Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Роль актин-миозиновых структур в механизмах подвижности нормальных и трансформированных фибробластов

На правах рукописи

ШУТОВА Мария Сергеевна

РОЛЬ АКТИН-МИОЗИНОВЫХ СТРУКТУР В МЕХАНИЗМАХ ПОДВИЖНОСТИ НОРМАЛЬНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

Специальность 14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004601033

Москва 2010

004601033

Работа выполнена в лаборатории механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук член-корр. РАН, профессор ВАСИЛЬЕВ Юрий Маркович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

СТАВРОВСКАЯ Алла Александровна

доктор биологических наук, профессор СМИРНОВА Елена Александровна

Ведущая организация: Институт цитологии

Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится «2 А) 2010 г. в /'Г . часов на заседании

диссертационного совета (Д.001.017.01) Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « ¿^^£2^^2010 года. Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

При опухолевой прогрессии нарушаются не только механизмы нормальной пролиферации клеток, но и их локомоторная активность, что приводит к таким проявлениям «асоциального» поведения опухолевых клеток, как инвазивный рост и метастазирование.

На клеточном уровне основой возникновения этих свойств являются генетические изменения, приводящие к нарушению регуляции адгезии и подвижности клеток (Yamazaki et al., 2005). Установлено, что в этих процессах определяющую роль играют перестройки цитоскелетных структур. Трансформированные клетки зачастую отличаются от нормальных по своей морфологии и организации цитоскелета (Bershadsky and Vasiliev, 1988). Реорганизации цитоскелета, особенно изменения клеточной сократимости, регулируемой актин-миозиновым комплексом, имеют центральное значение для развития фенотипа морфологически трансформированных клеток с инвазивным поведением. Редукция стресс-фибрилл, характерная для многих типов трансформированных клеток, сопряжена с нарушением созревания контактных структур (Ровенский и Васильев, 2004) и часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Рокота et al., 1994; Sahai and Marshall, 2003).

Таким образом, изучение механизмов нормальной подвижности клетки и нарушений этих механизмов является одной из важнейших задач современной клеточной биологии.

Согласно современным данным, глазную роль в определении локомоторного фенотипа играет динамическое взаимодействие двух основных систем цитоскелета - микротрубочек (МТ) и актин-миозиновой системы, создающей внутри клетки и в окружающем ее матриксе механическое натяжение, регулируемое молекулярной системой малых ГТФ-аз семейства Rlio. Предыдущие работы нашей лаборатории дают основание предположить, что одним из ключевых событий в приобретении способности к инвазии является Rho-зависимое снижение актин-миозиновой контрактильности при сохранении структуры и активности системы МТ. Заслуживает внимания дальнейшее исследование механизмов Rho-зависимой регуляции реорганизаций цитоскелета, а также формы, адгезии и движения в одном из основных морфологических типов клеток - в фибробластах.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение роли актин-миозиновой системы в определении морфологии и подвижности фибробластов в норме и при RAS-трансформации. Мы использовали клетки линии REF52tetRas с тетрациклин-регулируемой экспрессией онкогена RAS, в которых отмывка тетрациклина приводит к синтезу конститутивно активного белка и к морфологической трансформации клеток (Kopnin et al., 2003; Alexandrova et al., 2006).

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать изменения морфологии, подвижности и направленности движения нетрансформированных фибробластов при подавлении актин-миозиновой сократимости (с помощью ингибиторов Y27632 и блеббистатина) по следующим пунктам:

- исследование строения цитоскелетных структур и фокальных контактов иммунофлуоресцентными методами;

- видеонаблюдение с целью изучения поведения индивидуальных клеток;

- оценка скорости и степени распластывания клеток с помощью компьютерного морфометрического анализа;

оценка эффективности направленной миграции клеток в экспериментальную рану;

- ультраструктурное исследование цитоскелета методом платиновых реплик;

- исследование динамики восстановления актин-миозиновых структур после

отмывки ингибиторов сократимости.

2. Охарактеризовать изменения в морфологии и подвижности фибробластов

при /¿-^-трансформации.

3. Сравнить изменения в морфологии и локомоторном поведении трансформированных и нетрансформированных клеток в присутствии агентов, изменяющих организацию актин-миозинового цитоскелета (Y27632, блеббистатин, латрункулин А, цитохалазин D).

Научная новизна и практическая значимость работы

Необходимость дальнейших исследований молекулярных и клеточных механизмов морфологической трансформации и инвазивных миграций опухолевых клеток не подлежит сомнению. Взаимодействие различных компонентов цитоскелета и регуляторные пути при развитии инвазивиого фенотипа еще не достаточно изучены.

В настоящей работе впервые проведен детальный анализ динамики актин-миозинового цитоскелета и локомоторного поведения трансформированных фибробластов в сравнении с нетрансформированными, а также проанализирована роль двух основных процессов - полимеризации актина и актин-миозинового сокращения - в клеточной подвижности.

В последние годы получены новые соединения, избирательно меняющие активность белков, регулирующих динамику цитоскелета, это Y27632, ингибитор активирующей миозин Rho-киназы (Ishizaki et al., 2ООО), и блеббистатин, ингибитор немышечного миозина II (Straight et al., 2003). В нашей работе впервые проведено сравнение локомоторных реакций нормальных и трансформированных фибробластов на эти агенты, а также на ингибиторы полимериации актина (латрункулин А и цитохалазии D).

Мы показали, что трансформированные клетки имеют сходство с клетками, обработанными ингибиторами сократимости: это усиление локомоторной активности на фоне ослабления/разрушения системы актин-миозиновых пучков. Однако, в отличие от трансформированных клеток, нормальные фибробласты сохраняют способность к направленному движению и под действием ингибиторов сократимости, которое поддерживается системой МТ.

Показано, что трансформированные клетки иначе реагируют на низкие концентрации ингибиторов полимеризации актина, а именно утрачивают актин-миозиновые пучки, но не псевдоподиальную активность. Напротив, нормальные клетки утрачивают активность края, но сохраняют пучки.

Впервые показано, что минимальная активность немышечного миозина II играет ключевую роль в первичном прикреплении и эффективной протрузии клеточного края. Также показано, что организация миозина в «рабочие единицы» - биполярные филаменты - зависит от степени и характера развития стресс-фибрилл в клетке.

Таким образом, ослабление актин-миозиновой системы в значительной мере обуславливает усиление подвижности &4£-трансформированных клеток, хотя, вероятно, ненаправленность движения обусловлена активацией других сигнальных путей, ведущих от онкобелка Ras к цитоскелету.

Изучение механизмов регуляции перестроек цитоскелета и подвижности клеток, возможно, в дальнейшем откроет подходы к направленному исправлению молекулярных и клеточных нарушений, приводящих к инвазии, например, через нормализацию функций регуляторных белков, в частности, Rho-системы.

Апробация работы

Диссертация апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, иммунохимии, генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН и отдела математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 30 сентября 2009 г.

Материалы диссертационной работы были представлены на XII и XIII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005 и 2006); на конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006); на конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); на XII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2008); а также на международных конференциях The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting (San Francisco, 2008) и The American Society for Cell Biology 49th Annual Meeting (San Diego, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 144 страницах, содержит 64 рисунка и 9 таблиц и состоит из следующих разделов: Списка сокращений, Введения, Обзора литературы, Материалов и Методов, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего 163 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточная культура. В работе использовали клетки линии REF52tetRas, любезно предоставленные проф. Б.П. Копниным (Agapova et al., 1999; Kopnin et al., 2003). Клетки были получены из исходной линии REF52 (иммортализованные крысиные эмбриональные фибробласты) путем трансфекции плазмидой с геном конститутивно активного белка N-Ras/aspl2 под тетрациклин-зависимым супрессором. Таким образом, мы имели возможность регулировать экспрессию онкогена N-/1-1S' и тем самым вызывать трансформацию клеток путем добавления/отмывки тетрациклина из среды. Клетки культивировали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки (РАА Laboratories GmbH) и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, 100 ед./мл) при 37°С и 5% С02. Клетки вели в среде с добавлением тетрациклина (2 мкг/мл) каждые три дня. Для трансформации клеток тетрациклин отмывали и культивировали клетки в среде без тетрациклина в течение 5 дней, после чего использовали в экспериментах.

Ингибиторы. В экспериментах использовали следующие ингибиторы: Y27632 - ингибитор Rho-киназы (45 мкМ) (Calbiochem); блеббистатин -ингибитор ЛТФ-азнсй активности немышечного миозина II (45, 75 и 100 мкМ) (Toronto Research Chemicals Inc.); ингибиторы полимеризации актина -латрункулин А (0.5,1,2 мкМ) (Calbiochem) и цитохалазин D (0.2 мкг/мл) (Sigma); колцемид - агент, деполимеризующий микротрубочки (0.5 мкг/мл) (Sigma).

Иммунофлуоресцентное окрашивание и микроскопия. Для иммунофлуоресцентного окрашивания цитоскелетных структур применяли фиксацию 3.7% параформальдегидом на PBS, либо холодным метанолом (для окрашивания МТ). Для одновременного окрашивания МТ и микрофиламентов, клетки фиксировали 2.5% глютарапьдегидом. Для окрашивания F-актина применяли флуоресцентные красители alexa 488 и 594 phalloidin (Molecular Probes). В исследовании были использованы следующие первые антитела: рАЬ rabbit-anti-Myosin (Non-muscle) IgG (Biomedical Technologies Inc.), pAb rabbit anti-p34-Arc/ARPC2 (Upstate, Millipore), mouse monoclonal anti-vinculin (Clone hVIN-l, Sigma), anti-a-tubulin mouse monoclonal IgGl (Clone DM1-A, Sigma), anti-acetylated tubulin mouse monoclonal IgG2B (Clone 6-11-B-l, Sigma), pAb rabbit anti-Phospho-Myosin Light Chain 2 (Thrl8/Serl9) (Cell Signaling Technology). В качестве II антител использовали: TRITC goat anti-mouse (Sigma), TRITC goat anti-rabbit (Molecular Probes), alexa 488 goat anti-mouse (Molecular Probes), alexa 488 goat anti-rabbit (Molecular Probes), FITC goat anti-mouse IgGl (Southern Biotech), TRITC goat anti-mouse IgG2B (Southern Biotech).

Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan (Zeiss) (20х, 40х, ЮОх), камеры Olympus DP70 с программным обеспечением DP Controller. Мы использовали также флуоресцентный микроскоп Eclipse Ti (Nikon) (ЮОх) с камерой Hamamatsu ORCA ER (Hamamatsu Photonics) и программным обеспечением NIS-Elements AR.

Оценка скорости распластывания и морфометрический анализ. Для характеристики распластывания клетки (50 тыс. кл./мл) высевали в 35 мм-чашки Петри на покровные стекла и фиксировали через 2, 4 и 24 ч, затем окрашивали

фаллоидином и фотографировали (40х). Полученные изображения одиночных клеток (30 клеток на точку) использовали для морфометрического анализа. Контуры клеток в цифровом виде были проанализированы с помощью программы TRACER VI.0 (Dunn and Brown, 1986). Скорость распластывания оценивали путем сравнения площади и степени поляризации клеток на разных сроках фиксации. Степень поляризации определяли как сумму двух параметров -дисперсии и элонгации клеточного контура (Brown et al., 1989).

Анализ миграции в рану и направленности движения. Миграционную способность оценивали по стандартной методике - анализу миграции клеток в экспериментальную рану (Valster et al., 2005). Клетки высаживали на размеченные сеткой покровные стекла 18x18 мм (Photoetchcd Coverslips, Bélico Biotechnology, Inc.), доращивали до монослоя и удаляли часть монослоя с помощью лезвия бритвы. Фотографировали 5 полей зрения (участков раны) на точку с использованием инвертированного микроскопа Axiovert 200 (Zeiss) (10*) и камеры AxioCam MRc (Zeiss) с программным обеспечением Axiovision 4.3. Далее клетки инкубировали в присутствии/отсутствии ингибиторов в течение суток. Через 24 ч после нанесения раны клетки фиксировали и окрашивали DAPI (Sigma). После чего по разметке на стеклах были найдены сфотографированные ранее поля зрения и вновь сфотографированы в режиме фазы и флуоресценции.

Количественную оценку миграции в рану осуществляли путем подсчета клеток, вышедших в рану на определенное расстояние за сутки на участке шириной 1000 мкм. Полученные кадры накладывали друг на друга в программе Adobe Photoshop CS2, что позволяло производить точный подсчет клеток, вышедших за изначальную границу раны. Пространство раны, начиная от бывшей границы, разбивали на полоски по 50 мкм и подсчитывали количество клеток в каждом. На основании полученных данных строили графики распределения клеток по расстояниям. Количество мигрировавших опытных клеток и максимальное расстояние выражали в процентах по отношению к контролю.

Для оценки направленности движения клеток фазовые изображения получали с интервалом в 1 ч в течение 4 ч через сутки после нанесения раны (30 клеток на точку). Позицию клетки определяли по положению ядра. Направленность миграции оценивали как отношение D/T (расстояние между начальной и конечной точками пути клетки, поделенное на общую длину пути). D, Т и скорость миграции клеток были измерены с помощью программы ImageJ.

DIC-видеомикроскопия. Для видеонаблюдения клетки высаживали на покровные стекла площадью 18x18 мм. За 24 ч до начала видеосъемки наносили широкую рану в монослое. Ингибиторы добавляли перед видеосъемкой. Для видеонаблюдения использовали клетки, обработанные Y27632, но не блеббистатином, поскольку блеббистатин инактивируется под воздействием света (Kolega, 2004). DIC-видеомикроскопию проводили с использованием микроскопа Leitz Aristoplan (40х) в условиях постоянной температуры. Видеозапись проводили с интервалом 30 сек между кадрами в течение 2-4 ч с помощью цифровой камеры Hamamatsu (C8484-05G, Hamamatsu Photonics) с программным обеспечением Wasabi (Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH).

Платиновые реплики и электронная микроскопия. Коррелятивная электронная микроскопия платиновых реплик цитоскелета позволяла одновременно рассмотреть взаимную пространственную организацию актиновых, миозиновых и контактных структур в одной клетке при большом разрешении электронного микроскопа. Метод получения платиновых реплик с цитоскелетных препаратов включает в себя следующие этапы обработки культивируемых клеток: экстракция, фиксация, высушивание методом перехода критической точки, напыление, отмывка реплик (подробно см. Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Для получения флуоресцентных изображений клетки окрашивали после экстракции и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Eclipse ТЕ2000 (Nikon) (100*), камеры Cascade 512В (Roper Scientific, Trenton, NJ) с программным обеспечением MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale).

Для визуализации миозина на электронно-микроскопическом уровне клетки окрашивали вторыми антителами, конъюгированными с коллоидным золотом: 18 nm Colloidal gold donkey anti-rabbit (Immunoresearch Laboratories Inc.), 1:5 в буфере А с 1% BSA. Поскольку сеть актиновых филаментов в клетке перекрывает другие цитоскелетные структуры при исследовании реплик, для подробного рассмотрения миозиновых структур готовили препараты, где актин был удален с помощью разрезающего белка гельзолина (0.4 мкг/мл в MES-KOH рН 6.3).

Платиновые реплики цитоскелета исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 1200ЕХ и CCD камеры ORIUS 835.10W (Gatan) с программным обеспечением Gatan Digital Micrograph. Изображения представляли в инвертированном виде.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эффект ингибиторов сократимости на организацию и локомоторное поведение ^трансформированных фибробластов.

1.1. Контрольные ^трансформированные клетки.

Клетки линии REF52tetRas, культивируемые в присутствии тетрациклина, морфологически не отличались от исходной линии крысиных эмбриональных фибробластов REF52. Они были хорошо распластаны и поляризованы, имели мощные стресс-фибриллы и крупные фокальные контакты. Миозин II имел четкую колокализацию с актиновыми пучками и давал так называемую поперечную исчерченность. Контрольные клетки были способны к направленной миграции в экспериментальную рану. В процессе движения они формировали широкую ламеллу на переднем крае и 1-2 коротких хвоста, которые периодически подтягивались.

1.2. Локомоторный фенотип клеток с подавленной сократимостью.

Для подавления клеточной сократимости мы использовали: Y27632 -ингибитор активирующей миозин Rho-киназы и блеббистатин - ингибитор АТФ-азной активности миозина II. Было показано, что 45 мкМ Y27632 и 45 мкМ блеббистатина вызывали сходные изменения. При этой концентрации ингибиторов в клетках пропадали мощные актин-миозиновые пучки и зрелые

фокальные контакты. Вдоль клеточного края сохранялись ламеллиподии и точечные фокальные комплексы. Миозин II окрашивался диффузно, поперечная исчерченность пропадала. При проведении экстракции клеток перед фиксацией интенсивность окраски миозина существенно снижалась, т.е. большая часть миозина была не связана с актином и вымывалась.

Движение клеток, обработанных Y27632 (блсббистатин не использовали для видеонаблюдения), сопровождалось значительными изменениями клеточной формы. Наиболее значимым изменением было образование и удлинение несократимых хвостов на заднем конце клетки. Ламеллы расширялись, боковые стабильные края пропадали, и на их местах формировались новые протрузии. Боковые ламеллы периодически коллапсировали и превращались в хвосты. Но псевдоподиальная активность никогда не возникала в уже сформированных хвостах. Всегда существовала одна ведущая лзмелла, за которой направленно двигалось тело клетки.

В клетках, обработанных Y27632 или блеббистатином, большая часть МТ была направлена к активному краю, а остальные формировали в хвостах плотные тяжи, обогащенные ацетилированным тубулином, что свидетельствовало о повышенной стабильности МТ.

Эффективность миграции обработанных клеток значительно увеличивалась по сравнению с контролем: за 24 ч количество мигрировавших клеток возрастало приблизительно в полтора раза, и максимальная дальность миграции была также почти в полтора раза выше (табл. 1, рис. 1).

Рис. 1. Распределение клеток по расстояниям при миграции в рану в присутствии ингибиторов миозина II. Диаграмма иллюстрирует результаты одного из трех аналогичных опытов.

L, мкм

Табл. 1. Результаты анализа миграции контрольных и обработанных ингибиторами клеток. N кл. - общее число клеток, вышедших за границу раны за 24 ч; L - максимальное расстояние, пройденное клетками за 24 ч. Результаты для клеток с ингибиторами представлены как процент от контроля ± SEM.

контр. Y27632 блебб. колц. У27632+колц бл.+колц.

N кл., % 100 150.6±12.6 146.9±26.6 18.8±9.8 17.0±8.0 16.6±4.8

L, % 100 160.6±14.4 170.7±16.8 36.5±7.9 45.7±9.9 40.1±4.3

Наши данные показывают, что, вопреки распространенному мнению, миозин-зависимая ретракция не является необходимой для направленного клеточного движения: полярность клетки и способность к направленной миграции сохраняется в присутствии ингибиторов миозина И. С другой стороны, высокая степень развития стресс-фибрилл, видимо, не способствует высокой

скорости перемещения: очень много актина занято в построении пучков и затруднена разборка старых фокальных контактов.

1.3. Способность клеток с подавленной сократимостью к поляризации.

Способность к поляризации мы оценивали по двум характеристикам - это способность клеток к направленному движению и способность к развитию поляризованного фенотипа в процессе распластывания.

Направленность миграции. В результате ингибирования миозина направленность движения не претерпевала изменений, а скорость значительно повышалась по сравнению с контролем (р<0.001 для У27632 и блеббистатина согласно тесту Стьюдента) (табл. 2).

Табл. 2. Направленность и скорость движения нетрансформированных клеток при миграции в экспериментальную рану в течение 4 ч.

контроль Y27632 блеббистатнн

Скорость, мкм/ч 19.2±0.7 40±1.7 26.7±1.0

D/T 0.90±0.02 0.95±0.01 0.94±0.01

Развитие поляризации de novo при распластывании. В процессе распластывания как контрольные, так и обработанные ингибиторами миозина клетки приобретали сначала дисковидную форму, а затем начинали поляризоваться. Поляризация контрольных клеток сопровождалась ориентацией стресс-фибрилл в едином направлении и последующим вытягиванием клетки. При ингибировании миозина первыми признаками поляризации клеток было с перераспределение МТ и псевдоподиальной активности. Через 4 ч в большинстве клеток был виден активный ведущий край, обогащенный микрофиламентами, и стабильный задний край, где утрачивалась псевдоподиальная активность и инициировались хвосты. К переднему активному краю клетки подходило множество МТ, тогда как сзади их было значительно меньше.

1.4. Потеря способности к поляризации и направленному движению при деполимеризации МТ колцемидом.

Один из возможных механизмов участия системы МТ в организации направленного движения подразумевает взаимодействие МТ с актин-миозиновыми пучками и фокальными контактами (Small and Kaverina, 2003). Мы показали, что при ингибировании миозина и утрате мощных пучков и контактов нетрансформированные клетки сохраняют способность к поляризации и направленному движению. Клетки формировали хвосты, содержащие тяжи стабильных МТ, и эти хвосты всегда находились на заднем конце мигрирующей клетки, а начало развития поляризации при распластывании совпадало с перераспределением МТ. Мы решили проверить, действительно ли система МТ регулирует направленное движение клетки в отсутствие стресс-фибрилл.

Разборка МТ колцемидом приводила к потере поляризации контрольных клеток. Мигрирующие в рану клетки утрачивали направление движения и останавливались в течение 10-20 мин после добавления колцемида, несмотря на высокую псевдоподиальную активность. Соответственно, миграция в рану была сильно подавлена (табл. 1, рис. 2).

45

40

35

30

£ 25

г 20

15

10

5

0

V

контроль I

колцемид

-У27632+колцемид I "блебб.+колцемид |

N

[_, мкм

При добавлении колцемида к клеткам, предобработанным У27632 или блеббистатином, большая часть МТ исчезала, но стабильные МТ часто сохранялись в хвостах. Однако клетки также утрачивали поляризацию и способность к направленному движению (табл. 1, рис. 2). Таким образом, ингибиторы сократимости никак не увеличивали скорость миграции в присутствии колцемида.

Рис. 2. Колцемид ингибирует миграцию в рану как необработанных, так и обработанных У27632 или блеббистатином клеток. Диаграмма иллюстрирует один репрезентативный эксперимент.

Исходя из этих данных, мы предположили, что направленность движения клеток с подавленной активностью миозина определяется упорядоченным пространственным распределением МТ в интегрированной системе, т.е. относительным положением тяжа МТ в хвосте и МТ в ведущей ламелле. Возможно, собранные в пучок стабильные МТ хвоста не способствуют полимеризации актина и протрузии края, тогда как полимеризация поддерживается и усиливается МТ в ламелле.

1.5. Клетки с пониженной сократимостью распластываются быстрее.

Одним из проявлений клеточной подвижности является способность клетки к распластыванию. Мы исследовали динамику распластывания фибробластов через 2, 4 и 24 ч после посадки. Мы показали, что фибробласты с подавленной сократимостью распластывались интенсивнее, т.е. быстрее достигали конечной площади, чем контрольные клетки, и имели более высокую степень поляризации за счет образования длинных хвостов, тогда как конечная площадь обработанных клеток практически не отличалась от контроля (табл. 3, рис. 3).

Табл. 3. Данные морфометрического анализа контуров клеток через 2, 4 и 24 ч распластывания в контроле и при обработке У27632 и блеббистатином.

площадь, кв. мкм дисперсия элонгация степень поляризации

контроль 2ч 1551±82 0.035±0.005 0.256±0.03 0.291±0.033

4ч 2541±92 0.048±0.007 0.521±0.064 0.569±0.067

24ч 4665±209 0.177±0.022 1.178±0.05 1.355±0.053

У27632 2ч 2860±94 0.013±0.001 0.211±0.023 0.224±0.024

4ч 3213±105 0.07±0.0П 0.387±0.052 0.457±0.059

24ч 4689±247 1361*0.146 1.445±0.131 2.805±0.212

блебб. 2ч 2180±96 0.045±0.006 0.43±0.053 0.476±0.056

4ч 2849±147 0.098±0.011 0.456±0.058 0.553±0.061

24ч 5566±322 1.774±0.131 1.574±0.119 3.348±0.199

Вероятно, существует обратная зависимость скорости распластывания от активности миозина II. Во-первых, актин-миозиновое натяжение в пучках может сдерживать распластывание. Во-вторых, в присутствии Y27632 и блеббистатина может усиливаться полимеризация актиновой сети и протрузия края, например, за счет активации Rae.

2. Эффект ингибиторов сократимости на организацию и локомоторное поведение трансформированных фибробластов.

2.1. Изменения морфологиии фибробластов при /гл^-трансформации.

При ЛЛ^-трансформации клетки становились хуже распластанными и образовывали хвосты и отростки в разных направлениях. Увеличивалось количество ровных вогнутых краев, уменьшались размеры ламелл. Другим характерным признаком ¿'-трансформированных клеток было ослабление и утрата упорядоченной организации актин-миозиновых пучков. Фокальные контакты становились более мелкими. Трансформированные фибробласты имели более одного активного края, и участки псевдоподиальной активности были непостоянны. Так, в норме кратковременная активация Ras под воздействием внешнего стимула инициирует полимеризацию актина и формирование активного края и тем самым регулирует полярность клетки и направленность движения (Burridge and Wennerberg, 2004; Sasaki et al., 2004). Мы предполагаем, что при постоянной активации Ras в трансформированных клетках индукция полимеризации актина происходит спонтанно на разных участках края вне зависимости от каких-либо стимулов.

2.2. Морфология трансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости.

При обработке Y27632 или блеббистатином трансформированные фибробласты образовывали длинные ветвящиеся отростки и тонкие хвосты, приобретая причудливую форму. Как и в случае действия ингибиторов на нетрансформированные клетки, актин-миозиновые пучки пропадали, в ламеллах выявлялась густая сеть микрофиламентов и интенсивное образование раффлов. Немногочисленные фокальные контакты исчезали, но оставались точечные фокальные комплексы.

Итак, при Л45-трансформации ослабевает система актин-миозиновых пучков и фокальных контактов. Действие ингибиторов сократимости на трансформированные клетки проявляется еще более полной утратой этих структур и образованием многочисленных отростков, имеющих псевдоподиальную активность.

2.3. Миграция трансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости.

Трансформированные клетки мигрировали в рану более эффективно: их количество (N) и пройденные дистанции (L) всегда были больше, чем для контрольных нетрансформированных клеток. Было отмечено, что кривая миграции трансформированных фибробластов практически совпадает с кривой для нетрансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости. Однако движение трансформированных клеток утрачивало направленный

характер. Ненаправленный характер миграции в сочетании с высокой скоростью обусловлен, видимо, спонтанным и интенсивным образованием протрузий в трансформированных клетках.

При подавлении сократительной активности миозина II в трансформированных клетках дальность миграции также увеличивалась, но, как правило, дальше выходили лишь единичные клетки. Так, расстояние более 900 мкм преодолели менее 3% клеток. Общее же число мигрировавших трансформированных клеток в серии опытов не сильно различалось в присутствии и в отсутствии ингибиторов сократимости (табл. 4, рис. 4).

Табл. 4. Количество клеток и пройденные расстояния при миграции в рану трансформированных фибробластов, обработанных У27632 и блеббистатином.

/Ш1 Л45+У27632 &4?+блебб.

N кл. 436 372 441

100% 85% 101%

Ь, мкм 900 1200 1300

100% 133% 144%

Рис. 4. Распределение по расстояниям при миграции в рану ^/^-трансформированных клеток в присутствии блеббистатина и У27632 (по результатам одного из 3 аналогичных экспериментов).

Мы увидели, что при ЯА5-трансформации подвижность фибробластов повышается, как и при подавлении сократимости в нетрансформированных клетках. Миграционная способность трансформированных клеток при воздействии ингибиторов миозина увеличивается в меньшей степени, нежели миграция нетрансформированных.

2.4. Эффект ингибиторов миозина II на динамику распластывания и поляризацию трансформированных фибробластов.

Распластывание трансформированных клеток происходило фрагментарно: псевдоподиальная активность не распределялась равномерно по всему краю, а сосредотачивалась на нескольких участках, где сразу начиналось образование отростков, таким образом, отсутствовала стадия радиального распластывания (рис. 3). На каждой стадии площадь клеток была примерно в два раза меньше, чем в контроле (табл. 3 и 5). Трансформированные клетки поляризовались раньше, и их степень поляризации была выше, чем у контрольных фибробластов, за счет повышения дисперсии, т.е. за счет образования отростков (табл. 3 и 5).

Под воздействием ингибиторов миозина скорость распластывания трансформированных клеток увеличивалась в меньшей степени, нежели в случае нетрансформированных, а степень поляризации (дисперсия) сильно возрастала за счет интенсивного образования хвостов и отростков (табл. 5).

и мкм

Табл. 5. Данные морфометрического анализа контуров трансформированных клеток через 2,4 и 24 ч распластывания при действии У27632 и блеббистатина.

площадь, кв. мкм дисперсия элонгация степень поляризации

№ 2ч 844±45 0.140±0.023 0.499±0.057 0.639±0.067

4ч 1159±65 0.606Я).056 0.943±0.087 1.548±0.116

24ч 2283±146 0.808±0.081 1.306±0.114 2.115±0.114

Л45+У27632 2ч 1046±81 0.97&Ь0.075 0.9Ш.103 1.887±0.139

4ч 1116±59 1.48±0.099 1.103±0.101 2.583±0.103

24ч 2932±193 2.214±0.146 2.08±0.148 4.294±0.146

Л45+блебб. 2ч 1216±53 1.043±0.078 0.86±0.103 1.903±0.107

4ч 1794±80 0.96±0.092 1.154±0.142 2.114±0.185

24ч 2793±146 2.344±0.155 1.921±0.145 4.265±0.144

Итак, при сравнении фенотипов трансформированных клеток с нормальными клетками, обработанными ингибиторами миозина, мы выявили несколько общих черт: 1) ослабление актин-миозиновых структур и контактов; 2) повышение псевдоподиальной активности и усиление миграции; 3) увеличение степени поляризации. Отличия же состоят в том, что трансформированные клетки гораздо хуже распластаны и мигрируют менее направленно. Ухудшение распластывания в данном случае нельзя объяснить ослаблением актин-миозиновой системы, поскольку ингибирование миозина в нормальных клетках приводит к усилению распластывания. Мы полагаем, что при трансформации нарушения затрагивают систему адгезии (например, через активность белка Зге), что и влечет «недоразвитие» системы стресс-фибрилл: мощные пучки не могут развиться на слабых контактах. Во-первых, это объясняет тот факт, что эффект ингибиторов миозина становится менее выражен. Если ослабление пучков при трансформации вызвано ухудшением адгезии, а уровень активации миозина сохраняется, то ингибитор будет одинаково снижать ее в нормальных и трансформированных клетках. А так как пучки трансформированных клеток были слабее, то и видимый эффект ингибитора будет казаться меньше. Во-вторых, ослабленная система контактов не может поддерживать распластанное состояние, поскольку натяжение пучков ведет к легкому отрыву и подтягиванию клеточных краев. Поэтому площадь трансформированных клеток снижается в два раза.

3. Ультраструктура цитоскелета клеток при разной степени подавления миозиновой сократимости.

3.1. Ультраструктура ^трансформированных фибробластов.

На электронно-микроскопическом уровне, также как и на световом, выявлялись мощные актиновые пучки, закрепленные на крупных фокальных контактах. Клетки формировали плоские ламеллиподии, образованные густой актиновой сетью. Для определения локализации миозина мы использовали антитела, конъюгированные с коллоидным золотом. Миозин II был колокализован с актиновыми пучками. В контрольных клетках филаменты миозина располагались упорядочение и формировали регулярные структуры в виде цепочек и «стеков» (рис. 5).

Рис. 5. Организация миозина в нормальных, трансформированных и обработанных блеббистатином клетках, (а, в, д) Флуоресцентная окраска на актин (красный) и миозин II (зеленый) Масштаб 20 мкм. (б, г, е) Платиновые реплики цитоскелета (актин удален с помощью гельзолина). Стрелкой указан миозиновый филамент.

3.2. Ультраструктура клеток, обработанных блеббистатином.

Клетки, обработанные 45-75 мкМ блеббистатина, утрачивали мощные стресс-фибриллы, связанные со зрелыми фокальными контактами, что приводило к общему расслаблению клетки и неспособности к ретракции. Такие клетки хорошо прикрепляются к субстрату, образуют ламеллиподии и имеют высокую подвижность. На электронно-микроскопическом уровне мы обнаруживали тонкие актин-миозиновые пучки в центральной части ламеллы и равномерную сеть актина лишь непосредственно позади ламеллиподии. Мы решили посмотреть, как будет меняться структура ламеллы при более глубокой степени ингибирования миозина, и использовали также блеббистатин в концентрации 100 мкМ. Клетки, обработанные 100 мкМ блеббистатина, становились поджатыми, ламеллиподии пропадали, а фокальные комплексы выявлялись редко. Вместо ламеллиподий мы наблюдали образование филоподий и раффлов. Мы увидели, что большая часть миозина переходит в несвязанное с актином состояние и резко снижается количество миозиновых филаментов (рис. 5). К настоящему моменту не была показана зависимость сборки биполярных филаментов от АТФ-азной активности миозина II.

Мы заключили, что протрузия (образование ламеллиподий) и прикрепление края (образование фокальных комплексов) взаимозависимы, а для эффективного прикрепления необходима минимальная активность миозина II.

По традиционным представлениям, миозин-зависимое сокращение обеспечивает построение пучков и созревание контактов, но не протрузию ведущего края. Полимеризация актина в ламеллиподии и появление фокальных комплексов считается независимым от натяжения. Вероятно, инициация сборки фокальных комплексов действительно происходит без участия миозина, но они быстро подвергаются разборке, если к ним не приложено механическое натяжение. По нашим наблюдениям, ламеллиподии успешно формируются, только если они могут отталкиваться от сайтов адгезии, таким образом, они косвенно зависят от контрактильности миозина.

3.3. Ультраструктура /^^-трансформированных клеток.

Мы показали, что в трансформированных фибробластах также как и в контрольных клетках миозин организован в биполярные филаменты. Однако они не имеют единой ориентации и гораздо реже формируют регулярные структуры (рис. 5). При обработке трансформированных клеток блеббистатином миозиновые филаменты практически исчезают.

4. Восстановление актин-миозиновых структур при отмывке ингибиторов миозина II.

Изменения структуры цитоскелета под действием У27632 и блеббистатина были полностью обратимы. Мы наблюдали очень быстрое (в течение минут) восстановление актин-миозиновых структур при отмывке от 100 мкМ блеббистатина. Мы показали, что первым видимым изменением является образование и прикрепление ламеллиподий (мощные ламеллиподии и фокальные комплексы в их основании развиваются в течение 1 мин отмывки). Последовательно повышается фракция связанного с цитоскелетом миозина и

степень агрегации его в филаменты, в течение 5-15 мин развиваются стресс-фибриллы и созревают фокальные контакты.

5. Эффект ингибиторов полимеризации актина на локомоторное поведение ^трансформированных и трансформированных клеток.

5.1. Морфология клеток, обработанных ингибиторами полимеризации актина.

Мы подобрали низкие концентрации агентов, которые не ингибировали полимеризацию актина полностью, а лишь снижали ее интенсивность. При действии 0.5 мкМ латрункулина А, нетрансформированные клетки напоминали по форме контрольные, однако они становились более поджатыми. Клетки формировали мощные актин-миозиновые пучки, но ламеллиподии исчезали (рис. 3). Сохранялись только зрелые фокальные контакты на концах стресс-фибрилл, а новых фокальных комплексов не образовывалось. Действие цитохалазина D проявлялось сходным образом. Действие ингибиторов полимеризации актина на трансформированные фибробласты проявлялось абсолютно иначе: клетки формировали аномальные ламеллиподии и мелкие контакты при сильной дезорганизации остального актинового цитоскелета (рис. 3). Видеонаблюдение показало, что под действием латрункулина такие клетки сохраняли псевдоподиальную активность.

Мы показали, что низкие концентрации ингибиторов полимеризации актина подавляли в первую очередь образование ламеллиподий, но не пучков в нормальных клетках, тогда как в трансформированных клетках практически исчезали пучки и сохранялись ламеллиподии.

5.2. Миграция клеток, обработанных ингибиторами полимеризации актина.

Воздействие низких доз латрункулина А и цитохалазина D приводило к значительному подавлению миграционной способности как нормальных так и трансформированных клеток (табл. 6 и 7, рис. 6).

Табл. 6. Количество клеток и пройденные расстояния при миграции в рану контрольных клеток и обработанных латрункулином А и цитохалазином D.

контр. лат.А 1мк.М | лат.А2мкМ uut.D

N кл. 326 101 38 141

100% 31% 12% 43%

L, мкм 700 500 200 400

100% 71% 29% 57%

Табл. 7. Количество клеток и пройденные расстояния при миграции в рану трансформированных фибробластов, обработанных латрункулином А и цитохалазином О.

RAS /ШЧ-лат.А 0.5 мкМ Л45+лат.А 1 мкМ ЛЛЗЧ-лат.А 2 мкМ /MS+miT.D

N кл. 391 108 68 35 60

100% 28% 17% 9% 15%

L, мкм 850 600 450 300 400

100% 71% 53% 35% 47%

В°5гиА0,5мМ 'йблиМ мМ №5гвА2мМ

§ 8 й 8

и м^

Цмл1

Рис. 6. Распределение по расстояниям при миграции в рану нормальных и трансформированных клеток в присутствии латрункулина А и цитохалазина О.

5.3. Эффект ингибиторов полимеризации актина на динамику распластывания.

Действие латрункулина А приводило к серьезным нарушениям распластывания нетрансформированных клеток. На всех сроках края клеток оставались сглаженными, без прструзий. В распластывающихся клетках формировались короткие хаотично расположенные пучки, не образующие единой системы. На всех этапах распластывания площадь обработанных клеток была значительно снижена по сравнению с контролем (табл. 8, рис. 3). Несмотря на подавление распластывания, клетки в присутствии латрункулина могли поляризоваться, и степень их поляризации фактически не менялась.

Табл. 8. Данные морфометрического анализа контуров нормальных клеток через 2, 4 и 24 ч распластывания при обработке ингибиторами полимеризации актина.

площадь, кв. МКМ дисперсия элонгация степень поляризации

контроль 2ч 1551±82 0.035±0.005 0.256±0.03 0.29Ш.033

4ч 2541±92 0.048±0.007 0.521±0.064 0.569±0.067

24ч 4665±209 0.177±0.022 1.178±0.049 1.355±0.053

лат.Л 0.5 мкМ 2ч 390-Ы7 0.015±0.002 0.2±0.024 0.216±0.024

4ч 769±43 0.178±0.031 0.745±0.066 0.923±0.081

24ч 1498±80 0.08±0.015 0.887±0.11 0.967±0.118

цит.1) 2ч 501±25 0.074±0.016 0.487±0.055 0.561±0.059

4ч 813±44 0.14±0.019 0.578±0.069 0.718±0.073

24ч 1990±114 0.617±0.09 0.997*0.113 1.615±0.13

При подавлении полимеризации актина в трансформированных клетках не наблюдалось такого снижения скорости распластывания, а конечная площадь снижалась в меньшей степени, нежели площадь нетрансформированных клеток в присутствии ингибиторов (табл. 9).

Эксперименты по отмывке блеббистатина в присутствии латрункулина А показали, что для восстановления/образования как ламеллиподий так и пучков необходима полимеризация актина. Мы полагаем, что в трансформированных клетках баланс интенсивности полимеризации смещен в сторону

псевдогюдиальной активности за счет ослабления пучков. Возможно, это происходит за счет снижения активности Rho-киназы и повышения активности Rae (Sahai et al, 2001), Поэтому в условиях «дефицита» G-актина под воздействием латрункулина весь свободный актин идет на построение ламеллиподии, тогда как пучки еще больше разбираются. У нормальных же клеток более чувствительным процессом оказывается формирование ламеллиподии, но не пучков.

Табл. 9. Данные морфометрического анализа контуров трансформированных клеток на 2,4 и 24 ч распластывания при действии латрункулина А и цитохалазина D.

площадь, КВ. МКМ дисперсия элонгация степень поляризации

RAS 2ч 844±45 0,140±0,023 0,499±0,057 0,639±0,067

4ч 1159±65 0,606±0,056 0,943±0,087 1,548±0,116

24ч 2283±146 0,808±0,081 U06±0,l 14 2,115±0,114

RAS +лат.А O.SmkM 2ч 692±40 0,232±0,063 0,648±0,09 0,88±0,107

4ч 785±44 0,464±0,074 0,594±0,Ю6 1,057±0,123

24ч 1148±74 0,901±0,1481 1,04б±0,149 1,947±0,226

RAS +цитЛ) 2ч 734±33 0,856±0,079 1,351±0,152 2,208±0,145

4ч 763±37 0,5±0,058 1,539±0,143 2,04±0,12

24ч 1252±68 0,897±0,108 1,268±0,146 2,165±0,163

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе мы подробно рассмотрели роль актин-миозинового структур в организации движения нормальных и трансформированных клеток. Понижение сократимости является частым характерным признаком клеток, подвергшихся трансформации, и наблюдается, в частности, в случае трансформации фибробластов онкогеном RAS. Мы увидели, что снижение (но не абсолютное подавление) сократимости коррелирует с усилением клеточной подвижности (добавление 45 мкМ блеббистатина, Л45-трансформация) (рис. 7). С другой стороны, мы показали, что минимальная активность миозина необходима для успешного прикрепления клетки к субстрату и эффективной протрузии клеточного края.

Разрушение системы стресс-фибрилл с помощью ингибиторов миозина не оказывает отрицательного влияния на развитие и поддержание поляризации фибробластов на двумерном субстрате. Мы полагаем, что механизм такой поляризации основан на взаимодействии двух сохраняющихся цитоскелетных систем - сети микрофиламентов и МТ. С другой стороны, RAS-трансформированные клетки, занимающие «промежуточное положение» по степени развития стресс-фибрилл между контрольными и обработанными ингибиторами, имеют нарушения поляризации. При высокой общей степени поляризации, они, как правило, мультиполярны: имеют высокую дисперсию, но не элонгацию, и постоянно меняют направление движения.

Мы показали, что нарушения поляризации и направленности движения трансформированных клеток не являются следствием ослабления системы актин-миозиновых пучков (подавление сократимости в нормальных клетках не приводит к нарушению поляризации), но, очевидно, являются следствием

нарушения других сигнальных путей, контролируемых онкобелком Ras. Так. снижение сократимости - только один из признаков ЛЛ5-трансформированных клеток.

Локомоторное поведение трансформированных клеток оказывается менее чувствительным к действию ингибиторов миозина II и полимеризации актина. Возможно, повышенная активация сигнальных путей у трансформированных клеток за счет постоянной активации Ras, приводит к тому, что они менее эффективно реагируют на внешние сигналы. Такая пониженная реакция трансформированных клеток на регуляторные сигналы, поступающие извне (в нашем случае на воздействие ингибиторов) является существенным адаптационным механизмом, позволяющим опухолевым клеткам инвазировать в соседние ткани, прикрепляться и образовывать новые колонии в условиях, в которых нормальные клетки существовать не могут.

Рис. 7. Схема зависимости клеточной подвижности от сократимости актин-миозинового цитоскелета. При снижении сократимости нормальных клеток с помощью ингибиторов миозина (светлые точки на схеме) клеточная подвижность повышается, но при максимальном ингибировании миозина (добавлении высоких доз ингибитора) нарушается формирование и прикрепление ламеллиподий, что негативно сказывается на подвижности. При /¿-(^-трансформации также снижается сократимость актин-миозина по сравнению с нормой, что усиливает подвижность, кроме того, происходят нарушения регуляции направленности движения, очевидно, не зависящие от изменений сократимости.

ВЫВОДЫ

1. При трансформации фибробластов онкогеном RAS актин-миозиновые пучки и фокальные контакты становятся менее выражены. Площадь трансформированных клеток снижается в два раза, они становятся мультиполярны, усиливается подвижность, но клетки двигаются менее направленно.

2. Нетрансформированные фибробласты при ингибировании миозин-зависимой сократимости утрачивают зрелые фокальные контакты и стресс-фибриллы, их подвижность существенно повышается. Однако такие клетки сохраняют способность к развитию поляризации и направленной миграции, что, вероятно, обеспечивается взаимодействием системы микрофиламентов и микротрубочек.

3. Фибробласты, трансформированные онкогеном RAS, имеют общие признаки с клетками, обработанными ингибиторами сократимости. Это

блебб

45мкМ RAS-

_ трансформация 75мкМ »

i О

блебб ЮОмкМ

сократимость

нарушение образования стресс-фибрилл и фокальных контактов, усиление псевдоподиапьной активности и подвижности, увеличение степени поляризации.

4. В контрольных ^трансформированных клетках миозиновые филаменты имеют высокую степень структурной организации. При /^^-трансформации они становятся менее упорядоченными. При разборке пучков под действием ингибиторов миозина миозиновые филаменты пропадают. Таким образом, в клетке агрегация миозина в биполярные филаменты зависит от того, в какой мере он задействован в стресс-фибриллах, хотя в условиях in vitro миозиновые филаменты могут собираться и без участия актина.

5. В нетрансформированных клетках стресс-фибриллы и фокальные контакты разрушаются ири неполном подавлении активности миозина II (45 мкМ блеббистатина). Максимальное подавление активности миозина (100 мкМ бллеббистатина) ведет к ингибированию образования ламеллиподий и фокальных комплексов. Эти процессы взаимозависимы и требуют минимальной активности миозина II. При отмывке блеббистатина первыми восстанавливаются ламеллиподии и фокальные комплексы. Для восстановления и ламеллиподий, и стресс-фибрилл при отмывке необходима полимеризация актина.

6. В нетрансформированных клетках при частичном подавлении полимеризации актина в первую очередь нарушается образование ламеллиподии, а в трансформированных клетках - образование пучков. Таким образом, при RAS-трансформации происходят изменения регуляции полимеризации актина в сторону усиления псевдоподиальной активности и одновременного нарушения построения пучков.

7. Таким образом, онкоген RAS вызывает, во-первых, нарушение регуляции полимеризации актина и снижение актин-миозиновой сократимости, что приводит к усилению подвижности клеток, и, во-вторых, потерю направленности движения, очевидно, обусловленную нарушением других сигнальных путей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Shutova M.S., Alexandrova A. Y., Vasiliev J.M. Regulation of polarity in cells devoid of actin bundle system after treatment with inhibitors of myosin II activity. // Cell Motility and the Cytoskeleton. - 2008. - V.65-9 - P. 734-746.

2. Шутова M.C., Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания нормальных и трансформированных фибробластов: роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения. // Цитология. - 2010. - Т.52 №1 - С. 41-51.

Тезисы конференций:

1. Шутова М.С. Роль Rho-киназы в морфогенезе и миграции нормальных и трансформированных фибробластов. // Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005». -Москва, 2005.-С. 261.

2. Шутова М.С. Сравнительное исследование подвижности нормальных и трансформированных фибробластов. Роль актина и миозина 2. // Тезисы докладов

XIII международно» конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». - Москва, 2006. - С. 254-255.

3. Шутова М.С., Александрова АЛО. Как ползет клетка. Перестройки цитоскелета, обеспечивающие движение клеток в культуре, роль актина и миозина 2. // Сборник тезисов конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» - Москва, 2006. - С. 26.

4. Александрова А.Ю., Шутова М.С. Ведущая роль Агр2/3-зависимой полимеризации актина и формирования первичных адгезионных структур в перестройках актинового цитоскелета, обеспечивающих движение клеток в культуре. // Тезисы конференции «Биология клетки в культуре». - Санкт-Петербург. - Цитология. - 2006. - Т.48 №9 - С. 741.

5. Шутова М.С., Александрова А.Ю. Исследование подвижности нормальных фибробластов. Роль актин-миозинового сокращения. // Тезисы конференции «Биология клетки в культуре». - Санкт-Петербург. - Цитология. -2006. -Т.48 №9-С. 813-814.

6. Shutova M.S., Svitkina Т.М. Dynamics of Actin Cytoskeleton Restoration after Blebbistatin Treatment. // The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting. - San Francisco, CA, 2008. - Poster #1125.

7. Александрова А.Ю., Ломакина M.E., Шутова M.C., Васильев Ю.М. Реорганизация актинового цитоскелета фибробластов в процессе движения. Нарушения, приводящие к инвазии при опухолевой трансформации. // Материалы XII Российского онкологического конгресса. - Москва, 2008. - С. 123-124.

8. Shutova M.S., Svitkina Т.М. Roles of myosin II in initiation of focal adhesion assembly during their restoration after blebbistatin treatment. // The American Society for Cell Biology 49th Annual Meeting. - San Diego, CA, 2009. - Poster # 1000.

Автор выражает глубокую благодарность Антонине Юрьевне Александровой за активное участие и помощь на всех этапах работы, а также Татьяне Михайловне Свиткиной за предоставленную возможность проведения электронно-микроскопических исследований.

Подписано в печать:

15.03.2010

Заказ № 3400 Тираж -100 зкз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы.

При трансформации и опухолевой прогрессии нарушаются не только механизмы нормальной пролиферации клеток, но и их локомоторная активность, что приводит к таким проявлениям «асоциального» поведения опухолевых клеток, как инвазивный рост и метастазирование.

На клеточном уровне основой возникновения этих свойств являются генетические изменения, приводящие к нарушению регуляции адгезии и подвижности клеток (Yamazaki et al., 2005). Установлено, что в этих процессах определяющую роль играют перестройки цитоскелетных структур. Трансформированные клетки зачастую отличаются от нормальных по своей морфологии и организации цитоскелета (Bershadsky and Vasiliev, 1988). Реорганизации цитоскелета, особенно изменения клеточной сократимости, регулируемой актин-миозиновым комплексом, имеют центральное значение для развития фенотипа морфологически трансформированных клеток с инвазивным поведением. Редукция стресс-фибрилл, характерная для многих типов трансформированных клеток, сопряжена с нарушением созревания контактных структур (Ровенский и Васильев, 2004) и часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994; Sahai and Marshall, 2003).

Таким образом, изучение механизмов нормальной подвижности клетки и нарушений этих механизмов является одной из важнейших задач современной клеточной биологии.

Согласно современным данным, главную роль в определении локомоторного фенотипа играет динамическое взаимодействие двух основных систем цитоскелета, микротрубочек и актин-миозиновой системы, создающей внутри клетки и в окружающем ее матриксе механическое натяжение, регулируемое молекулярной системой малых ГТФ-аз семейства Rho. Предыдущие работы нашей лаборатории дают основание предположить, что одним из ключевых событий в приобретении способности к инвазии является Rho-зависимое снижение актин-миозиновой контрактильности при сохранении структуры и активности системы микротрубочек. Заслуживает внимания дальнейшее исследование механизмов КЬо-зависимой регуляции реорганизаций цитоскелета и посредством них - формы, адгезии и движений в одном из основных морфологических типов клеток - в фибробластах.

Цели и задачи исследования.

Целью работы является изучение роли актин-миозиновой системы в определении морфологии и подвижности фибробластов в норме и при ras-трансформации.

Мы использовали клетки линии REF52tetRas с тетрациклин-регулируемой экспрессией онкогена ras (Gille and Downward, 1999; Boettner and Van Aelst, 2002), в которых отмывка тетрациклина приводит к синтезу конститутивно активного белка и к морфологической трансформации клеток (Kopnin et al., 2003; Alexandrova et al., 2006). В качестве характеристик клеточной подвижности мы рассматривали динамику процесса распластывания клеток и миграцию в экспериментальную рану.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать изменения морфологии, подвижности и направленности движения ^трансформированных фибробластов при подавлении актин-миозиновой сократимости (с помощью ингибиторов Y27632 и блеббистатина) по следующим пунктам:

- исследование строения цитоскелетных структур и фокальных контактов иммунофлуоресцентными методами;

- видеонаблюдение с целью изучения поведения индивидуальных клеток;

- оценка скорости и степени распластывания клеток с помощью компьютерного морфометрического анализа;

- оценка эффективности направленной миграции клеток в экспериментальную рану;

- ультраструктурное исследование цитоскелета методом платиновых реплик;

- исследование динамики восстановления актин-миозиновых структур после отмывки ингибиторов сократимости.

2. Охарактеризовать изменения в морфогенезе и подвижности фибробластов при ras-трансформации.

3. Сравнить изменения в морфогенезе и локомоторном поведении трансформированных и ^трансформированных клеток в присутствии агентов, изменяющих организацию актин-миозинового цитоскелета (Y27632, блеббистатин, латрункулин А, цитохалазин D).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Необходимость дальнейших исследований молекулярных и клеточных механизмов морфологической трансформации и инвазивных миграций опухолевых клеток не подлежит сомнению. Взаимодействие различных компонентов цитоскелета и регуляторные пути при развитии инвазивного фенотипа еще не достаточно изучены.

В настоящей работе впервые проведен детальный анализ динамики актин-миозинового цитоскелета и локомоторного поведения трансформированных фибробластов в сравнении с ^трансформированными, а также проанализирована роль двух основных процессов - полимеризации актина и актин-миозинового сокращения — в клеточной подвижности.

В последние годы получены новые соединения, избирательно меняющие активность регуляторных белков и, вследствие, динамику цитоскелета, это Y27632, ингибитор активирующей миозин Rho-киназы (Ishizaki et al., 2000), и блеббистатин, ингибитор немышечного миозина II (Straight et al., 2003). В нашей работе впервые проведено сравнение локомоторных реакций нормальных и трансформированных фибробластов в присутствии этих агентов, а также сравнение реакций на ингибиторы полимеризации актина (латрункулин А и цитохалазин D).

Мы показали, что трансформированные клетки имеют сходство с клетками, обработанными ингибиторами сократимости: это усиление локомоторной активности на фоне ослабления/разрушения системы актин-миозиновых пучков. Однако, в отличие от трансформированных клеток, нормальные фибробласты сохраняют способность к направленному движению и под действием ингибиторов сократимости, которое поддерживается системой микротрубочек.

Показано, что трансформированные клетки иначе реагируют на низкие концентрации ингибиторов полимеризации актина, а именно утрачивают актинмиозиновые пучки, но не псевдоподиальную активность. Напротив, нормальные клетки утрачивают активность края, но сохраняют мощные пучки.

Впервые показано, что минимальная активность немышечного миозина II играет ключевую роль в первичном прикреплении и эффективной протрузии клеточного края. Также показано, что агрегация миозина в «рабочие единицы» - биполярные филаменты -зависит от степени и характера развития стресс-фибрилл в клетке.

Таким образом, ослабление актин-миозиновой системы в значительной мере обуславливает усиление подвижности ras-трансформированных клеток, хотя, вероятно, ненаправленность движения обусловлена активацией других сигнальных путей, ведущих от протоонкогена г as к цитоскелету.

Изучение механизмов регуляции перестроек цитоскелета и подвижности клеток, возможно, в дальнейшем откроет подходы к направленному исправлению молекулярных и клеточных нарушений, приводящих к инвазии, например, через нормализацию функций регуляторных белков, в частности, Rho-системы.

Обзор литературы

В основе движения клеток лежат перестройки актинового цитоскелета. Инициальным шагом перестроек является формирование так называемого ведущего (активного) края, на котором образуются протрузии и первичные контакты клетки с внеклеточным матриксом. Протрузия ведущего края обеспечивается силой полимеризации актина в зоне ламеллиподии. В зоне ламеллы происходит дальнейшая перестройка актина - формирование актин-миозиновых пучков. Образование контактов с субстратом инициируется в ламеллиподии, а созревание происходит в зоне ламеллы с участием стресс-фибрилл (Bershadsky et al., 2006, Alexandrova et al, 2008). Натяжение, создаваемое миозином, воздействует на инициальные фокальные комплексы, индуцируя их рост и превращение в фокальные контакты (Ingber, 1991; Riveline et al., 2001; Rottner et al., 2001; Krendel and Mooseker, 2005).

Ключевую роль в изменении и поддержании формы клеток и их движении играет цитоскелет. Он представлен тремя типами структур: актиновыми филаментами, микротрубочками и промежуточными филаментами, среди которых именно перестройки системы актина являются движущей силой в процессе движения клетки.

Выводы.

1. При трансформации фибробластов онкогеном RAS актин-миозиновые пучки и фокальные контакты становятся менее выражены. Площадь трансформированных клеток снижается в два раза, они становятся мультиполярны, усиливается подвижность, но клетки двигаются менее направленно.

2. ^трансформированные фибробласты при ингибировании миозин-зависимой сократимости утрачивают зрелые фокальные контакты и стресс-фибриллы, их подвижность существенно повышается. Однако такие клетки сохраняют способность к развитию поляризации и направленной миграции, что, вероятно, обеспечивается взаимодействием системы микрофиламентов и микротрубочек.

3. Фибробласты, трансформированные онкогеном RAS, имеют общие признаю! с клетками, обработанными ингибиторами сократимости. Это нарушение образования стресс-фибрилл и фокальных контактов, усиление псевдоподиальной активности и подвижности, увеличение степени поляризации.

4. В контрольных нетрансформированных клетках миозиновые филаменты имеют высокую степень структурной организации. При ^^-трансформации они становятся менее упорядоченными. При разборке пучков под действием ингибиторов миозина миозиновые филаменты пропадают. Таким образом, в клетке агрегация миозина в биполярные филаменты зависит от того, в какой мере он задействован в стресс-фибриллах, хотя в условиях in vitro миозиновые филаменты могут собираться и без участия актина.

5. В нетрансформированных клетках стресс-фибриллы и фокальные контакты разрушаются при неполном подавлении активности миозина II (45 мкМ блеббистатина). Максимальное подавление активности миозина (100 мкМ бллеббистатина) ведет к ингибированию образования ламеллиподии и фокальных комплексов. Эти процессы взаимозависимы и требуют минимальной активности миозина II. При отмывке блеббистатина первыми восстанавливаются ламеллиподии и фокальные комплексы. Для восстановления и ламеллиподий, и стресс-фибрилл при отмывке необходима полимеризация актина.

6. В нетрансформированных клетках при частичном подавлении полимеризации актина в первую очередь нарушается образование ламеллиподии, а в трансформированных клетках - образование пучков. Таким образом, при RAS-трансформации происходят изменения регуляции полимеризации актина в сторону усиления псевдоподиальной активности и одновременного нарушения построения пучков.

7. Таким образом, онкоген RAS вызывает, во-первых, нарушение регуляции полимеризации актина и снижение актин-миозиновой сократимости, что приводит к усилению подвижности клеток, и, во-вторых, потерю направленности движения, очевидно, обусловленную нарушением других сигнальных путей.

4. Заключение.

В нашей работе мы подробно рассмотрели роль актин-миозинового сокращения в организации движения нормальных и трансформированных клеток. Понижение сократимости является частым характерным признаком клеток, подвергшихся трансформации, и наблюдается, в частности, в случае трансформации фибробластов онкогеном RAS. Мы увидели, что снижение (но не абсолютное подавление) сократимости коррелирует с усилением клеточной подвижности (добавление 45 мкМ блеббистатина, ^^-трансформация) (рис. 64). С другой стороны, мы показали, что минимальная активность миозина необходима для успешного прикрепления клетки к субстрату и эффективной протрузии клеточного края.

Мы показали, что нарушения поляризации и направленности движения трансформированных клеток не являются следствием ослабления системы актин-миозиновых пучков (подавление сократимости в нормальных клетках не приводит к нарушению поляризации), но, очевидно, являются следствием нарушения других сигнальных путей, контролируемых онкобелком Ras. Так, снижение сократимости -только один из признаков ^«^-трансформированных клеток. Локомоторное поведение трансформированных клеток оказывается менее чувствительным к действию ингибиторов миозина II и полимеризации актина.

Возможно, повышенная активация многих сигнальных путей у трансформированных клеток, в частности за счет постоянной активации Ras, приводит к тому, что они менее эффективно реагируют на внешние сигналы. Меньшая реактивность трансформированных клеток по сравнению с нормальными проявляется также при реакции их на различные субстраты (Moizhess and Vasiliev, 2001). Такая пониженная реакция трансформированных клеток на регуляторные сигналы, поступающие извне (в нашем случае на воздействие ингибиторов) является существенным адаптационным механизмом, позволяющим опухолевым клеткам инвазировать в соседние ткани, прикрепляться и образовывать новые колонии в условиях, в которых нормальные клетки существовать не могут.

CD I блебб ЮОмкМ блебб 45мкМ блебб 75м кМ <

RAS-трансформация норма сократимость

Рис. 64. Условная схема зависимости клеточной подвижности от сократимости актин-миозинового цитоскелета. При снижении сократимости нормальных клеток с помощью ингибиторов миозина (зеленые точки на схеме) клеточная подвижность повышается, но при максимальном ингибировании миозина (добавлении высоких доз ингибитора) нарушается формирование и прикрепление ламеллиподий, что негативно сказывается на клеточной подвижности. При /WS-трансформации также снижается сократимость актин-миозина по сравнению с нормой, что усиливает подвижность, кроме того, происходят нарушения регуляции направленности движения, видимо, не зависящие от изменений сократимости.