Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование эндотелиопротективного эффекта резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном

На правах рукописи

Корнеев Марат Маулудович

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНОГО ЭФФЕКТА РЕЗВЕРАТРОЛА И ЕГО КОМБИНАЦИЙ С ЭНАЛАПРИЛОМ И ЛОЗАРТАНОМ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03066181

Курск - 2007

003066181

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель.

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки, профессор Резников Константин Михайлович доктор медицинских наук, профессор Ивашев Михаил Николаевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

еГТ?

часов на

Защита состоится «"ТС^» 2007 г в ^

заседании диссертационного совета К 208 03^01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г Курск, 305041, ул К Маркса)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Автореферат разослан « » г

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕМЫ Актуальность проблемы. По современным представлениям эндотели-альная дисфункция (ЭД) является одним из ведущих патогенетических звеньев сердечно-сосудистых заболеваний. Так, роль дисфункции эндотелия доказана в патогенезе ряда наиболее распространенных заболеваний и патологических состояний атеросклерозе, артериальной гипертензии, легочной гипертензии, сердечной недостаточности, дилятационной кардиомиопатии, ожирении, гиперли-пидемии, сахарном диабете, гипергомоцистеинемии (Laufs U 1998, Белоусов Ю Б., Намсараев Ж Н , 2006)

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO) при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М, 2005)

Таким образом, дисфункция эндотелия проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелий-зависимых процессов (Shimokawa Н 1998, Luscher TF 2001)

Нарушения продукции, взаимодействия, разрушения эндотелиальных ва-зоактивных факторов наблюдаются одновременно с аномальной сосудистой реактивностью, изменениями в структуре и росте сосудов, которым сопутствуют сосудистые заболевания (Xu С., 2001).

NO синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина (Casino Р R, Kilcoyne С М, Quyyumi A A, Hoeg J.M, Panza J А , 1994)

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, но вместе с тем, в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции

Одной из важных точек приложения терапевтического воздействия при ЭД является восстановление дефицита NO, которое возможно путем активации фермента eNOS (Бабак О .Я., 2004)

Научные исследования в области изыскания эндотелиотропных средств указывают на активизацию нитроксидергической системы природным веществом резвератролом (3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбен), содержащимся в красных сортах виноградных вин (Orallo F, Alvarez Б, Camiña М, et all, 2002)

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что резве-ратрол наряду с гиполипидемической, антиоксидантной, эстрогенной, антиаг-регационной активностью, обладает также кардиопротективной и эндотелио-тропной активностью в опытах in vitro Эндотелиотропная активность резве-ратрола обусловлена активацией фермента eNOS (Li Н F , Chen S.A , Wu S.N., 2000)

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелио-протективных свойств резвератрола и его комбинаций с ингибитором ангиотен-зинпревращающего фермента (АПФ) - эналаприлом и блокатором ангиотензи-

новых рецепторов (ATO - лозартаном при экспериментальном дефиците оксида азота

Номер государственной регистрации темы - 01 22 006 10406

Цель исследования: провести оценку эндотелиопротективного эффекта резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном калия в эксперименте

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1 Изучить эндотелиопротективную активность резвератрола при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO

2 Изучить эндотелиопротективную активность ингибитора АПФ энала-прила при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO

3 Изучить эндотелиопротективную активность блокатора АТ1-рецепторов лозартана калия при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO

4 Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и ингибитора АПФ эналаприла при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO

5 Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и блокатора ATI-рецепторов лозартана калия при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что резве-ратрол 0,15 и 2 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) оказывает эндотелийпротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД Эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан калия 6 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) как монотерапия также обладали эндоте-лиопротективными эффектами на выбранной модели патологии Сочетанное использование резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом и блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия показало положительное эндотелиопротек-тивное взаимодействие

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом и блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилятация) и нитро-пруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилятация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию NO-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивности, и т д.)

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания резвератрола при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротек-тивной активности лозартана калия «Блоктран» и эналаприла малеата «Рени-прил» (производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000)

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндо-телиопротективной активности резвератрола, используются и в лекционных курсах кафедры фармхимии и фармакогнозии Белгородского государственного университета

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2004, 2005 и 2006 гг. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ

Положения, выносимые на защиту.

1 Резвератрол 0,15 и 2 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) оказывает дозозависимое эндотелийпротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированной ЫО-дефицитной ЭД Эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан калия 6 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток), как монотерапия, также обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии

2 Сочетанное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом (0,5 мг/кг) оказывает выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ИОх При этом достигаются целевые цифры АД, в отличие от монотерапии отдельно резверат-ролом и эналаприлом Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышения адренореактивности на фоне снижения реакции на реоксигенацию, Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации резвератрола с эналаприлом увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов

3 Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия (6,0 мг/кг) оказывает эндотелиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов Ж)х При этом не отмечается предотвращение развития гипертензии Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 271 источник, из них 121 -отечественных и 150 - зарубежных авторов Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 16, рисунков - 38, схем - 1

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Опыты' проводились на белых крысах самцах линии Wistar массой 250300 г N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинио, в дозе 25 мг/кг На 7 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену Показатели гемодинамики* систолическое артериальное дäвлeниe (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell" Функциональные пробы внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (J В Laureen, 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М Е, 1991)

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould» США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt шах), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт.ст х уд мин)

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности'

1 Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9% раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) (Меерсон Ф 3 ,1980)

2 Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида из расчета 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980)

3 Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Меерсон Ф 3 , 1980)

4 3-х минутная гипоксия (Пашин Е.Н , 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Ме-тельская В А , Гуманова Н Г , 2005).

Уровень экспрессии эндотелиальной синтезы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В А , Туманова Н Г , 2002)

Для морфологического подтверждение развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином для выявления ранних повреждений мио-кардноцитов по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция При морфометрии сердца

использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов , определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г Г Автандилова (1994) Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Исследованы дозы резверат-рола 0,15 и 2 мг/кг Доза 0,15 мг/кг соответствует дозе резвератрола, разрешенной в РФ в качестве биологически активной добавки (10 мг/сут )

При этом, согласно данным литературы, эндотелио- и кардиотропные эффекты резвератрола в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне доз от 0,2 До 2 мг/кг (Fremont L , 2000) Доза 2 мг/кг соответствует содержанию его в экстраординарных сортах вин (10 мкмоль/л, 600 мл/сут.) Согласно литературных данных, именно в этой дозе резвератрол, проявляет максимальные эндотелио- и кардиотропные эффекты

Таким образом, описанные дозы резвератрола - 0,15 и 2 мг/кг использованы нами при проведении острой фармакологической пробы

В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота резвератрол вводили в дозах 0,15 и 2 мг/кг один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L Y , 1993)

Ингибиторы АПФ эналаприла малеат «Рениприл» (производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) и лозартан калия «Блоктран» (производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) использовали в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно, что подтверждается данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории

Комбинированное использование резвератрола 2 мг/кг (внутрибрюшинно) плюс эналаприла малеата 0,5 мг/кг (внутрижелудочно) и лозартана калия 6 мг/кг (внутрижелудочно) проводилось по вышеописанному протоколу один раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией Различия оценивали как достоверные, при р<0,05 Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NÂME-индуцированном дефиците NO.

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг /кг привело к стойкому повышению артериального давления (рис 1)

АД

■ ю ]

□ САД ,' ■ ДАД '

247,3*

Иитакгньн 1.-МЛМЕ

с\08

ДМ

1'и су но к 1. Функциональные, биохимические и морфологические показа- 2В тени при моделировании Ь-ТЧЛМЕ-индуцированного дефицита N0. 16

'■р< 0,05 в сравнении с группой шпакшых '.к;: астшх

18*

щ

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелий-зависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с Ь-^АМЕ-индуцированной патологией в отличие от интактных животных На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диастолическое и ЧСС Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией После окончания миокардиального компонента (метка 2) артериальное давление восстанавливается Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами как площадь эндотелиальной реакции

Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндоте-лийзависимую вазодилятацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг\кг) у интактных животных

Треугольники над кривой артериального давления-объяснение по тексту

На рис 26 представлена реакция на ацетилхолин при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции При этом видно, что площадь эндотелийзависимой реакции в несколько раз меньше, чем у интактных животных

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропрус-сид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис 3)

а) интактные животные

К« п

at.ee «« нйшс »

да,« №1ШГИЛ

1« )

з» « «о шш; I?

__ь

ШН Ш»1«ТС1К В (ПК )

5эв аэ шшгмп

б) животные с патологией

Рисунок 3.

Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндоте-лийзависимую вазодилятацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг) у интактных животных

Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющимся отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил -1,1 ±0,09, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше - его значение составило 5,4±0,08 (рис 1) Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис 1), У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 83,6±7,7, а у животных с Ь-МАМЕ-индуцированной патологией значительно сильнее - до 66,0±5,5 %

Характерная динамика биохимических маркеров Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис 1 Так, концентрация нитрит-ионов (МОх) у животных, получавших Ь-ЫАМЕ составила 61,2 ±3 6, тогда как у интактных - 114,1±4 1 мкМ

Экспрессия эндотелиальной КО-синтазы (еЖ>8) сывороткой интактных животных составила 72,9±3 8 тогда как у животных, получающих Ь-ЫАМЕ -21,4±4 7%

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились

результаты морфологических исследований (рис. 4). На представленных гистологических препаратах, рис. 4а - интактные мискардиоциты, рис. 46 - миокар-диоциты животных на 7-с сутки с L-NAME-I!ндуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении. МарфометричесКИе исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1Д, а у животных, получавших L-NAME- ]8,4±1,1 мкМ (рис. I).

Рисунок 4. Морфология миокарда у интактных и опытных животных: а) гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; б) гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер у крысы с артериальной гипертензией в модели с Ь-ЫЛМЕ па поперечном срезе, Окраска гематоксилином и эозином. Рис. а, б - в 440-кратном увеличении.

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол (рис. 5). V интактных животных клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-ЫАМЕ-патологии (б) - сосуд с п армирован, стенки утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, ежедневное в течение 7 суток, внутрибрЮшишое введение Ь^АМЕ 25 мг вызывает развитие эндотелиалыюи дисфункции, характеризующейся резким увеличением ЮД, АД, повышением алренореактивности с развитием скрытой сердечной недостаточности, характерными биохимическими сдвигами и гистологической картннои гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

Рисунок 5. Морфологическая картина почечных артерий у интактных и опытных животных: а) неизмененная артерия почки у интактноЙ крысы; б) перестройка стенки почечной артерии с резким утолщением ее стенки и сужением просаста, гиперплазией эластических структур и гипертрофией гладкомышеч-пых элементов у крысы с артериальной гипертензией в модели с Ь-ЫАМЕ. Окраска гематоксилином и эозином. Рисунок а, 6 - в 440-кратном увеличении.

2, Исследование эндотслиопротективной активности резвератрол я, эналапрнла и лозартаыа при Ь-Ы АМЕ-индуцнрованнои модели дефицита N0 в эксперименте*

Наши исследования показали, что резвератрол обладает выраженным до-зозависимым эндотелнопротективным эффектом, превосходящим таковую у эналаирила и лозартана. Так, КЭД у интактных животных составил - !,1±0,1, у Ь-ЫАМЕ - 5,4=5=0,6, Ь-ЫАМЕ + резвератрол (0,15 мг/кг) - 2,1±0,3, Ь-ЫАМЕ + резвератрол (2 мг|кг) - 1,2±0,1, Ь-ЫАМЕ + эналалрнл (0,5 мг/кг) - 3,3±0,3, Ь-ЫАМЕ + лозартан (6 мг/кг) - 2,5±0.3 (рис, 6).

Проба на адренореактивность у животных с Ь-ЫАМЕ-нндуцированной патологией на фойе терапии резвератролом, эналаприлом и лозартаном также обнаружила снижение максимальных цифр л евожел уд очкового давления. У интактных животных - 199,2±8,3, у Ь-ЫАМЕ - 247,3±4,8, у резверзтрола (0,15 мг/кг) - 220,4*6,0, у резвератрола (2 мг/кг) - 21 1,9±12,2, у эналаприла (0,5 мг/кг) — 216,2± 10,8, у лозартана (6 мг/кг) - 242,7:=4,7 мм рт.ст. Аналогичная тенденция выявлена в пробе на нагрузку сопротивлением. Сократимость на 25 секунде нагрузки составила у интактных животных — 83,6±2,1 к 5-й секунде, взятой за 100%. Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология - 66,0±2,3%, Ь-ЫАМЕ + резвератрол (0,15 мг/кг) - 69,2±3,2, Ь-ЫАМЕ + резвератрол (2 мг/кг) - 74,4±3, Ь-ЫАМЕ + экалаприл - 82,7*2,8, Ь-ЫАМЕ + лозарта.н - 78,1*3,1%.

Рисунок 6. Влияние резвератрола 0,15 х 2 мг/кг, эналаприла 0,5 мг/кг, лозар-тана калия 6 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита N0. * - р < 0,05 в сравнении с группой [.-NAME животных,

- р < 0,05 в сравнении с группой интакгных животных

NOv

fNOS

43,3-

□ - Иитактнме gj - L-NAME gg - Peiaepaipon 0,15 ш7кг

Ш - Резвератрол2 мг/кг щ .Эвалалрнл0,5 мг/кг щ - Лозартал 6 мг/кг

На рисунке 6 представлена экспрессия эндотелиальной ЫО-синтазы в % от контроля сывороткой животных, получавших Ь-ЫАМЕ и указанные препараты Для интактных животных показатель составил 72,9±3,8, Ь^АМЕ-21,4±4,7, Ь-ЫАМЕ + резвератрол (0,15 мг/кг), резвератрол 2 (мг/кг), эналаприл (0,5 мг/кг), лозартан (6 мг/кг), соответственно, 30,2±3,5, 36,7±4,7, 42,2±3,6, 43,3±3,8, что достоверно выше, чем у Ь-ЫАМЕ, но ниже интактных Концентрация нитрит ионов в сыворотке крови под влиянием резвератрола дозозави-симо увеличивалась и достоверно не отличалась от интактных при использовании дозы 2 мг/кг Эналаприл и лозартан не предотвращали Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота (рис 6)

Влияние указанных препаратов на диаметр миокардиоцитов также выявило существенные преимущества резвератрола (2 мг/кг) в способности предотвращать гипертрофию миокардиоцитов Резвератрол (0,15 мг/кг), эналаприл (0,5 мг/кг) и лозартан (6 мг/кг) заняли промежуточное положение между ин-тактными и животными с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией Однако, не достигли статистически значимых различий диаметра кардиомиоцитов крыс с моделированием патологии

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, резвератрол (2 мг/кг) проявил активность, сопоставимую или превосходящую таковую у ингибитора АПФ эналаприла и блокатора АТ1 -рецепторов лозарта-на

3. Изучение эидотелиопротективной активности сочетанного применения резвератрола и ингибитора АПФ при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение эналаприла (0,5 мг/кг) с резвератролом (2 мг/кг) на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота приводило к значительному снижению артериального давления, что не достигалось при монотерапии отдельно резвератролом и эналаприлом (рис 7)

КЭД при сочетанном использовании резвератрола и эналаприла составил 1,5±0,1, что достоверно отличается от монотерапии эналаприлом - КЭД -3,3±0,3 и приближается к показателям у интактных животных - КЭД - 1,1±0,1 и в 2,5 раза отличается от Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии - КЭД — 5,4±0,6 (рис 7)

Абсолютная цифра максимального ЛЖД на введение адреналина у животных, получавших эналаприл с резвератролом составила - 210,9±3,6, что меньше чем у эналаприла - 216,2±10,8, и сопоставима с резвератролом -209,9±12,3, при показателе у интактных - 199,2±8,3 и с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией - 247,3±4,8 мм рт ст (рис 7) Аналогичная ситуация отмечалась при проведении пробы на нагрузку сопротивлением У интактных животных показатель составил - 83,6± %, Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология - 66,0± %, резвератрол - 74,4±2,1, сочетанное применение резвератрола и эналаприла - 89,1±3,0 (рис 7)

[ : - Ми. ал ГНВДС Н - Эралаприл 0,5 мг/кг

-[.-КАМЕ - Реэверягрол 2 мг/кг

- Эналаприл 0,5 мг/кг - I 'езвера: .>■: I 2 мг/кг

Рисунок 7. Влияние комбинированного применения резвератрола 2 мг/кг и знала-прила 0,5 мг/кг на функциональные, биохимические и Морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцировалного дефицита КО. • - р < 0,05 в сравнении с группой 1.-МАМВ животных,

** - р < 0,05 в (-раниемии с группой интактных ЖИВОТНЫХ

сГЧОБ

Оценка экспрессии еЫ08 не выявила влияния комбинации препаратов. В то же время концентрация нитрит ионов (1чЮх) при сочетанном использовании эналаприла и резвератрола оказалась выше, чем при монотерапии эналаприлом (рис 7)

Морфометрия диаметра миокардиоцитов также показала преимущество комбинации эналаприла и резвератрола по сравнению с монотерапией эналаприлом Диаметр миокардиоцитов составил в группе эналаприл + резвератрол -9,3±0,3, монотерапии эналаприлом - 15,2±1,0, интактных - 9,1±1,1, животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией - 18,4±1,1 мкм

Таким образом, сочетанное применение ингибитора АПФ эналаприла с индуктором еЫОв резвератролом, выявило существенные преимущества по сравнению с монотерапией эналаприлом по совокупности функциональных, биохимических и морфологических критериев, характеризующих выраженность и степень эндотелиальной дисфункции, а также сопутствующих ей признаков гипертрофии миокарда и ремоделирования сосудистого русла

4. Изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения Ь-аргинина и блокатора АТ1-рецепторов лозартана калия при Ь^АМЕ- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение резвератрола (2 мг/кг) с блокатором АТ1-рецепторов лозартаном (6 мг/кг) оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-НАМЕ-индуцированного дефицита N0 (рис 8)

Так, при сочетанном применении лозартана с резвератролом обнаружено увеличение эндотелиопротективного эффекта лозартана, что привело к снижению КЭД У интактных животных КЭД составил 1,1±0,1, Ь-ЫАМЕ - 5,4±0,6, резвератрол и лозартан по 1,8±0,1. Одновременно достигался целевой уровень артериального давления (рис 8)

В экспериментах на открытом сердце также обнаружена эффективность сочетанного использования резвератрола с лозартаном по сравнению с монотерапией Так, максимальная цифра ЛЖД при комбинации в пробе на адреноре-активность составила 208,4±7,5, тогда как отдельно лозартан 242,7±4,7, резвератрол - 209,9±12,3, интактные - 199,2±8,3, Ь-ЫАМЕ - 247,2±4,8 мм ртст Аналогичная ситуация обнаружена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением У интактных ЛЖД на 25 сек. составила 83,6±2,1, лозартана - 78,1±4,1, резвератрол - 74,4±2,1, а их сочетания - 83,6±3,1, тогда как животные с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией - 66,0±2,3%

Эффективность сочетанного применения резвератрола и лозартана по сравнению с монотерапией выявлена в увеличении концентрации нитрит ионов. Она была выше и достоверно не отличалась от интактных животных (рис 8)

Рисунок 8. Влияние комбинированно-[■о применения резвератрола 2 мг/кг и лозартапа б мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-КАМЕ-индуцирйванного дефицита N0.

* - р < 0,05 о сравнении с 1руппой [.-ЫАМК животных,

** - р < 0,05 в сравнении с группой иятакт-иых животных

- ИнИктные Щ -1 ,-ЫЛМЬ ¡д - Резвсратрол 2 мг/кг

53 - Лозартан 6 мг/кг § - Лозарган 6 мг/кг + Рсзлсрафол 2 мг/кг

еКОв

Функционально-биохимические показатели подтвердились результатами морфометрии миокардиоцитов Средний диаметр животных, получающих комплексную терапию 10,1±1,0 мкм, что существенно лучше чем при монотерапии лозартаном и достоверно не отличается от интактных животных

Таким образом, сочетанное использование блокатора АТ1 -рецепторов ло-зартана и резвератрола оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, а также предотвращении снижения нитрит ионов (Ж)х) и динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований При этом и предотвращалось развитие гипертензии

ВЫВОДЫ

1 Резвератрол в дозе 2 мг/кг однократно в течение 7 суток проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов 1ЧОх Результаты нагрузочных проб вьивили предотвращение повышения адренореактивности и исчерпания миокардиального резерва на фоне повышения реакции на реоксигенацию Резвератрол (2 мг/кг) предотвращал увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов Резвератрол (0,15 мг/кг) также проявлял эндотелио- и кардиопротективную активность, однако уступал резвератролу (2 мг/кг) Монотерапия резвератролом в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений артериального давления

2 Эналаприл (0,5 мг/кг) проявлял эндотелиопротективное и кардиопро-тективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей Монотерапия эналаприлом не достигала целевых значений артериального давления

3. Лозартан калия (6,0 мг/кг) проявлял эндотелиопротективное и кардио-протективное действие на модели Ь-НАМЕ-индуцированного дефицита N0 и по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей оказался сопоставим с эналаприлом (0,5 мг/кг) Монотерапия лозартаном калия не достигала целевых значений АД

4 Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом (0,5 мг/кг) оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов МОх При этом не отмечалось предотвращение развития гипертензии Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности на фоне снижения сократимости миокарда на пике реоксигенации. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации резвератрола с эналаприлом

5 Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия (6,0 мг/кг) оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx При этом достигались целевые цифры АД, что не наблюдалось при монотерапии отдельно резвератролом и лозартаном. Сходную и сопоставимую с эналалрилом (0,5 мг/кг) положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб и морфологических исследований

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Application resveratrol with lozartan at experimental modelling deficiency of nitrogen oxid / VI Kochkarov, M V Pokrovskiy, M.M. Komeev et all. // Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi - Perm, 2006 -P 97

2 Correction L-NAME induced of endothelial dysfunction at application resveratrol in the combination with amlodipm / VI Kochkarov, T G Pokrovskaya, MM Komeev et all // Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi - Perm, 2006 -P 98

3 Endothelioprotective action resveratrol at L-NAME-induced endothelial dysfunction /VI Kochkarov, T G Pokrovskaya, M M Komeev et all // Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi - Perm, 2006 -P 98.

4 Endothelioprotective action of the extract of leaves of grapes at L-name-indused deficiency of nitrogen oxide /VI Kochkarov, T G Pokrovskaya, M Stancovich, et all. // Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi - Perm, 2006 - P 99

5 Studying of action resveratrol on the background of application indapamid / V.I Kochkarov, T G Pokrovskaya, M.M Komeev et all // Fundamental pharmacologi and pharmacy - clinical practice- Materials of the Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacologi - Perm, 2006 - P 100

6 Кардиопротективные эффекты резвератрола при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / М В Покровский, М.М Корнеев, Т Г Покровская, В.И Кочкаров // 1 национальный конгресс терапевтов «Новый курс консолидация усилий по охране здоровья нации» (Москва, 1-3 ноября 2006) - М , 2006

7 Методические подходы для количественной оценки развития эндотели-альной дисфункции при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М В Покровский, В И Кочкаров, Т Г Покровская, и др // Кубанский науч мед вестн - Краснодар, 2006 №10 (91) - С 72-77

8 Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с эна-лаприлом и лозартаном при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / В И. Кочкаров, М В Покровский, М М Корнеев и др // Кубанский науч мед вестн - Краснодар, 2006 №9 (90) -С 150-152

9 Исследование эндотелиопротективнного эффекта Ь-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном / М,В Покровский, В И. Кочкаров, ТГ Покровская и др //Биомедицина 2006 - №4 - С. 145

10 Изучение действия резвератрола на фоне применения эналаприла / М М Корнеев, Т Г Покровская, В И Кочкаров и др // Человек и лекарство Тез докл Рос нац конгр - М , 2007 - С 833

11 Комбинированное применение лозартана с резвератролом при экспериментальной эндотелиальной дисфункции /ММ Корнеев, Т Г Покровская, В И Кочкаров и др // Человек и лекарство Тез докл Рос нац конгр -М,2007-С 833

12 Эндотелиопротективное действие резвератрола / В И Кочкаров, М В Покровский, М М Корнеев и др // Человек и лекарство Тез докл Рос нац конгр -М, 2007-С 835

13 Кардиопротективное действие резвератрола / В И Кочкаров, МВ Покровский, ММ Корнеев, ТГ Покровская // Человек и лекарство Тез докл Рос нац конгр - М , 2007 - С 834

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД — артериальное давление АДр - адренореактивность

ДАД- диастолическое артериальное давление (мм рт ст )

ДМ - диаметр кардиомиоцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

НС - нагрузка сопротивлением

САД- систолическое артериальное давление (мм рт ст) ЧСС- частота сердечных сокращений (уд мин) eNOS - экспрессия NO-синтетазы NOx- total NO

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ:

р - уровень статистической значимости * - достоверность различий, р<0,05

Лицензия ЛР № 020862 от 30 04 99 г Сдано в набор 12 09 2007 г Подписано в печать 13 09 2007 г Формат 30х42'/8 Бумага офсетная Гарнитура Times New Rom Печать офсетная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 6А Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г Курск, ул К Маркса, 3

По современным представлениям эндотелиальная дисфункция, (ЭД) является одним из ведущих патогенетических звеньев сердечно-сосудистых заболеваний. Так, роль дисфункции эндотелия доказана в патогенезе ряда наиболее распространенных заболеваний и патологических состояний: атеросклерозе, артериальной гипертензии, легочной гипертензии, сердечной недостаточности, дилатационной кардиомиопатии, ожирении, гиперлипидемии, сахарном диабете, гипергомоцистеинемии. [10, 18, 41, 48, 57, 74, 76, 79, 118, 192, 223, 238, 250, 262].

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД является снижение образования и биодоступности оксида азота (N0), при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [65].

Таким образом, дисфункция эндотелия проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [36, 65, 99, 103, 106, 176, 215, 216, 249].

Нарушения продукции, взаимодействия, разрушения эндотелиальных вазоактивных факторов наблюдаются одновременно с аномальной сосудистой реактивностью, изменениями в структуре и росте сосудов, которым сопутствуют сосудистые заболевания [85, 96, 109, 117, 130, 171, 219, 248].

NO синтезируется из L-аргинина, под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина [31, 42, 136, 242, 248, 270].

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, но вместе с тем, в настоящее время не существует препаратов для ее специфической коррекции.

Одной из важных точек приложения терапевтического воздействия при ЭД является восстановление дефицита N0 [5], которое возможно путем активации фермента eNOS.

Научные исследования в области изыскания эндотелиотропных средств указывают на активизацию нитроксидергической системы природным веществом резвератролом (3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбен), содержащимся в красных сортах виноградных вин [177, 180, 197, 207, 224, 232, 239].

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что резвератрол наряду с гиполипидемической, антиоксидантной, эстрогенной, антиагрегационной активностью, обладает также, кардиопротективной и эндотелиотропной активностью в опытах in vitro. Эндотелиотропная активность резвератрола обусловлена активацией фермента eNOS [177, 197, 207, 224.].

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств резвератрола и его комбинаций с ингибитором ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) - эналаприлом и блокатором ангиотензиновых рецепторов (ATi) - лозартаном при экспериментальном дефиците оксида азота.

Номер государственной регистрации темы - 01.22.006 10406

Цель исследования: провести оценку эндотелиопротективного эффекта резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном калия в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Изучить эндотелиопротективную активность резвератрола при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO.

2. Изучить эндотелиопротективную активность ингибитора АПФ эналаприла при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.

3. Изучить эндотелиопротективную активность блокатора АТ1-рецепторов лозартана калия при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.

4. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и ингибитора АПФ эналаприла при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.

5. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения резвератрола и блокатора ATI-рецепторов лозартана калия при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что резвератрол 0,15 и 2 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) оказывает эндотелийпротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД. Эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан калия 6 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) как монотерапия также обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом и блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия показало положительное эндотелиопротективное взаимодействие.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом и блокатором ATI-рецепторов лозартаном калия для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию NO-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивности, и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания резвератрола при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности лозартана калия «Блоктран» и эналаприла малеата «Рениприл» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности резвератрола используются и в лекционных курсах кафедры фармхимии и фармакогнозии БелГУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2006, 2007 гг. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Резвератрол 0,15 и 2 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрибрюшинно оказывает дозозависимое эндотелийпротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированной ЫО-дефицитной ЭД. Эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан калия 6 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно как монотерапия также обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии.

2. Сочетанное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывает выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx . При этом не отмечается предотвращение развития гипертензии. Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышения адренореактивности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации резвератрола с эналаприлом увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов.

3. Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия 6,0 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, положительной динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. . При этом достигаются целевые цифры АД, в отличие от монотерапии отдельно резвератролом и лозартаном.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 271 источник, из них 121 отечественных и 150 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 138 страницах машинописи, содержит таблиц-16, рисунков-38, схем-1.

ВЫВОДЫ

1. Резвератрол в дозе 2 мг/кг однократно в течение 7 суток проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов МЭх. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Резвератрол 2 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов. резвератрол 0,15 мг/кг также проявлял эндотелио- и кардиопротективную активность, однако уступал резвератролу 2 мг/кг. Монотерапия резвератролом в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений артериального давления.

2. Эналаприл 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия эналаприлом не достигала целевых значений артериального давления.

3. Лозартан калия 6,0 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 и по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей оказался сопоставим с эналаприлом 0,5 мг/кг. Монотерапия лозартаном калия не достигала целевых значений АД.

4. Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-1ЧГАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов №)х. При этом не отмечалось предотвращение развития гипертензии. Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности на фоне на фоне снижения сократимости миокарда на пике реоксигенации. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации резвератрола с эналаприлом.

5. Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия 6,0 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. При этом достигались целевые цифры АД, что не наблюдалось при монотерапии отдельно резвератролом и лозартаном. Сходную и сопоставимую с эналаприлом (0,5 мг/кг) положительную динамику продемонстрировали результаты нагрузочных проб и морфологических исследований.

109

100 Заключение

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД является снижение образования и биодоступности оксида азота (N0), при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [65], т.е. проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [36, 65, 99, 103, 106, 176, 215, 216, 249].

Изучение ЭД, состояния сосудистой стенки артерий у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая АГ, и поиск возможностей лечения ЭД являются важными клиническими задачами. Усилия исследователей направлены на поиск препаратов, которые наряду с гипотензивным эффектом могли бы уменьшать выраженность ЭД и способствовать обратному ее развитию.

Вышеизложенное предопределило необходимость разработки и систематизации методологических подходов к оценке эндотелиальной дисфункции с одной стороны, и последующей оптимизации коррекции ЭД с учетом вклада в течение патологического процесса препаратов разных групп.

Так, в ходе проведенных нами исследований в эксперименте на белых крысах-самцах линии был разработан комплекс методических подходов для оценки функционального состояния эндотелия, включающий физиологические, биохимические и морфологические методы.

Физиологические методы исследования включали моделирование эндотелиальной дисфункции ежедневным в/б введением Ь-ЫАМЕ в течение 7 суток. Механизм ингибирования выработки N0 в данном случае, заключается в конкурентном ингибировании фермента еЫОЗ аналогом Ь-аргинина — Ь-МЫА. Ь-ЫАМЕ фактически является пролекарством: в организме этот эфир гидролизуется с участием специальных ферментов — эстераз, давая активный ингибитор — Ь-№ЧА.

На восьмые сутки животных наркотизировали брали в эксперимент и на первом этапе оценивали реакции артериального давления на эндотелийзависимую (ацетилхолин) и эндотелийнезависимую (нитропруссид) вазодилатацию [25, 205].

Степень эндотелнальной дисфункции рассчитывали как коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) - отношение площадей треугольников над кривой восстановления артериального давления на нитропруссид и ацетилхолин.

Мы рассчитывали КЭД у каждого животного интактной группы и крыс после моделирования блокады NO-синтазы и получили разницу КЭД в 5 раз -соответственно 1,1 у интактных и 5,4 у животных, получавших L-NAME. Данные результаты выявили адекватность выбранной модели патологии для исследования фармакологической активности резвератрола е его комбинации с эналаприлом и лозартаном калия.

Данные факты подтвердились при определении биохимических маркеров ЭД. NO-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных увеличения экспрессии e-NOS (в процентах от контроля) и содержания нитрит-ионов NOx, и обнаружено, что моделирование L-NAME-индуцированного дефицита N0 приводило к резкому снижению экспрессии e-NOS и содержания нитрит-ионов (NOx), соответственно в 3,5 и 1,9 раза.

Результаты гистологических исследований обнаружили, что моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO на 8-е сутки приводит к яркой гипертрофии миокардиоцитов, утолщению мышечного слоя сосудистой стенки и спазму артериол, наиболее выраженному в почечных артериях, а также «вздыбливанию» эндотелиоцитов.

Подводя итог вышеизложенному, следует отметить, что предложенный методический комплекс, функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0, вследствие блокады NO-синтетазы, позволяет в достаточной степени объективно оценивать эндотелиотропное действие фармакологических агентов.

В дальнейшем с помощью вышеизложенных методологических подходов были проведены сравнительные исследования резвератрола с традиционными антигипертензивными препаратами, в частности с ингибитором АПФ эналаприлом и блокатором ангиотензиновых рецепторов (подтип АТ1) лозартаном калия.

Эти препараты считаются наиболее перспективными. В опытах на животных и клинических исследованиях показано, что тканевые эффекты ИАПФ восстанавливают функцию эндотелия, подавляют пролиферацию и миграцию ГМК, нейтрофилов и мононуклеарных клеток, снижают свободнорадикальное окисление, усиливают эндогенный фибринолиз, снижают агрегацию тромбоцитов, обладают антиатерогенным действием и стабилизируют атеросклеротические бляшки у животных [7, 28, 46, 63, 150]. Одна из возможностей воздействия на ЭД связана с восстановлением метаболизма брадикинина, нарушенного при сердечно-сосудистых заболеваниях. Блокада тканевого АПФ с помощью ИАПФ приводит не только к уменьшению синтеза АТ II, но и замедляет деградацию брадикинина. Наиболее перспективны в этом отношении ИАПФ, которые обладают большей афинностью к эндотелиальной РААС (периндоприл, рамиприл, хинаприл и трандолаприл).

Одним из возможных механизмов действия этих препаратов могут быть снижение базальной и индуцированной инсулином секреции эндотелина-1 и увеличение продукции N0. Каптоприл проявил это действие в эксперименте на культуре эндотелиальных клеток, а также во время недельной терапии больных АГ и здоровых добровольцев. В эксперименте на крысах со спонтанной АГ каптоприл и цилазаприл способствовали восстановлению эндотелиальной функции, повышая продукцию релаксирующих факторов, в частности N0; при этом уровень простагландина Б2альфа оставался неизменным [241]. Кроме того, для цилазаприл а было доказано положительное действие на функцию эндотелия в результате повышения выработки эндотелиального гиперполяризующего фактора [242].

Была экспериментально доказана способность рамиприла предотвращать ЭД, опосредованную действием недоокисленных липопротеидов низкой плотности. Положительный эффект связывают с накоплением в эндотелии брадикинина, что, в свою очередь, ведет к повышению продукции N0 [189]. При изучении способности эналаприла и кандесартана восстанавливать функцию эндотелия артерий брыжейки крыс со спонтанной АГ была выявлена их одинаковая эффективность в отношении ЭД, что в последующем было доказано и в других экспериментах, в частности с каптоприлом и лозартаном [41, 147, 168, 196, 210, 241].

Как свидетельствуют литературные данные, несомненная перспективность в комплексной фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции наряду с препаратами с доказанной эндотелиопротективной активностью отводится веществу, обуславливающему «Французский парадокс» 3,4,5-тригидрокси-транс-стильбену (резвератролу).

В многочисленных исследованиях было изучено эндотелиопротективное действие резвератрола, связанное с активацией фермента эндотелиальной Ж)-синтазы (е>Ю8). Данный механизм и выдвигается на роль ключевого звена «Французского парадокса» [139, 141, 143, 177, 180, 197,211,224, 232, 239, 251].

Также, резвератрол обладает выраженной антиоксидантной активностью [227, 228, 229, 239, 251]. Уменьшает НАДУНАДФ - оксидазную активность. [23 0].

Кроме, того некоторые авторы связывают кардиопротективный эффект от длительного применения красного виноградного вина антиоксидантными свойствами резвератрола [141, 142, 202, 208, 226, 255].

В данном случае коррекция свободнорадикальных процессов при ЭД позволяет предотвратить ускоренную деградацию N0, восстановить активность !ЧО-синтазы, экспрессию N0 в кровоток улучшать метаболические процессы и сократительную функцию миокарда [142] и препятствовать развитию эндотелиальной дисфункции [204].

Данные факты подтвердились результатами наших исследований. Так, резвератрол в дозе 2 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в увеличении экспрессии e-NOS и полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием резвератрола 2 мг/кг увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией.

Резвератрол 0,15 мг/кг, эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг также проявили эндотелио- и кардиопротективную активность, однако уступали резвератролу 2 мг/кг.

Следует отметить тот факт, что все препараты в изученных дозах не достигали заданных значений артериального давления, и следовательно, не могут рассматриваться в виде монотерапии на модели с L-NAME-индуцированной артериальной гипертензией.

Учитывая вышеизложенное определилась необходимость в изучении сочетаний резвератрола (2 мг/кг) с ингибитором АПФ эналаприлом и блокатором ангиотензиновых рецепторов (подтип АТ|) лозартаном калия.

Как, показали дальнейшие исследования комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, близкого у интактных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов Ж)х. При этом отмечалось существенное предотвращение развития гипертензии.

Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности и развитие скрытой сердечной недостаточности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации резвератрола с эналаприлом поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией.

Комбинированное использование резвератрола (2 мг/кг) с лозартаном калия 6,0 мг/кг также оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, близкого у интактных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ЫОх.

Важно подчеркнуть, при этом достоверно достигались заданные уровни АД. что не достигалось при монотерапии отдельно резвератролом и эналаприлом.

Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности и развитие скрытой сердечной недостаточности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации резвератрола с лозартаном калия поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-NAME-индyциpoвaннoй патологией.

Выраженная в большей степени эндотелиопротективная активность выявлена при использовании комбинации резвератрола с лозартаном калия, также, данная комбинация приводила АД к заданным значениям. Напротив сочетанное использование резвератрола с эналаприлом достоверно не приводила АД к заданным значениям, что объясняется селективной блокадой лозартаном калия подтипа АТ) ангиотензиновых рецепторов.