перитонеальную жидкость рекомендуется рассматривать как равноправный объект исследования в диагностическом алгоритме НГЭ наряду с определением белковых маркеров в периферической крови.

2. Определение ангиогенных факторов, провоспалительных цитокинов и хемокинов в перитонеальной жидкости рекомендуется использовать для прогнозирования дальнейшего течения патологического процесса и определения риска развития рецидива заболевания (УЕОР - как показатель интенсивности ангиогенеза при НГЭ, хемокины МЮ, 1Ь-8 и провоспалительный цитокин 1Ь-б - как показатель, характеризующий активность спаечного процесса, хемокин МСР-1 - как предиктор спаечной болезни и фактор, определяющий необходимость назначения противоспаечной терапии в комплексном лечении НГЭ, хемокин 1Р-10 - как предиктор рецидивирования заболевания).

3. Определение в перитонеальной жидкости изученных факторов подтверждает целесообразность применения антицитокиновой терапии, нестероидных противовоспалительных и антифибротических препаратов в комплексной терапии НГЭ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль ангиогенеза в развитии наружного генитального эндомстрноза / Д.И. Соколов, П.Г. Кондратьева, В.Л. Розломий, H.JI. Крамарева, CA. Сельков // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т. 6, №2. -С. 10-17.

2. Участие факторов ангиогенеза в развитии наружного генитального эндомстрноза / П.Г. Кондратьева, Д.И. Соколов, A.B. Колобов, И.М. Кветной, М.И. Ярмолинская, Н.Г. Солодовникова, Д.А. Ниаури, CA. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. - 2007. - Т. LVI, выпуск 3. - С. 70-74.

3. Содержание хемокннов и цнтокинов в псрнтонсальной жидкости больных наружным геннтальньш эндометрнозом различной степени тяжести / Д.И. Соколов, П.Г. Кондратьева, М.И. Ярмолинская, H.JI. Крамарева, A.B. Селюти, В.В. Рулев, Д.А. Ниаури, С.А. Сельков // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 1. - С. 85-90.

4. Апоптоз в патогенезе наружного генитального эндомстрноза / П.Г. Кондратьева, Д.И. Соколов, М.И. Ярмолинская, Д.А. Ниаури, С.А. Сельков // Вестник Санкт-Петербургского государственного университета. - 2009. - выпуск 4. - С. 213-221.

5. Участие фактров ангиогенеза и воспаления в развитии наружного генитального эндометриоза различной степени тяжести / П.Г. Кондратьева, Д.И. Соколов, М.И. Ярмолинская, H.JI. Крамарева, A.B. Селютин, Э.Н. Попов, Д.А. Ниаури, С.А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Т. LV, спецвыпуск. - С. 5657.

6. Иммунологическая характеристика больных с наружным генитальным эндометриозом, проявляющимся болевым синдромом / П.Г. Кондратьева, М.И. Ярмолинская, Д.И. Соколов, H.JI. Крамарева, С.А. Сельков // Материалы Девятой Всероссийской медико-биологической

конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье».- СПб. -2006. - С. 153-154.

7. Содержание фактора роста эндотелия сосудов и ангиогенина в перитонеальной жидкости больных наружным генитальным эндометриозом / Д.И. Соколов, П.Г. Кондратьева, М.И. Ярмолинская, H.JI. Крамарева, A.B. Селютин, Д.А. Ниаури, С.А. Сельков // Проблемы репродукции. - 2006. - спецвыпуск. - С. 87-88.

8. Содержание хемокинов и провоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости больных наружным генитальным эендометриозом / П.Г. Кондратьева, Д.И. Соколов, A.B. Селютин, М.И. Ярмолинская, H.JI. Крамарева, Д.А. Ниаури, С.А. Сельков // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 311.

9. Оценка динамики продукции факторов роста в перитонеальной жидкости и эндометриоидных гетеротопиях больных наружным генитальным эндометриозом / П.Г. Кондратьева, Д.И. Соколов, С.А. Сельков, Д.А. Ниаури // Российский иммунологический журнал. -2008. - Т. 2(11), № 2-3. - С. 290.

10. Содержание ангиогенных и провоспалительных факторов в перитонеальной жидкости больных наружным генитальным эндометриозом и эндометриоидных гетеротопиях / П.Г. Кондратьева, Д.И. Соколов, М.И. Ярмолинская, С.А. Сельков, Д.А. Ниаури // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С.409.

Подписано в печать 12.04.2010 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 1586.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: i2d_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru