Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль опухолевого супрессора р53 в регуляции организации цитоскелета и формы нормальных и опухолевых клеток

на правах рукописи

, Рубцова Светлана Николаевна

РОЛЬ ОПУХОЛЕВОГО СУПРЕССОРА р53 В РЕГУЛЯЦИИ ОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА И ФОРМЫ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

(специальность 14.00.14-Онкология)

I

( Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в ГУ Российском Онкологическом научном центре им H.H. Блохина РАМН

Научный руководитель:

член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Ю.М. Васильев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Г.Е. Онищенко доктор медицинских наук, проф. A.A. Ставровская

Ведущая организация: Институт белка РАН

Защита состоится _ 2005 года в // час на заседании

диссертационного совета (К 001.017.01) ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского Онкологического центра им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан "26 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

2 2 69Ш

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач клеточной биологии является изучение механизмов морфогенеза клеток, тканей и органов, а также патологических изменений морфогенеза, происходящих в процессе опухолевых превращений. В настоящее время выяснены многие черты клеточных механизмов морфогенеза и, в особенности, природа динамики цитоскелетных и адгезионных структур клетки, определяющих эти процессы. Вместе с тем, остается малоизученным вопрос контроля этих цитоскелетных изменений основными регуляторными системами клетки.

Особую роль среди таких регуляторных систем играет система гена и белка р53 - важнейшего регулятора процессов клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки. Несмотря на огромное число исследований, посвященных структуре и функции р53, вопрос о связи этой системы с функциями цитоскелета остается неясным. Этот вопрос актуален не только для понимания нормальных механизмов морфогенеза, но и для понимания основных механизмов канцерогенеза, поскольку в динамике канцерогенеза резко нарушаются как функция р53, так и функции цитоскелетных систем, в особенности акто-миозинового контрактильного аппарата. Одним из особых аспектов этой проблемы является изучение связи изменения активности р53 с так называемыми эпителио-мезенхимальными трансформациями, играющими важнейшую роль во многих морфогенезах и злокачественных превращениях клеток.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение взаимосвязей между изменением морфологического фенотипа клеток различного происхождения, их цитоскелетных систем, и активностью опухолевого супрессора

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить, является ли избирательное нарушение структуры основных цитоскелетных систем - актиновых микрофиламентов или микротрубочек -фактором, достаточным для активации р53 в клетках.

2. Изучить изменения морфологического фенотипа клеток в зависимости от экспрессии р53.

3 Изучить феномен мезенхимо-эпителиальной трансформации при воздействии на клетки хелатора железа дефероксамина и выяснить, является ли этот фенотипический переход р53-зависимым.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые показано, что нарушение целостности цитоскелетных систем клетки с помощью специфических химических агентов влечет за собой активацию онкосупрессора р53. Разборка пучков актиновых микрофиламентов с помощью цитохалазина Б или разборка микротрубочек с помощью колцемида вела к функциональной активации р53 и, как следствие, к остановке клеточного цикла или апоптозу клеток. В линиях клеток, не содержащих р53 или содержащих функционально неактивный р53, остановка цикла или апоптоз в ответ на

р53.

разрушение цитоскелетных систем были не выражены Таким образом, впервые было показано, что патологическое изменение морфологии клеток и цитоскелетных систем может приводить к активации р53 Полученные нами данные существенно дополняют и расширяют представления о стрессорных воздействиях, приводящих к активации р53.

Показано, что экспрессия р53 меняет морфологический фенотип клеток Клетки карциномы, лишенные р53, имели более дисковидную, эпителиоидную морфологию, сопровождающуюся образованием эпителиоидных островков а также изменениями цитоскелетных систем. Так, в отличие от исходных, р53-содержащих клеток, в клетках с нокаутированным р53 частично восстанавливались краевые пучки актиновых микрофиламентов, отсутствующие у клеток, экспрессирующих р53 Контактные структуры клеток, лишенных р53, также были более ярко выражены Так, эти клетки образовывали протяженные тангенциальные адгезионные контакты Фокальные адгезии р53-негативных клеток были более многочисленны, чем у р53-позитивных клеток, и располагались по всему периметру клетки В целом, такая перестройка цитоскелета и изменение морфологического фенотипа клеток говорит о том, что р53 индуцирует переход клетки к более фибробластоподобному фенотипу.

Показано также, что переход клеток от фибробластоподобного к эпителиоидного фенотипу, т.е. мезенхимо-эпителиальная трансформация, может быть вызвана, среди ряда других агентов, добавлением к культурам хелатора железа дефероксамина, и что эта морфологическая трансформация не зависит от экспрессии р53 в клетках В сравнительных опытах с воздействием дефероксамина на клетки, экспрессирующие р53 дикого типа и клетки, где р53 был так или иначе инактивирован, мы показали, что индукция мезенхимо-эпителиальной трансформации в этой системе не зависит от экспрессии р53.

Таким образом, установлены многообразные реципрокные связи между экспрессией р53 и динамическими перестройками цитоскелета, в том числе, участвующими в мезенхимо-эпителиальной трансформации. Исследование участия р53 в контроле морфологического фенотипа и цитоскелетной организации клеток приобретает все большее значение. Понимание роли р53 в этих процессах могут привести к более полному пониманию механизмов канцерогенеза. В частности, полученные нами данные о таких взаимодействиях могут оказаться ценными для разработки новых методов нормализации морфологического фенотипа и предотвращения процесса инвазии.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции Лаборатории механизмов канцерогенеза, Лаборатории цитогенетики и Лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН и Группы клеточных регуляций НИИ Физико-химической биологии им. Белозерского МГУ 21 июня 2005 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на/^страницах машинописного текста, включает рисунков и список литературы из/^ публикаций.

Материалы и методы

1. Культуры клеток

В нашей работе мы использовали различные линии фибробластов, различающиеся по статусу р53, а также фибробластоподобные клетки карциномы

Все клеточные линии были любезно предоставлены проф. Б П Копниным (НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН), если не указано иначе. 1 1 REF - эмбриональные фибробласты крысы, полученные путем трипсинизациии

крысиных эмбрионов второй половины беременности 1 2 REF52 - линия спонтанно иммортализованных фибробластов крысы,

экспрессирующих р53 дикого типа (Ishizaka et al, 1995). 1 3 REF52/GSE22 - фибробласты крысы REF52, конститутивно экспрессирующие

негативный регулятор активности р53 GSE22 (Ossovskaya et al, 1996). 1 4 REF52/mdm2/2 - фибробласты крысы REF52, конститутивно экспрессирующие ген mdm2 - негативный регулятор активности р53. Клетки получены в лаборатории и любезно предоставлены проф П М. Чумаковым (Институт Молекулярной Биологии РАН). 1 5 REF52CAT - фибробласты крысы REF52, конститутивно экспрессирующие репортерный ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) под р53-респонсивным промотором (Кондратов, 1996). 1 6 12(1) - линия ЗТЗ-подобных фибробластов мыши, экспрессирующих р53 дикого типа В клетки, использованные нами, был встроен вектор pConALacZ, несущий репортерный ген бактериальной Р-галактозидазы под р53-респонсивным промотором (Komarova et al, 1997). 1 7 10(1) - линия ЗТЗ-подобных фибробластов мыши, не экспрессирующих р53

(Harvey & Levine, 1991). 1 8 С8 (р53+/+) и А4 (р53-/-) - линии иммортализованных фибробластов мыши, экспрессирующих ген El А и конститутивно активный H-ras (Lowe at al, 1993) 1.9 HCT116 p53 +/+ и HCT116 p53-/- - клетки карциномы кишечника человека и их производные с нокаутированным р53 (Bunz et al, 1998).

Все клеточные линии инкубировали в среде DMEM (Life Sciences) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко), ЮОЕд/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина

В ходе экспериментов клетки инкубировались с различными агентами

• цитохалазин D (Sigma), 0,2-0,4 мкг/мл

• колцемид (Serva), 0,1-0,4 мкг/мл

• дефероксамин (DFO) (Sigma) 100-400мМ

2. Вестерн-блот анализ

Клетки в количестве 107 дважды промывали холодным PBS и переносили в 0,5 мл холодного лизирующего буфера (20мМ HEPES рН7,6, ЮмМ NaCl, 1,5тМ

MgCl2, 0,2мМ ЭДТА, 20% глицерин, 0,1% Тритон Х-100, 1мМ дитиотреитол, 1мМ PMSF, 100мг/мл апротинин) Целые ядра, отделенные центрифугированием, инкубировали на льду со встряхиванием в том же буфере с добавлением 500мМ NaCl После центрифугирования, супернатант был подвергнут электрофорезу в СДС-ПААГ Белки, перенесенные на мембрану ECL, инкубировали с антителами рАЬ421, специфичными к р53 Проявление блота проводили с помощью ECL Western blotting kit (Amersham).

3. Определение трансактивационной способности р53

3.1 Анализ активности хлорамфеиикол-ацетилтраисферазы (CAT)

Клетки в количестве 1-1,5х10б промывали дважды раствором PBS, собирали скребком в 0,25М Tris-HCl pH 7,8 и лизировали замораживанием-оттаиванием Эквивалентные по белковому содержанию клеточные экстракты инкубировали с хлорамфениколом, содержащим С и ацетил-СоА при 37°С в течение 1-3 часов «

Продукты реакции экстрагировали этилацетатом, хроматографировали на силикагеле в системе хлороформ/метанол 19/1 и экспонировали контактным способом на рентгеновской пленке в течение суток v

3.2 Анализ активности ß-галактозидазы.

Клетки промывали 5-6 раз PBS и фиксировали 1% глютаральдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем клетки промывали 3-4 раза PBS и инкубировали при 35°С в течение ночи в растворе, содержащем 0,2% Xgal, 3,3mM K4Fe(CN)6, З.ЗмМ K3Fe(CN)e, 1мМ MgCl2.

4. Анализ вхождения клеток в S-фазу цикла по включению 5-бромдезоксиуридина (5-BrdU) в ДНК.

Клетки инкубировали с 5-BrdU в концентрации ЮОмМ. По окончании инкубации клетки промывали 3-4 раза PBS, затем фиксировали 3,7% раствором параформальдегида на PBS в течение 15 минут при комнатной температуре Далее клетки инкубировали с 1% р-ром Тритона Х-100 на PBS в течение 10 минут, промывали 3-4 раза PBS и инкубировали в течение 10 минут с 4N раствором HCl

Для выявления включения 5-BrdU использовали метод непрямой иммунофлуоресцентной окраски. Клетки последовательно инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре с антителами, специфичными к 5-BrdU (BU-33, Sigma), а затем с антителами к мышиным IgG, меченными TRITC. Для одновременной окраски ядер использовали флуоресцентный краситель Hoechst #33258 (Sigma).

5. Апоптотическое фрагментирование ДНК

Клетки в количестве 1,5-3x106 соскребали в центрифужные пробирки, промывали PBS и осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали 30 мин в 200 мкл лизисного буфера (20мМ Tris-HCl рН7,5, ЮмМ ЭДТА, 0,2% Тритон X-100) после центрифугирования супернатант обрабатывали протеиназой К (0 1 мг/мл) в течение 1,5 ч при комнатной температуре и подвергали экстракции смесью фенола с хлороформом и затем хлороформом. ДНК осаждали путем добавления ацетата аммония до концентрации 2М и этанола. После этого препарат ДНК

обрабатывали РНКазой А (0,1 мг/мл) в течение 1,5ч и разделяли в 1% агарозном геле

6. Флуоресцентная окраска

6.1 р53

Для выявления р53 использовали мышиные моноклональные антитела к р53 клон рАЬ421. Антитела были любезно предоставлены проф. П М Чумаковым (Институт Молекулярной Биологии РАН).

6.2 Ядра

Для окраски ядер применялся ДНК-специфичный флуоресцентный краситель Hoechst #33258 (Sigma).

6.3 цитоскелетные белки

• актин

Для окрашивания полимеримеризованного актина использовали фаллоидин, конъюгированный с красителем А1еха488 (BD Transduction Labs).

• микротрубочки

Для выявления микротрубочек использовали мышиные моноклональные антитела к а-тубулину (клон DM1A, Sigma).

• фокальные контакты (паксиллин)

Для выявления фокальных контактов использовались мышиные моноклональные антитела к паксиллину (клон 349, BD Transduction Labs).

• межклеточные контакты ((3-катенин)

Для выявления фокальных контактов использовались мышиные моноклональные антитела к Р-катенину (клон 14, BD Transduction Labs)

При использовании метода непрямой иммунофлуоресценции в качестве вторых антител использовались ослиные антитела к мышиным IgG, конъюгированные с флуоресцентными красителями (Chemicon)

Наблюдения проводились с помощью микроскопов Leitz Axiophot и Zeiss Aristoplan. Съемка велась с помощью камеры Olympus D70.

7. Количественный анализ морфологии клеток.

Полученные изображения одиночных клеток использовались для морфометрического анализа Контуры клеток с учетом масштаба были введены в компьютер и проанализированы с помощью программы Tracer 1 0, разработанной и любезно предоставленной А. Брауном (Dunn and Brown, 1986) При анализе, использовался параметр площади клеток, а также два параметра, характеризующие форму клеток' дисперсия и элонгация Элонгация является величиной, характеризующей степень вытянутости клеток Она равняется нулю у радиально симметричных фигур Дисперсия - величина, выражающая степень "изрезанности" края клеток. Она равняется нулю у любого эллипса Таким образом, эти две величины отражают степень поляризованности клеток Как правило, степень элонгации и дисперсии у клеток мезенхимального происхождения превышают значения этих величин, вычисленные для эпителиоподобных клеток

Результаты и обсуждение.

В этой работе мы исследовали несколько аспектов взаимодействия р53 с цитоскелетными системами и влияние р53 на морфологический фенотип клетки Обсудим теперь полученные результаты.

1. Разрушение цитоскелетных систем с помощью специфических агентов ведет к активации р53

В данной части работы мы хотели выяснить, приводят ли нарушения целостности цитоскелетных систем к активации р53. Для этого мы использовали химические вещества, избирательно воздействующие на различные компоненты цитоскелета. Для разборки системы актиновых микрофиламентов нами был использован цитохалазин Б Воздействие этого агента уже через несколько часов приводило к значительным перестройкам актинового цитоскелета и изменениям в морфологии клеток. N

1.1 Обработка цитохалазином Б приводит к накоплению и активации р53 в клетках

Обработка цитохалазином Б приводит к накоплению р53 в клетках

Нами было показано, что разрушение актинового цитоскелета, вызванное цитохалазином, приводило к накоплению р53 в иммортализованных фибробластах линии ИЕР52, что было подтверждено с помощью Вестерн-блот анализа (рис 1)

REF REFS2 10(1)

р53»

р53 ► щт* -

Рис.1 Первичные фибробласты REF, а также фибробласты линий REF52 и 10(1) Вестерн-блот на р53 В клетках REF и REF52 видно повышение уровня р53 при воздействии цитохалазина D (0,4 мкг/мл) В клетках 10(1), не экспрессирующих р53, окраска на р53 отсутствует

Обработка цитохалазином D ведет к функциональной активации р53

На клетках REF52CAT, несущих ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) под р53-респонсивным промотором, было показано, что воздействие цитохалазина D в течение 36 часов вызывало 4-6-кратную функциональную активацию р53 в зависимости от дозы цитохалазина (табл. 1)

Табл 1. Активация CAT под действием различных концентраций цитохалазина D по данным денситометр ического анализа _____

Цитохалазин D, мкг/мкл контроль (0) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Активация CAT относительно контроля 1 3,5 6,0 6,3 5,9 4,6

Функциональная активация р53 была также показана в клетках, несущих ген Р-галактозидазы под р53-респонсивным промотором Такая система позволяет проанализировать активацию р53 в индивидуальных клетках Воздействие цитохалазином О на клетки 12(1) действительно приводила к повышению активности р53 В культурах клеток, обработанных цитохалазином (0,4мкг/мл, 72 часа), 51,3±2,9% клеток окрашивались положительно на Р-галактозидазу по сравнению с 2,4±0,9% в контрольных культурах.

Обработка цитохалазином О приводит к р53-зависимому угнетению синтеза ДНК в клетках

Нами было показано, что 72-часовая инкубация клеток ЯЕР52 с цитохалазином О (0,4 мкг/мл) приводила к практически полному угнетению синтеза ДНК В то же время клеточные линии - производные КЕР52, где активность р53 была подавлена введением ОЗЕ22 или тс1т2, продолжали входить в Б-фазу (рис 2) Это свидетельствует о том, что остановка клеточного цикла, вызванная добавлением цитохалазина О, опосредована активацией р53.

Рис. 2. р53-зависимое угнетение синтеза ДНК под действием цитохалазина Б в несинхронизированных культурах

REPS2/Q8B2 REF52Andm2/2

В следующей группе опытов мы показали, что в культурах клеток ШЕИ52 и 12(1), содержащих р53 дикого типа, синхронизованных в 01-фазе клеточного цикла с помощью инкубации в течение 48 часов в бессывороточной среде, под действием цитохалазина угнетается вход в первую же Б-фазу. В культурах клеток, не содержащих р53 (линия 10(1)) или клеток с функционально неактивным р53 (ЯЕР52С5Е22 и ЯЕР52/тс1т2/2) этой остановки цикла не было, или она была менее выражена (рис. 3).

Рис. 3. рЗЗ-зависимое торможение клеточного цикла в G1, вызвано цитохалазином D Мышиные фибробласты 12(1) и 10(1). 1-я группа столбцов - 10% FCS в течение эксперимента 2-я группа - среда без сыворотки в течение эксперимента 3-я группа - среда без сыворотки в течение 48 часов, затем среда с добавлением сыворотки и 5-BrdU в течение 15 часов 4-я группа -среда без сыворотки в течение 48 часов, затем среда с добавлением сыворотки, цитохалазина D и 5-BrdU в течение 15 часов При добавлении цитохалазина D видно подавление синтеза ДНК в клетках 12(1), экспрессирующих р53 дикого типа, но не в 10(1), не экспрессирующих р53 Сходные результаты были получены при сравнении линий REF52 и REF52/GSE22

Обработка цитохалазином D приводит к р53-зависимому апоптозу

В другой клеточной системе, использованной нами, добавление цитохалазина D к культурам клеток вызывало апоптоз. Для этой цели нами использовались мышиные фибробласты линий С8 (р53+/+) и А4 (р53 -/-) трансфицированные активированным геном ras и одновременно аденовирусным геном El А, инактивирующим клеточный белок Rb. В этой клеточной системе активация р53 приводит к массовой гибели клеток путем апоптоза.

Из рис 4 видно, что в течение 48 часов опыта контрольные клетки продолжали делиться. Добавление цитохалазина D к клеткам А4 р53-/- замедляет пролиферацию клеток, но в целом динамика роста положительная (рис 4А) В случае р53-позитивных клеток С8 (рис 4Б) видно, что добавление цитохалазина резко уменьшает количество клеток, что свидетельствует об апоптозе, вызываемом цитохалазином D

контроль б/с 48 б/с 48 б/с (FCS) часо» часов-» FC&HpD FCS 15 15 часов

А Б

Рис. 4. Изменение динамики роста клеток при воздействии цитохалазина О По оси X - время в часах, по оси У - количество ядер в поле зрения микроскопа при увеличении 100х Открытые значки - контроль, заполненные - цигохалазин О в концентрации 0.25 мкг/мл

Чтобы подтвердить апоптотическую природу гибели р53-положиельных клеток, мы подвергли электрофорезу ДНК контрольных и обработанных цитохалазином Б клеток С8 и А4 (рис.5) По данным электрофореза видно, что в контрольных культурах не наблюдается специфического сегментирования ДНК, характерного для апоптоза (т н "лесенки"). При обработке цитохалазином О (0,25 мкг/мл) в культурах клеток С8 р53+/+ апоптотическая лесенка видна уже через 12 часов воздействия цитохалазина. В культурах клеток А4 р53 -/- апоптотической лесенки не наблюдалось ни через 12, ни через 24 часа воздействия цитохалазина Э

А4р53->-ц«0 а 12ч 24ч

С8р53+/+ 0 124 24ч

Рис. 5 Мышиные фибробласты линий С8 и А4 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Таким образом, нам удалось показать, что разрушение актиновых микрофиламентов с помощью цитохалазина Б приводит к накоплению и активации р53 в различных клеточных системах В зависимости от клеточного контекста активация р53, вызванная разрушением актинового цитоскелета, вызывает остановку клеточного цикла или апоптоз.

Какие же факторы опосредуют активацию р53 при разрушении актиновых микрофиламентов? Точный ответ на этот вопрос нам не известен, хотя можно предложить ряд гипотетических механизмов Во-первых, известно, что цитохапазин О активирует ферменты, входящие в цепочки передачи стрессорных сигналов - а именно, киназ ЖК и р38, активирующихся в ответ на различные повреждения (Оиау е! а1, 1997; Ущш е1 а1, 1999) Эти сигнальные каскады могут привести к фосфорилированию и активации р53 Во-вторых, при разрушении актиновых микрофиламентов происходит и разборка фокальных контактов Перемещение регуляторных компонентов фокальных контактов в цитоплазму и ослабление сигнала, свидетельствующего об успешном прикреплении клетки к субстрату, является фактором, потенциально способным активировать р53 Известно, что нахождение клеток в суспензии, то есть естественная разборка фокальных контактов, приводит к так называемому анойкису - р53-зависимому

апоптозу в ответ на недостаточное прикрепление клеток к субстрату (Frisch & Ruoslahti, 1997) В-третьих, можно предположить существование гипотетического механизма, реагирующего на пониженную сократимость клеток, обработанных цитохалазином D, тормозящего клеточный цикл в ответ. И наконец, в ранних работах было показано, что р53 может локализоваться на актиновых микрофиламентах и таким образом, оказываться секвестрированым вне ядра (Katsumoto et al, 1995, Metcalfe et al, 1999). Можно предположить, что разрушение актиновых филаментов цитохалазином D нарушает эту связь, и р53 передислоцируется в ядро и активирует транскрипцию генов-мишеней

1.2 Обработка колцемидом приводит к накоплению и активации р53 в клетках

Во второй серии экспериментов мы показали, что вещество, которое специфически действует на другой компонент цитоскелета - микротрубочки -также вызывает активацию р53 Колцемид воздействует на микротрубочки, нарушая их полимеризацию.

1

Обработка колцемидом приводит к накоплению р53 в клетках

Нам удалось показать, что в культурах иммортализованных фибробластов REF52 добавление колцемида вызывало накопление р53 в клетках. По данным иммунофлюоресцентного анализа, 1.5±0 1% контрольных клеток экспрессирует р53 на уровне, сравнимом с чувствительностью данного метода. После обработки колцемидом таких клеток в культуре наблюдается 9.5±0.9%.

Обработка колцемидом приводит к функциональной активации р53

На мышиных фибробластах линии 12(1), несущих р53-репортерную конструкцию, было показано, что инкубация с колцемидом повышает и функциональную активность р53 В контрольных культурах количество клеток, положительно окрашивающихся на ß-галактозидазу, составляло 2 4±0 3% После обработки колцемидом этот показатель повышался до 46 0±1.2%

Обработка колцемидом приводит к р53-зависимому угнетению синтеза ДНК в клетках

В следующих экспериментах мы показали, что обработка колцемидом приводит к остановке клеточного цикла в синхронизированных клетках REF52 В то же время, в клетках REF52/GSE22, в которых функция р53 подавлена, эта остановка значительно менее выражена (рис. 6).

Таким образом, можно сделать вывод, что остановка клеточного цикла в ответ на нарушения целостности системы микротрубочек, опосредована активацией р53.

Рис. 6. р53-зависимое торможение клеточного цикла в 01, вызвано колцемидом Крысиные фибробласты ЯЕР52 и ЯЕР52/05Е22 1-я группа столбцов -10% РСБ в течение эксперимента 2-я группа - среда без сыворотки в течение эксперимента 3-я группа -среда без сыворотки в течение 48 часов, затем среда с добавлением сыворотки и 5-ВгсШ в течение 15 часов 4-я группа - среда без сыворотки в течение 48 часов, затем среда с добавлением сыворотки, колцемида и 5-Вгс1и в течение 15 часов При добавлении колцемида видно подавление синтеза ДНК в клетках КЕР52, экспрессирующих р53 дикого типа В клетках 1ШР52/08Е22, где функциональная активность р53 подавлена, эта остановка менее выражена

Разрушение микротрубочек с помощью колцемида приводит к значительным изменениям формы клеток, а также организации актинового цитоскелета и связанных с ним фокальных контактов При воздействии колцемида, как и цитохалазина О, клетки приобретают дисковидную форму Однако их актиновый цитоскелет меняется в противоположную по сравнению с клетками, обработанными цитохалазином О, сторону В отсутствие микротрубочек возрастает внутриклеточное натяжение, опосредованное актином и миозином, что приводит к . значительному утолщению пучков актиновых филаментов и удлинению фокальных

контактов на концах актиновых пучков Этот эффект колцемида был подробно описан в работах нашей лаборатории (РОДшШпа е1 а1,1998, Кгепс1е1 е1 а1,2002)

Таким образом, при сопоставлении результатов двух групп экспериментов (с >' воздействием цитохалазина О и колцемида) обнаруживается удивительный факт' использованные нами агенты оказывают практически противоположное действие на актиновый цитоскелет клетки И тем не менее, оба воздействия активируют р53 По-видимому, нарушение баланса внутриклеточного натяжения как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения способно генерировать стрессорный сигнал, в конечном счете приводящий к активации р53 и остановке клеточного цикла

Заметим также, что колцемид вызывает характерные изменения ядер (появление микроядер), которых не обнаруживается в обработанных цитохалазином клетках. Эти микроядра вызваны запаздыванием одной или нескольких хромосом в анафазе с последующим образованием отдельной ядерной оболочки вокруг отставшей хромосомы. В клетках ЯЕР52, содержащих микроядра, образовавшиеся под действием колцемида, действительно обнаруживалось более высокое содержание р53 в ядре, и такие клетки не входили в Э-фазу В клетках, не

содержащих р53, наличие микроядер не вызывало остановки клеточного цикла (табл 2)

Табл. 2. Включение 5-Вг(Ш клетками, содержащими микроядра.

Чтобы индуцировать появление микроядер, клетки инкубировались с колцемидом в течение 36 часов После этого культуры были отмыты от колцемида и проинкубированы в течение 15 часов

с 5-BrdU

Клетки Обработка колцемидом Процент клеток с микроядрами* Включение 5-BrdU клетками без микроядер1 Включение 5-Вгйи клетками с микроядрами"

REF52 6 5±0 2 42 0±2 4 12 5±0 8

+ 41 7±2 0 23 0±1 5 4 5±0 3

REF52/GSE22 12 9±0 4 57 2±2 9 56 5±4 6

+ 53 1±2 6 21 2±1 5 21 1±0 9

* подсчитано относительно общего числа клеток ^ подсчитано относительно клеток без микроядер

# подсчитано относительно клеток с микроядрами.

Недавно были раскрыты возможные механизмы активации р53 под действием колцемида Саблиной и соавт было показано, что обработка колцемидом вызывает активацию протеинкиназы Егк, одного из ключевых компонентов сигнального каскада, запускающего пролиферацию клеток, и что активация этого фермента обуславливала последующую активацию р53 Активация Егк, в свою очередь зависела от удлинения фокальных контактов при возрастании внутриклеточного натяжения (ЗаЫта й а1, 2001). В другой работе было показано, что Егк может быть транслоцирована в фокальные контакты и активирована там, скорее всего, за счет протеинкиназ, локализованных в фокальных контактах (РАК и Бгс, РтсЬат е! а1, 2000). Однако, напомним еще раз, что противоположные изменения натяжения, вызванные цитохалазином Б, также ведут к активации р53. Сравнительное изучение этих двух эффектов, обнаруженных нами, может представлять значительный интерес.

2. Влияние р53 на морфологический фенотип клеток

Как было показано в предыдущем разделе, изменение цитоскелетных систем и морфологии клетки вызывает активацию р53 В ходе наших опытов был выявлен обратный эффект зависимость морфологического фенотипа клеток от экспрессии р53 Ранее в литературе появились отдельные указания на различные аспекты этой зависимости (ОЬиБЬапкоуа й а1,1997, А1ехапс1гоуа а1,2000, Оас1еа е1 а1, 2002, БаЫша й а1,2003).

Наши исследования, проведенные на клетках карциномы человека НСТ116 выявили фенотипическую разницу между культурами исходных клеток НСТ116, экспрессирующих р53 дикого типа и НСТ116р53-/- с нокаутированным р53 Клетки НСТ116, не имевшие р53, были полигональной или дисковидной формы; у них

также прослеживалась тенденция образовывать эпителиоподобные островки. Напротив, клетки НСТ116, содержащие р53, имели вытянутую фибробластоподобную форму (табл. 3)

Табл. 3. Морс] юметрические парамет ры клеток НСТ116 р53 +/+ и р53 -/-

Площадь (мкм2) Дисперсия Элонгация

НСТ116 р53+/+ 856 4±69 3 0 33±0 03 1 07±0 10

НСГ116 р53-/- 612 4±58 1 0 22±0 02 0 76±0.05

Как видно из табл 3, уменьшение индекса элонгации у клеток НСТ116 р53-/-по сравнению с НСТ116 р53+/+ указывает на снижение степени поляризации. Уменьшение индекса дисперсии говорит об уменьшении числа боковых отростков

Также нами были отмечены различия в контактных структурах у р53-содержащих клеток и клеток с нокаутированным р53. Клетки НСТ116 р53+/+ образовывали межклеточные контакты эпителиального типа между отростком одной вытянутой клетки и боковой стороной другой. Межклеточные контакты клеток НСТ116 р53-/-, также эпителиального типа, имели значительно большую протяженность. Практически все эти клетки в островках были соединены тангенциальными адгезионными контактами (рис. 7).

Рис. 7. Схематическое изображение клеток НСТ116 р53+/+ (А) и НСТ116 р53-/- (Б) На схеме представлены различия в форме клеток, а также различное расположение межклеточных адгезионных контактов (жирная линия).

Были различия и в расположении фокальных контактов. Фокальные контакты р53-содержащих клеток сосредотачивались на концах клеточных отростков. В клетках с нокаутированным р53 радиальные фокальные контакты располагались равномерно по периметру дисковидных клеток.

Наши данные хорошо дополняются данными, полученными Саблиной и соавт. Авторы приводят доказательства того, что в той же клеточной системе р53 повышает способность клеток к миграции. Активация р53 при помощи агентов, вызывающих повреждения ДНК или гипоксию, увеличивала эту разницу (БаЫта й а1,2003).

Показано, что в клетках НСТ116 наличие р53 обеспечивает активацию белка Racl - еще одного члена семейства малых ГТФаз, регулирующих полимеризацию актина. При этом общее количество белка Racl не отличается между р53-положительными и отрицательными клетками (Sablina et al, 2003) В принципе, активация одного только Racl в большинстве клеточных линий приводит к повышенному образованию псевдоподий по всему периметру клетки, но не к направленному движению Однако, следует помнить, что НСТ116 -трансформированные клетки, несущие мутацию гена Ras. В большинстве клеток, трансформированных геном Ras, активность белка Rho, отвечающая за образование актиновых пучков и зрелых фокальных контактов подавлена; по-видимому, то же происходит и с линией НСТ116 В таких условиях активация только белка Rae потенциально может привести к увеличению подвижности клеток за счет повышения псевдоподиальной активности Дальнейшие исследования должны прояснить связь между активацией белка Racl и р53-зависимым изменением морфологии клеток

3. р53-независимый механизм мезенхимо-эпителиальной трансформации (МЭТ)

Было существенно выяснить, всегда ли мезенхимо-эпителиальное превращение опосредовано изменением уровня активности р53 Для этой цели мы использовали новую, ранее не описанную, систему индукции МЭТ Мы обнаружили, что дефероксамин (DFO) - хелатор трехвалентного железа - вызывает эпителиоидное превращение фибробластоподобных клеток независимо от активности р53. Эта трансформация была обнаружена при анализе действия данного агента. Под действием DFO вытянутые веретеноподобные клетки карциномы НСТ116 р53+/+ превращались в дисковидные хорошо распластанные клетки, напоминавшие своей формой эпителий. На линию НСТ116 р53-/- DFO оказывал аналогичное действие (табл. 4)

Табл. 4. Изменение морфометрических параметров клеток НСТ116 под действием DFO

Площадь (мкм1) Дисперсия Элонгация

НСТ1Х6 р53+/+ Контроль 856 4±69 3 0 33±0 03 1 07±0 10

DFO 24 часа 2152 0±167 3 010±0 02 0 39±0 04

НСТ116 р53-/- Контроль 612.4±58 1 0 22±0 02 0 76±0 05

DFO 24 часа 1894 6±110 4 013±0 02 0 39±0 03

Воздействие ЭРО влекло за собой и перестройку цитоскелетных систем клеток В клетках НСТ116р53+/+ и р53 -/- актин в основном диффузный, пучки актиновых филаментов тонкие и редкие. Несмотря на то, что клетки под воздействием БРО принимали эпителиоидную форму, восстановление кольцевого пучка актина - основной актиновой структуры эпителиальных клеток - было лишь частичным После обработки БРО можно было заметить разрежение актина в

центральной части клеток и сгущение актина на периферии, в отдельных случаях короткие краевые акгиновые пучки.

Тем не менее, контактные структуры, связанные с актиновыми филаментами, претерпевали значительные изменения. Межклеточные адгезионные контакты в контрольных клетках НСТ116р53+/+ и НСТ116р53-/- тангенциальные, несмотря на вытянутый фибробластоподобный фенотип После обработки клеток ЭРО расположение межклеточных контактов не менялось, но резко возрастала их протяженность. Хорошо распластанные дисковидные клетки образовывали межклеточные контакты по всей длине своей общей границы (рис 8)

Рис. 8. Схематическое изображение контрольных клеток НСТ116 (А) и клеток НСТ116, обработанных БРО (Б) На схеме представлены изменения формы клеток, а также расположения межклеточных адгезионных контактов (жирная линия)

У вытянутых клеток НСТ116 р53+/+ в контроле фокальные контакты с субстратом находятся только на концах отростков. У более дисковидных клеток НСТ116 р53-/- радиальные фокальные контакты расположены по всему периметру клетки. Обработка ОБО приводила к увеличению количества фокальных контактов по всему периметру клеток.

Необходимо заметить, что под воздействием БРО полностью пропадала фенотипическая разница между клетками НСТ116р53+/+ и р53-/-, описанная в гл.2.

Табл. 5. Изменение морфометрических параметров клеток ЛЕР52 и ЯЕР52/08Е22 под действием

оио

Площадь (мкм2) Дисперсия Элонгация

ШСК52 Контроль 3051.6±120 3 0.19±0 02 0 95±0 08

ОРО 24 часа 5727.3±243 7 0 10±0.02 0 58±0 04

Контроль 293 7 2±146 7 0 19±0 02 0 91±0.09

ОГО 24 часа 5329±292.2 0 10±0.02 0 58±0.05

Воздействие ОРО на иммортализованные фибробласты крысы линий ЛЕР52 и 11ЕР52/08Е22 также приводило к частичной МЭТ. Полигональные вытянутые

фибробласты распластывались под действием ОГО, значительно увеличивая свою площадь Клетки принимали более дисковидную форму (табл. 5)

Такая морфологическая перестройка влекла за собой и перестройку цитоскелета - треть клеток после обработки БГО образовывала кольцевой пучок актиновых филаментов подобно тому, что наблюдается в эпителии (рис.9)

Рис 9. Схематическое изображение контрольных клеток ИЕР52 (А) и клеток КЕР52, обработанных ЭРО (Б) На схеме представлено изменение формы клеток на более эпителиоидную, а также изменения в распределении пучков актиновых микрофиламенгов (жирные линии)

Также наблюдалось изменение формы фокальных контактов - они значительно удлинялись по сравнению с контролем и часто принимали изогнутую форму Таким образом, мы наблюдали выраженный морфологический сдвиг в сторону эпителизации у фибробластов В отличие от линий НСТ116, у контрольных клеток линий КЕР52 и НЕР52/С8Е22 нет четких морфологических отличий, зависящих от активности р53 Воздействие ЭРО также не приводило к появлению разницы между морфологическим фенотипом ЯЕР52 и ЛЕР52/08Е22 Таким образом, из приведенных выше данных следует, что изменение активности р53 не является необходимым условием для мезенхимо-эпителиального перехода, вызываемого ОРО

Заключение

В этой работе мы рассмотрели взаимодействие системы белка-онкосупрессора р53 и цитоскелетных систем' актиновых микрофиламентов и миктротрубочек Эти цитоскелетные системы определяют форму клетки, ее подвижность, а также образование адгезионных структур Белок р53 является центральным компонентом сигнальных каскадов, активирующихся в ответ на клеточный стресс Нам удалось показать, что нарушение целостности каждой из цитоскелетных систем, ведущее к патологическим изменениям формы клетки, является фактором, достаточным для активации клеточной системы, приводимой в действие р53 Ранее было показано, что р53 активируется в ответ на нарушения генетического аппарата, являясь, таким образом, своеобразным «стражем генома» Выявленная нами в различных клеточных системах активация функции р53 при различных цитоскелетных нарушениях существенно дополняет и расширяет круг стрессорных воздействий на клетку, меняющих экспрессию этого гена. р53 можно считать не только «стражем

генома», но и стражем всей внутренней организации клетки, в том числе цитоскелетных систем.

Во второй части работы нам удалось показать, что отношения между р53 и цитоскелетными системами является реципрокным - с одной стороны, нарушение цитоскелетных систем влияет на активность р53, с другой стороны, активность р53 влияет на организацию цитоскелета и морфологический фенотип клеток В наших экспериментах с клетками карциномы мы наблюдали изменение формы клеток с фибробластоподобной на эпителоидную при нокауте р53.

В третьей части работы мы рассмотрели переход между эпителиоидной и фибробластоподобной формой клеток, поскольку указанные данные свидетельствовали о возможной связи р53 с переходом между мезенхимальной и эпителиоидной структурой. В этой серии экспериментов мы исследовали вопрос о том, является ли такое изменение экспрессии р53 необходимым условием во всех случаях МЭТ Для этого анализа мы использовали обнаруженный нами феномен индукцию мезенхимо-эпителиального перехода под действием DFO, который удаляет железо путем хелирования из внутриклеточного пула. В нашей опытной > системе, в которой добавление к клеткам карциномы DFO вызывала драматический сдвиг клеточной формы в эпителиоидном направлении, роль р53 оказалась не столь значимой. Клетки, лишенные р53, после обработки DFO по реакции не отличались от своих более фибробластоподобных предшественников. Клетки обеих линий сильно распластывались и образовывали эпителиоподобные островки. Тогда, чтобы исключить возможность частичной реверсии трансформированного фенотипа под действием DFO, мы повторили эти эксперименты, использую линию фибробластов, то есть клеток совершенно другого происхождения и другой цитоскелетной организации. Результаты оказались сходными - мы наблюдали явный морфологический сдвиг в сторону эпителиоидного фенотипа вне зависимости от активности р53 в клетках. Оказалось, что подавление функциональной активности р53 с помощью генетического суппрессорного д элемента GSE22 не влияла на переход мезенхимоидных клеток в сторону

эпителиоидного фенотипа, вызываемого инкубацией с DFO. Таким образом, р53, по-видимому, участвует в определенных, но не во всех сигнальных путях, регулирующих переходы между мезенхимоидным и эпителиоиынм фенотипом По всей вероятности, действие DFO связано с уменьшением количества активных форм кислорода (ROS) в клетке (Lam et al, 2001; McLoughlin et al, 2003). С другой стороны, накапливающиеся в последнее время данные указывают на существенное значение ROS в морфологической неопластической трансформации Как показывают полученные нами данные, эти перестройки могут проходить, по-видимому, разными путями: с участием изменения экспрессии р53 и без такого участия. В частности, такие перестройки возможны в неопластических клетках, многие из которых лишены активного гена р53. Таким образом, многообразные связи между активностью р53 и организацией цитоскелетной системы могут иметь существенное значение как для физиологических морфологических реакций, так и для канцерогенеза.

Выводы

1 Дезорганизация актинового компонента цитоскелета специфический ингибитором (цитохалазином) приводит к активации опухолевого супрессора р53 Эта активация, в свою очередь, ведет к различным последствиям, характерным для для повышенной экспрессии этого опухолевого супрессора' остановке клеточного цикла в фазе 01 или апоптозу.

2 Деполимеризация системы микротрубочек специфическим агентом (колцемидом) приводит наряду с характерными нарушениями митоза и структуры ядер, к активации р53 Следствием такой активации является остановка клеточного цикла в фазе

3 Полученные данные показывают, что разрушение каждого из основных < компонентов цитоскелета - актин-миозиновой системы и системы микротрубочек - приводит к сходному повышению активности опухолевого супрессора р53 Эти данные существенно расширяют представление о

спектре нарушений внутриклеточного гомеостаза, вызывающие активацию этого супрессора.

4 Клетки карциномы с нокаутированным р53 резко отличаются по своей морфологии и цитоскелетной организации от гомологичных клеток, экспрессирующих р53. Клетки без р53 имеют морфологию эпителиоидного типа, тогда как клетки с р53 - морфологию типа поляризованных фибробластов Таким образом, между активностью опухолевого супрессора р53 и цитоскелетной организацией имеется взаимозависимость- эта активность зависит от структуры цитоскелета, но и в свою очередь регулирует эту структуру

5 Дефероксамин, удаляющий железо из цитоплазмы, вызывает переход клеток с от фибробластоподобной к эпителиоидной цитоскелетной структуре и морфологии Такой переход протекает сходным образом как в клетках с активным р53, так и в клетках, где эта активность подавлена введением генетичского суппрессорного элемента или нокаутом.

6 Суммируя полученные данные, можно заключить, что структура цитоскелета и активность р53 реципрокно регулируют друг друга. Вместе с тем, определенные перестройки морфологии клеток (переход от поляризованной к эпителиоподобной структуре) могут осуществляться как при участии р53, так и без такого участия Поскольку поляризованная структура клетки может способствовать опухолевой инвазии, полученные данные существенно раширяют представления о механизмах возникновения злокачественного инвазивного фенотипа в процессе канцерогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Rubtsova, S.N "Cytoskeleton-specific drugs cause p53 induction in rodent fibroblasts" in "VIIEUROCELLPATH conference "Stromal Reaction in Preneoplastic and Early Cancerous Lesions", Ioannina, Greece (1997)

2. Sablina A.A., Ilyinskaya, G.V , Rubtsova, S N, Agapova, L S , Chumakov, P M, Kopnin, B.P "Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in responce to micronuclei formation" J Cell Sci. Ill, 977-984 (1998).

3 Rubtsova, S N , Kondratov, R.V , Kopnin, P В., Kopnin, B.P., Chumakov, P M, Vasiliev, J.M "Disruption of actin microfilaments by Cytochalasin D leads to activation of p53" FEBS Lett 430, 353-357 (1998).

4. Kopnm, B.P., Sablina, A.A., Rubtsova, S N , Ilyinskaya, G V , Agapova, L.S , Chumakov, P.M. "Activation of p53-Dependent Cell Cycle Checkpoints ш Response to Destruction of Microtubules and Micronuclei Formation" in "9th p53 Workshop", Crete (1998).

5. Rubtsova, S.N., Sablina, A.A., Kopnin, B.P. "Disruption of actin microfilaments activates p53 by a pathway different from that observed in cells with disintegrated microtubule system" in 39th ACSB Meeting, Washinton, DC (1999)

6 Рубцова, C.H., Саблина, А.А, Чумаков, П.М., Копнин, Б.П., Васильев, Ю.М. "Активация р53, вызываемая разрушениями цитоскелетных систем".// Тезисы докладов конференции "Цитоскелет и клеточная регуляция", Пущино (2000)

Служба множительной техник» ГУ РОНЦ им Н Н Блохнпа РАМИ Подписано в печать 19 . 07 . 053аказ № 406 Тираж 100 экз

I I

I

%

РНБ Русский фонд

2006-4 30679

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач клеточной биологии является изучение механизмов морфогенеза клеток, тканей и органов, а также патологических изменений морфогенеза, происходящих в процессе опухолевых превращений. В настоящее время выяснены многие черты клеточных механизмов морфогенека и, в особенности, природа динамики цитоскелетных и адгезионных структур клетки, определяющих эти процессы. Вместе с тем, остается малоизученным вопрос контроля этих цитоскелетных изменений основными регуляторными системами клетки.

Особую роль среди таких регуляторных систем играет система гена и белка р53 - важнейшего регулятора процессов клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки. Несмотря на огромное число исследований, посвященных структуре и функции р53, вопрос о связи этой системы с функцией цитоскелета остается неясным. Этот вопрос актуален не только для понимания нормальных механизмов морфогенеза, но и для понимания основных механизмов | канцерогенеза, поскольку в динамике канцерогенеза резко нарушаются как • функция р53, так и функции цитоскелетных систем, в особенности актомиозинового контракгильного аппарата. Одним из особых аспектов этой проблемы является изучение связи изменения активности р53 с так называемыми эпителио-мезенхимальными трансформациями, играющими важнейшую роль в морфогенезе многих тканей, а также при злокачественном превращении клеток. I

Цели и задачи работы

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение взаимосвязей между изменением морфологического фенотипа клеток различного происхождения, их цитоскелетных систем, и активностью опухолевого супрес^ора р53.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить, является ли избирательное разрушение цитоскелетных систем -41 актиновых микрофиламентов или микротрубочек - фактором, достаточным для активации р53 в клетках. ч

2. Изучить изменения морфологического фенотипа клеток в зависимости от экспрессии р53.

3. Изучить феномен мезенхимо-эпителиальной трансформации при воздействии на клетки хелатора железа дефероксамина и выяснить, является ли этот фенотипический переход р53-зависимым. I

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые показано, что нарушение целостности цитоскелетных систем клетки с помощью специфических химических агентов влечет за собой активацию онкосупрессора р53 и остановку клеточного цикла или апоптоз клеток с разрушенным цитоскелетом. Разборка пучков актиновых микрофиламентов с помощью цитохалазина й или микротрубочек с помощью колцемида вела к функциональной активации р53 и, как следствие, к остановке клеточного цикла или апоптозу клеток. В линиях клеток, не содержащих р53 или содержащих функционально неактивный р53, остановка цикла или апоптоз в ответ на разрушение цитоскелетных систем были не выражены. Таким образом, впервые было показано, что патологические изменения морфологии клеток и цитоскелетных систем может приводить к активации р53. Полученные нами данные существенно дополняют и расширяют представления о стрессорных воздействиях, приводящих к активации р53.

Показано, что экспрессия р53 меняет морфологический фенотип клеток. Клетки карциномы, лишенные р53, имели более дисковидную, эпителиоидную морфологию, сопровождающуюся образованием эпителиоидных островков, а I также изменениями цитоскелетных систем. Так, в отличие от исходных, р53-содержащих клеток, в клетках с нокаутированным р53 частично восстанавливались краевые пучки актиновых микрофиламентов, отсутствующие у клеток, экспрессирующих р53. Контактные структуры клеток, лишенных р53, т!акже были более ярко выражены. Так, эти клетки образовывали протяженные тангенциальные адгезионные контакты. Фокальные контакты р53-негативных клеток были более многочисленны, чем у р53-позитивных клеток, и располагались по всему периметру клетки. В целом, такая перестройка цитоскелета и изменение морфологического фенотипа клеток говорит о том, что р53 индуцирует переход клетки к более мезенхимальному фенотипу.

Показано также, что переход клеток от фибробластоподобного к » эпителиоидному фенотипу, т.е. мезенхимо-эпителиальная трансформация, может быть вызвана добавлением к культурам хелатора железа дефероксамина, и что I эта морфологическая трансформация не зависит от экспрессии р53 в клетках. В сравнительных опытах с воздействием дефероксамина на клетки, экспрессирующие р53 дикого типа и клетки, где р53 был так или иначе инакгивирован, мы показали, что индукция мезенхимо-эпителиальной ' трансформации не зависит от экспрессии р53.

Таким образом, установлены многообразные реципрокные связи между экспрессией р53 и динамическими перестройками цитоскелета, в том числе, участвующими в мезенхимо-эпителиальной трансформации. Исследование участия р53 в контроле морфологического фенотипа и цитоскелетной организации клеток приобретает все большее значение. Понимание роли р53 в этих процессах может привести к более полному пониманию механизмов канцерогенеза. В • частности, полученные нами данные о таких взаимодействиях могут оказаться ценными для разработки новых методов нормализации морфологического фенотипа и предотвращения процесса инвазии. I

Обзор литературы

В соответствии с задачами работы в обзоре литературы рассмотрены основные данные, касающиеся различной формы клеток и цитоскелетных структур, играющих главную роль в динамике этой морфологической организации. В первой части обзора мы разберем организацию двух типов клеток - эпителия и мезенхимальных клеток (фибробластов). Далее будут рассмотрены данные о механизме взаимных переходов между этими двумя типами организации, а также возможная роль р53 в этих переходах.

Выводы

1. Дезорганизация актинового компонента цитоскелета специфическим ингибитором (цитохалазином) приводит к активации опухолевого супрессора р53. Эта активация, в свою очередь, ведет к различным последствиям, характерным для повышенной экспрессии этого опухолевого супрессора: остановке клеточного цикла в фазе или апоптозу.

2. Деполимеризация системы микротрубочек специфическим агентом (колцемидом) приводит, наряду с характерными нарушениями митоза и структуры ядер, к активации р53. Следствием такой активации является остановка клеточного цикла в фазе Э1.

3. Полученные данные показывают, что разрушение каждого из основных компонентов цитоскелета - актин-миозиновой системы и системы микротрубочек - приводит к сходному повышению активности опухолевого супрессора р53. Эти данные существенно расширяют представление о спектре нарушений внутриклеточного гомеостаза, вызывающих активацию этого супрессора.

4. Клетки карциномы с нокаутированным р53 резко отличаются по своей морфологии и цитоскелетной организации от гомологичных клеток, экспрессирующих р53. Клетки без р53 имеют морфологию эпителиоидного типа, тогда как клетки с р53 - морфологию типа поляризованных фибробластов. Таким образом, между активностью опухолевого супрессора р53 и цитоскелетной организацией имеется взаимозависимость: эта активность зависит от структуры цитоскелета, но и в свою очередь регулирует эту структуру.

5. Дефероксамин, удаляющий железо из цитоплазмы, вызывает переход клеток от фибробластоподобной к эпителиоидной цитоскелетной структуре и морфологии. Такой переход протекает сходным образом как в клетках с активным р53, так и в клетках, где эта активность подавлена введением генетичского супрессорного элемента или нокаутом.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что структура цитоскелета и активность р53 реципрокно регулируют друг друга. Вместе с тем, определенные перестройки морфологии клеток (переход от поляризованной к эпителиоподобной структуре) могут осуществляться как при участии р53, так и без такого участия. Поскольку поляризованная структура клетки может способствовать опухолевой инвазии, полученные данные существенно раширяют представления о механизмах возникновения злокачественного инвазивного фенотипа в процессе канцерогенеза.

Заключение

В этой работе мы рассмотрели взаимодействие белка-онкосупрессора р53 и цитоскелетных систем: актиновых микрофиламентов и микротрубочек. Эти цитоскелетные системы определяют форму клетки, ее подвижность, а также образование адгезионных структур. Белок р53 является центральным компонентом сигнальных каскадов, активирующихся в ответ на клеточный стресс. Нам удалось показать, что нарушение целостности каждой из цитоскелетных систем, ведущее к изменениям формы клетки, является фактором, достаточным для активации защитной клеточной системы, приводимой в действие р53. Ранее было показано, что р53 активируется в ответ на генетические нарушения, являясь, таким образом, своеобразным «стражем генома». Выявленная нами в различных клеточных системах активация функции р53 при различных цитоскелетных нарушениях существенно дополняет и расширяет круг стрессорных воздействий на клетку, меняющих экспрессию этого гена. р53 можно считать не только «стражем генома», но и стражем всей внутренней организации клетки, в том числе цитоскелетных систем.

Во второй части работы нам удалось показать, что отношения между р53 и цитоскелетными системами являются реципрокными - с одной стороны, нарушение цитоскелетных систем влияет на активность р53; с другой стороны, активность р53 влияет на организацию цитоскелета и морфологический фенотип клеток. В наших экспериментах с клетками карциномы мы наблюдали изменение формы клеток с фибробластоподобной на эпителиоидную при нокауте р53.

В третьей части работы мы рассмотрели переход между эпителиодной и фибробластоподобной формами клеток, поскольку указанные данные свидетельствовали о возможной связи р53 с переходом между мезенхимальной и эпителиоидной структурой. В этой серии экспериментов мы исследовали вопрос о том, является ли такое изменение экспрессии р53 необходимым условием со всех случаях МЭТ. Для этого анализа мы использовали обнаруженный нами феномен: индукцию мезенхимо-эпителиального перехода под действием ОРО, который удаляет железо путем комплексообразования из внутриклеточного пула. В нашей опытной системе, в которой добавление к клеткам карциномы ОРО вызывало драматический сдвиг клеточной формы в эпителиоидном направлении, роль р53 оказалась не столь значимой. Клетки, лишенные р53 и имеющие более эпителиодную морфологию, после обработки DFO не отличались от своих фибробластоподобных предшественников. Клетки обеих линий сильно распластывались и образовывали эпителиоподобные островки. Тогда, чтобы исключить возможность частичной реверсии трансформированного фенотипа под действием DFO, мы повторили эти эксперименты, используя линию фибробластов, то есть клеток совершенно другого происхождения и другой цитоскелетной организации. Результаты оказались сходными - мы наблюдали явный морфологический сдвиг в сторону эпителиоидного фенотипа вне зависимости от активности р53 в клетках. Оказалось, что подавление функциональной активности р53 с помощью генетического супрессорного элемента GSE22 не влияло на переход фибробластоподобных клеток в сторону эпителиоидного фенотипа, вызываемого инкубацией с DFO. Таким образом, р53, по-видимому, участвует в определенных, но не во всех сигнальных путях, модулирующих переходы между фибробластоподобным и эпителиоидным фенотипом. Как уже отмечалось (см. гл 3 раздела Результаты), действие DFO, вероятно, связано с уменьшением количества активных форм кислорода (ROS) в клетке. С другой стороны, накапливающиеся в последнее время данные указывают на существенное значение ROS в морфологической неопластической трансформации. Как показывают полученные нами данные, эти перестройки могут проходить, по-видимому, разными путями: с участием изменения экспрессии р53 и без такого участия. В частности, такие перестройки возможны в неопластических клетках, многие из которых лишены активного гена р53. Таким образом, многообразные связи между активностью р53 и организацией цитоскелетной системы могут иметь существенное значение как для физиологических морфологических реакций, так и для канцерогенеза, в частности для процесса инвазии.