Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Взаимодействие цитоскелетных систем при неопластической трансформации

Российская Академия Медицинских Наук Онкологический научный центр

На правах рукописи УДК 616-018-006.04:576348

Каверин* Ирена Нвхшгасша

Взаимодействие цитоскелетных систем при неопластической трансформации

(спецналы) ост» 14.00.14 — ошалела)

Автореферат

диссертации на соискание учгмсЗ сгезгея кянлпгата биологических пук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в лаборатории механизмов ' канцерогенез; (руководитель — чл — корр. РАН Ю.М.Васильев) Онкологической научного центра РАМН (директор — академик РАМН Н.Н.Трапезников)

Научный руководитель:

чл,—корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Ю.М.Васильев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б.П.Копнин

доктор биологических наук С.Г.Васецкий

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН (Санкт-Петербург)

Защита состоится •/7■ дека&я 1992г. на заседании специализированного Ученого совета (K_001.I7.01) Онкологического научного центра РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН.

[О -

Автореферат разослан • Щ • и К /// о/¿у 1992г.

/

Ученый секретарь специализированного Ученого совета доктор медицинских наук, профессор

В.С.Турусов

Легальность проблемы

Способность к метастазировакию и инвазии - наиболее характерные и пасные патологические свойства клеток злокачественных опухолей. Изучение геханизмов возникновения таких свойств — одно из важнейших направлений о временной экспериментальной онкологии. На клеточном уровне основой оэникновения этих свойств являются, по-видимому, генетические изменения, Приводящие к нарушениям адгезии н подвижности клеток. В механизме гроявления этих изменений центральную рать играет пкгсскелет, состоящий из исгем октановых микрофиламенгов, микротрубочек и промежуточных зиламстгтов. При опухолевой трансформации происходит модуляция тункиионировзння щгго скелета, осуществляемая через ряд регуляторных систем. 1ри этом наиболее выражена заметная перестройка и частичная редукция ястемы актиновых шосрофиламентов.

В то же время в ряде исследований выявлена существенная регуляторная юль взаимодействия систем шпоскепста между собой. Так, в отсутствие аперотрубочех акттш не способен обеспечивать направленное движение [зибрсбластов и после обработки специфическими веществами, кполимеризующимн тубулнн (основной белок микротрубочек), образующиеся ¡севдоподии хаотично распределяются по краю клетки (Васильев и др. 1972).

Таким образом, взаимодействие шггоскелетных систем между собой шляется важным фактором регуляции клеточной подвижности. Однако хлается неизвестным, как изменяются эти регулягориые взаимодействия например, микротрубочек и 21 гинового- шпоскелегга) при стухолевой рансформлции и какое значение 01Ш имеют для определения формы и годвижиости нормальных и опухолевых клеток.

Другой существенный фактор, влияющий на адгезию и подвижно ~гь слеток — это их взаимодействие с внеклеточным матршссом, включающем (шбриллы фибронектина, ламинина, коллагена и других продуцируемых меткой белков. В процессе сс-орки этих фибрилл активно участвует ахтиновый лггсскелет (Васильев, Любимов 1983). В свою очередь, структура системы 1Шхрофиламснтов зависит от адгсзивности субстрата, определяемой матршссом. (Сак правило, опухолевые клетки значительно хуже, чем нормальные, Ьормируют матршх (КошМИ 1988, Любимов, Глейбершн 1981). Остается неясным, насколько большую роль играет взаимодействие клетки и матракса в зпределении различий в адгезии, подвижности и морфологии нормальных и эпухолевых клеток. у

Изложенные соображения определили цель а задачи нашей ра£сгы.

Цель и задачи работы

Целью настоящей диссертационной работы явилось выяснение рол цитоскелетных систем и фибронектинового матрикса в экспресса: трансформированного фенотипа. В соответствии с этим . задачи рабоп заключались в следующем:

1. Провести количественный анализ формы и характеристику цитоскелет трансформированных и нетрансформированных клеток в системе с чеггк охарактеризованными генетическими различиями.

2. Изучить изменения цитоскелета нетрансформированных 1 трансформированных клеток после деполимеризации микротрубоче: колцемидом и провести количественный анализ изменений формы этих клеток.

3. Изучить изменения цитоскелета нетрансформированных : трансформированных клеток после дезинтеграции системы микротрубоче таксолом и провести количественный анализ изменений формы этих клеток.

4. Изучить различия морфологии и цитоскелета нетрансформированных 1 трансформированных клеток после нарушения формирована фибронектинового матрикса ингибитором трансглютаминаз; монодансил кадаверином (МБС).

Научная новизна и практическая значимость работы

Все сравнения нетрансформированных и трансформированных клето проводились в двух системах с четко охарактеризованными генетическим отличиями клеток, а именно, на линиях, различающихся по экспрессии одног онкогена. Такие линии были впервые использованы в подобных экспериментах

Впервые проведена компьютерная морфометрическая • оценк нетрансформированных и трансформированных клеток. Сравнивалис количественные параметры, описывающие форму клеток (дисперсия ! элонгация) и их площадь. В результате компьютерной обработк морфометрических данных впервые показано, что нетрансформированные 1 трансформированные клетки различаются по степени поляризации. Пр: опухолевой трансформации статистически достоверно увеличиваются об параметра, характеризующих степень поляризации клеток — дисперсия : элонгация.

Впервые проведена сравнительная характеристика различных си ста цитоскелета, а также фибронектинового матрикса нетрансформированных : трансформированных клеток после деполимеризации микротрубочек

результате воздействия колцгмкда и дезинтеграции системы г.гикротрубочек в результате воздействия глксолл. Впервые показано, что разлитая акпшовой системы, матрикса и формы нетран<-форм1тровакнкх и трансформированных клеток уменьшаются при деполимеризации и дезинтеграции микротрубочек. Таким образом, доказано участие актин—регулирующей функции микротр^-бочек в определении ряда различий нормальной к опухолевом клетки.

Было также обнаружено не описанное ранее различие в организация промежуточных филаментов нстралеформированных и трансформированных клеток, проявляющееся при деполимеризации микротрубочех. Это различие состоит в ослаблении способности к коллапсу (энергттав к.>; мому сворачгизанк» фнламентов вокруг ядра).

При изучении действия ингибгггора трансглютамкчазы монодансилкаяйверкча (\ГОС) на строение фябронекпгноъого матрикса, фокальных контактов и акпшовых структур, а тахже на упометгавыгеся выше количественные параметры, было впервые показано, что метрике оказывает модулирующее действие ка признаки трансформации, связанные с адгезией. При редукции матрикса происходил сдвиг ряда признаков в сторону опухолевого фенотипа, однако уменьшения различий ^расформированных и трансформированных клеток не наблюдается.

Таким образом, теоретическое значение диссертационной ряботы состоэт в том, что выявлены щггсскелетные механизмы ихспргссии морфологической трансформации.

Наряду с теоретическим значением полученные дзкнке имеют научно— прзжладное значение, поскольку расширя-.ст пошшанле механизмов, приводящих к инзагивности а мстастазирозанкю, а также механизма дгйст-ия на нормальные и опухолевые оепзз препарата тахсола, применяемого ках цитосгатпк при лечешш ряда алскачегтэгнныя опухолей. •

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, гскетакя опухолевых клеток и цитогенетики НИИ канцерогенеза Онкологического Центра РАМН 20 марта 1992 года.

Материалы работы докладывались на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1989) и Всесоюзном со'зещенни "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Санкт-Петербург, 1991).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методм исследования, описания результатов, выводов ' и списка цитированной литературы. Работа изложена на ^.¿страницах машинописного текста, включая 10 таблиц, </1/<рнсунщ и список литературы из Ji í ссылок.

Материалы и методы Описание клеточных культур, использованных в работе

1, Клоны BALB/c ЗТЗ

В работе использовались мышиные культивируемые фибробласты BALB/< ЗТЗ. Клон А31-1-1 представляет собой минимально трансформировании! клетки. Клон A31—1 — 1 0.3ras получен из первого клона путем трансфекшо геном Ha-ras (Yamasaki 1988). Клетки культивировали на среде DMEM с 10Я эмбриональной сыворотки при 37С° в присутствии 5% С02 на культуральнои пластике. В экспериментах использовались 24-часовые редкие культуры выращенные на покровных стеклах.

2. Клоны RAT2

Были использованы три клона крысиных фибробластов.

Í. Крысиные культивируемые фибробласты клона RAT2 el S представляю собой минимально трансформирование клетки.

2. Клон RAT2/5 получен из преыдущего трансфекцией плазмидой содержащей ген N-ras под гормонзависимым промотором вирус MMTV.

3. Клон RAT2/S Neo был трансфеиирован аналогичной плазмидой. н содержащей онкоген.

Эти клоны были любезно предоставлены X. Патерсоном (Лондон Великобритания). Методика трансфекции и тестирования описаны в работ Маккея и соавторов (McKay et al, 1986). Клетки клонов RAT2 с15 и RAT2/5 No культивировали на среде DMEM с 10% эмбриональной сыворотки, а клена клона RAT2/5 среде DMEM с 5% эмбриональной сыворотки на культурально! шастике при 37С0 в присутствии 5% СС>2- Для экспериментов испольэовалис

^трехсуточные редкие и густые культуры, выращенные иа покровных стеклах с фибронектиновой подложхой или без нее на среде DMEM с 1% эмбриональной сыворотки. 3. Фибронектиновая'подложка

Стекла помещали в раствор фибронектина (Sigma) концентрацией 100мхг/кд около 04кл/см и в высушивали.

Специфические агенты

Синтетечесхий стероидный гормон дексамстазон фирмы Sisma добавляли в среду при пассировании, клеток из спиртового раствора 200мкМ до концентрации 2мкМ.

Ингибитор трансглютаминазы монодансилкадаверин (MDC) фирмы Sigma добавляли в срезу из раствора 200мк в бессывороточной среде до концентрации 25 мхМ при пассировании (на 4 суток) или до концентрации SO или 80мхМ через трое суток госле пассирования (на 24 часа) для редких х в густых культур RAT 2/5 на стекле или фиброиекпшовой подложке.

ДеполимеризующиЙ мнгротрубочхи агент колцемад (аемеколцпн) фирмы Sigma добавляли в среду из раствора 10мкг/мл в бессывороточной среде до концентрации 0.1мкг/мл для трехсуточных культур клеток В ALB/с ЗТЗ на стекле и из раствора 100мкг/мл до конпентрации О.Змкг/мл для суточных культур клеток RAT 2/5 на стекле на сроки 8 и 24 часа.

Стабилизирующий микротрубочки агент таксол, любезно предоставленный Национальным раковым институтом США (Бетезда, США), добавлялся в среду из раствора 2мМ в DMSO до концентрации 10мкМ для трехсуточных культур RAT 2/5 и суточных культур BALB/c ЗТЗ на стекле на сроки 8 и 24 часа

Экстракция в фяксацшс клеток

Для последующего выявления виментнна и тубулина, а также (в эксперментах с применением колцемида и такеола) актина и фибронеггина, клетки отмывали 1-3 раза физиологическим раствором на 0.01М фосфатном буфере (ФБР). Затем проводили экстракцию в течение 30-60 секунд 0.1% тритоном Х-100 (Serva) на имкаозольном буфере (состав: SOmh нмндозол, 50mM KQ, 0,5тМ Mga2*6H20, O.lmM ЭДТА*Ыа2, ImM ЭГГА, ImM меркаптозтанол) с добавлением 4% полиэггиленгликоля 40000 (Sigma). Клетки промывали 1-3 раза чистым имвдозольным буфером и фиксировали 0.25*

глутаровым альдегидом на ФБР в течение 20 минут, после чего оставляли в ФБР на сутки при 4С°. Все растворы, применяемые для экстракции и фиксации, предварительно нагревали до 37С°. Затем свободные альдегидные группы блокировали, помещая препараты в 0.08% раствор глицина на ФБР на 1 час при комнатной температуре, затем в раствор №ВЩ на ФБР (2мг/мл) на 15 минут при 4С°, после чего повторяли инкубацию в глицине. В промежутках между инкубациями клетки промывали ФБР несколько раз б течение 15 минут.

Для последующего выявления винкулина и рецептора фибронектина, а также (в экспериментах с монодаксилкадаверином) актина и фибронектина, клетки отмывали 1-3 раза ФБР, затем обрабатывали 0.1% раствором тритона >С— 100 в 4% параформальдегиде на ФБР в течение 5 минут. После этого клепки фиксировали 4% растеором пара формальдегида на ФБР в течение 20 минут и отмывали ФБР. Все растворы, применяемые для экстракции и фиксации, предварительно нагревали до 37С°.

Флуоресцентная микроскопия

8 работе использовался метод непрямой иммунофлуоресценции. Для выявления тубулина использовались мышиные моноклональные антитела к альфа—тубулину (Viclicky 1982), любезно предоставленные В. Виклицким (Прага, ЧСФР). Мышиные монокюнальные антитела к виментину (клон NT30) получены Трояновским и соавторами (1985). Для выявления фибронектина использовались кроличьи поликлональные антитела (Ljubimov tt al 1985). Для выявления рецептора к фнбронектину использовались мышиные моноклональные антитела, любезно предоставленные Е. Роуслахти (Ла Хойя, США). Для выявления винкулина использовались мышиные моноклональные антитела (Glukhova et al 1990), любезно предоставленные А. Белкиным (КНЦ АМН, Москва). Для выявления актина использовали меченый родамином фаллоидин (Sigma).

Фиксированные описанными методами клетки инкубировали 45 минут в растворе первых антител на ФБР, отмывали 3 раза в ФБР в течение 20—60 минут, затем инкубировали в растворе вторых антител на ФБР в течение 45 минут. Для получения двойной иммунофлуоресцентной окраски применяли Общий раствор двух первых, а затем вторых антител. Для совместного выявления актина с другими белками меченый фаллоидин добавляли в раствор вторых антител. Окрашивание производили при комнатной температуре. Препараты заключали в раствор поливинилового спирта в ФБР и исследовали с помощью флуоресцентного фотомикроскопа Opton, об. 40*0.25, ок. 10х.

Для флуоресцентного окрашивания митохондрий живые клетки нкубировали в растворе родамина 123 в культур альной среде (10мкг/мл) при 7С° в прис)тстзии 5% C02i затем отмывали в среде п течение 1 минуты. Трепараты заключали в камеру в культуральной среде и исследовали с помощью ршуоресценгного фотомшсроскопа Opton, об. 40*0.25, ок. 10*.

Компьютерная обработка результатов

Форму клеток клеток исследовали по методу, разработанному в работе &нна и Брауна (Dunn, Brown, 19S6). Анализируемые клк.;л были окрашены на истин и сфотографированы с помощью фотомикроскока Opton, об. 40*1.25. Для исключения влияния на форму межклеточных взгшлсдейспшй пссягжовались тзлько изолированные клетки. Контуры увеличенных клеток были с учетом масштаба введены в компьютер с помощью специальной коо-щкнатной шасткны (Summagrapliics, Bitpad 2) и статистически обработаны с помощью грограммы, разработанной и любезно предостаатенной А. Брауном (Лондон, Зелккобрнтания). При анализе, кроме площзда и периметра клеток, «пользовались два индекса, характеризующих форму клеток: дисперсия я ыонгация. Элонгация выражает степень вшянутосгп клеток и равняется нулю у задиально симметричных фигур, например у круга. Дисперсия выражает степень *зрезанности контура клеток и равняется нулю у любого эллипса. Обе эти »«личины увеличиваются с увеличением степени поляр изо ванн ости клток.

Результаты и их обсуждение 1. Разлипяя трансформированных и нетраясформароваяиьи клеток

Преимущества системы

В работе использовались две пары клеточных культур: мышиные фибробласты BALB/c ЗТЗ и крысиные фибробласты RAT2/5. Исходный клон BALB/c ЗТЗ A31-1—1 представляет собой минимально трансформированные клетки. Второй, сильно трансформированный, клоп BALB/c ЗТЗ А31—1—1 0.3ras получен в результате трансфекцли первого онкогеном На—ras. Другая система — минимально трансформированный клон RAT2/5, несущий ген N-ras поя промотором, активируемым синтетическим " стероидным гормоном дексаметазоном. При добавлении дексаметазона в среду начинается лспрессия онкогена и клетки приобретают трансформированный фенотип. В обоих случаях представляется возможность изучить изменения минимально трансформированных (бессмертных) клеток, обусловленные экспрессией одного

онкогена из семейства ras. Эти изменения соответствуют одному шагу опухолевой прогрессии. In vivo такой шаг может определять возникновение опухолеродности или озлокачествление опухоли. На молекулярном уровне функции белков — продуктов генов семейства ras — не выяснены окончательно. Очевидно, эти белки принимают участие в передаче внешних сигналов в клетке (Hall 1992). Представлялось важным изучение отличий трансформированных и нетран сформированных клеток с четко определенными генетическими отличиями в чистой системе. Б. Различия формы

В обеих системах площадь нетрансформированных клеток значительно превышала площадь трансформированных: примерно с 4 раза для ЗТЗ и в 3 раза для RAT2/5 (см. таблицы 1-4 и Рис. 1). Очевидно, такое различие связано с ухудшением адгезии и сокращением площади ламеллярчой цитоплазмы, обычным при неопластической трансформации (Domnina et al, 1972). Различались и параметры, определяющие разрезанио_ть и удлинение клетки — дисперсия и элонгация (см. таблицы 1—4 и рис. 1). В трансформированных клетках они гораздо выше (дисперсия для ЗТЗ в 3 раза, для RAT2/5 почти в 10 раз; элонгация для ЗТЗ в 3 раза , для RAT2/5 - в 4 раза).

ПшшкьСюм2)

5000 «100 ЗОЮ 2000 Ю00

О

Кмраъ

Даиг-мешон

Дспцкня

Эхнада

U 1

V 2

1

05 О

о» 06 04 02

„ . i Копршъ

0

ДИ2~ исшон

Копра*

Jkssr-

кеаяи

Рис.1 Различия площади и формы трансформированных й нетрансформированных клеток RAT2/5

Эти два параметра в совокупности характеризуют степень поляризации клетки. Следовательно, мы установили, что трансформированным клеткам свойственна б-\лее сильная поляризация., чем нормгчьным аналогам.

Изменение формы клеток, подвижность и адгезия — функции цито скелета (см. Bershadsky, Yasffiev 1988). Представляется вероятным, что, обнаруженные нами различия — следствие различий в каких-либо шггоскелетных образованиях.

Рассмотрим изменения указанных структур при трансформации. В. Различия цитрсхелета

Согласно многим данным, наиболее чувствителььой к трансформации является ахткновая система (Ambrose 1970, McNutt 1973, Pollack 1975," Goldman 1976, Burridge I9S1, Carter 1991). В изученных кдкм негрансформированньа и трансформированных клетках образованные мшсрофиламентами структуры сильно различаются. При большом количестве пучков и широком *чстиновом ведущем крае в петрансформкрованннх ЗТЗ, у клона, несущего ген Ha-ras, пучки практически отсутствуют, а на небольшом по протяженности активном крае ламеллы (при ее налички) можно наблюдать полиморфные раффлы. В клетках RAT2/5 разшща несколько меныие: после действия дексаметазона обычно остаются немногочисленные пучки в теле клетки и отростках, протяженность акпязного края сокращается.

Винкулннсодержашие фокальные контакты, также претерпевают редукцию. В нетралеформнрованн >к клетках RAT2/5 они многочисленны, имеют форму штрихов п распределены по всей клетке. Посла трансформашш контактов мало и они, как правило, точечные. Подобная редукция этих адгезивных структур обычна для нее пластических клеток и коррелируем с. понижением адгезии (см. Burridge 1985). Считается, что у трансформированных клеток нарушено формирование фокальных контактов: вновь образовавшиеся точечные контакты не претерпевают созревания п евлзи с редукцией актнновых структур (Bershadsky et al 1985).

Различия распределения промежуточных филаментов у нормальных п трансформированных клеток ЗТЗ очень малы и определяются различной степенью распластывания: в веретеновидных клет&ах клонз, несущего онкоген, не всегда можно отчетливо проследить отдельные фяязменты. В клетках RAT2/5 различий не обнаруживается.

Микротрубочки в обеих парах культур внешне не изменяются, равномерно расходясь из центра к периферии клетки.

Поскольку микротрубо'вш определяют расположение органелл в клетке, о функциональном состоянии микротрубочек можно судить, например, по распределению митохондрий з клетке. Митохондрии в контрольных клетках

ЯАТ2/5 распределяются в основном в окслоядерной зоне и частично протянул, в ламеллу, а в трансформированных — в отростки. 3 обоих случаях мшохондрш располагаются и в центре, и на периферии клетки; видимо, в состояли! микротрубочек нет больших различий.

Таким образом, различия цитоскелсгга изученных нам! нетрансформированных и трансформированных клеток в основном относятся 1 системе актиновых микрофиламентое.

2. Влияние деполимеризации и дезинтеграции микротрубочек на нормальные и трансформированные клетки

Наиболее выраженные изменения под влиянием активации одной онкогена претерпевает актиновый кортекс. Однако известно, что микр&фубочю играют определяющую роль в поляризации фибробластов, а также регулирую функционирование актиновой системы (см. УааЬеу 1987) Чтобы выяснил насколько важны микротрубочки и каково их влияние на другие цитоскелетны системы для проявления выявленных нами различии площади и формы, № изучали алияние на клетки деполимеризации и дезинтеграции микротрубоче; специфическими агентами. При обработке клеток кслиемидом этот аген связывается с субъединицами тубулика, что приводит к полно; деполимеризации микротрубочек (Weisenfceгg Л а1 1968). Таксал, наоборот стабилизирует полимеризованный тубулин и сдвигает равновесие о деполимермзованного белка в сторону образования многочисленных свободны микротрубочек (ОеВгаЬап«1ег е1 а! 1981). В отличие от контрольных клеток, эт микротрубочки не связаны с организующими центрами, а свобода распределяются в цитоплазме, то есть происходит дезинтеграция систем] микротрубочек.

Нами исследовано влияние нарушений микротрубочек на форму клеток строение цитоскелета. А. Изменения формы.

При деполимеризации микротрубочек колцемидом или дезшпеграци микротрубочек таксолом площадь нетрансформированных клеток меняете мало: она, как правило, немного уменьшается (см. таблицы 1, 3 и рис. 2 Напротив, площадь трансформированных клеток при этом увеличиваете причем сильнее с увеличением времени инкубации (см. таблицы 2, 4 и рис. 2 Дисперсия (см. таблицы 1—4 и рис. 3) и элонгация (см. таблицы 1—4 и рис. ' под действием колцемида и таксола падают; происходит деполяризация клето; Показатели элонгации трансформированных и нетрансформированных клеток среде, содержащей таксол, практически совпадают и очень малы. Диспер

клеток, обработанных таксолом, также чрезвычайно мала, хотя некоторая разница между нормальными и трансформированными клетками сохраняется.

Действие колцемнза и таксона иа кстрлпефсрмированные клетки ВАЬВ/с ЗТЗ АЗ 1-1-1 _:__

Клетки Контроль Кмцемид Колцеыид Таксол Таксол

(S-часовая (24-часовая (8-часовая (24—часовая

инкубация) инкубация) инкубация) инкубация)

Количество 34 32 50 25 33

обработанных

клеток

Средняя 3*44.04 3245.10 2874.07 3796.95 3715.84

площадь ± 232.85 ± 222.39 ± 146.27 ± 353.78 ± 208.63

Средняя 0.3184 0.2352 0.4079 0.0946 0.1120

дисперсия ± 0.0261 ± 0.0207 ± 0.0237 ± 0.0130 ± 0.0181

Средняя 0.7914 0.4203 0i6231 0.3812 0.4200

элонгация ± 0.0590 ± 0.0247 ± 0.0528 ± 0.0494 ± 0.0421

1а5яина_2

Действие колцемнда и тассол на клетки, трансфецирокшные геном Ha—res (А31—

1-1 0.3 ras)

Клетки Контроль Колцемид Кащемид Таксол Таксол '

(8—часовая (24-часовая (8-часовая (24—часовая

. ютбещия) инкубация) инкубация) инкубация)

Количество 53 34 45 47 53

обработанных

клеток

Средняя 829.57 1046.55 1641.02 1836.41 2218.08

площадь ± 37.25 + 89.58 ± 95.01 ± 154.46 ± 121.61

Средняя 0.9284 0.5668 0.8>35 0.2269 0.1226

дисперсия ± 0.0748 ± 0.0892 ± 0.0685 ±0.0240 ±0.0117

Средняя 2.4135 0.9748 0.8417 0.5874 • 0.4533

элонгация ± 0.1350 ± 0.0815 ± 0.0698 ±0.0446 ± 0.0504

Таблица 3

Действие колцемида и таксола на негрансформированныс клетке ____ (клон RAT 2/5) _

Клетки Контроль Колцемид Колцемид Таксол Таксол

(8-часовая (24-часовая (8-часовая (24—часовая

инкубация) инкубация) инкубация) инкубация)

Количество 58 38 66 55 55

обработанных

клеток

Средняя 4659.51 3837.19 4108.00 3455.78 4037.39

площадь ±208.16 ± 180.21 ± 174.92 ± 184.02 ± 223.85

Средняя 0.1557 0.1214 0.1003 0.0595 0.0463

дисперсия ±0.0137 ± 0.0146 ± 0.0114 ± 0.0046 ± 0.0036

Средняя 0.5993 0.4712 0.4972 0.4515 0.5785

элонгация ±0.0504 ± 0.0386 ± 0.0342 ± 0.0365 ± 0.0403

Таблиш 4

• Клетки Контроль Колцемид Колцемид Таксол Таксол

(8—часовая (24-часовая (8-часовая (24-часовая

инкубация) инкубация) инкубация) инкубация)

Количество 68 46 72 51 87

обработанных

клеток

Средняя 1766.31 1997.38 2171.62 2058.92 2014.95

площадь ± 93.04 ± 106.39 ± 109.50 ± 135.29 ± 93.85"

Средняя 1.0728 0.1856 0.2474 0.1191 0.1238

дисперсия ± 0.0649 ± 0.0202 ± 0.0223 ± 0.0101 ± 0.0091

Средняя 2.0842 0.7552 0.5098 0.7568 0.5408

элонгация ± 0.0789 ± 0.0570 ± 0.0344 ± 0.0514 ± 0.0311

Действие колцемида и таксола на трансформированные клетки

6 клетках, обработанных колцемидом, элонгация более высокая, чем после обработки таксолом, однако разница нормальных и трансформированных клеток также сильно уменьшается, и эффект на трансформированных клетках гораздо сильнее. Дисперсия ВАЬВ/с ЗТЗ после инкубации в присутствии колцемида меняется мало, за счет наличия у колцемидных клеток многих

узких отростков. Дисперсия ЛАТ2/5 после обработки колцемидом сильно уменьшается, в особенности у трансформированных клеток, так что ее значение становится близким к дисперсии нетрп'-'сформиро ванных клеток.

Нзригфдорсвгснс кхгеи

"Цасф^мрЕЗИЛ Шпга

яга «го

ЗОЮ 2009 1000 0

тг+п

ГГ+Г

500!) 4000

зооо

ЗОЮ 1000 о

Кнраъ Катсма Иктл Рис.2 Площадь (мо^) клеток ИАТ2/5

Нггр;нз!Ерм рта гм чти

V 1

ад

0,6 0,4 02 о

Кппраь Каткип ТЬкоол после обработки колцемидом и таксолом олхи

3_Е

53.

1

0,8 Об

оа 0

К

i ■)

Кзорсаь Кгома Тзшг» Рис.3 Элонгация клеток ЯАТ2/5 после Нярэсфрлрокмье гагат

V 2

I

ОД О

JШL

Кзгер*» Кгпавя Цапи обработки колцемидом и таксолом Трнфрцяснье тетей

У; 2

1Д 1 05 . 0

Кяяра-ь Усимя Тягая Рис.4 Дисперсия клеток ЛАТ2/5 после

Ка греть йтклэд Цизи обработки колцемидом и таксолом

Таким образом, статистический анализ формы клеток после деполимеризации п дезинтеграции микротрубочек говорит о том, что такие обработки приводят к сближению фенотипа трансформированного клона с исходным по площади и степени поляризации. Вероятно, микротрубочки определяют значительную часть различий этих параметров. С другой стороны, по-видимому, другие цигоскелегные системы влияют на форму клеток и не

зависящим от микротрубочек образом, поскольку различия исчезают не полностью.

Б. Изменения цитоскелета.

Иммуно—флуоресцентные исследования показывают, что в клетках, обработанных колцемидом, микротрубочки отсутствуют полностью. Следовательно, в них не осуществляются все реакции, • зависящие от микротрубочек. После инкубации в присутствии таксола в клетке обнаруживается множество коротких микротрубочек, собранных в агрегаты или разрозненных. Они распределены в центральной части «трансформированных клеток; в трансформированных клетках они занимают почти всю клетку. Таким образом, не осуществляются только те внутриклеточные процессы, которые зависят от целостности системы микротрубочек, их динамики и специфического расположения (см. веШтс!, ВегеЬа&ку 1991). Например, транспорт везикул, очевидно, не ингибируется таксолом, но теряет осмысленную направленность. Митохондрии как в трансформированных, так и в нетрансформироЕанных клетках, обработанных колцемидом, образуют плотные неравномерные скопления вокруг или сбоку от ядра. В среде с таксолом митохондрии образуют рыхлое скопление вокруг ядра, также сходное в двух типах культур. Видимо, расположение митохондрий определяется микротрубочками и не коррелирует со степенью трансформации.

Функционирование актинового цитоскелета регулируется микротрубочками. После описанных обработок его морфология претерпевает изменения.

В нетрансформированных клетках много ярких пучков проходит через всю клетку. Как правило, эти пучки направлены вдоль ее длинной оси. После обработки клеток колцемидом количество пучков не уменьшается и часто увеличивается, они пересекают клетки в разных направлениях. В трансформированных клетках ЗТЗ появляются пучки, отсутствовавшие в контроле, а в трансформированных ИАТ2/5, где в контроле выявляются немногочисленные пучки, их количество в ряде случаев увеличивается. Эти пучки перпендикулярны краю. Однако количество и длина пучков в трансформированных клетках всегда остается меньше, чем в нетрансформированных.

При дезинтеграции микротрубочек таксолом пучки микрофиламенгов в нетрансформированных клетках перестраиваются, распределяясь на периферии клетки. У клеток ЗТЗ это почти всегда мощный кольцевой пучок; у 11АТ2/5 кольцевой или дугообразный незамкнутый. Таким образом, основная масса актина оказывается ближе к краю, чем скопление неорганизованных микротрубочек и промежуточных филаментов. В трансформированных клетках

также могут появляться кольцевые или параллельные краю тонкие пучки, но они всегда значительно менее выражены, чем в нетрзнсформированных. Необходимо отметить, что распределенче миозина во всех случаях соответствует актину, и, следовательно, пучки сохраняют сократимость н могут нормально функционировать.

Таким образом, можно заключить, что в случае обработки и колцемидом, и таксолом происходит некоторое восстановление актинового цитоскелета у трансформированных клеток. Однако собствешю организация актинового ксртекса клеток, обработанных этими агентами, различна. Так, пучки располагаются перпендикулярно краю, пересекая клетку, после колцемвда и сонаправлекно краю ira периферии после таксола. По-видимому, организация пучков зависит от состояния микротрубочек, и масса пучков легко организуется в районах, содержащих мало микротрубочек. Очевидно также, что микротрубочки не полностью определяют строение актинового цитосгслета, так как и после дезинтеграции, и после деполимеризации микротрубочек различия в пучках сохраняются.

Параллельно с акпшовым цптоскелегом меняются и фокальные контакт. После обработки колцемидом контакты в нетрансформированных клетках становятся несколько крупнее, а в трансформированных увеличиваются в числе и размере. • приобретают штриховую форму. В тзксольных клетках контакты также увеличиваются, особенно это заметно в трансформированных клетках. Как правило, они располагаются вблизи края хлетки.

Таким образом, фокальные контакты трансформированных клеток, в отсутствие функциональных микротрубочек, по-видимому, проходят процесс созревания, приближаясь к контактам нормальных клеток.

Промежуточные фшаменты при разрушении микротрубочек претерпевают коллапс: расходившиеся в контроле радиально из околоядерной области по всей . клетке, они собираются в зкту.ы и сворачиваются вокруг ядра (см. Goldman et al 1986). При сравнении клеток ЗТЗ, обработанных колцемидом, выявляется различие коллапса при трансформации: в нетрансформированных клетках жгуты филаментов, как правило, выявляются в виде плотного кольца вокруг ядра или, реже, частично размотаны в центральной части клетки. В трансформированном клоне жгуты промежуточных филаментов часто размотаны сильно и протянуты в длинных разветвленных отростках. Поскольку считается, что коллапс — это активный энергозависимый процесс, осуществляемый системой актиновыя микрофиламентов (Hollenbeck et al 1989, Tint et al 1991), возможно, наблюдаемый нами в трансформированных клетках неполный коллапс связан с сильной редукцией актинового цитоскелета в этих клетках. В трансформированных дексаметазоном клетках RAT2/5, где актин сохраняется

лучШ!е, -ухудшение: кодлапса выражено менее четко. Таким образом, обработка ксяцемидом выявляет разницу промежуточных филаментов нормальных и трансформированных клеток.

■ЙосЯе-обработки таксолом единственная разница заключается в том, что переплетенная сеть промежуточных филаментов, так же как и неорганизованные микротрубочки, "в трансформированных клетках занимает почти всю площадь клетки, а в нетрансформированных — только центр, оставляя место для мощного кольцевого пучка. Известно, что распределение ■ промежуточных филаментов в культивируемых фибробластах в значительной степени совпадает с распределением микротрубочек в той же клетке. Видимо, под действием таксола ассоциация промежуточных филаментов с микротрубочхами сохраняется, а их разница в нормальных и трансформированных клетках определяется взаимодействием микротрубочек и актина.

Итак, при деполимеризации микротрубочек клетка претерпевает ряд существенных изменений: деполяризация, перестройка актиновой системы с возникновением большого количества стрсссфибрилл, увеличение размеров и количества фокальных контактов, увеличение площади клеток. Все эти 'изменения, которые можно рассматривать как сдвиг в сторону более нормальной морфолопш, сильнее выражены в трансформированных клетках. Полученные данные дают основание предположить, что микротрубочки в Трансформированных клетках до некоторой степени усиливают экспрессию трансформированного фенотипа.

В обработанных таксолом клетках, где присутствует большое количество неорганизованных микротрубочек, та осе происходит ряд изменений, которые можно рассматривать как сдвиг в сторону более норма!ьной морфологии, и «различия между нетрансформированными и трансформированными клетками уменьшаются. Трансформированные клетки в. таксоле сильно нормализуются по площади и степени поляризации, а ряде случаев появляются актиновые пучки. Итак, мы можем предположить, что для осуществления контроля фенотипиЧеских отлйчий нетрансформированных и трансформированных клеток необходима фунционально целостная динамическая система микротрубочек.

3. Роль шеоеточмого матрикса в морфологической трансформации. Действие ингибитора траксглкггамвназы MDC на петрансфоркярованные и трансформированные клетки А." Изменения фибронектинового матрикса при деполимеризации и дезинтеграции микротрубочек.

Помимо взаимодействия цитоскелешых систем между собой, существенное влияние на подвижность и форму клеток может оказывать взаимодействие клеток с внеклеточным матрнксом. Считается, что трансформация фибробласгоа обычно ведет к потере фибронектина с поверхности клеток (Mtalo, Vahen 1982, Ruoslahíi 1988). В культурах RAT2/5 фибронектиновый матршсс также формируется нетрансформированными клетками несколько более активно. Количественная разница заметна только в редких культурах, пзможно, лимитирующей является ранняя стадия сборки фибрилл. У нетрансформированных клеток видны немногочисленные тонкие фибриллы и сетки, в трансформированных только иногда редкие точки и фибриллы.

Изменение ранних стадий сборки фибронектина может быть обусловлено аномалиями актиновой. системы. В процессе сборки активно участвует актиновый цитоскелет. Изменения актина при трансформации предшествуют изменениям фибронектина (Комиссарова и др. 1989). Предполагается, что при определенном уровне нарушения строения актиновой системы она становится неспособной осуществлять кэппиш' комплексов фибропекпш—рецелтор, что ведет к потере фибриллярного фибронектина (Васильев, Любимов 1983).

При деполимеризации микротрубочек формирование фибронектинового матрикса клетками RAT2/5 изменяется. После пнкубацки п колцемиде ред; ах -культур нетрансформированных клеток образуется множество радиально расположенных под клеткой ярких фибрилл, то есть Сильно увеличивается количество фибронектина. «ак же выглядит фибронектиновый матршсс •трансформированных RAT2/5, у которых в контроле он практически отсутствовал. Этот эффект может быть связан со способностью актпновых пучков колцемидных клеток лучше регулировать сборку матрикса. В любом случае мы наблюдаем еще одну черту фенотипической нормализации под действием колцемвда.

В клетках, обработанных таксолом, фибронектиновый матрице формируется плохо, не лучше или даже хуже, чем в контроле. Вероятно; кольцевые пучки не способны стимулировать сборку матрикса. Б. Изменения формы клеток RAT2/5 под действием MDC.

Кроме влияния на фибронектиновый матрикс изменений цитоскелега, обусловленных колцемндом и таксолом, мы изучали эффекты ухудшения сборки

матрикса и взаимодействия его с клеточной поверхностью. Для этой пели был использован ингибитор трансглютаминазы, фермента, сшивающего молекулы матриксных белков между собой (Birckbicher 1978, Barsidian el al 1938) и с компонентами плазматической мембраны (Fellin et al 1988, Menter et al 1991). Трансглютаминазы катализируют Са2+-зависимую реакцию между гамма-карбоксильной группой глютамина и эпсилон-аминогруппой лизина в составе пептидов, образуя внутри- и межмолекулярные связи (Folk, Finlayson 1977).

В нашей работе мы применяли самый эффективный конкурентный ингибитор, выступающий как несущий аминогруппу субстрат трансглютаминазы, — N—(5—аминопентил)—5—диметил—амино—1—нафгален-сульфонамид, он же монодансилкадаверин (MDQ (Lorand et al 1968), предоставленный нам профессором ГЛ. Николсоном (Хьюстон, США), чьи любезные консультации мы использовали в этой части работы.

Площадь нетрансформированных и трансформированных дексаметазоном клеток RAT2/5 при обработке MDC сильно уменьшается. При этом определяющие поляризацию параметры — дисперсия и элонгация — для каждой культуры уменьшаются гораздо меньше (см таблицу S и рис. 5 и 6).

Таблица 5

Действие монодаисилкадаверина (MDC) на форму клеток RAT2/5

Клетки ^трансформированные клетки Трансформированные клетки

ЛАТ2/5 RAT2/5 (инкубированные в

присутствии дексаметазона)

Контроль MDC Контроль. MDC.

Количество 58 85 68 79

обработанных

клеток.

Средняя 4659.51 1568.45 1766.31 . 10J4.96 -

площадь ±208.16 ± 76.896 ± 93.0356 ± 41.672

Средняя 0.1557 0.1292 1.0728 0.6439

дисперсия ±0.0137 ± 0.0162 ± 0.0649 ± 0.0445

Средняя 0.5993 0.7405 2.0842 1.8855

элонгация ±0.0504 ± 0.0471 ± 0.0789 ± 0.0943

ад

<U5 0,1 № о

50И 4030 ЗОЮ 2X0

кет

л j

ДюЕрЖЯ

ЙЗГрОЛ.

MDC

Кзорояк

AS 0,6 <v»

(Ц о

их;

Зи»явя

¿■у:-■1

1" • -!-¡-'!•'•■'.

Ксираъ

МК

Рис.5 Изменения нетрансформированных клеток RAT2/5 под действием MDC

Пташ. (мзаг )

2000

Ш)

Ккфсяь

MDC

u 1

ад w 0А

«а о

Д зпзроя

!Й§

Эизшякя

Кмтршь

мое

Ряс.6 Изменения трансформированных клеток RAT2/5 под действием MDC

В. Изменения цитоскелета и матрикса клеток ИАТ2/5 под действием МРС.

При воздействии ингибитора трансглютаминазы МПС на густые культуры наблюдается резкое уменьшение количества фибронектиш во Енеклсточном матриксе.

Фибронектин в густой культуре нетрансформиро ванных КАТ2/5 представляет собой сетки из ярких довольно толстых фибрилл, часто соединенные' в общий матрикс. После инкубации с МБ С фибронектин выявляется в виде редко расположенных коротких широких палочек и маленьких несложных сеток. Трансформирозанные клетки, инкубированные в дексаметазоне, в густой культуре образуют сеть из тонких фибрилл фибронектина, часто ориентированных вдоль длинной оси клеток. После обработки их МОС матрикс составляют лишь отдельные тонкие нити и простые сетки. Разницы в количестве фибронектина между трансформированными и нетрансформированными клетками ни до, ни после обработки ингибитором не выявляется. Струкрура фибрилл в обоих случаях различается — у трансформированных клеток они более тонкие.

Известна способность разных трансглютаминаз сшивать молекулы фибронектина с другими фибриллярными белками (фибрином, коллагеном) или между собой (МозЬег 1974; Ке«и-0)а е! а1 1976). Отмечалось также сораспределение фибронектина и трансглютаминазной активности при фракционировании клеток (ВпскЫсЫег а а! 1976) и положительная корреляция между количеством трансглютаминазы и фибронектина во внеклеточном матриксе в культуре (ВнскЫсЫег & а1 1975). Эти данные и наши результаты позволяют предположить, что трансглюгаминаза актнЕно формирует фибронектиновый матрикс в культуре, сшивая молекулы фибронектина между собой. При высоком уровне трансглютаминазной активности образуется мощный матрикс, а после ингибирования фермента количество связанного фибронектина резко уменьшается, что и приводит к указанной корреляции.

Нами обнаружено уменьшение количества и размеров фокальных контактов клеток на фибронектиновой подложке и на стекле под действием МОС. После обработки МОС количество и размеры контактов уменьшается. Исчезают штриховые контакты, совпадающие с окончаниями акгюшвых пучков и расположенные как у края, так и в центральной части клетки, и преобладают точечные контакты, расположенные на поджавшихся краях клетки. В трансформированных клетках эффект МОС выражен в уменьшении числа точечных контактов.

Нарушения фокальных контактов могут быть' прямым следствием уменьшения количества фибронектина на стекле, так как взаимодействие клегки с матрнксом существенно при инициации этих структур. В то же время

известно, что MDC и другие ингибиторы трансглготамнназы ингибнруют образование сшивок между фкбронмггаком я определенными мембранными белками (Menter et al 1991). Полигональные антэтгла против комплексов фибронектена с этими белками при иммунофлуоресцентном окрашивании выявляют фокальные контакты. Отсутствие еппшок между фибронгкткном и мембраной, вызываемое MDC, может быть одной га причин редукции фокальных контактов.

При совместной окраске »слеток антителами к интегршювому рецептору фибронектина и маркерном)' белку фокальных контактов Бинкулину было выявлено, что они сораспреаелены. Эти данные сооп.-.тствуют полученным ранее (см. Rouslahti, Pierschbacher 1987) и подтверждают, что" рецептор расположен в фокальных контактах

Вместе с тем молекулярный вес одного го мембранных белков, входящих в MDC—зависимый комплекс с фибронекттшом, выявляемый в вокальных контактах, совпадает с весом клеточной трансглютаминазы (Menter et al 1991). Предполагается, что транспнотаминаза при адгезии на фибронектпне сораспределена с рецептором фибронектина в мембранах фокальных контактов.

Можно предположить, что взаимодействие между рецептором к фибронектином обеспечивает контакт клетки и субстрата, но стабилизация и созревание контакта требует трансглютаминазной активности и образования ковалентной связи мембраны и матрикса.

Нами показано также, что обработка MDC приводит к сильным изменениям в ахтнновой системе. Контрольные клетки, содержат много пучков актиновых микрофиламентов, проходящих через всю клетку. Выявляется яркая полоса на краю ламеллы. Пос^е воздействия MDC в клетках остаются _ немногочисленные короткие и топкие лучки, актпн распределен в основном диффузно. В клетках, инкубированных в дексаметазоне, как правило, . присутствуй тонкие пучки, параллельные длинной оси клетки. После воздействия MDC остается в основном диффузное окрашивание.

Формирование пучков актиновых микрофидаментов требует наличия фокальных контактов и, следовательно, взаимодействЕЯ с субстратом (внеклеточным матриксом) (Bumdge et al 1988).

По—видимому, в отсутствие прочных , контактов с субстратом » сохраняющееся в результате слабое взаимодействие недостаточно для поддержания или создания развитой системы пучков ахтпновьи микрофиламентов в клетках, обработанных MDC.

С другой стороны, существует гипотеза, согласно которой формирование фибронектиноЕого матрикса на ранних стадиях сборки регулируется акгиновыми сгрессфибриллами (LjubimoY, Vasffiev 1982, Peters, Mosher 1987). В

таком случае, КШС—зависимая редукция актиновой системы может вторично влиять на формирование фибронектинового матрикса.

Изменение морфологии клеток под действием \ШС несколько напоминают изменения при трансформации. Происходит уменьшение площади клеток и количества фибронектина в матриксе, редукция фокальных контактов и актиновых пучков. Перечисленные изменения происходят и в нетрансформировзнных, и в трансформированных клетках. Таким образом, ингибитор не снимает различий нормальных и трансформированных клеток, а вызывает их сдвиг в одну и ту же сторону, увеличивая степень фенотапической трансформации. Все изменяющиеся под действием МБС свойства прямо или косвенно связаны с адгезией клеток на субстрате. Такой эффект логически Вытекает из механизма действия ингибитора. Свойства, связанные с поляризацией — элонгация и дисперсия — и при таком воздействии не меняются. Можно сделать вывод о том, что поляризация и степень распластанности клеток — признаки, не зависящие друг от друга и их изменения могут не коррелировать друг с другом при Морфологической трансформации.

Заключение

Роль цитоскелета и матрикса в экспрессии трансформированного

фенотипа

Полученные нами данные позволяют дать определенный ответ на вопрос о том, какова роль трех цитоскелетных систем, а также внеклеточного матрикса в экспрессии трансформированного фенотипа.

После деполимеризации микротрубочек в результате воздействия колцемида и дезинтеграции системы микротрубочек в результате воздействия таксола происходит частичная фенотипическая нормализация клеток по ряду признаков. В частности, система актиновых микрофиламеэтов при воздействии колцемида и таксола в трансформированных клетках частично восстанавливается. После обработки колцемидом возникают пучки, пересекающие клетку, а после обработки таксолом — кольцевые. Это позволяет сделать предположение о том, что микротрубочки регулируют проявление морфологической трансформации, усиливая экспрессию трансформированного фенотипа.

Следует, однако, отмстить, что и после воздействия таксола, и после воздействия колцемида пучки менее многочисленны, более короткие и тонкие, чем в нетрансформированных клетках после таких обработок. Появляющиеся в

трансформированных клетках штриховые фокальные контакты также не хостигают по количеству и размеру контактов в аналогично обработанных «»трансформированных клетках. Тагам образом, в отсутствие фуизециональных микротрубочек различия нетрансформироваккък и трансформированных клеток яе исчезают, хота заметно уменьшаются. Можно сделать предположение, что в грансформкро ванных клетках существуют изменения актиноиого цитоскелета, не связанные с регуляторным действием системы микротрубочек.

Организация промежуточных филаментов н«трансформированных и [расформированных клеток имеет определенные различия прояатяющиеся при теполимерИЗзцки микротрубочек. Эпт различия состоят в ослаблении гпособности к коллапсу (энергсзависимому сворачиванию филаментйв вокруг адра). Возможно, это различие в свойствах прсмеаугочных филаментов также тграет какую-то роль в экспрессии трансформированного фенотипа.

Разрушение фибронкепшового матрикса приводит к ншггаготл "екоторых жойств трансформированных клеток, а именно уменьшению площади, гедукции фокальных коотактоэ, системы актиионкх микрофиламентов, то есть люйств, связанных с адгезией. Различия трансформированных и гетрансформированных . клеток при этом сохраняются, следовательно, 1>ибронектно£ый матрикс, вероятно, не участвует в экспрессии грансформярованного фенотшта, но может модулировать степень выражения «которых свойств, характерных для трансформированных клеток.

Проведенные опыты позволкгот заключить, что основным эпементом, лгределяющим морфологическую трансформацию являются кзмененпя □станового кортскса. Микротрубочки регулируют . органшашпо коргекса и осиливают экспрессию трансформированной морфологии. Фиброяекппюрчй ¿атрикс способен модулировать ряд фенотшшчгсклх свойств, связанных с рзнсформацией.

Перспективной пробло.гой для дальнейших нсслс&овзний является пучение механизмов независимых от микротрубочек изменений актина. Зероятно, они. связаны с изменениями в цепи передачи сигнала внутри клетки, ¡ызываемими экспрессией онкогена. Известно, например, что функция многих истин—связывающих белков, в том числе миозикэ и вшпеулина, регулируются гутем фосфорилирования протеинхиназами этой цепи. Необходимо выяснить, эким образом изменения биохимии аютшозого кортекса приводят к вменениям его морфологии.

Конкретные механизмы регуляции михротрубочхами актановс Л системы акже подлежат дальнейшему исследованию. В частности, важно определить, эким образом осуществляется деполяризация трансформированных и гстрансформированных клеток и перестройка актина при воздействии таксола.

Выяснение этого вопроса имеет тем большее значение, что из наших опытов очевидно, что одним из механизмов действия этого препарата на опухоли может являться угнетение направленного движения опухолевых клеток, то есть торможение инвазии.

Выводы

1. В опытах на двух парных культурах нетрансформированных и трансформированных клеток, различающихся по экспрессии одного онкогена семейства ras, методом компьютерной морфометрии показано, что трансформированные клетки обладают большей степенью поляризации (более высокой дисперсией и элонгацией) при' меньшей площади, чем нетрансформированные. Методом иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что актиновый цитоскелет и фокальные контакты трансформированных клеток редуцированы, в то время как микротрубочки и промежуточные филаменты не имеют существенных отличий.

2. Методом компьютерной морфометрии показано, что при деполимеризации микротрубочек под действием колцемида элонгация и дисперсия клеток уменьшаются, причем у трансформированных клеток более резко. Площадь трансформированных клеток при этом увеличивается.

При дезинтеграции микротрубочек под действием таксола дисперсия и элонгация клеток резко падает, причем у трансформированных клеток эффект более сильный. Площадь трансформированных клеток при этом сильно увеличивается. Таким образом, в обоих случаях происходит восстановление нормального фенотипа по площади и поляризации.

3. Иммунофлуоресцетная микроскопия показала, что при деполимеризации микротрубочек под действием колцемида происходит частичная нормализация трансформированных клеток (появление пучков, пересекающих клетку и многих штриховых фокальным контактов, а также увеличение количества фибрилл фибронектинового матрикса).

При дезинтеграции микротрубочек под действием таксола происходит частичная нормализация организации актинового кортекса трансформированных клеток (появление кольцевых или параллельных краю пучков).

4. Монодансилкадаверин (MDC) - ингибитор сшивающего молекулы фибронектина между собой фермента трансглютаминазы - нарушает

формирование фкбронеюгинового матрикез обоих типов клеток. При этом происходит выявляемая иммунофлуоресценцней редукция фокальных контактов и системы актиновых микрофяяаментов, а также уменьшение площади трансформированных и нсхрансформированных клеток. Определенные методом компьютерной морфомстрии показатели дисперсии и элонгации при этом не меняются. Таким образом, взаимодействие с матриксом модулирует свойства клеток, связанные с адгезией, усиливая морфологическую трансформацию.

5. Методом иммунофлуореспипной микроскопии показано, что организация промежуточных филаментов у нетрзнс.^ормнрованных и трансформированных клеток имеет различия, проявляющееся при деполимеризации микротрубочек колцемвдом. Эта различия состоят в ослаблеюш способности к коллапсу (энергоззвисамоьгу сворачивашш филаментов вокруг ядра).

6. Проведенные опыты позволяют заключить, что основным элементом цитоскелета, определяющем экспрессию морфологической трансформации, является актиновый кортекс. Микротрубочки регулируют его функционирование и усиливают проявление морфологических черт, характерных для трансформированных клеток. Возможно, промежуточные филаменты также участвуют в этой регуляции. Внеклеточный матрикс способен модулировать ряд фенотйпических свойств, связанных с трансформацией.

Список литературы, опубликсзлнной но Диссертации.

1. И.Н.Кавермна. Влияние опухолевого 'проУютора ТРА на распределение актина и миозина в культивируемых клгтках (тезисы доклада). Цитология, т.31, N'9, стр.1104 (1989).

2. Т.М.Свиткина, И.Н.Каверина. Нарушения актинового цитоскелета в трансформированных эпителиальных клетках. Цитология, т.-31, N12, стр.14441—1447, (1989).

•3. И.Н.Каверина, Ю.М.Васильев. Влияние деполимеризации и дезинтеграции системы Ыикротрубочек на шггоскелет нетраксформйрованных и трансформированных клеток. Цитология, т.ЗЗ, N12, стр.49-53, (1991).

-Ч. И.Н.Каверина, Ю.М.Васильев, ГЛ.НиколсоН. Изменения нетрансформированных и трансформированных клеток йод действием ингибитора трансглютаминлзы м о:! о дан сил к-ДайьериНа (МОС). Вестник

онц рамн, А^/, а}"4Ч-ю[ 1М2)

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВСНЦ АМН СССР __

гг^'п.'к печаГи^г Л2. Л-' — заказ 232 тирАа|соэкз.