Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Значение факторов врожденного иммунитета в патогенезе наружного генитального эндометриоза I-II стадии у пациенток с бесплодием и обоснование использования препарата глюкозаминилмурамилдипептида в комп

На правах рукописи

РОМАНОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

ЗНАЧЕНИЕ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ПАТОГЕНЕЗЕ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗАІ-ІІ СТАДИИ У ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ И ОБОСНОВАНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРЕПАРАТА ГЛІОКОЗАМИНИЛМУРАМИЛДИПЕПТИДА В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ДАННОЙ ПАТОЛОГИИ

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

II 111111III ІШІІІІІІІШІ11111II

005541201

2 8 НОЯ 2013

Иваново 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджета учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российск Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук (ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия», Минздрава России)

Малышкина Анна Йванові Сотникова Наталья Юрьев

Лапочкина Нина Павлов

доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»

Минздрава России) Боровкова Людмила Васильевна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «_» декабря 2013 года в «_» часов

заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федерально государственном бюджетном учреждении «Ивановский научн исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городков Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 15304 Россия, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ « Ив Н] МиД имени В.Н. Городкова» Минздрава России.

Автореферат разослан « 76 » ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Панова И.А.

Актуальность научного исследования

Эндометриоз - одно из наиболее распространенных гинекологических аболеваний женщин репродуктивного возраста (Ааёп Р, Уекясо I., 2013). Со-ласно последним данным, эндометриозом во всем мире страдает каждая 10-я женщина епродуктивного возраста ( Адамян Л.В., 2013, Масег М.Ь., 2012, Л.), причем у 0%-50% всех женщин с эндометриозом диагностируется бесплодие (Боровкова . В., 2005, М^тег БА, 2004, ОшсИсе ЬС, 2004). Однако механизмы, определя-щие нарушение репродуктивной функции у пациенток с эндометриозом, до онца не установлены. Особый интерес представляет бесплодие, ассоциирован-ое с 1-П стадией наружного гениталыюго эндометриоза, поскольку, несмотря на шимальные анатомические изменения органов малого таза, у этих пациенток тмечается высокая частота бесплодия (Марченко Л.А., 2007).

В последние годы увеличилось число сообщений о важной роли иммун-1ых нарушений в патогенезе эндометриоза и связанного с ним бесплодия. Во шогих работах подчеркивается важная роль клеток фагоцитарного ряда в про-ессах, определяющих мехапизмы формирования эндометриоидных очагов, од-ако практически во всех работах, посвященных этому вопросу, оцениваются акрофаги перитонеальной жидкости, (Lous.se .1С 2012; Dmwoski РЖ, 2006). енее изученными при эндометриозе остаются особенности периферических еток фагоцитарного ряда, в частности моноцитов, хотя ряд исследователей казывает на важную роль системного воспаления в патогенезе эндометриоза втугек вВ., 2008.). В доступной нам литературе мы встретили лишь единичные аботы, посвященные изучению этой проблемы. Установлено, что для моноци-ов пациенток с наружным генитальным эндометриозом характерно нарушение кспрессии адгезионых рецепторов и продукции ПТЧу (Полумисков Д.М.,2007). рактически отсутствуют данные о взаимосвязи особенностей функционального остояния моноцитов и характера репродуктивной функции пациенток с наружным генитальным эндометриозом 1-П стадии. Остаются полностью неизученны-и механизмы реализации каскада воспалительных реакций моноцитами с во-

влечением PRR рецепторов, таких как TLR, N0D2, RAGE и провоспательных цитокинов TNFa и IL-lß у этих пациенток.

Важной проблемой современной гинекологии в настоящее время являет поиск медикаментозных путей лечения эндометриоза и связанного с ним беспл дня. Одним из препаратов, действующих на клетки фагоцитарного рада, являе Ликопид, активным действующим веществом которого является ГМДП (глюкоз минилмурамилдипептид). В экспериментальных исследованиях показано, ч ГМДП, входящая в состав Ликопида, является сильным активатором врожденн и адаптивной иммунной системы и может быть использован в лечении эндометр оза (Antziferova Yu.S. and Sotnikova N.Yu., 2012). Однако до настоящего времени лечении пациенток с бесплодием и эндометриозом Ликопид не применялся. В св зи с этим, определение особенностей функционального состояния моноцитов пациенток с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии и бесплодием, также уточнение возможности медикаментозной коррекции выявленных наруш ний с целью повышения эффективности лечения бесплодия является актуальн задачей, имеющей как фундаментальное, так и практическое значение.

Цель исследования:

Изучить особенности экспрессии паттерн распознающих рецепторов и ре ализацто каскада воспалительных реакций, опосредуемых периферическим мо ноцитами у женщин с наружным генитальным эндометриозом I-II стдии и бес плодием, обосновать целесообразность включения препарата ГМДП (глюкоза минилмурамилдипептид) в комплексную терапию пациенток с данной патологи ей.

Задачи исследования:

1. Дать клинико-анамнестическую характеристику женщин с наружным гени тальным эндометриозом 1—11 стадии и бесплодием.

2. Выявить особенности экспрессии ряда сигнальных и цитокиновых рецепторов (NOD-2, TLR2, RAGE, CD 120а), а также определить характер внутриклеточной продукции провоспапительных цитокинов (IL-lß, TNFa) перифе-

рическими моноцитами у женщин с наружным генитальным эндометриозом 1-Й стадии и бесплодием.

3. Определить in vitro влияние ГМДП (гшокозаминилмурамилдипептида) в различных концентрациях на показатели функционального состояния моноцитов периферической крови пациенток с наружным генитальным эндометриозом 1-П стадии и бесплодием.

4. Установить особенности влияния терапии с применением иммуномодули-рующего препарата ГМДП на функциональное состояние моноцитов периферической крови и репродуктивную функцию женщин с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии и бесплодием.

5. Разработать алгоритм назначения иммуномодулирующей терапии в раннем

послеоперационном периоде у пациенток с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии и бесплодием.

Научная новизна исследования

Установлено, что развитие бесплодия у женщин с эндометриозом I-II стадии ассоциируется с дисбалансом активации моноцитов, проявляющемся в усилении экспрессии сигнальных рецепторов (TLR2, RAGE) и внутриклеточной продукции TNFa, на фоне сниженной выработки IL-Iß.

В эксперименте in vitro показано, что препарат ГМДП стимулирует экспрессию TLR2 и CD 120а молекул на поверхности моноцитов периферической крови пациенток жешцин с наружным генитальным эндометриозом 1-Й стадии и бесплодием, и усиливает внутриклеточную продукцию моноцитами провоспа-лительных цитокинов IL-lß и TNFa.

Впервые показано, что иммуномодулятор ГМДП в дозе 10 мкг/мл. усиливает внутриклеточную продукцию моноцитами IL-lß у пациенток с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии и бесплодием.

Выявлено, что применение иммуномодулятора ГМДП в раннем послеоперационном периоде оказывает положительное воздействие на состояние репродуктивной функции пациенток с эндометриозом I-II стадии и бесплодием в

тех случаях, когда у них изначально определятся нормальное и/или низкое содержание моноцитов с фенотипом TLR2+.

Впервые показано, что при успешном наступлении беременности после комплексной терапии с включением препарата ГМДП динамика показателей врожденного иммунитета у пациенток с бесплодием при I-II стадиях наружного генитального эндометриоза характеризуется увеличением количества TLR2+ моноцитов, усилением экспрессии мРНК NOD2 и снижением экспрессии мРНК RAGE через 1 месяц после лечения.

Впервые установлено, что содержание IL-lß+ моноцитов является прогностическим критерием эффективности хирургического лечения бесплодия в течение года у женщин с I-II стадией наружного генитального эндометриоза.

Практическая значимость результатов исследования

Разработан способ прогнозирования эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с I-II стадией наружного генитального эндометриоза на основании определения в периферической крови относительного количества IL-lß+ моноцитов (уведомление о поступлении заявки № 2013146410 от 18.10.2013).

Предложены критерии назначения иммуномодулиругощей терапии у женщин с наружным генитальным эндометрнозом I-II стадии и бесплодием. Разработан алгоритм обследования и определения тактики ведения пациенток с наружным генитальным эндометрнозом I-II стадии и бесплодием, после хирургического лечения.

Положения, выносимые на защиту

Развитие бесплодия у пациенток с наружным генитальным эндометрнозом I-II стадии и бесплодием связано с угнетением внутриклеточной продукции IL-lß моноцитами на фоне усиления активности каскада воспалительных реакций, опосредуемых через сигнальные рецепторы TLR2 и RAGE. Препарат ГМДП in vitro и in vivo усиливает продукцию моноцитами IL-lß, стимулируя мембранную экспрессию TLR2.

Комплексная терапия с включением иммуномодулирующего препарата ГМДП в раннем послеоперационном периоде оказывает положительное влияние на состояние репродуктивной функции пациенток с изначально низкими/нормальными показателями количества TLR2+ моноцитов, ответ которых на препарат через 1 месяц после лечения характеризуется повышением мембранной экспрессии TLR2 рецепторов, увеличением уровня экспрессии мРНК NOD2 и снижением уровня экспрессии мРНК RAGE.

Показатель относительного содержания IL-lß+ моноцитов является прогностическим критерием успеха хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным гениталышм эндометриозом I-II стадии

Внедрение результатов в практику

Разработанный способ прогнозирования эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии прошел предрегистрационное испытание в гинекологической клинике Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Апробация работы

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: конференции молодых ученых - Иваново,2012,V Российской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты».- Иваново. - 2012, Конференции молодых ученых. - Иваново, 2013, 93-й ежегодной научной конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки - 2013», посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора медицинских наук, профессора Е.С. Мясоедова - Иваново.- 2013, Объединенном иммунологическом форуме -Нижний Новгород, 2013, XIV Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» V съезде акушеров-гинекологов России. Москва 2013.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, ю них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов научных исследований.

Личное участие автора

Автором лично проводилось обследование и лечение пациенток, самостоятельно проводились отбор пациенток в группы, согласно критериям включения и исключения. Заполнялись карты обследования, проводилась статистико-математическая обработка полученных данных, анализ и описание полученных результатов. Сформулированы выводы, основные положения и практические рекомендации.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 51 отечественных и 141 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 13 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России, директор - д.м.н А.И. Малыппсина. Исследования проводились в эндоскопическом отделении в гинекологической клиники, - зав. к.м.н. В.Н. Романов, лаборатории клинической иммунологии - зав. д.м.н., профессор Н.Ю. Сотаикова, лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии - зав. д.м.н., проф. Л.П. Перетятко. Всего было обследовано 117 женщин: 24 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста, поступавших в отделение эндоскопической хирургии с целью добровольной хирургической стерилизации по социальным показаниям согласно федеральному закону « Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, N323-03. (контрольная группа) и 93 женщин с наружным генитальным эндометриозом (N80.3 -эндометриоз тазовой брюшины) 1-И стадии

(по классификации Американского общества фертильносте, 1985 год) и бесплодием (основная группа). В зависимости от ведения раннего послеоперационного периода 72 женщины основной группы методом случайного выбора были разделены на две подгруппы: 39 женщин (I подгруппа) в раннем послеоперационном периоде в дополнение к традиционной терапии получали иммуномодулирующий препарат Ликопид (регистрационный № 015 494/01). Ликопид применялся per os в дозе 10 мг 1 раз в сутки в течение первых десяти дней послеоперационного периода, и 33 женщины' (II подгруппа) с традиционным ведением послеоперационного периода (назначались антибактериальные и обезболивающие препараты), не получавщие терапию препаратом Ликопид.

Обследование женщин проводилось дважды: при поступлении в стационар для проведения хирургического лечения и через 1 месяц после лечения.

Для оценки исхода лечения динамическое наблюдение за женщинами основной группы проводилось в течение одного года после лапароскопии.

Материалом для исследования служили: гепаринизированная периферическая венозная кровь, которые забиралась за день до операции; биоптаты эндометрия и брюшины, которые получали одновременно с проведением оперативного вмешательства. В схему обследования входили общеклинические, электрофизиологические (УЗИ, ЭКГ), морфологические, иммунологические исследования.

Клинические методы

Клинические методы исследования включали сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр, лабораторные исследования, необходимые для выполнения оперативного вмешательства (общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, коагулограмма, определение группы крови и резус-фактора, реакции Вассермана, серологической реакции на выявление ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С, мазки на флору, степень чистоты).

Иммунологические методы

- Процедура выделения мононуклеарных клеток из периферической крови

Выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d=l ,078). -Оценка функционального состояния периферических моноцитов методом проточной цитометриии

Мембранную экспрессию рецепторов и внутриклеточный синтез цитокинов моноцитами определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ). В исследовании использовали следующие мАТ: коныогированные с FITC anra-TLR2, CD120a антитела (Beckman Coulter, USA), коныогированные с РЕ aimj-CD14 антитела (КлоноСпектр, Москва). Внутриклеточную продукцию цитокинов оценивали с помощью следующих мАТ: коныогированные с FITC aurra-human-IL-lß антитела и коныогированные с РЕ анти-human-TNFa антитела (Beckman Coulter, USA). Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При оценке внутриклеточной продукции цитокинов моноцитами крови предварительно проводили процедуру фиксации и пермебиализации клеточной мембраны с использованием коммерческого набора Fixative Solution IOTest®3 10х Concentrate (Beckman Coulter, USA). В каждом образце анализировалось не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "CELLQuest Pro" (Becton Dickinson, USA). Анализировали клетки в моноцитарном гейте, который устанавливали на основании окрашивания клеток анти-С014 антителами.

-Проведение количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени

Для количественного определения экспрессии мРНК NOD2 и RAGE моноцитами периферической крови использовали метод полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. Предварительно проводили выделение чистой популяции мо-

ноцитов из фракции МНК периферической крови методом штатной сепарации с использованием магнитных частиц, коныогированных с aimi-CD14 антителами (Dynabeads® CD14, Invitrogen by Life Technologies AS, Oslo, Norway) в соответствии с инструкцией фирмы-разработчика. Дня выделения тотальной РНК из моноцитов крови полученную обогащенную фракцию CD14+ клеток лизировали в растворе, содержащем гуашщин тиоциа-нат, цитрат натрия, саркгаия и 2-меркапгоэтанол. Вьщеление РНК проводили стандартным гуанидш-тиощанат-фенот-хтороформным методом. Полученную РНК переводили в комплементарную кДНК, используя рендом-гексамеры и обратную транскрипгазу (Prome-ga, USA). Реакцию обратной транскрипции проводили при 70°С в течение 3 мил и при 37°С в течение 90 мин. В работе проводили определение экспрессии мРНК NOD2, RAGE и Р2-микроглобулина, который использовали в качестве гена домашнего хозяйства. Для проведения количественной ПЦР в реальном времени использовались коммерческие наборы из ферментов, праймеров и зондов производства ООО «Сшггол» (Москва, Россия). В наборы входили также последовательности клонированных соответствующих генов, серию десятикратных разведений которых использовали в качестве стандартов. Реакцию амплификации проводили в соответствии с предложенными протоколами ООО «Синтол» на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ BIO-RAD Laboratories, California, USA). В каждом образце определяли количество копий нуклеотидов р2-микроглобулина и специфических генов с помощью стандартных кривых, построенных при использовании программного обеспечения амплификатора iCycler iQ. Затем количество копий пар нуклеотидов специфического гена делили на количество копий пар ß2-микроглобулина для получения нормализованного значения экспрессии гена. Результаты представлены как нормализованное значение специфического гена х 103/мкл дая всех изученных генов. -Проведение имщ'иофсрмситшхю анализа

Содержание RAGE в сыворотке крови определяли методом иммупофер-мептного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems,

Finland) с использованием коммерческой тест-системы (R&D, USA). Анализ проводился в соответствии с протоколом фирмы-производителя. -Изучение in vitro влияния препарата ГМДП на внутриклеточную продукцию цитат toe периферическими лимфоцитами

В эксперименте in vitro оценивали влияние чистого препарата ГМДП на мембранную экспрессию TLR2 и CD120a, внутриклеточную продукцию IL-lß и TNFa моноцитами женщин наружным генитальным эндометриозом I-П стадии и бесплодием. Для этого 0,5 мл взвеси периферических МНК в среде RPMI 1640 в концентрации 2х106 кл/мл инкубировали в течение 24 часа при 37° С и 5% С02 с равным объемом препарата ГМДП в концентрациях 2, 10 и 20 мкг/мл, конечная концентрация препарата в культуральной среде составила 1, 5 и 10 мкг/мл. После окончания культивирования МНК отмывали в среде RPMI 1640 в течение 10 мин, окрашивали с помощью мАТ и определяли уровень TLR2+, CD120a+, IL-lß+ и TNFa+ клеток в моноцитарпом гейте методом проточной цитометрии В качестве контроля использовали показатели моноцитов, инкубировавшиеся в тех же условиях без добавления ГМДП.

Морфологические методы

Производилась обзорная гистология. Оперативно удаленный материал фиксировался в 10%-ном нейтральном формалине в течение 72 часов. После стандартной парафиновой проводки готовились срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивались гематоксилином Эрлиха с докраской эозином и заключались в бальзам. В обзорных препаратах изучалась межуточная ткань, сосудистое русло и мышечный компонент. В работе использовался микроскоп «Биолам» с бинокулярной насадкой АУ -12 (JIOMO).

Статистические методы исследования

Статистический анализ данных осуществлялся по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядовна нормальность распределения. В зависимости от типа распределения данных достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по t-критерию Стьюдента или непараметрическому U-крнгерию Манна-Уитни. Статистический

анализ осуществляли в пакете прикладных лицензионных программ «Statistica 6.0», «Microsoft Office 2007», «GenStat», «MedCalk» и «Open Epi».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Средний возраст женщин основной группы составил 30,8±0,39 лет и был достоверно ниже (р=0,014), чем у женщин контрольной группы(32,6±1,1), за счет преобладания в основной группе женщин в возрасте 26-35 лет. Это согласуется с мнением большинства исследователей, считающих, что эндометриоз - это заболевание женщин активного репродуктивного возраста (Hummelshoj L. 2010; Яроцкая, Е.Л. 2004; Клинические рекомендации по ведению больных, Москва 2013; Hediger ML, 2005)

Нарушение менструального цикла по типу альгодисменореи встречалось у 45,2% женщин основной группы, что достоверно выше, чем у женщин контрольной группы - 16,66%, (р=0,01), что соответствует данным многих авторов и может являться одной из причин обращения женщин к гинекологу (Fanta M, 2012, Андреева, Е.Н. 1997.)

В контрольной группе своевременные физиологические роды в анамнезе были у 100% женщин, в основной группе - у 22,6% женщин (Р=0,000). У всех женщин основной группы (100%) отмечалось бесплодие, длительность которого составила от 1 до 13 лет, в среднем 3,74±0,25 года. Первичное бесплодие наблюдалось у 46 женщин (49,5%), вторичное у 47 женщин (50,5%). Этот факт является закономерным, так как бесплодие, является основным симптомом наружного гепитального эндометриоза I-II стадии и одной из ведущих причин обращения к врачу (Falcone Т., 2011, Адамян Л.В., 2006). Женщины основной группы имели самопроизвольные выкидыши в анамнезе (18,3%), тогда как ни одна женщина из контрольной группы не имела в анамнезе невынашивания беременности (р=0,026), что также хорошо согласуется с имеющимися литературными данными (Ярмолинская М.И., Сельков С.А., 2007). Некоторые авторы объясняют это иммунологическими нарушениями ( Сухих, Г.Т. 2003. , Радзипский, К.В. и др., Sargent IL,.2006; Le Bouteiller Р 2006)

Неопухолевые заболевания шейки матки в анамнезе достоверно чаще

встречались у женщин основной группы - в 23,7% случаев, по сравнению с женщинами контрольной группы - 2,86% (р=0,039), что, по мнению многих авторов может являться причиной развития локального воспаления и играет роль в патогенетических механизмах развития эндометриоза [Адамян Л.В.,2004].

У женщин с наружным генитальным эндометриозом на момент обследования выявлялась железисто-кистозная гиперплазия эндометрия в 16,6% случаев. Полученные нами данные, находят подтверждение в литературных источниках, согласно которым, около 15% больных с наружным генитальным эндометриозом страдают гиперплазией эндометрия и полипозом (Логинова О.Н., 2011)

Аллергические реакции в анамнезе отмечались достоверно чаще (23,6%) у женщин основной группы, чем в контрольной группе (8,3%) (р=0,039). Это соответствует литературным данным о высокой частоте аутоиммунных и аллергических заболеваний у женщин с наружным генитальным зндометриозом (Inagaki J. et al., 2003; Mathur N. Sinaii, 2002).

В настоящее время широко распространена точка зрения о том, что иммунное воспаление играет важную роль в патогенезе эндометриоза (Halis G, 2004 Dec; Khoufache К,. 2012) Однако большинство проведенных исследований посвящено изучению механизмов развития локального перитонеалыюго воспаления при эвдометриозе (de Ziegler D., Borghese В., Chapron С., 2010). Системные воспалительные реакции, в развитии которых участвуют моноциты, изучены недостаточно. В нашей работе мы оценили особенности экспрессии ряда сигнальных рецепторов и продукции провоспалительных цитокинов моноцитами женщин с наружным генитальным эндометриозом I-П стадии и бесплодием, а также попытались разработать подходы к коррекции выявленных нарушений с целью восстановления репродуктивной функции пациенток.

Анализ полученных результатов показал, что уровень моноцитов, экспрессирующих TLR2 (64,8±1,9%), а также моноцитов, внутршслеточно продуцирующих TNFa (62,5± 1,17 пг/мл) у женщин основной группы был достоверно выше, чем в контрольной группе (55,5±3,35%, р=0,015 и 54,77±2,4

пг/мл, р=0,01). Однако внутриклеточная продукция другого провоспалительного цитокина - IL-Iß у женщин основной группы (44,05±1,3 пг/мл) была достоверно ниже, чем у женщин контрольной группы (59,9±2,3 пг/мл, р=0,000). Также по нашим данным, при эндометриозе был достоверно выше синтез моноцитами еще одного рецептора относящегося к классу PRR - RAGE (7,08±1,57 копий пар нуклеотидов х 1000), чем аналогичный показатель у женщин контрольной группы (0,44±0,17 копий пар нуклеотидов х 1000) (р=0,04). Кроме того, сывороточное содержание RAGE в основной группе составило 2811,67 пг/мл, что достоверно выше аналогичного показателя у женщин контрольной группы 1102,73±188,98 пг/мл (р= 0,01). Полученные нами результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными об усилении экспрессии RAGE при эндометриозе (Sharma 1,2010).

Учитывая полученные нами результаты и экспериментальные исследования (Antziferova Yu.S. and Sotnikova N.Yu., 2012), мы предположили, что коррекция реакций врожденного иммунитета может оказать позитивное влияние на репродуктивную функцию пациенток с наружным генитальным эндометриозом. Одним из немногих препаратов с доказанным активирующим воздействием на фагоциты через NOD2 рецепторы является препарат Ликопид (Takada Н, 2006). До настоящего времени для лечения бесплодия у женщин с эндометриозом этот препарат не использовался. В нашей работе мы оценили влияние комплексной терапии с включением препарата Ликопид на состояние репродуктивной функции пациенток с бесплодием при I-II стадиях наружного гениталыюго эндометриоза, а также проследили наличие взаимосвязи между характером иммунных нарушений и последующим наступлением беременности после проведения иммуномодулирующей терапии.

Мы оценили действие ГМДП на параметры функционального состояния моноцитов в различных концентрациях (1, 5 и 10 мкг/мл). Установлено, что действие ГМДП в дозе 1 мкг/мл было минимальным и проявлялось лишь в стимуляции мембранной экспрессии CD120a молекул моноцитами. В дозе 5 и 10 мкг/мл препарат оказывал достоверное стимулирующее влияние на все

изученные параметры. При этом усилеиие экспрессии TLR2 моноцитами в максимальной степени проявлялось при воздействии препарата в концентрации 10 мкг/мл (р= 0,019), а максимальная стимуляция экспрессии CD120a молекул, внутриклеточной продукции IL-ip и TNFa моноцитами отмечалась при использовании дозы ГМДП 5 мкг/мл.

Таким образом, полученные нами in vitro результаты хорошо согласуются с имеющимися экспериментальными данными и позволяют говорить о перспективности дальнейшего изучения возможности использования препарата ГМДП в лечении иммунных нарушений у пациенток с эндометриозом и бесплодием.

Для оценки влияния препарата Ликопид на состояние репродуктивной функции и на иммунологические показатели пациенток с наружным генитальным эндометриозом 1-П стадии и бесплодием, мы пролечили 39 пациенток основной группы препаратом Лиокпид в дозе 10 мкг 1 раз в сутки в течение 10 дней. Препарат назначался в раннем послеоперационном периоде вместе с курсом обезболивающей и антибактериальной терапии для профилактики послеоперационных осложнений. Женщинам второй подгруппы (п=33) назначалась только обезболивающая и антибактериальная терапия. Женщины обеих подгрупп были сопоставимы по основным клинико-анамнестическим параметрам.

У пациенток с традиционным ведением раннего послеоперационного периода мы не отметили каких-либо изменений иммунологических показателей через 1 месяц после проведения лапароскопии. Тогда как в подгруппе женщин, получавших Ликопид, через 1 месяц после хирургического лечения бесплодия была выявлена нормализация внутриклеточной продукции IL-ip моноцитами. Таким образом, результаты лечения пациенток с бесплодием и эндометриозом in vivo соответствуют выявленным нами ранее эффектам препарата in vitro.

При оценке репродуктивной функции пациенток двух подгрупп в течение года после лапароскопии было установлено, что у женщин, получавших в раннем послеоперационном периоде только традиционную терапию,

наступление беременности произошло у 21,2% пациенток. В подгруппе женщин, получавших в раннем послеоперационном периоде комплексную терапию с использованием препарата Ликопид, беременность наступила у 33,3% женщин, т.е. у них прослеживается четкая тенденция к улучшению репродуктивной функции.

При дифференцированном анализе иммунологических показателей пациенток до лапароскопии в зависимости от последующего наступления беременности нами было установлено, что в подгруппе с традиционным ведением послеоперационного периода успех хирургического лечения бесплодия отмечался у пациенток с минимальными иммунологическими нарушениями. Беременность наступала спонтанно в течение 1 года после проведения лапароскопического удаления очагов эндометриоза у женщин с изпачально нормальными значениями относительного содержания TLR2+ и IL-lß+ моноцитов, уровня экспрессии мРНК RAGE и сывороточного содержания RAGE. При этом анализ полученных данных показал, что показатель количества IL-lß+ моноцитов может служить прогностическим критерием успеха хирургического лечения бесплодия у пациенток с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии, получавших в раннем послеоперационном периоде традиционную терапию. Показано, что при значении относительного содержания EL-lß+ моноцитов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии и бесплодием 50% и более позволяет прогнозировать успех хирургического лечения бесплодия с точностью 83,3%. Чувствительность предложенного способа составила 80%, специфичность - 84%. На основании полученных результатов нами был разработан «Способ прогнозирования эффективности хирургического лечения бесплодия у женщин с I-II стадией наружного гениталыюго эндометриоза (уведомление о поступлении заявки № 2013146410 от 18.10.2013) Эти данные подтверждают высказанное выше предположение о значимости IL-lß в обеспечении успеха репродукции у пациенток с эндометриозом, поскольку при нормальном уровне внутриклеточной продукции IL-lß моноцитами пациенток с наружным генитальным эндометриозом 1-Й

стадии и бесплодием достаточно только хирургического удаления эндометриоидных очагов для восстановления репродуктивной функции пациенток.

Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о необходимости индивидуального подхода к назначению препарата Ликопид пациенткам с бесплодием при I-II стадиях наружного генитального эндометриоза. Мы разработали алгоритм обследования этого контингента пациенток с целью повышения эффективности лечения у них бесплодия (Схема 1). На первом этапе обследования мы предлагаем оценивать уровень IL-lß+ и TLR2+моноцитов. При значениях IL-lß+ 50% и более мы предлагаем традиционное ведение раннего послеоперационного периода, так как по нашим данным у этих женщин достаточно велика вероятность (83,3%) спонтанного наступления беременности после проведения лечебно-диагностической лапароскопии. Пациенткам с низкими значениями IL-lß+ моноцитов (менее 50%) и низкими/нормальными показателями уровня TLR2+ моноцитов (66% и менее) мы рекомендуем в раннем послеоперационном периоде проведение терапии с включением препарата Ликопид. Эффективность лечения предлагается оценивать через 1 месяц по показателям относительного содержания TLR2+ моноцитов и уровня экспрессии моноцитами мРНК RAGE и NOD2. Повышение количества TLR2+ моноцитов, уровня экспрессии мРНК NOD2 и снижение экспрессии мРНК RAGE через 1 месяц после лечения следует рассматривать как эффективный результат терапии с применением препарата Ликопид, который окажет положительное влияние на состояние репродуктивной функции пациенток с эндометриозом. В том случае, если наблюдаются одновременно низкие значения содержания IL-lß+ моноцитов и высокое содержание TLR2+ моноцитов, эффективный ответ на хирургическое удаление очагов эндометриоза и на иммуномодулирующую терапию препаратом Ликопид будет отсутствовать. Этих пациенток следует ориентировать на другие методы лечения бесплодия, в частности, на ЭКО.

Схема 1 .Алгоритм обследования и определения тактики ведения раннего послеоперационного периода у пациенток с бесплодием при 1-П стадиях наружного генитального эндометриоза

Определение количества ГИЬ+ моноцитов

50% и менее ц-1 1-► Более 50%

ВЫВОДЫ

1. Особенностями клинико-анамнестической характеристики женщин с наружным генитальным эидометриозом 1-П стадии и бесплодием являются высокая частота нарушения менструальной функции по типу альгодисменореи, самопроизвольных абортов в раннем сроке беременности, а также неопухолевымых заболеваний шейки матки и аллергических реакций в анамнезе.

2. У женщин с эндометриозом 1-П стадии и бесплодием в периферической крови повышается относительное содержание ТЫ12+ и ТИРа+ моноцитов, экспрессия

мРНК RAGE моноцитами, концентрация RAGE в сыворотке крови и снижается уровень моноцитов, продуцирующих внутриклеточно IL-lß.

3. ГМДП in vitro оказывает стимулирующее действие па экспрессию TLR2 и CD120a молекул, а также на внутриклеточную продукцию IL-lß и TNFa моноцитами пациенток с эндометриозом I-1I стадии и бесплодием. В дозе 1 мкг/мл ГМДП усиливает экспрессию CD120a молекул моноцитами, в дозе 5 и 10 мкг/мл ГМДП повышает уровень TLR2+, CD120a+, IL-lß+ и TNFa+ моноцитов.

4. Использование препарата Ликопид в дозе 10 мг 1 раз в сутки в первые 10 суток после операции у пациенток с эндометриозом 1-Й стадии и бесплодием приводит к нормализации относительного содержания IL-lß+ и повышению количества TLR2+ моноцитов через 1 месяц после лечения, чего не наблюдается при традиционном лечении.

5. Наступление беременности после хирургического лечения бесплодия у женщин с эндометриозом I-II стадии и бесплодием ассоциируется с отсутствием исходных нарушений в экспрессии TLR2 молекул, внутриклеточной продукции IL-1 ß, синтезе RAGE моноцитами и сывороточном содержании RAGE.

6. Наступление беременности у женщин с эндометриозом 1-Й стадии и бесплодием, получавших после операции препарат Ликопид, отмечается при изначально низком/нормальном содержании TLR2+ моноцитов, и при повышении через 1 месяц после лечения количества TLR2+ моноцитов, экспрессии мРНК NOD2 и снижении экспрессии мРНК RAGE в пуле моноцитов относительно показателей до операции.

7. Показатель относительного содержания IL-lß+ моноцитов 50% и более является прогностическим критерием эффективности хирургического лечения бесплодия в течение года у женщин с 1-Й стадией эндометриоза. Точность способа - - 83,3%, чувствительность - 80,0%, специфичность - 84,0%;

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Пациенткам наружным генитальным эндометриозом I-П стадии и бесплодием рекомендуется до проведения лапароскопии в периферической крови определять относительное содержание IL-lß+ моноцитов и при значениях данного показа-

теля 50% и более прогнозируется успешное восстановление репродуктивной функции пациенток после проведения хирургического лечения бесплодия.

2. При низких значениях относительного содержания IL-lß+ моноцитов (менее 50%) рекомендуется определять в периферической крови пациенток с бесплодием при стадиях наружного генитального эндометриоза до проведения лапароскопии относительное содержание TLR2+ моноцитов, уровень экспрессии мРНК NOD2 и RAGE. При значениях показателя TLR2+ моноцитов 66% и менее рекомендуется назначить в раннем послеоперационном периоде курс иммуномодулирующей терапии (препарат Ликопид в дозе 10 мг в течение 10 дней).

3. Для оценки эффективности иммупомодулирующей терапии рекомендуется проводить повторное иммунологическое обследование пациенток через 1 месяц после лечения и в случае повышения показателя относительного содержания TLR2+ моноцитов, экспрессии мРНК NOD2 и снижении экспрессии мРНК RAGE прогнозируется успешное наступление беременности в течете 1 года после лапароскопии.

4. У контингента пациенток с одновремешю низкими значениями содержания IL-lß+ моноцитов и высокими показателями количества TLR2+ моноцитов после проведения хирургического лечения ввиду неблагоприятного прогноза в отношении' наступления спонтанной беременности рекомендуется своевременное решение вопроса о применении ВРТ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в журналах, включённых в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ:

1. Анциферова Ю.С., Романова C.B., Красильникова А.К. Влияние in vitro препарата ГМДП на экспрессию сигнальных рецепторов и продукцию ци-токинов фагоцитами периферической крови и перитонеальной жидкости при эндометриозе // Российский иммунологический журнал.- Т.6(14), №2(1), 2012,- С.143-145

2. Малышкина А.И., Красильникова А.К., Романова C.B. Особенности системных реакций врожденного иммунитета у женщин с бесплодием при

«малых» формах наружного гениталыюго эндометриоза // Российский иммунологический журнал,- Т.6(14), №2(1), 2012,- С. 84-86

3. Малышкина А.И., Сотнйкова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Красилышкова А.К., Романова C.B. Новые подходы к медикаментозной коррекции иммунных нарушений у пациенток с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза // Проблемы репродукции (спецвыпуск) -Москва.-2012,-С. 136-137

4. Малышкина А.И., Романова C.B., Анциферова Ю.С., Красилышкова А.К. Влияние иммуномодулирующей терапии с использованием препарата Ли-копид на функциональное состояние моноцитов периферической крови женщин с бесплодием и «малыми» формами наружного генитального эндометриоза // Российский иммунологический журнал,- Т.7(16), №2-3,- 2013.-С.280

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы

докладов:

1. Малышкина А. И., Сотнйкова Н. Ю., Романова С. В., Красилышкова А. К., Анциферова Ю. С. Значение факторов врожденного иммунитета в развитии бесплодия у женщин с «малыми» формами наружного генитального эндометриоза // Материалы XII Всероссийский научный форум «Мать и дитя»,-Москва.- 2011- С.360

2. Малышкина А.И., Сотнйкова Н.Ю., Романова C.B., Красилышкова А.К., Анциферова Ю.С. Влияние препарата Ликопид на иммунологические показатели женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза: связь с восстановлением репродуктивной функции. // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва,-2012.- С.301-302

3. Романова C.B. Влияние Ликопида на функциональное состояние моноцитов в крови у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза // Материалы 66-й научной конференции молодых ученых - г.Ярославль-2012.- С.114

4. Романова C.B., Малышкина А.И., Сотнйкова Н.Ю. Особенности внутриклеточной продукции провоспалительпых цитокинов моноцитами периферической крови у женщин с бесплодием при «малых» формах наружного гени, талыюго эндометриоза. // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А.Алмазова.- 2012.- С.

40

5. Малышкина А.И., Романова C.B., Сотнйкова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Красилышкова А.К. Изменение сывороточного содержания RAGE при наружном гениталыюм эндометриозе // Амбулаторно-поликлиническая помощь — в эпицентре женского здоровья,- Сборник тезисов V Всероссийского Конгресса. - Москва. - 2013.-С.233-235

6. Романова C.B. Значение маркеров воспаления в прогнозировании наступления беременности у женщин с наружным генитальным эндометриозом после хирургического лечения Н Материалы 93-й ежегодной научной конфе-

ренции студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки- 2013» - Иваново.- 2013.- С.172

7. Красильникова А.К., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Романова C.B. Дифференцированный подход к назначению иммуномодули-рующей терапии женщинам с бесплодием при «малых» формах наружного генитального эндометриоза. // Мать и дитя: материалы XIV Всероссийского научного форума - М., 2013.- С.326-327.

8. Малышкина А.И., Красильникова А.К., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Романова C.B. Применение иммуномодуляторов в лечении пролифератив-ных гинекологических заболеваний// VII Международный конгресс по репродуктивной медицине - М.,2013.-С.337-338.

Список условных сокращений: PRR- паттерн-распознающий рецептор RAGE - рецептор конечных продуктов гликозилирования CD - кластер дифференцировки лимфоидных клеток TNFa- фактор некроза опухоли NOD - образ-распознающий рецептор TLR - толл-подобный рецептор мРНК - матриксная рибонуклеиновая кислота IL - интерлейкин

ЭКО -экстракорпоральное оплодотворение ГМДП- глюкозамонимурамилдипептид УЗИ - ультразвуковое исследование ЭКГ - электрокардиограмма

ВРТ- вспомогательные репродуктивные технологии