Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Резвератрол и его комбинации с основными антигипертензивными препаратами в фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции.

□□3471428

На правах рукописи

Кочкаров Владимир Исхакович

РЕЗВЕРАТРОЛ И ЕГО КОМБИНАЦИИ С ОСНОВНЫМИ АНТИГИПЕРТЕНЗИВНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ В ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Я

Смоленск - 2009

О О ' .', ---->

003471428

Работа выполнена на базе государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Росздрава» и государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный университет» Федерального агентства по образованию.

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Зарубина Ирина Викторовна доктор биологических наук, профессор Митрохин Николай Михайлович доктор медицинских наук Жаркова Людмила Павловна Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава».

Защита состоится «¿Х-» ^уО К & 2009 г. в и часов на заседании диссертационного совета Д 208.097.02 при ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Росздрава» (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д.28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Росздрава».

Автореферат разослан « 2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

А.А. Яйленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение роли эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний привело к пониманию концепции о нем как о мишени для профилактики и лечения данных патологий.

Как известно, эндотелиальная дисфункция (ЭД) рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогенных и других состояниях (Бабак О.Я., 2004, Сидоренко Б.А., 2003, Napoli С., 2001).

Этому способствуют такие модифицируемые факторы риска сердечнососудистых заболеваний, как курение, гипокинезия, солевая нагрузка, различные интоксикации, нарушения углеводного, липидного, белкового обменов, инфекции и др. (Гогин Е.Е., 1998, Маколкин В.И., 2002, Cai Н., 2000, Cullen Р., 2005).

При этих заболеваниях эндотелий сосудов предстает в роли первоочередного органа-мишени, поскольку участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции (Гомазков O.A., 2001, Petrak О., 2006, Feletou М., 2006).

Участие эндотелия в возникновении и развитии различных патологических состояний многогранно и связано как, с регуляцией сосудистого тонуса, так и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки и др. (Schiffrin E.L., 2001, Verma S., 2002). В качестве основных стимулов, вызывающих ответ эндотелиальной клетки следует выделить изменение скорости кровотока (увеличение напряжения сдвига), тромбоцитарные медиаторы (серотонин, АДФ, тромбин), а также циркулирующие и/или "внутристеночные" нейрогормоны (катехоламины, вазопрессин, ацетилхолин, эндотелии, брадикинин, гистамин и др.) (Luscher T.F., 1995).

Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота - NO. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов (Мартынов А.И., 2005). В то же время, NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов (Бабак О.Я., 2004) и предотвращая тем самым патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза.

Недостаточная продукция NO в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны это связано со снижением биодоступности NO, с другой - со сниженной активностью eNOS, в результате присутствия эндогенных или экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения

доступности его субстрата, L-аргинина. В основе снижения биодоступности N0 лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эядотелиальными клетками биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеют свободные радикалы кислорода, которые, соединяясь с N0, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК) как пероксинитрит (ONOO") (С. Szabo С., 2002). Пероксинитрит являясь высокотоксичным соединением повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности (O'Domell V.B., 1997). При этом возникает оксидантный стресс, активирующий большое количество оксидантчувствительных ' факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (NF-кВ), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов, способствующих развитию воспалительных и других процессов протекающих при атеросклерозе (Griendling, К. К., 2000, Taniyama, Y., 2003).

ЭД проявляется снижением образования и биодоступности оксида азота (NO) при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов, что приводит к дисбалансу медиаторов, обеспечивающих в норме эндотелийзависимые процессы (Марков Х.М., 2005, Яковлев В.М., 2000, Loscalzo J., 2004).

В свою очередь оценка ЭД как основного патогенетического звена сердечно-сосудистых заболевани, требует пересмотра терапевтических стратегий с целью профилактики или уменьшения повреждений сосудистой стенки.

Учитывая возможные механизмы реализации предотвращения развития ЭД, следует отметить, что на роль эффективного эндотелиопротекторного средства подходит вещество - резвератрол (3, 5, 4'-тригидрокси-транс-стильбен).

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что резвератрол наряду с гиполипидемической, антиоксидантной, эстрогенной, антиагрегационной активностью, обладает также, кардиопротективной и эндотелиотропной активностью в опытах in vitro. Эндотелиотропная активность резвератрола обусловлена активацией фермента eNOS (Leikert J.F., 2002, Naderali Е.К., 2000).

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств резвератрола и его комбинаций с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью, в частности ингибитором АПФ - эналаприла малеатом, блокатором ангиотензиновых рецепторов (подтип ATi) лозартаном калия, блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином, селективным блокатором Р i -адренорецепторов -небивололом и тиазидоподобным диуретиком - индапамидом при экспериментальном дефиците оксида азота.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества

и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120. 0 710379. Номер государственной регистрации диссертационной темы - 01.2.00950596.

Цель исследования: провести комплексное исследование и обосновать возможности фармакологической коррекции эндотелиапьной дисфункции 3,5,4-тригидрокси-транс-стильбеном (резвератролом) и его комбинациями с основными антигипертензивными препаратами в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Разработать методические подходы и изучить характер развития эндотелиальной дисфункции при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной модели дефицита N0 в эксперименте, с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

2. Изучить эндотелиопротективную активность резвератрола, эналаприла, лозартана калия, амлодипина, небиволола, индапамида при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

3. Провести исследование эндотелиопротективной активности сочетанного применения резвератрола и эналаприла при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

4. Исследовать эндотелиотропную активность сочетанного применения резвератрола и лозартана калия при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

5.Провести изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения резвератрола и амлодипина при Ь-ИАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0, с использованием предложенных методических подходов.

6. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и небиволола при Ь-ИАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

7. Исследовать эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и индапамида при Ь-ИАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

8. Провести комплексную оценку функциональных характеристик (сосудистой реактивности, нитроксидергической системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда) с помощью интегрального векторного анализа и выявить степень вклада резвератрола в эндотелиопротективное действие при сочетанном применении с основными антигипертензивными препаратами при Ь-ЫАМЕ- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспериментальные Ь-ЫАМЕ-индуцированный и гипоэстроген-индуцированный модели эндотелиальной дисфункции являются объективными, информативными, и характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэфиициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), снижением показателей биохимических

маркеров (Total NO, экспрессия NO-синтазы), а также динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (увеличение диаметра миокардиоцитов, повышение адренореактивности, снижением миокардиального резерва).

2. Резвератрол является дополнением к фармакологической коррекции традиционными антигипертензивными средствами при состояниях сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

3. Резвератрол усиливает эндотелиопротективную активность эналаприла, лозартана калия, амлодипина, небиволола и индапамида.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте с использованием резвератрола и основных антигипертензивных препаратов. Используя комплекс методических подходов, выявлено, L-NAME- и гипоэстроген-индуцированная эндотелиальные дисфункции характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД в 5 и 2,6 раза соответственно, повышением адренореактивности и снижением исчерпания миокардиального резерва, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO- синтазы), а также отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов).

В работе впервые показано, что сочетанное использование резвератрола (2 мг/кг/сут.) с ингибитором АПФ эналаприлом (0,5 мг/кг/сут.), блокатором ATI-рецепторов лозартаном (6 мг/кг/сут.), блокатором кальциевых каналов амлодипином (0,5 мг/кг/сут.), тиазидоподобным диуретиком индапамидом (2 мг/кг/сут.), бета-блокатором небивололом (0,5 мг/кг/сут) и тиазидоподобным диуретиком- индапамидом (2 мг/кг/сут.) оказывает аддитивное эндотелиопротективное действие при моделировании эндотелиальной дисфункции. Полученные результаты доказывают необходимость наряду с традиционной терапией основными антигипертензивными препаратами дополнительной эндотелиотропной терапии. Научная новизна подтверждается получением 10 патентов РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом, блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия, блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином, селективным блокатором pi-адренорецепторов небивололом и тиазидоподобным диуретиком индапамидом для коррекции L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД соответственно в 5 и 2,6 раза, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию NO-синтазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных

показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, соотношение интима-медиа и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания резвератрола и его комбинаций при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией..

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности лозартана калия «Блоктран», эналаприла малеата «Рениприл», индапамид «Индапамид» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения антигипертензивной и эндотелиопротективной активности резвератрола включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (Свидетельство о государственной регистрации № 154/032.43.07). Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности резвератрола используются и в лекционных курсах кафедры фармакологии КГМУ и кафедры фармхимии и фармакогнозии БелГУ.

Публикации

По результатам исследования опубликовано 41 научных и научно-методических работ, в том числе 19 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2004 — 2007 гг.; XIII - XV национальном конгрессе «Человек и лекарство»; II национальном конгрессе терапевтов, г. Москва; международной научно-практической конференции «Лекарственные препараты: традиции и новации», апрель 2005 г., г. Белгород; VI международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр медико-биологических дисциплин, биохимии и фармакологии, внутренних болезней №1, акушерства и гинекологии, фармацевтической химии и фармакогнозии, фармации ГОУ ВПО «БелГУ Федерального агентства по образованию», и кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, фармакогнозии, инфекционных болезней, внутренних болезней № 2, хирургии ФПО, биохимии, внутренних болезней ФПО, научно-исследовательского института экологической медицины ГОУ ВПО «КГМУ Росздрава».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов и списка используемой литературы, включающего 490 источников, из них 75 отечественных и 415 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 381 странице машинописного текста, содержит таблиц - 50, рисунков - 129, схем - 1.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Опыты проводились на белых крысах обеих полов линии Wistar массой 250-300 г в количестве 270 животных. У самцов ЭД моделировали ежедневным в/б введением в течение 7 дней ингибитора фермента eNOS М-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME-индуцированная ЭД), а также, путем проведения билатеральной овариэктомии у крыс-самок (гипоэстрогенная ЭД).

На 7 и 43 сутки соответственно от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell". Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40мкг/кг) (J.B.Laursen, 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould» США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt шах), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г.) (Ф.З.Меерсон, 1980).

2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 110'5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (19,72) (Ф.З.Меерсон, 1980).

3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Ф.З.Меерсон, 1980).

4. 3-х минутную гипоксию. (Е.Н.Пашин, 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2002).

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином. При морфометрии

сердца использован метод взвешивания миокарда с определением индексов, определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова [2], а также с использованием окулярмикрометра; определяли абсолютную и относительную массу надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков; соотношение интима-медиа в участках сонной артерии и брюшной аорты.

Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективных эффектов исследуемых препаратов.

Для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, сократимости миокарда, нитроксидергической системы и морфологических характеристик миокарда на основе интегрального анализа всего спектра проводимых исследований, мы представили значение каждого показателя в виде вектора. Все вектора, каждый из которых соответствовал определенной нагрузочной пробе, были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат Оху, полюсом для всех векторов было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат, полярной осью служило положительное направление оси Оу, длина вектора равнялась величине каждого показателя функционально-морфометрической оценки эндотелио- и кардиопротективного эффекта нагрузочной пробы. Направление каждого вектора задавалось жестко, 1-й вектор - САД (систолическое артериальное давление) совпадал с осью Оу, последующие вектора располагались в порядке проведения нагрузочной пробы по часовой стрелке, угол между соседними векторами составлял 60°. Следующими векторами соответственно обозначены показатели - ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; КМЦ - диаметр кардиомиоцитов - нагрузка объемом; NO х - суммарное количество нитратов и нитритов (Total NO); ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия). Площадь векторной диаграммы рассчитывали по формуле:

где: Б - площадь векторной диаграммы, X; и у:— прямоугольные координаты соответствующих векторов, п - количество векторов.

Различия между соответствующими функциональными, биохимическими и морфологическими показателями при проведении исследований между изучаемыми группами интактных, контрольных и опытных групп животных отражаются площадью диаграмм, образованной соединением конечных точек векторов вышеуказанных показателей.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Исследованы дозы резвератрола 0,15 и 2 мг/кг. Доза 0,15 мг/кг соответствует дозе резвератрола разрешенной в РФ в качестве биологически активной добавки (10 мг/сут.).

При этом согласно данным литературы эндотелио- и кардиотропные эффекты резвератрола в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне

доз от 0,2 до 2 мг/кг (Fremont L., 2000). Доза 2 мг/кг соответствует содержанию его в экстраординарных сортах вин (10 мкмоль/л, 600 мл/сут.). Согласно литературных данных именно в этой дозе резвератрол, проявляет максимальные эндотелио- и кардиотропные эффекты.

В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота резвератрол вводили в дозах 0,15 и 2 мг/кг один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME. При моделировании гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота резвератрол вводился в дозе 2 мг/кг один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 42 дней.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993).

Препараты с доказанной эндотелипротективной активностью вводили внутрижелудочно в течение 7 суток при L-NAME-опосредованной модели дефицита оксида азота, и в течение 42 суток при гипоэстроген-индуцированном дефиците оксида азота. Ингибитор АПФ эналаприла малеат («Рениприл», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), лозартан калия («Блоктран», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма»), небиволол, («Небилет», производства «Берлин-хеми»), индапамид («индапамид», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), использовали в дозах 0,5 мг/кг, 6 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,5 мг/кг, 2 мг/кг соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, проведённых ранее в нашей лаборатории.

При комбинированном использовании резвератрола с антигипертензивными препаратами использовались те же дозы, пути введения, и та же продолжительность применения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO.

Внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг /кг однократно в течение 7 суток крысам-самцам, привело к стойкому повышению артериального давления. У крыс-самок артериальная гипертензия развивается в течение 42 суток после овариэктомии (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелий-зависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группах с патологией в отличие от интактных животных. На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диастолическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией. После окончания миокардиального компонента — (метка 2) артериальное давление восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами как площадь эндотелиальной реакции.

ьз Интактные самцы ВТЖШ □ Интактные самки ВДвариэктомпя

I - Интактные самцы; II- Ь-ЫАМЕ; Ш-Интактные самки; ГУ-Овариэктомия

Н Интактные самцы В Ь-ЫАМЕ ЕЗ Интактные самки 0 Овариэктомия

я дм \ \ 1-20 «км. ■15 ■10

12,7

\

Интактные В Ь-ЫАМЕ 0 Интактные самки 0 Овариэктомия

Рис. 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: САД, ДАД, АД систолическое, диастолическое артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр - адренореактивиость, НС -нагрузка сопротивлением, еЪЮБ - экспрессия "ЫО-синтетазы, ЫОх - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ -диаметр кардиомиоцитов. * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

ш Интактные самцы и Ь-ЫАМЕ Р Интактные самки и Овариэктомия

"П° 75 "И 70

-V0 65

процент контроля

Интактные самцы -Х-Ь-ЫАМЕ

Интактные самки "О" Овариэктомия

67,9%

____л

мкМоль

мм.рт.ст.

Н Интактные Н Ь-ЫАМЕ

0 Интактные самки Е Овариэктомия

Рис. 2. Динамика АД и ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилятацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг/кг), А - у интактных животных, Б - у животных с патологией. Примечание: здесь и везде далее АД - артериальное давление (мм.рт.ст.); ЧСС - частота сердечных сокращений (уд.мин)

На рис. 2 Б представлена реакция на ацетилхолин при моделировании эндотелиальной дисфункции. При этом видно, что площадь эндотелийзависимой реакции в несколько раз меньше чем у интактных животных.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропруссид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющимся отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных самцов составил -1,1±0,1, при Ь-ИАМЕ индуцированном дефиците оксида азота - 5,4±0,6, в группе интактных самок - 0,8±0,11, при гипоэстроген-индуцированном дефиците оксида азота - 2,2±0,2. Разница у интактных животных и животных с патологиями соответственно составила в 5 и 2,6 раза (рис. 1).

Рис. 3. Динамика АД и ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилятацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг) А - у интактных животных, Б - у животных с патологией.

Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированные модели патологии приводят к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1).

У интактных самцов ЛЖД к 25 секунде снижалось до 83,6±7,7, у интактных самок до 89,3±5,4, а у животных с Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированной патологией значительно сильнее соответственно - 66,0±5,5 % и 67,9±2,5 % (рис. 1).

Характерная динамика биохимических маркеров Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис.1. Так, концентрация нитратов и нитритов плазмы (ЫОх) у животных, получавших Ь-МАМЕ, и перенесших овариэктомию соответственно составил 61,2 ±3,6 и 71,5 ±3,6 мкМ, тогда как соответствующие значения у интактных животных составили - 114,1±4,1 и 122,8±2,8, мкМ.

Экспрессия эндотелиальной ИО-синтазы (еМОБ) сывороткой интактных самцов и самок соответственно 72,9±3,8% и 80,1±4,6%, тогда как у животных с соответствующими патологиями 21,4±4,7% и 32,4±3,5%.

Результаты гистологических исследований показали, что в обоих случаях присутствует гипертрофия миокардиоцитов, утолщение мышечного слоя сосудистой стенки и спазм артериол, (рис.4). На представленных гистологических препаратах, слева (а) - интактные миокардиоциты, справа (б) - миокардиоциты животных на 7-е сутки с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении.

Морфометрические исследования показали, что у интактных самцов поперечное сечение составило 9,1±1,1, у интактных самок 8,5±0,21, у животных, поучавших Ь-ЫАМЕ - 18,4+1,1, у животных перенесших овариэктомию 12,5±0,7 мкм (рис.1).

Рис. 4. Морфологическая картина миокарда у интактных и опытных животных: а - гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; б - гипертрофия кардиомиоцитов у крысы с Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункцией на поперечном срезе. Окр. гематоксилином и эозином, а, б - х280.

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол (рис.5). У интактных животных (а) -клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-ЫАМЕ-патологии (б) - сосуд спазмирован, стенка утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, моделирование Ь-ИАМЕ и гипоэстроген-индуцированные патологии сопровождаются увеличением артериального давления и коэффициента эндотелиальной дисфункции, повышением адренореактивности с развитием скрытой сердечной недостаточности, характерными биохимическими сдвигами - снижением экспрессии еЫОЗ и концентрации нитратов и нитритов плазмы крови, а также характерной гистологической картиной - гипертрофией миокарда и гиперплазией сосудистого русла.

Рис. 5. Морфологическая картина почечных артерий у интактных и опытных животных: а - неизмененная артерия почки у интактной крысы; б -перестройка стенки почечной артерии с резким утолщением ее стенки и сужением просвета, гиперплазией эластических структур и гипертрофией гладкомышечных элементов у крысы с патологией. Окр. гематоксилином и эозином, а, б - х440.

2. Исследование эндотелиопротективной активности резвератрола и препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью при 1_,-МАМЕ - модели дефицита N0 в эксперименте.

Сравнительные исследования показали, что при Ь-КАМЕ-индуцированной патологии все изучаемые вещества, снижали АД, однако, уровня нормы АД не достигало ни в одном случае, и значения АД, были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов. Максимальное снижение АД выявлено при монотерапии небивололом -САД - 170,1±7,3, ДАД - 125,9±4,7 (рис.6).

Проведение функциональных проб выявили в разной степени эндотелиопротективное действие у всех препаратов. Применение резвератрола обнаружила выраженное дозозависимое эндотелиопротективное действие, превосходящим таковую у препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью. Максимальные эффекты наблюдались при использовании резвератрола в дозе 2 мг/кг и небиволола. Соответственно КЭД составил 1,2±0Д - у резвератрола, и 1,7±0,1 у небиволола. Тогда, как данный показатель у интактных животных составил - 1,2±0,1, а у животных с патологией 5,4±0,6 (рис. 6).

Проба на адренореактивность у животных с патологией на фоне терапии, препаратами, также обнаружила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления. Максимальное снижение выявлено при монотерапии амлодипином - 201,3±14,4 и небивололом - 206,6±15,6 мм рт.ет., у интактных самцов - 199,2±8,3, Ь-КАМЕ- 247,3±4,8 мм рт.ст. (рис.6).

i и ш IV V vi vu vm ix

l - Интактные;!!- L-NAME; III- резвератрол 0,15 мг/кг; IV-резвсратрол 2 мг/кг; V-эналаприл 0,5 мг/кг; VI-лозартан 6 мг/кг, VII-амлодипин 0,5 мг/кг, VIII-небиволол 0, 5мг/кг, 1Х-индапамид 2 мг/кг

100

95 --90 --85 --

7SÏ 7Û

sn i -Интактные t L-NAME

■L-NAME+резвератрол 0,15 L-NAME+резвератрол 2 мг/кг - L-NAME+эналаприл 0,5 мг/кг ■Ф- • L-NAME+лозартан 6 мг/кг —L-NAME+амлодипин 0,5 мг/кг Ь5-х—L-NAME+небиволол 0,5 мг/кг L-NAME+индапамид 2 мг/кг

:

i¡§

Ш Интактные

0 L-NAME+резвератрол 0,15 мг/кг В L-N АМЕ+эналаприл 0,5 мг/кг И L-NAME+амлодишш 0,5 мг/кг □ L-NAME+индаламид 2 мг/кг

"247,3*;

Ш Интактные

HL-NAME+резйератрол 0,15 мг/кг 0 L-NAME+эналаприл 0,5 мг/кг ЕЗЬ-ЫАМЕ+амлодигган0,5 мг/кг Q L-NAME+индаламид 2 мг.кг

6 ■5 4 •3 2 ■1 iL

QL-NAME

О L-NAME+резвератрол 2 мг/кг 13 L-N АМЕ+лозартан 6 мг/кг 0 L-NAME+небиволол 0,5 мг/кг

220,4*

211,9»

242,7

216,2*

. 206,6*

~247,9\ММ.рТ.СТ.

■220

170

0L-NAME

Е L-NAME+резвератрол 2 мг/кг Е L-NAME+лозартан 6 мг/кг В L-NAME+небиволол 0,5 мг/кг

АДр

II Интактные 0 Ь-Ы АМЕ

В Ь^АМЕ+резвератрол 0,15 мг/кг 51 Ь-ЫАМЕ+резвератрол 2 мг/кг

В Ь-ЫАМЕ+эиалаприл 0,5 мг/кг ® Ь-ЫАМЕ+лозартан 6 мг/кг

0 Ь-ЫАМЕ+амлодипин 0,5 мг/кг 0 Ь-ЫАМЕ+небиволол 0,5 мг/кг □ Ь-ЫАМЕ+индапамид 2 мг/кг

eNOS

Рис. 6. Влияние резвератрола и препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-НАМЕ-индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр -адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, е>Ю8 -экспрессия ЫО-синтазы, 1-Юх - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ - диаметр кардиомиоцитов. Примечание: *- р < 0,05 - в сравнении с ЫЧАМЕ, ** - р < 0,05 - в сравнении с интаетными

H L-NAME+резвератрол 0,15 мг/кг В ЫЧАМЕ+эналаприл 0,5 мг/кг И L^NAME+амлодипин 0,5 мг/кг □ L-NAME+индапамид 2 мг/кг

ЕЗ l^NAME+резвератрол 2 мг/кг 3 L-NAME+лозартан 6 мг/кг S l^NAME+небиволол 0,5 мг/кг

NOx

ED Интактные

BL-NAME+резвератрол 0,15 мг/кг @ L-N АМЕ+эналаприл 0,5 мг/кг £3 L-NAïviE+амлодипин 0,5 мг/кг S L-NAME+индапамид 2 мг/кг

□ L-NAME

GDL-NAME+резвератрол 2 мг/кг 58 L-NAME+лозартан б Mr/taba L-NAME+небиволол 0,5 мг/кг

Аналогичная тенденция выявлена в пробе на нагрузку сопротивлением. Данные при использовании монолечении исследуемыми препаратами находились между значениями интактных животных и животных с патологией. Сократимость на 25 секунде к 5-й секунде, взятой за 100% нагрузки соответственно составила у интактных самцов 83,6±2,1, у животных с Ь-ИАМЕ- индуцированной патологией - 66,0±2,3%. Максимальное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено при монотерапии небивололом (95,1±3,2%) (рис.6).

Значения экспрессии эндотелиальной ИО-синтазы, при Ь-ЫАМЕ -индуцированной модели патологии не достигали значений интактных животных (рис.6).

Концентрация суммы нитратов и нитритов плазмы при монотерапии указанными препаратами достоверно увеличивалась. Резвератрол в дозе 2 мг/кг и небиволол выявили максимальное предотвращение снижения концентрации суммы нитратов и нитритов плазмы, соответствующие значения составили 107,9±6,3 и 99,1±4,3 (рис.6).

Данные морфометрических исследований показали, что все изучаемые вещества в разной степени предотвращают развитие гипертрофии миокардиоцитов. Данный эффект выражен у резвератрола-9,8±0,3 мкм, амлодипина -10,2±0,2 и небиволола -9,6±0,1 мкм (рис.б).

Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективной активности резвератрола 0,15 и 2 мг/кг, эналаприла 0,5 мг/кг, лозартана 6 мг/кг, амлодипина 0,5 мг/кг, небиволола 0,5 мг/кг, индапамида 2 мг/кг, определяет характеристику функции эндотелия и сократимости миокарда с использованием нескольких основных параметров Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

Сравнение площадей векторных диаграмм, выявил выраженные различия между группой интактных животных, животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота и групп, животных с фармакологической коррекцией вышеуказанными препаратами. В группе интактных животных расчётная площадь составляет 5,48 усл. ед., в группе с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота -10,12 усл. ед., что отличается в 2 раза и принимается за наибольшую степень выраженности сочетанных сосудистых, гемодинамических, биохимических и морфологических нарушений.

Результирующие площади векторных диаграмм составляют в группах: резвератрола 0,15 мг/кг - 6,97; резвератрола 2 мг/кг - 6,13; эналаприла 0,5 мг/кг - 8,16; лозартана 6 мг/кг - 7,39; амлодипина 0,5 мг/кг - 6,46; небиволола 0,5 мг/кг - 6,47; индапамида 2 мг/кг - 8,05 усл.ед.

Анализируя площади векторных диаграмм по совокупности эндотелио- и кардиотропных эффектов данную группу выбранных исследуемых

лекарственных средств для коррекции Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота можно расположить в порядке возрастания активности эналаприл (0,5 мг/кг) - индапамид (2 мг/кг) - лозартан (б мг/кг) - резвератрол (0,15 мг/кг) - небиволол (0,5 мг/кг) - амлодипин (0,5 мг/кг) -резвератрол (2 мг/кг).

Из предложенных шести показателей - САД, ДАД," коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), диаметр кардиомиоцитов (КМЦ), суммарное количество нитратов и нитритов (N0 х), показатели миокардиальной пробы с нагрузкой сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия, ПА 5-25), при Ь-ИАМЕ-индуцированном моделировании дефицита оксида азота, только КЭД имеет дельту (А) по отношению к показателю у интактных животных в 500 %, остальные показатели соответственно: САД - 138%, ДАД - 142 %, КМЦ - 203 %, N0 - 54%, ПА 5-25 - 79 %. Таким образом, сумма Дсад. дад, кмц, n0, па 5-25= 616 % сопоставима с Акэд- Отсюда, очевидно, что предложенный подход в своём интегральном виде преимущественно показывает эндотелиальную составляющую интегрального протективного эффекта при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците N0.

Применение данного подхода комплексной оценки позволил выявить степени активности в группе изучаемых препаратов в отношении коррекции нарушений метаболического пути Ь-аргинина/ИО при моделировании Ь-КАМЕ-индуцированного оксида азота. Наиболее выраженной активностью обладают резвератрол (2 мг/кг), амлодипин (0,5 мг/кг) и небиволол (0,5 мг/кг), наименьшей - эналаприл (0,5 мг/кг) и индапамид (2 мг/кг), занимают промежуточное положение резвератрол (0,15 мг/кг) и лозартан (6 мг/кг).

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, резвератрол 2 мг/кг выявил активность, сопоставимую и в ряде случаев превосходящую таковую у препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью.

3. Изучение эндотелиопротективной активности сочетаиного применения резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью при Ь^АМЕ- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью с резвератролом (2 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота приводило к значительному снижению артериального давления, что не достигалось при соответствующей монотерапии. В группе животных, где применялся лозартан с резвератролом, достигался целевой уровень АД - 144/116 мм рт.ст. (рис.7).

I П Ш IV V VI VII VIII I - Интактные;П- ЬИАМЕ; Ш- рсзверагрол 2 мг/кг (РЕЗВ.); 1У-РЕЗВ+ эналаприл 0,5 мг/кг; У-РЕЗВ+ лоззртан 6 мг/кг; У1-РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг, УП-РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг, УШ-РЕЗВ+иццапамвд 2 мг/кг

60

--Ит'актные

■ • Ь-ЫАМЕ

*•^"резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ)

— -♦ — РЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг

— -А — РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг

— - РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг - РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

—X— РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

е.. Ю" 15"

20"

25"

ЕЭИнтаюные

□ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ) В РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг ИРЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

ЕЗЫМАМЕ

В РЕЗВ+эналаприп 0,5 мг/кг № РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг В РЕЗВ+индапамвд 2 мг/кг

■220

170

_1Ж_

□ Ит-актные

□ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ) В РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг

В РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

ИЬ-^АМЕ

ШРЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг ЙРЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг В РЕЗВ+инцапамид 2 мг/кг

Ш Игггакшые

□ резвератрол 1 мг/кг (РЕЗВ) В РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг ЕЗРЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

ЕЬ-КАМЕ

ОРЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг Е РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг В РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

Рис. 7. Влияние комбинированного применения резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью на

функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр - адренореактивностъ, НС -нагрузка сопротивлением, еМОБ - экспрессия ИО-синтазы, ЫОх - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ -диаметр кардиомиоцитов.

Примечание: *- р < 0,05 - в сравнении с Ь-ЫАМЕ, * * р < 0,05 - в сравнении с интактными

О Интактные

□ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ)

□ РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг

В РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

ШЫЧАМЕ

ШРЕЗВ+эналагтрил 0,5 мг/кг И РЕЗВ+амлоднпин 0,5 мг/кг 5 РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

Ш) Интактные

□ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ) Н РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг И РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

ИЬ-ЫАМЕ

ЕВ РЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг ВРЕЗВ+омлодипин 0,5 мг/кг ЕЗ РЕЗВ+ индапамид 2 мг/кг

КЭД при сочетанном использовании резвератрола с данными препаратами, также снижался в большей степени, чем при монотерапии. КЭД в группах с использованием сочетаний составил 1,5±0,1-эналаприл+резвератрол, 1,8±0,2-лозартан+резвератрол, 1,6±0,1 -амлодипин+резвератрол, 1,3±0,1 -

небиволол+резвератрол, 2,2±0,1-индапамид+резвератрол, что достоверно отличается от соответствующей монотерапии. Максимальное снижение КЭД обнаружено при использовании сочетания резвератрола с небивололом (рис. 7).

В экспериментах на открытом сердце также обнаружена эффективность сочетанного использования резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью по сравнению с монотерапией. Так, значения ЛЖД при использовании комбинаций в пробе на адренореактивность находилась в диапазоне от 199,5±6,5, до 210,9±13,5 мм рт.ст., тогда как при соответствующей монотерапии - от 201,3±14,3, до - 247,9±9,3. Интактные -199,2±8,3, Ь-ЫАМЕ - 247,2±4,8 мм рт.ст. Аналогичная ситуация обнаружена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. У интактных ЛЖД на 25 сек. составила 83,6±2,1%, у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией - 66,0±2,3%. Данные использования сочетаний имели промежуточные значения, которые оказались выше значений соответствующей монотерапии. Максимальное предотвращение исчерпания миокардиального резерва выявлено при применении сочетания небиволола с резвератролом - 92,7±3,4%. (рис.7).

Эффективность комбинаций резвератрола с основными антигипертензивными препаратами по сравнению с соответствующей монотерапией выявлена в увеличении концентрации суммы нитритов и нитратов плазмы. Значения в сериях сочетаний были близкими к значениям интактных животных (рис. 7).

Функционально-биохимические показатели подтвердились результатами морфометрии миокардиоцитов. Средний диаметр животных, получающих комплексную терапию существенно лучше, чем при соответствующей монотерапии и достоверно не отличается от интактных животных (рис.7).

Комплексную оценку эндотелио- и кардиопротективной активности сочетанного применения резвератрола 2 мг/кг с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью проводили с помощью интегрального векторного анализа гемодинамических, биохимических и морфологических показателей.

Векторные значения выбранных основных показателей представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

Площадь векторной диаграммы, в группе интактных животных составил 5,48, а в группе с моделированием Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота - 10,12. Значения в группах животных с фармакологической коррекцией сочетаниями резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью находились между значениями интактных и животных с патологией, а также были ниже соответствующей монотерапии с вышеназванными препаратами. Данный показатель составил: резвератрол

2 мг/кг+ эналаприл 0,5 мг/кг - 6,29, резвератрол 2 мг/кг+ лозартан 6 мг/кг -6,11, резвератрол 2 мг/кг+ амлодипин 0,5 мг/кг - 6,06, резвератрол 2 мг/кг+ небиволол 0,5 мг/кг - 6,26, резвератрол 2 мг/кг+ индапамид 2 мг/кг - 6,64.

Анализируя площади векторных диаграмм по совокупности эндотелио- и кардиотропных эффектов комбинаций исследуемых лекарственных средств для коррекции Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, следует отметить возрастание активности фармакологической коррекции метаболического пути Ь-аргинина/ЫО при совместном использовании резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью по сравнению с соответствующей монотерапией.

Дальнейший анализ данных сочетаний позволяет рассчитать дельту аддиции (Дадд= 8ПреГ1 - Брезв^преп) и её вероятностный процент (Радд), рассчитываемый по формуле: Радд=Аадд /Аьнаме * 100%. Проведение соответствующих расчётов выявила следующие данные: дельта (Дадд) и вероятностный процент (Радд) аддиции в группах комбинаций соответственно составил: резвератрол + эналаприл - 1,87-40,3 %; резвератрол + лозартан -1,28-27,6%; резвератрол + амлодипин - 0,4-8,6%, резвератрол + небиволол -0,21-4,5%; резвератрол + индапамид - 1,41-30,4%.

Таким образом, сочетанное использование резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью по сравнению с соответствующей монотерапией оказывало более выраженное, эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, в предотвращении снижения концентрации суммы нитратов и нитритов (ЫОх). При этом в большей степени предотвращалось развитие гипертензии, а в случае применения сочетания лозартана с резвератролом уровень АД достигал нормы.

4. Исследование эндотелиопротективной активности резвератрола и препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью при гипоэстроген-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Как показали дальнейшие исследования, при гипоэстроген-индуцированной патологии все препараты значительно снижали АД, а в случае монотерапии резвератролом, эналаприлом и небивололом предотвращалось развитие артериальной гипертензии и значения АД достоверно не отличались от значений интактных животных. Соответствующие значения АД составили САД - 123,3±6,3, 139,6±7,3, 125,1±4,8 мм рт.ст., ДАД - 108,2±3,2, 107,4±4,9, 94,8±4,1 мм рт.ст. (рис. 8).

Коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) также снижался во всех группах животных при монотерапии как резвератролом, так и с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью. Максимальное эндотелиопротективное действие наблюдалось при использовании резвератрола и небиволола. КЭД соответственно составил 0,9±0,1 и 1,1±0,1. Данный показатель у интактных животных составил - 0,8±0,1, а у животных с патологией 2,1±0,2 (рис. 8).

I П III IV V VI VII vin I - Интактяые;П- оварнэктомня; ГП- рсзвератрол 2 мг/кг; IV-эналаприл 0,5 мг/кг; V-лозартан 6 мг/кг, Vl-амлодипин 0,5 мг/кг, VH-нсбиволол О, 5мг/кг, Vffl-индапамид 2 мг/кг

- Интактные самки ■Овариэктомия (ОЭ) "ОЭ+резвератрол 2 мг/кг

— — ОЭ+эналаприл 0,5 мг/кг -А- ОЭ+лозартан 6 мг/кг

— -О- - ОЭ+амлодигош 0,5 мг/кг —О—ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг —X— ОЭ+индапамид 2 мг/кг

67,9%*

60

10"

15м

20"

Ш Интактные самки ЕЗ Овариэктомия (ОЭ)

Е) ОЭ+резвератрол 2 мг/кг И ОЭ+эналаприл 0,5 мг/кг

В ОЭ+лозартан 6 мг/кг H ОЭ+амлодипин 0,5 мг/кг

0 ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг В ОЭ+индапамид 2 мг/кг

ED Интакгиые самки Ш Оварюкгомия (ОЭ)

S ОЭ+резвератрол 2 мг/кг И ОЭ+эналаприл 0,5 мг/кг

В ОЭ+лозартан 6 мг/кг ПОЭ+амлодипинО,5 мг/кг

□ ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг H ОЭ+ивдапамвд 2 мг/кг

РИнтактные самки П ОЭ+резвератрол 2 мг/кг В ОЭ+лозартан 6 мг/кг 0 ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг

ЕЭОвариэктомия (ОЭ) Е ОЭ+эналаприл 0,5 мг/кг ВОЭ+амлодипин 0,5 мг/кг И ОЭ+индапамцд 2 мг/кг

Рис. 8. Влияние применения резвератрола и препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании гипоэстроген-индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиапьной дисфункции, АДр - адренореактивность, НС -нагрузка сопротивлением, еИОБ - экспрессия ИО-синтазы, 1ЧОх - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ - диаметр кардиомиоцитов.

Примечание: * - р < 0,05 - в сравнении с овариэктомией, ** - р < 0,05 - в сравнении с интактными

□ Интакгные самки

□ ОЭ+резвератрол 2 мг/кг ЕЭ ОЭ+лозартан 6 мг/кг

0 ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг

ЕЗОвариэктомия (ОЭ) ШОЭ+эналаприл0,5 мг/кг 03 ОЭ+амлоднпин 0,5 мг/кг 0ОЭ+индапамид2 мг/кг

О И1ггактные самки □ Овариэктомия (ОЭ)

С ОЭ+резвератрол 2 мг/кг И ОЭ+эналаприл 0,5 мг/кг

5 ОЭ+лозартан 6 мг/кг В ОЭ+амлодипин 0,5 мг/кг

0 ОЭ+небиволол 0,5 мг/кг В ОЭ+ индапамид 2 мг/кг

Функциональная проба на адренореактивность у животных с патологией на фоне монотерапии всеми препаратами, обнаружила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления. Максимальное предотвращение повышения адренореактивности выявлено при монотерапии небивололом - 200,5±6,1, у интактных самок - 203,3±2,6, у животных с овариэктомией - 243,2±6,4 (рис. 8).

Проведение пробы на нагрузку сопротивлением выявила аналогичную тенденцию. Данные при использовании монолечении исследуемыми препаратами находились между значениями интактных животных и животных с патологией. Сократимость на 25 секунде к 5-й секунде, взятой за 100% нагрузки соответственно составила у ии'гактных самок 87,2±3,4%, у животных с гипоэстроген - индуцированной патологией - 67,9±2,8%. Максимальное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено при монотерапии небивололом (89,9±2,5%) и амлодипином (86,7±3,2%) (рис. 8).

Показатель экспрессии еМОБ под воздействием изучаемых веществ, увеличивался, однако, значения экспрессии эндотелиальной МО-синтазы, не достигали значений интактных животных (рис.8).

Суммарная концентрация нитрит-ионов при монотерапии указанными препаратами достоверно увеличивалась. Небиволол и резвератрол в дозе 2 мг/кг и выявили максимальное предотвращение снижения концентрации нитрит - ионов, соответствующие значения составили 101,2±5,1 и 98,6±3,7 (рис. 8).

Морфометрические исследования показали, что все изучаемые вещества в разной степени предотвращают развитие гипертрофии миокардиоцитов. В большей степени предотвращение развития гипертрофии миокардиоцитов выявлена у резвератрола - 9,2±0,2, и небиволола - 9,6±0,3 (рис. 8).

Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективной активности резвератрола 2 мг/кг, эналаприла 0,5 мг/кг, лозартана 6 мг/кг, амлодипина 0,5 мг/кг, небиволола 0,5 мг/кг, индапамида 2 мг/кг представляет характеристику функции эндотелия и сократимости миокарда с использованием нескольких основных параметров .Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

Сравнивая площади векторных диаграмм, мы получили выраженные различия между группой интактных животных, животных с моделированием гипоэстроген - индуцированного дефицита оксида азота и групп, животных с фармакологической коррекцией вышеуказанными препаратами. В группе интактных животных расчётная площадь составляет 5,48 усл. ед., в группе с моделированием гипоэстроген - индуцированного дефицита оксида азота -7,33 усл. ед., что принимается за наибольшую степень выраженности сочетанных сосудистых, гемодинамических, биохимических и морфологических нарушений.

Результаты площадей векторных диаграмм в группах составляют: резвератрол 2 мг/кг - 5,47; эналаприл 0,5 мг/кг - 6,02; лозартан 6 мг/кг - 6,13; амлодипин 0,5 мг/кг - 6,41; небиволол 0,5 мг/кг - 5,76; индапамид 2 мг/кг -6,32 усл.ед.

Согласно данных анализа площадей векторных диаграмм по совокупности эндотелио- и кардиотропных эффектов данную группу выбранных исследуемых лекарственных средств для коррекции гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота можно расположить в порядке возрастания активности амлодипин (0,5 мг/кг) - индапамид (2 мг/кг) - лозартан -эналаприл (0,5 мг/кг) - (6 мг/кг) - небиволол (0,5 мг/кг) —резвератрол (2 мг/кг).

Из предложенных шести показателей - САД, ДАД, коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), диаметр кардиомиоцитов (КМЦ), суммарное количество нитратов и нитритов (ЫОх), показатели миокардиальной пробы с нагрузкой сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия, ПА 5-25), при гипоэстроген - индуцированном моделировании дефицита оксида азота КЭД имеет дельту (А) по отношению к показателю у интактных животных в 262,5 %, остальные показатели соответственно: САД - 124,9%, ДАД - 130,5 %, КМЦ - 147,1 %, N0 - 61,2%, ПА 5-25 - 76,0 %. Сумма остальных пяти

показателей Асад. дад, кмц, ко, па 5-25 = 539,7 %, а значит вклад Дкэд составляет половину, что очень существенно, в коррекции нарушений метаболического пути синтеза оксида азота, вызванного билатеральной овариэктомией.

Используя данный подход комплексной оценки, следует отметить, что наибольшей активностью в группе изучаемых препаратов в отношении коррекции нарушений метаболического пути Ь-аргинина/ЫО при моделировании гипоэстроген-индуцированного оксида азота обладают резвератрол (2 мг/кг), и небиволол (0,5 мг/кг), наименьшей - амлодипин (0,5 мг/кг) и индапамид (2 мг/кг), эналаприл (0,5 мг/кг) и лозартан (6 мг/кг) занимают промежуточное положение.

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, резвератрол 2 мг/кг выявил активность, сопоставимую или превосходящую таковую у препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью.

5. Изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью при гипоэстроген - индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью с резвератролом (2 мг/кг) на фоне гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота практически полностью предотвращало развитие артериальной гипертензии, и за исключением сочетания индапамида с резвератролом достигался целевой уровень АД (рис. 9).

I П Ш IV V VI VII УШ I - Интахтные самки; II- Овариэктомия; III- резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ.); IV» РЕЗВ+ эналаприл 0,5 мг/кг; У-РЕЗВ+ лозартан б мг/кг; VI-РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг, \Ш-РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг, VIII-РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

100

-Интактные самки

——•— Овариэктомия ^■•■"резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ)

— ♦ — РЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг

— -А — РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг

— О- - РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг —О—РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг —X— РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

94,2%* 90,6%* 89,9%* 88,7%* 87,2%*

„10"

15"

20"25"

КЭД

□ Интактные самки

□ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗЗ)

□ РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг

0 РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

ЕЗ Овариэктомия ВРЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг И РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг В РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

ЕЗ Интактные самки 13 Овариэктомия

В резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ) И РЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг

€ РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг 8ВРЕЗВ+амлодипинО,5 мг/кг

0 РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг Н РЕЗВ+индапамвд 2 мг/кг

ЕЗ Ингактные самки □ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ) В РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг ВРЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

Э Овариэкгомия В РЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг ЕВ РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг Н РЕЗВ+ивдапамид 2 мг/кг

Рис. 9. Влияние комбинированного применения резвератрола с препаратами с доказанной эндотелио-протективной активностью на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании гипоэстроген- индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр - адренореактивность, НС -нагрузка сопротивлением, еМОБ - экспрессия ЫО-синтазы, ЫОх - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ - диаметр кардиомиоцитов.

Примечание: * - р < 0,05 - в сравнении с овариэкгомией, ** - р < 0,05 - в сравнении с интактными

1ЧОх

98,6*

♦♦♦♦

101,7*

О Интактные самки

□ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ)

□ РЕЗВ+лозартан 6 мг/кг

0 РЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

□ Овариэктомия Ш РЕЗВ+эналаприл 0,5 мг/кг Я РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг В РЕЗВ+индапамид 2 мг/кг

О Интактные самки □ резвератрол 2 мг/кг (РЕЗВ) О РЕЗВ+лозартан С мг/кг ВРЕЗВ+небиволол 0,5 мг/кг

О Овариэктомия Ш РЕЗВ+эналаприл 0.5 мг/кг В РЕЗВ+амлодипин 0,5 мг/кг НРЕЗВ+ индапамид 2 мг/кг

Также комбинированное использование препаратов выявило увеличение эндотелиопротективного эффекта, что привело к снижению КЭД до уровня интактных во всех сериях кроме сочетания индапамида с резвератролом в сравнении с монотерапией (рис.9).

Абсолютная цифра максимального ЛЖД на введение адреналина у животных, получавших комбинации оказалась ниже, чем при монотерапии. В сериях экспериментов, где использовался эналаприл + резвератрол, амлодипин + резвератрол, небиволол + резвератрол и индапамид + резвератрол значения ЛЖД достоверно не отличались от группы интактных (рис.9).

Проведение пробы на нагрузку сопротивлением также выявила преимущества комбинированной терапии, так, как во всех сериях сочетаний значения достоверно не отличались от таковой у интактных животных. У интактных животных показатель составил - 87,2±3,4%, гипоэстроген -индуцированная патология - 67,9±2,8% (рис. 9).

Эффективность сочетанного применения резвератрола с основными антигипертензивными препаратами выявлена в увеличении концентрации суммы нитратов и нитритов плазмы, значения которых были выше чем у соответствующей монотерапии. У животных получавших комбинацию резвератрола с небивололом данный показатель достоверно не отличался от интактных животных (рис.9).

Функционально-биохимические показатели подтвердились результатами морфометрии миокардиоцитов. Средний диаметр животных, получающих комплексное лечение, оказался ниже в сравнении с монотерапией. Комбинации резвератрола с эналаприлом, лозартаном и небивололом выявили максимальное предотвращение гипертрофии миокардиоцитов, и соответствующие значения составили 8,9±0,1, 8,7±0,2 и 8,8±0,3 мкм.

Комплексную оценку эндотелио- и кардиопротективной активности сочетанного применения резвератрола 2 мг/кг с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью проводили с помощью интегрального векторного анализа гемодинамических, биохимических и морфологических показателей.

Векторные значения выбранных основных показателей представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

Площадь векторной диаграммы, в группе интактных животных составил 5,48, а в группе с моделированием гипоэстроген - индуцированного дефицита оксида азота - 7,33. Значения в группах животных с фармакологической коррекцией сочетаниями резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью находились между значениями интактных и животных с патологией, а также были ниже соответствующей монотерапии с вышеназванными препаратами. Данный показатель составил: резвератрол 2 мг/кг+ эналаприл 0,5 мг/кг - 5,52, резвератрол 2 мг/кг + лозартан 6 мг/кг -5,69, резвератрол 2 мг/кг+- амлодипин 0,5 мг/кг - 5,47, резвератрол 2 мг/кг+ небиволол 0,5 мг/кг - 5,55, резвератрол 2 мг/кг+ индапамид 2 мг/кг - 6,03.

Анализируя площади векторных диаграмм по совокупности эндотелио- и кардиотропных эффектов комбинаций исследуемых лекарственных средств для коррекции гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота, следует отметить возрастание активности фармакологической коррекции метаболического пути Ь-аргининаЖО при совместном использовании резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью по сравнению с соответствующей монотерапией.

Дальнейший анализ данных сочетаний позволяет рассчитать дельту аддиции (Дадд= 5преп - 5рсзвгпреп) и её вероятностный процент (Р^д), рассчитываемый по формуле: Радя=Дам /Дь^аме * 100%. Проведение соответствующих расчётов выявила следующие данные: дельта (Дадд) и вероятностный процент (Радд) аддиции в группах комбинаций соответственно составил: резвератрол + эналаприл - 0,50- 27,0%; резвератрол + лозартан - 0,4423,8%; резвератрол + амлодипин - 0,94- 50,8%, резвератрол + небиволол - 0,2111,3%; резвератрол + индапамид - 0,29-15,6%.

Таким образом, комбинированное применение препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью с резвератролом на модели гипоэстроген-индуцированной патологии обнаружила преимущества по сравнению с монолечением выраженные в предотвращении развития гипертензии и снижения концентрации нитрит ионов (МОх), в большем снижении КЭД, а также предотвращении повышения адренореактивности, и исчерпания миокардиального резерва и положительных данных морфометрии.

При этом практически полностью предотвращалось развитие артериальной гипертензии, и за исключением сочетания индапамида с резвератролом уровень АД имел значения в пределах нормы.

Дальнейший анализ сочетаний резвератрола с изученными препаратами проводился на основании результирующих площадей, полученный в результате интегрального векторного анализа, значения которых представлены в табл. 1.

Сравнение площадей векторных диаграмм, выявила выраженные различия между группой интактных животных, животных с моделированием Ь-ИАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота и групп, животных с фармакологической коррекцией вышеуказанными препаратами. В группе интактных животных расчётная площадь составляет 5,48 усл. ед., в группе с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота -10,12 усл. ед., в группе с гипоэстроген-индуцированным - 7,33, что принимается за наибольшую степень выраженности сочетанных сосудистых, гемодинамических, биохимических и морфологических нарушений в условиях данных моделей.

Как следует из данных таблицы 1 резвератрол, как монотерапия, занимает высокое положение как при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците N0, так и при гипоэстроген-индуцированной патологии по интегральной активности в коррекции нарушений метаболического пути Ь-аргинин/ЫО в сравнении с известными препаратами, обладающими эндотелиопротективной активностью. Кроме того, резвератрол при сочетанном применении усиливает протективную

Таблица 1

Результаты интегрального векторного анализа при применении комбинаций резвератрола 2 мг/кг с основными антигипертензивными препаратами при экспериментальной эндотелиальной дисфункции (усл. ед.)

Экспериментальные группы Результирующ ая площадь векторной диаграммы

Интактные самцы 5,48±0,3

Ь-ЫАМЕ 10,12±1,2

Резвератрол 2 мг/кг 6,13±0,4

Эналаприл 0,5 мг/кг 8,16±0,7

Резвератрол 2 мг/кг + Эналаприл 0,5 мг/кг 6,29±0,6

Лозартан 6 мг/кг 7,39±0,5

Резвератрол 2 мг/кг + Лозартан б мг/кг 6,11±0,4

Амлодипин 0,5 мг/кг 6,46±0,3

Резвератрол 2 мг/кг + Амлодипин 0,5 мг/кг 6,06±0,2

Небиволол 0,5 мг/кг 6,47±0,3

Резвератрол 2 мг/кг + Небиволол 0,5 мг/кг 6,26±0,5

Индапамид 2 мг/кг 8,05±0,7

Резвератрол 2 мг/кг + Индапамид 2 мг/кг 6,64±0,4

Экспериментальные группы Результир ующая площадь векторной диаграммы

Интактные самки 5,48±0,3

Овариэктомия 7,33±0,6

Резвератрол 2 мг/кг 5,47±0,3

Эналаприл 0,5 мг/кг 6,02±0,5

Резвератрол 2 мг/кг + Эналаприл 0,5 мг/кг 5,52±0,2

Лозартан 0,5 мг/кг 6,13±0,4

Резвератрол 2 мг/кг + Лозартан 0,5 мг/кг 5,69±0,3

Амлодипин 0,5 мг/кг 6,41±0,3

Резвератрол 2 мг/кг + Амлодипин 0,5 мг/кг 5,47±0,4

Небиволол 0,5 мг/кг 5,7б±0,2

Резвератрол 2 мг/кг + Небиволол 0,5 мг/кг " 5,55±0,5

Индапамид 2 мг/кг 6,32±0,3

Резвератрол 2 мг/кг + Индапамид 2 мг/кг 6,03±0,2

активность данных препаратов в отношении Ь-ИАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота, что выражается в большем приближении значения площади к группе интактных животных.

В дальнейшем была рассчитана дельта аддиции сочетаний резвератрола (ДадГ 8препар„ - 8рмвератр0Л + препарат), при этом дельта Ь-ИАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота соответственно составили - Дьыаме= Sl.na.me - 8ИНТ=10,12 - 5,48 = 4,64 (усл.ед)., Аовар= 80вар-8инт=7,33-5,48=1,85 (усл.ед) (таблица 2).

Кроме того, согласно формуле: Радд=Дадд /Дь-наме (или Довар) * 100% был произведен расчет вероятностного процента аддиции (Радд).

После проведения соответствующих расчётов, вероятностный процент аддиции описывает вклад резвератрола при комбинированном использовании его с каждым препаратом для коррекции Ь-КАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота (табл. 2).

Таблица 2

Расчётные показатели дельта аддиции и её вероятностного процента комбинаций резвератрола с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью при Ь-ИАМЕ- и гипоэстроген-индуцированном дефиците оксида азота (усл. ед., %).

Ь-КАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота Гипоэстроген-индуцированный дефицит оксида азота

Группы комбинаций Аадд (усл. ед) р гадд (•/„) Группы комбинаций Аадд (усл. ед.) Р 1 адд (%)

Резвератрол 2 мг/кг + Эналаприл 0,5 мг/кг 1,87 40,3%±3,5 Резвератрол 2 мг/кг + Эналаприл 0,5 мг,кг 0,50 27,0%±2,3

Резвератрол 2 мг/кг + Лозартан 6 мг/кг 1,28 27,6%±1,3 Резвератрол 2 мг/кг + Лозартан 0,5 мг/кг 0,44 23,8%±1,9

Резвератрол 2 мг/кг + Амлодипин 0,5 мг/кг 0,4 8,6%±0,9 Резвератрол 2 мг/кг + Амлодипин 0,5 мг/кг 0,94 50,8%±4,5

Резвератрол 2 мг/кг + Небиволол 0,5 мг/кг 0,21 4,5%±0,09 Резвератрол 2 мг/кг + Небиволол 0,5 мг/кг 0,21 11,3%±0,9

Резвератрол 2 мг/кг + Индапамид 2 мг/кг 1,41 30,4%±1,6 Резвератрол 2 мг/кг + Индапамид 2 мг/кг 0,29 15,6%±1,4

Из таблицы 2 видно, что при Ь-ИАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота добавление резвератрола к эналаприлу, индапамиду дают наиболее существенную аддицию, вероятностный процент которой колеблется или варьирует от 30 до 40%, наименьший прирост аддиции в комбинации резвератрола с небивололом - 4,5%, промежуточное положение занимают комбинации с лозартаном и амлодипином (табл. 2).

При гипоэстроген-индуцированном дефиците оксида азота картина несколько отличается. Наибольшую дельту аддиции резвератрол выявил в сочетании с амлодипином и эналаприлом (27-50%), среднюю - с лозартаном и индапамидом, наименьшую также с небивололом.

Полученные данные свидетельствуют о том, что аддитивный эффект максимален там, где патогенетически точки приложения фармакодинамического действия резвератрола, принципиально отличны от

механизма эндотелиопротекции традиционными препаратами. Учитывая что, небиволол сам является модулятором синтеза оксида азота, аддитивное действие резвератрола минимальна.

Таким образом, результаты оценки аддитивного действия резвератрола с традиционными антигипертензивными препаратами при экспериментальной эндотелиальной дисфункции, указывают на то, что наши исследования раскрывают перспективу целенаправленного и патогенетически осмысленного изучения возможностей использования резвератрола как дополнения к традиционным методам лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Выводы

1. Разработан комплекс методических подходов и выявлен объективный показатель эндотелиальной дисфункции - коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД®), представляющий собой соотношение площади под кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропруссид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилатации (ацетилхолин).

2. Экспериментальные Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированные модели эндотелиальной дисфункции характеризуются увеличением КЭД в 5 и 2,5 раза соответственно, а также развитием выраженной артериальной гипертензии, повышением адренореактивности и снижением резервов сократимости. Одновременно, в 3,5 раза, уменьшается уровень суммарного содержания нитритов и нитратов плазмы (МОх) и в 2 раза, снижается экспрессия еМОБ. Морфологически наблюдалась гипертрофия миокарда.

3. Резвератрол в дозах 0,15 и 2 мг/кг/сут. внутрибрюшинно оказывает дозозависимое эндотелиопротективное действие на моделях Ь-ЫАМЕ - и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в предотвращении развития гипертрофии миокарда и снижения концентрации нитритов и нитратов плазмы, при недостижении нормы значений артериального давления.

4. Эналаприл 0,5 мг/кг/сут., лозартан калия 6 мг/кг/сут., амлодипин 0,5 мг/кг/сут., небиволол 0,5 мг/кг/сут., индапамид 2 мг/кг/сут., (внутрижелудочно) также обладали эндотелиопротективными эффектами на данных моделях патологии по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия данными препаратами не приводила значения артериального давления к норме.

5. Сочетанное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывает более выраженное, в сравнении с соответствующей монотерапией эндотелиопротективное действие на моделях Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, что выражается в достоверном снижении КЭД. Показатели АД при Ь-ЫАМЕ патологии достоверно снижались, при эстроген-дефицитном состоянии достигали нормы. Положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб и морфометрических показателей.

6. Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия 6,0 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, что выражалось в достовеном снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитритов и нитратов плазмы. Значения артериального давление достигали нормы в обеих моделях патологии по сравнению с монотерапией данными средствами. Также, морфологические исследования и результаты нагрузочных проб выявили положительную динамику.

7. Комплексное использование резвератрола (2 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг), резвератрола (2 мг/кг) с небивололом (0,5 мг/кг), резвератрола (2 мг/кг) с индапамидом (2 мг/кг) обнаружила сходное эндотелиопротективное действие на моделях Ь-ИАМЕ- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, выражающееся в достоверном снижении КЭД, положительной динамики результатов нагрузочных проб, морфологических исследований, а также в предотвращении снижения содержания нитритов и нитратов плазмы. При этом у всех комбинаций уровень АД достигает нормы при гипоэстрогении.

8. Комплексная оценка функциональных характеристик выявила степень вклада резвератрола в эндотелиопротективное действие при сочетанном применении с основными антигипертензивными препаратами, которая при Ь-ЫАМЕ - индуцированной модели патологии убывает в ряду: резвератрол + эналаприл > резвератрол + индапамид > резвератрол + лозартан > резвератрол + амлодипин > резвератрол + небиволол, а при гипоэстроген-индуцированной патологии соответственно: резвератрол + амлодипин > резвератрол + эналаприл > резвератрол + лозартан > резвератрол + индапамид > резвератрол + небиволол.

Практические рекомендации

В практике фармакологических лабораторий при изучении эндотелиопротективной активности рекомендуется использовать методику исследования эндотелиальной дисфункции включающий комплекс физиологических, биохимических, морфологических методов, и показателя эндотелиальной дисфункции - коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД®).

Рекомендуется проведение широких клинических исследований резвератрола на добровольцах — мужчинах и добровольцах - женского пола с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, дислипопротеинемией, атеросклерозом.

С целью повышения эффективности антигипертензивной терапии рекомендуется провести клинические исследования у пациентов с данной патологией комбинаций резвератрола с эналаприлом, лозартаном калия, амлодипином, небивололом и индапамидом.

Провести исследования клинической эффективности сочетанного применения резвератрола с эналаприлом, лозартаном калия, амлодипином, небивололом и индапамидом у женщин с сердечно-сосудистой патологией в постклимактерическом периоде.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Даниленко Л.М., Белоус A.C., Артюшкова Е.Б., Корокин М.В., Корокина Л.В., Маяков А.И. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции / Russian journal of immunology - 2006. - vol. 9, supp. 3. P. 59-63.

2. Покровский M.B., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Гладченко М.П., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Брусник М.В., Чулюкова Т.Н., Клявс Ю.П., Корнеев М.М., Зеленкова Т.И., Малыхин В.А., Белоус A.C., Залозных Я.И., Маяков А.И. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / Кубанский научный медицинский вестник. -Краснодар 2006. -№ 10 (91) - С. 72-77.

3. Кочкаров В.И,. Покровский М.В., Корнеев М.М., Покровская Т.Г., Гладченко М.П., Артюшкова Е.Б., Метельская В.А., Туманова Н.Г., Файтельсон A.B., Дудка В.Т., Клявс Ю.П., Зеленкова Т.И., Гудырев О.С. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при экспериментальном моделировании оксида азота / Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2006. - № 9 (90). -С. 150-152.

4. Корокин М.В., Носов A.M., Покровский М.В, Артюшкова Е.Б., Покровская Т.Г., Метельская В.А., Кочкаров В.И., Корокина Л.В., Файтельсон A.B., Гудырев О.С., Пашин E.H., Дудка В.Т., Туманова Н.Г. Сравнительное исследование эндотелио- и кардиопротективных свойств фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea deltoidea и 17-р-эстрадиола /Кубанский научный медицинский вестник. / Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2006. - № 9 (90) - С. 137-140

5. Корокина Л.В., Граник В.Г., Макаров В.А., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Покровская Т.Г., Покровский М.В., Корокин М.В., Маяков А.И., Брусник М.С., Пашин E.H. Изучение эффектов синтетических доноров оксида азота при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2006. - № 9 (90) - С. 141-145.

6. Туманова Н.Г., Артюшкова Е.Б. Метельская В.А., Кочкаров В.И., Покровская 'Г.Г., Даниленко Л.М., Корнеев М.М., Покровский М.В., Пашин E.H. Влияние антиоксидантов pQ510 и резвератрола на регуляторную функцию эндотелия у крыс с моделированной артериальной гипертонией / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2007. - т. 143 - №6, С.619-622.

7. Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Корокин М.В., Корокина Л.В., Залозных Я.И., Клявс Ю.П., Брусник М.В., Корнеев М.М., Черноморцева B.C., Чулюкова Т.А., Зеленкова Т.И., Ахметзянова И.Н., Смешко Н.В., Малыхин В.А. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2007. -№ 1-2 (94-95) - С. 146-150.

8. Залозных Я.И., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., ПокровскийМ.В., Артюшкова Е.Б., Гладченко М.П., Гуреева Е.Т., Гуреев В.В., Малыхин В.А., Белоус A.C., Маяков А.И. Применение L-аргинина в комплексе с амлодипином

и индапамидом при экспериментальном моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции /Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2007. - № 1-2 (94-95) - С. 52-55.

9. Белоус A.C., Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Брусник М.В., Чулюкова Т.Н., Клявс Ю.П., Корнеев М.М., Зеленкова Т.Н., Малыхин В.А., Залозных Я.И. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты смеси гомеопатических разведений афинно очищенных поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтезе оксида азота (eNOS) С12, С30, С200 при экспериментальном моделировании L-Name индуцированной эндотелиальной дисфункции / Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2007. -№ 1-2 (94-95) - С. 23-26.

10. Кочкаров, В.И. Сравнительное исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном калия при гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции / Кубанский научно-медицинский вестник- №5. - 2008. - С.82-85.

11. Покровская Т.Г., Покровский М.В., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Корокин М.В., Пашин E.H., Метельская В.А., Туманова Н.Г., Файтельсон A.B. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинаций основных групп антигипертензивных средств с L-аргинином при эндотелиальной дисфункции в эксперименте /Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. - 2008. - №2. -С.126-131.

12. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б. Эндотелиопротективные эффекты L-аргинина при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота /Экспериментальная и клиническая фармакология.-2008.- т.71. - №2, С.29-31.

13. Артюшкова Е.Б., Туманова Н.Г., Метельская В.А., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Корокин М.В., Покровский М.В., Корокина JI.B., Носов A.M., Корнеев М.М. Влияние фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea Deltoidea на регуляторную функцию эндотелия при моделировании гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции /Рациональная фармакотерапия в кардиологии.-2008.-№2. - С. 85-89.

14. Артюшкова Е.Б., Пашков Д.В., Покровский М.В., Файтельсон A.B., Гудырев О.С., Покровская Т.Г., Пашин E.H., Кочкаров В.И. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте /Экспериментальная и клиническая фармакология.-2008. -Т.71. -№3,- С.23-25.

15. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Даниленко JI.M., Корокин М.В., Белоус A.C., Корокина JI.B., Малыхин В.А., Залозных Я.И., Брусник М.С., Жавберт Е.С. Сравнительное изучение потенциальных эндотелийпротекторов и препарата импаза при моделировании дефицита оксида азота / Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т.148, № 8 (прилож.) - С.154-157.

16. Белоус A.C., Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Жавберт Е.С. Коррекция эндотелиальной

дисфункции препаратом импаза в комплексе с эналаприлом и лозартаном при моделировании дефицита оксида азота / Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т.148, № 8 (прилож.) - С.151-153.

17. Кочкаров В.И., Покровский М.В., Покровская Т.Г., Корокин М.В., Гудырев О.С., Артюшкова Е.Б., Белоус A.C., Малыхин В.А. Кардиопро-тективные эффекты резвератрола при экспериментальной блокаде инду-цибельной синтазы оксида азота /Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9. -№1, С.157.

18. Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В. и др. Использование L-аргинина в профилактике нарушений функции эндотелия в условиях ингибирования эндотелиальной и индуцибельной NO-синтаз / Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9., № 3. - С. 328.

19. Корокин М.В. Покровский М.В., Артюшкова Е.Б., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Корокина J1.B., Белоус А.С, Гудырев О.С., Клявс Ю.П. Малыхин В.А., Ершов И.Н., Лучкина Е.В., Полонская К.В., Маяков A.C. Способы экспериментального моделирования эндотелиальной дисфункции / Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 327.

20. Васильев, Г.В., Новиков О.О., Кочкаров В.И. Аналитическая характеристика резвератрола / Человек и его здоровье. Курский науч.-практ. вест. - 2007. -№3. - С. 90-96.

21. Васильев, Г.В., Новиков О.О., Кочкаров В.И. Фармакологическая характеристика резвератрола / Курский науч.-практ. вест. «Человек и его здоровье». - 2007. - №3. - С. 97-104.

22. Кочкаров В.И., Покровский М.В., Покровская Т.Г., Даниленко Л.М., Гладченко М.П. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2006, №3(23), Вып.4. - С.57-64.

23. Кочкаров, В.И., Даниленко Л.М., Кузмичева O.A. Кардиопро-тективные эффекты сочетаний резвератрола с основными антигипертензив-ными препаратами при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / Научные ведомости Белгородского гос. ун-та. - 2008. - №6, Вып. 5. - С. 130-133.

24. Кочкаров, В.И., Даниленко Л.М., Кузмичева O.A. Резвератрол и его комбинации в эндотелиопротекции при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / "Научные ведомости" Белгородского гос. ун-та. - 2008. -№6, Вып. 5.-С. 133-137.

25. Кочкаров, В.И. Кардиопротективные эффекты препаратов с антиоксидантной активностью / Научные ведомости Белгородского гос. ун-та. -2008,-№6, Вып. 5.-С. 119-122.

26. Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В. Исследование эндотелиопротективных эффектов комбинации L-аргинина и резвератрола / Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: материалы II нац. конгр. терапевтов. - М., 2007. - С. 178.

27. Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Корокин М.В., Артюшкова Е.Б., Корокина Л.В., Малыхин В.А., Лазаренко Г.С., Гладченко

М.П. Исследование эндотелиопротективных эффектов комбинации L-аргинина и резвератрола при моделировании гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции / Клинические исследования, шестая международная конференция «Клинические исследования лекарственных средств» - Москва 2007. - С. 91-93.

28. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Даниленко JI.M., Артюшкова Е.Б., Гладченко М.П., Лазаренко Г.С., Корокин М.В., Корокина Л.В., Маяков А.И., Железнова З.Т. Способ оценки эндотелиальной дисфункции. / Сборник материалов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва.- 2006. - С. 575.

29. Корнеев М.М., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. , Покровский М.В., Брусник М.А. Изучение действия резвератрола на фоне применения эналаприла / Человек и лекарство: Тез. докл. Рос. нац. конгр. - М., 2007 - С. 833.

30. Корнеев М.М., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Залозных Я.И. Комбинированное применение лозартана с резвератролом при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / Человек и лекарство: Тез. докл. Рос. нац. конгр. - М., 2007 - С. 833.

31. Кочкаров В.И., Покровский М.В., Корнеев М.М. Покровская Т.Г. , Зеленкова Т.И., Клявс Ю.П. Эндотелиопротективное действие резвератрола / Человек и лекарство: Тез. докл. Рос. нац. конгр. - М., 2007 - С. 835.

32. Кочкаров В.И., Покровский М.В., Корнеев М.М., Покровская Т.Г. Кардиопротективное действие резвератрола / Человек и лекарство: Тез. докл. Рос. нац. конгр. - М., 2007 - С. 834.

33. Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Лазаренко Г.С., Покровская Т.Г. К определению нитратов и нитритов в крови у крыс как биохимических маркеров состояния эндотелия сосудов / Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. юбилей, науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ: в 2 т.- Курск: КГМУ, 2005,- Т.2. - С.132.

34. Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В. и др. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Рос. науч. конф. с междунар. участием «Медико - биологические аспекты мультифакториальной патологии». - Курск, 2006. -T. II. - С.336-340.

35. Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Понарьин A.C. Коррекция L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции при использовании резвератрола в комбинации с амлодипином / Университетская наука: взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН. - 2006,- Т.2.- С.239-240.

36. Кочкаров, В.И. Изучение действия резвератрола на фоне применения индапамида / Кочкаров В.И., Литвинов С.А. // Университетская наука: взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН. - 2006,- Т.2.- С.243-244.

37. Kochkarov V.l., Pokrovskiy M.V., Korneev М.М. et all. Application resveratrol with lozartan at experimental modelling deficiency of nitrogen oxid / Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice: Materials of the

Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi. - Perm, 2006.-P. 97.

38. Kochkarov V.I., Pokrovskaya T.G., Korneev M.M. et all. Correction L-NAME induced of endothelial dysfunction at application resveratrol in the combination with amlodipin / Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice: Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi.- Perm, 2006. - P. 98.

39. V.I. Kochkarov, T.G. Pokrovskaya, M.M. Korneev et all. Endothelioprotective action resveratrol at L-NAME-induced endothelial dysfunction / Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice: Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi. - Perm, 2006.-P. 98-99.

40. Kochkarov V.I., Pokrovskaya T.G., Stancovich M., et all. Endothelioprotective action of the extract of leaves of grapes at L-name-indused deficiency of nitrogen oxide / Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice: Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi.- Perm, 2006. - P. 99 - 100.

41. Kochkarov V.I., Pokrovskaya T.G., Korneev M.M. et all. Studying of action resveratrol on the background of application indapamid / Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice: Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi. - Perm, 2006. - P. 100-101.

Патенты

1. Пат. 2271202. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. -№ 2005113244/14, опубл. 10.03.06, Бюл. № 7. -4 с.

2. Пат. 2296566. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией амлодипина и L-аргинина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140965/14, опубл. 10.04.07, Бюл. № 10. -4 с.

3. Пат. 2301015. Способ оценки эндотелиальной дисфункции / соавт. М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. - № 2005113243/14, опубл. 20.06.07, Бюл. № 17. -7 е.: ил.

4. Пат. 2301670. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией эналаприла и резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. -№ 2005140966/14, опубл. 27.06.07, Бюл. № 18. - 5 с.

5. Пат. 2302239. Способ фармакологической коррекции ишемии конечности / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель:

M.B Покровский, Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров. -№2006125313/14, опубл. 10.07.07, Бюл.№ 19.-3 с.

6. Пат. 2302241. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией индапамида и резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патенообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. -№ 2005140969/14, опубл. 10.07.07, Бюл. № 19. -4 с.

7. Пат. 2306924. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. - № 2005140967/14, опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

8. Пат. 2306929. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией индапамида и L-аргинина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. -№ 2005140970/14, опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

9. Пат. 2306930.Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и L-аргинина при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова. -№ 2005140968/14, опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

10. Пат. 2306953. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека - С12, СЗО, С200 / М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: М.В Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров, Е.Б. Артюшкова, A.C. Белоус. -№ 2006125314/14, опубл. 27.09.07, Бюл. № 27. - 4 с.

Список сокращений

АД - артериальное давление АДр - адренореактивность

ДАД - диастолическое артериальное давление (мм рт.ст.)

ДМ - диаметр кардиомиоцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление t

НС - нагрузка сопротивлением

РФК - реактивные формы кислорода

САД - систолическое артериальное давление (мм рт.ст.)

ЧСС - частота сердечных сокращений (уд. мин)

ЭД - эндотелиальная дисфункция

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

L-NAME - №-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир

NF-kB - нуклеарный фактор каппа - В

N0 - оксид азота

NOx, total NO - сумма нитритов и нитратов

Подписано в печать 04.05.2009. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Усл. п. л. 2,5. Тираж 100 экз. Заказ 89. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в издательстве Белгородского государственного университета 308015 г. Белгород, ул. Победы, 85

Изучение роли эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний привело к пониманию концепции о нем как о мишени для профилактики и лечения данных патологий.

Как известно, эндотелиальная дисфункция (ЭД) рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогенных и других состояниях [3, 6, 67, 74, 219, 255, 296, 334].

Этому способствуют такие модифицируемые факторы риска сердечнососудистых заболеваний, как курение, гипокинезия, солевая нагрузка, различные интоксикации, нарушения углеводного, липидного, белкового обменов, инфекции и др. [13, 32, 35, 37, 72, 121, 124, 151, 197, 276].

При этих заболеваниях эндотелий сосудов предстает в роли первоочередного органа-мишени, поскольку участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции [15, 16, 116, 213].

Участие эндотелия в возникновении и развитии различных патологических состояний многогранно и связано как с регуляцией сосудистого тонуса, так и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки и др. [433, 479]. В качестве основных стимулов, вызывающих ответ эндотелиальной клетки следует выделить изменение скорости кровотока (увеличение напряжения сдвига), тромбоцитарные медиаторы (серотонин, АДФ, тромбин), а также циркулирующие и/или "внутристеночные" нейрогормоны (катехоламины, вазопрессин, ацетилхолин, эндотелии, брадикинин, гистамин и др.) [303].

Участие эндотелия в возникновении и развитии различных патологических состояний многогранно и связано как, с регуляцией сосудистого тонуса, так и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки и др. [433, 479]. В качестве основных стимулов, вызывающих ответ эндотелиальной клетки следует выделить изменение скорости кровотока (увеличение напряжения сдвига), тромбоцитарные медиаторы (серотонин, АДФ, тромбин), а также циркулирующие и/или "внутристеночные" нейрогормоны (катехоламины, вазопрессин, ацетилхолин, эндотелии, брадикинин, гистамин и др.) [303].

Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота - NO. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов [19]. В то же время, NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов [3] и предотвращая тем самым патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза.

Недостаточная продукция NO в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны это связано со снижением биодоступности NO, с другой - со сниженной активностью eNOS в результате присутствия эндогенных или экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения доступности его субстрата, L-аргинина. В основе снижения биодоступности NO лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками (ЭК) биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеют свободные радикалы кислорода (СРК), которые, соединяясь с NO, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК) как пероксинитрит (ONOO") [362]. Пероксинитрит являясь высокотоксичным соединением повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности [343]. При этом возникает оксидантный стресс, активирующий большое количество оксидантчувствительных факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (NF-кВ), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов, способствующих развитию воспалительных и других процессов протекающих при атеросклерозе [202, 232, 453].

Недостаточная продукция N0 в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны это связано со снижением биодоступности N0, с другой - со сниженной активностью eNOS, в результате присутствия эндогенных или экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения доступности его субстрата, L-аргинина. В основе снижения биодоступности N0 лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками (ЭК) биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеют свободные радикалы кислорода (СРК), которые, соединяясь с NO, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК) как пероксинитрит (ONOO") [362]. Пероксинитрит являясь высокотоксичным соединением, повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности [343]. При этом возникает оксидантный стресс, . активирующий большое количество оксидантчувствительных факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (NF-кВ), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов, способствующих развитию воспалительных и других процессов, протекающих при атеросклерозе [202, 232, 453].

ЭД проявляется снижением образования и биодоступности оксида азота (N0) при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов, что приводит к дисбалансу медиаторов, обеспечивающих в норме эндотелийзависимые процессы [18, 43, 65, 68, 70, 296, 299].

В свою очередь оценка ЭД как основного патогенетического звена сердечно-сосудистых заболеваний требует пересмотра терапевтических стратегий с целью профилактики или уменьшения повреждений сосудистой стенки.

Учитывая возможные механизмы реализации предотвращения развития ЭД, следует отметить, что на роль эффективного эндотелиопротекторного средства подходит вещество - резвератрол (3,4,5-тригидрокси-транс-стильбен).

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что резвератрол наряду с гиполипидемической, антиоксидантной, эстрогенной, антиагрегационной активностью, обладает также, кардиопротективной и эндотелиотропной активностью в опытах in vitro. Эндотелиотропная активность резвератрола обусловлена активацией фермента eNOS [214, 274, 288,333.].

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств резвератрола и его комбинаций с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью, в частности ингибитором АПФ - эналаприла малеатом, блокатором ангиотензиновых рецепторов (подтип ATi) лозартаном калия, блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином, селективным блокатором (Зр адренорецепторов - небивололом и тиазидоподобным диуретиком-индапамидом при экспериментальном дефиците оксида азота.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Изучение патологических состояний сердечно-сосудистой системы. Разработка современных медицинских технологий профилактики, диагностики и лечения болезней системы кровообращения» на 2004-2010 гг. Номер государственной регистрации темы — 01.2.00950596.

Цель исследования: провести комплексное исследование и обосновать возможности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции 3,5,4'- тригидрокси-транс-стильбеном (резвератролом) и его комбинациями с основными антигипертензивными препаратами в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Разработать методические подходы и изучить характер развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной модели дефицита NO в эксперименте, с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

2. Изучить эндотелиопротективную активность резвератрола, эналаприла, лозартана калия, амлодипина, небиволола, индапамида при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита NO.

3. Провести исследование эндотелиопротективной активности сочетанного применения резвератрола и эналаприла при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита NO.

4. Исследовать эндотелиотропную активность сочетанного применения резвератрола и лозартана калия при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита NO.

5. Провести изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения резвератрола и амлодипина при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита NO, с использованием предложенных методических подходов.

6. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и небиволола при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита NO.

7. Исследовать эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и индапамида при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита N0.

8. Провести комплексную оценку функциональных характеристик (сосудистой реактивности, нитроксидергической системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда) с помощью интегрального векторного анализа и выявить степень вклада резвератрола в эндотелиопротективное действие при сочетаниом применении с основными антигипертензивными препаратами при L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной моделях дефицита NO.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспериментальные L-NAME-индуцированный и гипоэстроген-индуцированный модели эндотелиальной дисфункции являются объективными, информативными, и характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэфиициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO-синтазы), а также динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (увеличение диаметра миокардиоцитов, повышение адренореактивности, снижением миокардиального резерва).

2. Резвератрол является дополнением к фармакологической коррекции традиционными антигипертензивными средствами при состояниях сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

3. Резвератрол усиливает эндотелиопротективную активность эналаприла, лозартана калия, амлодипина, небиволола и индапамида.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ комбинированной фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте с использованием резвератрола и основных антигипертензивных препаратов. Используя комплекс методических подходов, выявлено, L-NAME- и гипоэстроген-индуцированная эндотелиальные дисфункции характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД в 5 и 2,6 раза соответственно, повышением адренореактивности и снижением исчерпания миокардиального резерва, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO- синтазы), а также отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечнососудистой системы (диаметр миокардиоцитов).

В работе впервые показано, что сочетанное использование резвератрола (2 мг/кг/сут.) с ингибитором АПФ эналаприлом (0,5 мг/кг/сут.), блокатором ATI-рецепторов лозартаном (6 мг/кг/сут.), блокатором кальциевых каналов амлодипином (0,5 мг/кг/сут.), тиазидоподобным диуретиком индапамидом (2 мг/кг/сут.), бета-блокатором небивололом (0,5 мг/кг/сут) и тиазидоподобным диуретиком- индапамидом (2 мг/кг/сут.) оказывает аддитивное эндотелиопротективное действие при моделировании эндотелиальной дисфункции. Полученные результаты доказывают необходимость наряду с традиционной терапией основными антигипертензивными препаратами дополнительной эндотелиотропной терапии. Научная новизна подтверждается получением 10 патентов РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом, блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия, блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином, селективным блокатором Pi-адренорецепторов небивололом и тиазидоподобным диуретиком индапамидом для коррекции L-NAME- и гипоэстрогениндуцированной N0-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД соответственно в 5 и 2,6 раза, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию NO-синтазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, соотношение интима-медиа и т.д.).

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности лозартана калия «Блоктран», эналаприла малеата «Рениприл», индапамид «Индапамид» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения антигипертензивной и эндотелиопротективной активности резвератрола включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (Свидетельство о государственной регистрации № 154/032.43.07). Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности резвератрола используются и в лекционных курсах кафедры фармакологии КГМУ и кафедры фармхимии и фармакогнозии БелГУ.

Публикации.

По результатам исследования опубликовано 41 научных и научно-методических работ, в том числе 19 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2004 -2007 гг.; XIII - XV национальном конгрессе «Человек и лекарство»; II национальном конгрессе терапевтов, г. Москва; международной научно-практической конференции «Лекарственные препараты: традиции и новации», апрель 2005 г., г. Белгород; VI международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр медико-биологических дисциплин, биохимии и фармакологии, внутренних болезней №1, акушерства и гинекологии, фармацевтической химии и фармакогнозии, фармации ГОУ ВПО «БелГУ Федерального агентства по образованию», и кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, фармакогнозии, инфекционных болезней, внутренних болезней № 2, хирургии ФПО, биохимии, внутренних болезней ФПО, научно-исследовательского института экологической медицины ГОУ ВПО «КГМУ Росздрава».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов и списка используемой литературы, включающего 490 источников, из них 75 отечественных и 415 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 381 странице машинописного текста, содержит таблиц — 50, рисунков — 129, схем — 1.

выводы

1. Разработан комплекс методических подходов и выявлен объективный показатель эндотелиальной дисфункции - коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД®), представляющий собой соотношение площади под кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропруссид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилатации (ацетилхолин).

2. Экспериментальные L-NAME- и гипоэстроген-индуцированные модели эндотелиальной дисфункции характеризуются увеличением КЭД в 5 и 2,5 раза соответственно, а также развитием выраженной артериальной гипертензии, повышением адренореактивности и снижением резервов сократимости. Одновременно, в 3,5 раза, уменьшается уровень суммарного содержания нитритов и нитратов плазмы (NOx) и в 2 раза, снижается экспрессия eNOS. Морфологически наблюдалась гипертрофия миокарда.

3. Резвератрол в дозах 0,15 и 2 мг/кг/сут. внутрибрюшинно оказывает дозозависимое эндотелиопротективное действие на моделях L-NAME - и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в предотвращении развития гипертрофии миокарда и снижения концентрации нитритов и нитратов плазмы, при недостижении нормы значений артериального давления.

4. Эналаприл 0,5 мг/кг/сут., лозартан калия 6 мг/кг/сут., амлодипин 0,5 мг/кг/сут., небиволол 0,5 мг/кг/сут., индапамид 2 мг/кг/сут., (внутрижелудочно) также обладали эндотелиопротективными эффектами на данных моделях патологии по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия данными препаратами не приводила значения артериального давления к норме.

5. Сочетанное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывает более выраженное, в сравнении с соответствующей монотерапией эндотелиопротективное действие на моделях L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO, что выражается в достоверном снижении КЭД. Показатели АД при L-NAME патологии достоверно снижались, при эстроген-дефицитном состоянии достигали нормы. Положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб и морфометрических показателей.

6. Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия 6,0 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита NO, что выражалось в достовеном снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитритов и нитратов плазмы. Значения артериального давление достигали нормы в обеих моделях патологии по сравнению с монотерапией данными средствами. Также, морфологические исследования и результаты нагрузочных проб выявили положительную динамику.

7. Комплексное использование резвератрола (2 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг), резвератрола (2 мг/кг) с небивололом (0,5 мг/кг), резвератрола (2 мг/кг) с индапамидом (2 мг/кг) обнаружила сходное эндотелиопротективное действие на моделях L-NAME- и гипоэстроген-индуцированного дефицита N0, выражающееся в достоверном снижении КЭД, положительной динамики результатов нагрузочных проб, морфологических исследований, а также в предотвращении снижения содержания нитритов и нитратов плазмы. При этом у всех комбинаций уровень АД достигает нормы при гипоэстрогении.

8. Комплексная оценка функциональных характеристик выявила степень вклада резвератрола в эндотелиопротективное действие при сочетанном применении с основными антигипертензивными препаратами, которая при L-NAME - индуцированной модели патологии убывает в ряду: резвератрол + эналаприл > резвератрол + индапамид > резвератрол + лозартан > резвератрол + амлодипин > резвератрол + небиволол, а при гипоэстроген-индуцированной патологии соответственно: резвератрол + амлодипин > резвератрол + эналаприл > резвератрол + лозартан > резвератрол + индапамид > резвератрол + небиволол.

Практические рекомендации

В практике фармакологических лабораторий при изучении эндотелиопротективной активности рекомендуется использовать методику исследования эндотелиальной дисфункции включающий комплекс физиологических, биохимических, морфологических методов, и показателя эндотелиальной дисфункции - коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД1®).

Рекомендуется проведение широких клинических исследований резвератрола на добровольцах - мужчинах и добровольцах - женского пола постменопаузе с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом, дислипопротеинемией, атеросклерозом.

С целью повышения эффективности антигипертензивной терапии рекомендуется провести клинические исследования у пациентов с данной патологией комбинаций резвератрола с эналаприлом, лозартаном калия, амлодипином, небивололом и индапамидом.

Провести исследования клинической эффективности сочетанного применения резвератрола с эналаприлом, лозартаном калия, амлодипином, небивололом и индапамидом у женщин с сердечно-сосудистой патологией в постклимактерическом периоде.

330