Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая коррекция дефицита оксида азота при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне

На правах рукописи

Файтельсон Александр Владимирович

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ДЕФИЦИТА ОКСИДА АЗОТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОСТЕОПОРОЗЕ И ПЕРЕЛОМАХ НА ЕГО ФОНЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

3 ОКТ 2013 005533921

Старая Купавна - 2013

005533921

Работа выполнена на кафедре травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович доктор медицинских наук, профессор Дубровин Григорий Менделевич

Официальные оппоненты:

Резников Константин Михайлович, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежская медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакологии, заведующий кафедрой;

Утешев Даниил Борисович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджегное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра семейной медицины;

Моисеева Инесса Яковлевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессиональною образования «Пензенский государственный университет», кафедра общей и клинической фармакологии, заведующая кафедрой.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. ^О

Защита состоится 2013 года в г> часов

на заседании диссертационного совета Д 217.004.01, созданного на базе ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ», 142450, Московская область, Ногинский район, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ».

Автореферат разослан 13 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Яснецов Виктор Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность научного исследования. Остеопороз - одно из наиболее распространенных метаболических заболеваний скелета человека. По мнению экспертов ВОЗ он занимает третье место после сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета в рейтинге главных медико-социальных проблем современности. Данная патология характеризуется низкой массой кости и микроструктурной перестройкой костной ткани, которая приводит к повышенной ломкости костей и, как следствие, к повышению риска переломов, изменениям в нервной системе и внутренних органах: Это определение было сформулировано на международных конференциях по остеопорозу в Копенгагене (1990 г.) и Гонконге (1993 г.) и является в настоящее время общепринятым (Аврунин A.C., 1998; Беневоленская Л.И., 2003; Дыдыкина И.С., 2008).

Вероятность развития остеопоротических переломов в пожилом возрасте очень высока. С учетом возрастающей продолжительности жизни старение популяции ведет к двукратному увеличению частоты переломов бедра в период между 2005-2050 гг. (Беневоленская Л.И., 2005; Bürge R., 2007; Adachi J.D., 2010). Достаточно сказать, что смертность при характерном для этого заболевания переломе шейки бедра в течение первых шести месяцев после перелома достигает 30% (Михайлов Е.Е., 1999; Center J.R., 2007; Abrahamsen В., 2009). С каждым годом растет число проводимых оперативных вмешательств по поводу переломов в метаэпифизарных зонах длинных трубчатых костей с применением разнообразных имплантагов, включая использование эндопротезов крупных суставов на фоне травматической патологии и ортопедических заболеваний. По имеющимся данным, на каждые пять операций первичного эндопротезирования приходится одно реэндопротезирование, что чаще всего связано с развитием асептической нестабильности на фоне остеопоротических нарушений в костной ткани (Миронов С.П., 2006; Родионова С.С., 2007).

В настоящее время патогенетическая терапия остеопороза традиционно включает препараты, замедляющие костную резорбцию (эстрогены, кальцитонин), стимулирующие костеобразование (фториды, анаболические стероиды), и препараты многопланового действия (витамин D) (Рожинская Л.Я., 2000, 2007; Марченкова Л.А., 2010). Это разграничение в известной мере условно, поскольку все они действуют в той или иной степени на оба процесса ремоделирования.

Однако увеличение частоты остеопороза и его осложнений показывает, что на сегодняшний день надежных методов медикаментозного лечения и профилактики этого заболевания нет. Все это указывает на актуальность поиска новых подходов к фармакологическим методам воздействия, а также обосновывает избранное направление исследования.

Положение о значительном вкладе микроциркуляции в процесс ремоделирования костной ткани является общепризнанным (Гудырев О.С., 2008; Корокин М.В., 2006; Alagiakrishnan К., 2003). Как известно, строение микроциркуляторного русла костной ткани существенно отличается от морфологии сосудистого русла остальных тканей организма. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и

соединительнотканного слоев. Таким образом, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью (Брощусь В.В., 2003; Грибкова И.В., 2002; Napoli С., 2001).

В условиях повреждения тканей активируются процессы неоангиогенеза. Одним из основных условий для нормального течения ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что преимущественно связано с действием оксида азота (NO) (Покровский М.В., 2008). Повышение проницаемости сосудов необходимо для выхода белков плазмы крови, что приводит к образованию фибриновой основы для последующей миграции эндотелиоцитов. Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов, источником которых могут быть эндотелиальные клетки, тучные клетки, макрофаги и другие клетки. Под действием ангиогенных факторов происходит активация эндотелиоцитов и миграция их за пределы базальной мембраны с формированием ответвлений основных сосудов (Шляхто Е.В., 2002; Kureishi Y., 2000). Таким образом, одной из причин нарушения регионарного кровоснабжения является дисфункция эндотелия (Мартынов Н.Г., 2005; Небиеридзе Д.В., 2004; Шестакова М.В., 2001). Следовательно, дисфункция эндотелия посредством нарушения микроциркуляции может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым ряд остеологических заболеваний, в том числе и остеопороз.

В свою очередь, среди активных факторов контроля микроциркуляции на передний план все чаще в последнее время выходит эндотелиальный механизм регуляции просвета и тонуса сосуда. Экспериментальные исследования выявили положительные остеопротективные эффекты у ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) эналаприла и блокатора ангиотензиновых рецепторов (ATI) лозартана при остеопоротических нарушениях (Гудырев О.С., 2008). Данные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения веществ для целенаправленного фармакологического воздействия на дефицит оксида азота при остеопоротических изменениях.

Таким образом, все вышеизложенное указывает на актуальность исследования остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эндотелиотропными эффектами.

Цель исследования - изучение и анализ остеопротективных свойств препаратов, корректирующих дефицит оксида азота при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне.

Задачи исследования:

1. Изучить развитие экспериментального остеопороза и дефицита оксида азота, вызванного двусторонней овариэктомией, с использованием результатов оценки кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов, биохимических и гистологических исследований.

2. Изучить процессы консолидации экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости с использованием

результатов оценки кровоснабжения костной мозоли, рентгенологических, биохимических и гистологических исследований.

3. Изучить остеопротективные эффекты эналаприла и лозартана на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.

4. Изучить остеопротективное действие этоксидола на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.

5. Изучить остеопротективное действие резвератрола на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.

6. Изучить остеопротективное действие комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.

7. Изучить остеопротективное действие тетрагидробиоптерина на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.

8. Изучить остеопротективное действие клопидогреля на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости.

9. Провести комплексную оценку морфофункциональных характеристик с помощью интегрального векторного анализа и выявить степень остеопротективного действия изучаемых препаратов на модели экспериментального остеопороза.

Научная новизна.

В работе продемонстрировано, что развивающийся экспериментальный остеопороз через восемь недель после двусторонней овариэктомии сопровождается ухудшением кровоснабжения костной ткани, отрицательной динамикой морфологических показателей, наличием прямой зависимости между качеством кровоснабжения кости и микроархитектоникой, наличием признаков развития эндотелиальной дисфункции на основании функциональных тестов и биохимических исследований.

Было выявлено, что эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, резвератрол в дозе 2 мг/кг, комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг, вводимые ежедневно в течение восьми недель после двусторонней овариэктомии, проявляя эндотелиотропную активностью, обладали также остеопротективным действием, что выражалось в предотвращении ухудшения внутрикостного кровоснабжения, благодаря чему изучаемые препараты способствовали замедлению истончения трабекул в спонгиозной костной ткани и предотвращению возникновения микропереломов.

Исследование впервые показало, что этоксидол, вводимый животным в дозе 12,5 мг/кг в течение восьми недель после двусторонней овариэктомии, не оказывает статистически значимого влияния на состояние кровоснабжения костной ткани проксимального метафиза бедра экспериментальных животных, а

также не вызывает положительной динамики морфофункциональных и биохимических показателей на выбранной модели патологии.

В работе впервые выявлено, что эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, резвератрол в дозе 2 мг/кг, комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг на модели экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости предотвращают ухудшение кровоснабжения в костной мозоли, а также положительно влияют на качество и количество сращений экспериментальных переломов.

В ходе исследования впервые выявлено, что этоксидол в дозе 12,5 мг/кг не оказывает положительного влияния на кровоснабжение в костной мозоли и консолидацию экспериментальных переломов проксимальнрго метафиза бедренной кости лабораторных животных.

Проведенная с помощью интегрального векторного анализа комплексная оценка остеопрогективной активности препаратов позволила ранжировать их в зависимости от степени выраженности фармакологической активности на модели экспериментального остеопороза.

Таким образом, в результате выполнения диссертационного исследования разработан комплекс положений и целостных представлений о роли эндотелиальной дисфункции в процессах ремоделирования и репаративной регенерации коечной ткани, а также патогенетически обоснованных подходов к фармакологической профилактике и коррекции их нарушений.

Научно-практическая значимость.

В работе доказана эффективность применения эналаприла, лозартана, резвератрола, комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерина и клопидогреля для коррекции остеопоротических нарушений костей скелета и фармакотерапии остеопоротических переломов. В эксперименте доказано, что использование исследуемых препаратов и их комбинации позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых реакций в тестах эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации. Данные препараты способствуют нормализации кровоснабжения костной ткани при развивающемся остеопорозе, замедлению отрицательной динамики микроструктурных изменений кости и биохимических показателей, улучшению процессов консолидации остеопоротических переломов проксимального метафиза бедра.

Результаты исследования позволяют рекомендовать проведение целенаправленных клинических испытаний эналаприла, лозартана, резвератрола, комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном, тетрагидробиоптерина и клопидогреля для изучения их фармакологической остеопротективной активности при остеопорозе и переломах костей скелета на его фоне.

Внедрение результатов исследования.

На основании данных диссертационной работы запланировано проведение целенаправленных клинических исследований эналаприла, лозартана, резвератрола и их комбинаций, тетрагидробиоптерина, клопидогрела в

фармакологической коррекции оетеопоротических нарушений при переломах костей.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелио- и остеопротективной активности ингибитора АПФ эналаприла малеат («Рениприл» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) и блокатор АТ1-рецепторов лозартана калия («Блоктран» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), использованы в НИОКР ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (акт о внедрении от сентября 2008 г.). Также в лаборатории доклинических исследований Научно-исследовательского института Экологической медицины при Курском государственном медицинском университете применяется разработанный вспомогательный лаботарный инструментарий: «Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных» и «Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений» (акт о внедрении от 21 мая 2007 г.).

Полученные результаты используются в лекционных курсах кафедр фармакологии и травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО НИУ «Белгородский государственный университет».

Связь диссертационного исследования с темами научно-исследовательских работ организации.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов лечения и профилактики оетеопоротических нарушений с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни пациентов» на 2009-2013 гг., номер государственной регистрации темы - 01201051081.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Через восемь недель после двусторонней овариэктомии у самок крыс линии \Vistar развивается дисфункция эндотелия сосудов, в том числе кровоснабжающих костную ткань, которая сопровождается увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции и снижением концентрации в крови стабильных метаболитов оксида азота, как следствие - ухудшается кровоснабжение костной ткани, что ведет к развитию генерализованного остеопороза, проявляющегося истончением костных трабекул и возникновением в их структуре микропереломов.

2. Консолидация экспериментальных оетеопоротических переломов проксимального метафиза бедра у самок крыс линии \Vistar протекает в условиях эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся снижением концентрации в крови стабильных метаболитов оксида азота, а также ухудшением кровоснабжения костной мозоли, что отрицательно сказывается на результатах их сращения и вдвое увеличивает число несращений костно-травматических повреждений.

3. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, лозартан в дозе 6 мг/кг, резвератрол в дозе 2 мг/кг на модели остеопороза, вызванного двусторонней овариэктомией,

оказывают выраженное эндотелиопротективное действие, предотвращают ухудшение кровоснабжения костной ткани бедра и обладают остеопротективным действием; на модели экспериментальных остеопоротических переломов указанные препараты увеличивают количество сращений костно-травматических повреждений.

4. Комбинированное использование резвератрола в дозе 2 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг по сравнению с монотерапией препаратами оказывает более выраженное положительное воздействие на морфофункциональные характеристики на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов.

5. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов бедренной кости не влияет на морфофункциональные показатели эндотелиальной системы, не предотвращает ухудшения кровоснабжения костной ткани и костной мозоли, а также не обладает антиостеопоротическими свойствами, что негативно сказывается на результатах консолидации экспериментальных переломов бедра.

6. Тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг, клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг на модели остеопороза, вызванного двусторонней овариэктомией, оказывают выраженное эндотелиопротективное действие, предотвращают ухудшение кровоснабжения костной ткани бедра и обладают остеопротективным действием; на модели экспериментальных остеопоротических переломов указанные препараты увеличивают количество сращений костно-травматических повреждений.

Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Республика Татарстан, г. Казань, 2012); на VIII и IX съездах травматологов-ортопедов России «Травматология и ортопедия XXI века» (Самара, 2006; Саратов, 2010); на III и IV конференциях по остеопорозу с международным участием «Проблема остеопороза в травматологии и ортопедии» (Москва, 2006; 2009); на VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция - от молекулярных мишеней к органам и системным изменениям» (Ярославль, 2007); на VIII и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008, 2010); на региональной научно-практической конференции «Факультет последипломного образования: 20 лет на службе здравоохранения» (Курск, 2006); на 72-й научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН «Университетская наука: Взгляд в будущее» (Курск, 2007); на 74-й научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН «Университетская наука: теория, практика инновации (Курск, 2009); на межвузовской научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск, 2009); на межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск, 2009); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия»

(Курск, 2010); на третьей международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2010); на межрегиональной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 40-летию кафедры травматологии, ортопедии и ВПХ, «Современные технологии лечения и реабилитации повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы» (Курск, 2010); на заседаниях Курского регионального отделения ассоциации травматологов-ортопедов России (Курск, 2010, 2011, 2012).

Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр: фармакологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; терапии факультета последипломного образования; хирургии факультета последипломного образования; гистологии, цитологии и эмбриологии; анатомии человека; оперативной хирургии с топографической анатомией; биоорганической химии; инфекционных болезней и эпидемиологии; Научно-исследовательского института Экологической медицины при Курском государственном медицинском университете; кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования при Белгородском государственном национальном исследовательском университете.

Личный вклад автора.

Автору принадлежит ведущая роль в составлении плана и дизайна исследования, в постановке цели и поиске путей её достижения. Им проведен подробный анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнялись экспериментальные исследования на 905 самках белых крыс линии \Vistar с разделением их на группы: основные, сравнения и контрольные; выбраны критерии рандомизации. Диссертантом самостоятельно производился анализ и обобщение полученных результатов, составление графиков, таблиц и диаграмм, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия 80-90%.

Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы, в том числе 19 из них - в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации. Получено 2 патента РФ на полезные модели, 4 патента РФ на изобретения, а также 5 удостоверений о рационализаторских предложениях.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований экспериментального гипоэстрогенного остеопороза, результатов исследований экспериментальных переломов при

моделированном гипоэстрогенном остеопорозе и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 281 странице машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 112 рисунками. Библиографический список содержит 295 источников, из которых 119 отечественных и 176 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Моделирование генерализованного остеопороза. Опыты проводили на 905 самках белых крыс линии Wistar массой 250±50 г. Все манипуляции в эксперименте выполнялись под наркозом -внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Для моделирования системного остеопороза производилась операция - билатеральная овариэктомия (Stimpel М. et al., 1995). С целью подтверждения развития остепоротических нарушений и оценки эффективности исследуемых препаратов через восемь недель после овариэктомии (на 57 день) проводили гистоморфометрию костной ткани, при этом контрольной группой служили животные, которым выполнялась операция ложной овариэктомии.

2. Моделирование переломов бедренной кости с последующим остеосинтезом. Методика модели экспериментальных переломов бедренных костей у крыс с фиксацией спицами отрабатывалась на 160 животных и производилась двумя способами: открытым и закрытым. Животные были разделены на 8 групп по 20 крыс в каждой. Крысам 1 группы выполнялась открытая межвертельная остеотомия бедра без фиксации; во II группе животным производилась открытая межвертельная остеотомия бедра с остеосинтезом; III -закрытая межвертельная остеотомия бедра без фиксации; IV - закрытая межвертельная остеотомия бедра с остеосинтезом; V - открытая диафизарная остеотомия бедра без фиксации; VI - открытая остеотомия диафиза бедра с остеосинтезом; VII - закрытая остеотомия диафиза бедра без фиксации; VIII -закрытая остеотомия диафиза бедра с остеосинтезом.

Открытый метод. Выполнялся операционный доступ к проксимальному метафизу бедра. Затем с помощью стерильных бокорезов производилась межвертельная или диафизарная остеотомия бедренной кости (рис. 1) с последующим интрамедулдярным остеосинтезом спицей Киршнера диаметром i мм, который выполнялся под визуальным контролем (рис. 2). Операционная рана послойно ушивалась капроновыми нитями.

^ÉP . . б

1 исунок 1. Открытый способ Рисунок 2. Открытый способ

остеотомии бедра. интрамедулляриого остеосинтеза.

Закрытый метод. Животным без обнажения бедренной кости при помощи крампонов с надетыми на режущие поверхности силиконовыми трубками осуществлялось внешнее воздействие на бедренную кость в области проксимального метафиза или диафиза бедра, то есть моделировался перелом, а далее с помощью струбцины через зону остеотомии интрамедуллярно вводилась спица Киршнера диаметром 1 мм, которая прочно фиксировала поврежденную кость. Контроль правильности фиксации определялся по отсутствию патологической подвижности в области экспериментального перелома.

В дальнейшем в экспериметальных группах была применена закрытая модель перелома с последующим закрытым интрамедуллярным синтезом спицей.

3. Гистоморфометрическая оценка изменений, происходящих при генерализованном остеопорозе. Для подтверждения формирования генерализованного остеопороза и в комплексной оценке эффективности исследуемых препаратов проводили морфологическое исследование костной ткани проксимальных метафизов бедренной и плечевой костей, а также тел поясничных позвонков и межотломковой костной мозоли после моделирования перелома. Материал фиксировали в 10% растворе формалина с последующей проводкой, заливкой в парафин и окрашиванием гематоксилин-эозином (Г-Э). Производилась световая микроскопия полученных гистологических срезов при помощи микроскопа Leica СМЕ (увеличение хЮО: объектив хЮ, окуляр хЮ) с последующим фотографированием костных балок цифровым фотоаппаратом OlyMpus SP-350 с разрешением 3264x2448 пикселей путем сопоставления объектива фотокамеры и окуляра микроскопа. Гистоморфометрия костной ткани осуществлялась с помощью программы IMageJ версии 1.39, предварительно откалиброванной следующим образом. Использовалось то же оборудование, что и для получения фотографий костных трабекул. Фотографировали «линейку» длиной 1 мм на прозрачной подложке. Измеряли в программе IMageJ «линейку» в пикселях. Расстояние в 1425 пикселей соответствовало 1 мм. Линейкой в дальнейшем измеряли ширину костных трабекул и выражали в микрометрах.

4. Определение уровня микроцнркуляции в костной ткани, проведение функциональных сосудистых проб и расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции. Отработка методики определения микроциркуляции в тканях конечностей осуществлялась на 30 крысах. Сравнительные измерения микроциркуляции проводились в мышечной ткани, надкостнице, в костной ткани проксимального и дистального метафизов и диафизе бедренной кости. Также на 80 животных отрабатывалась методика определения микроциркуляции на поверхности межотломковой костной мозоли и внутри последней. При этом измерение данных параметров производилось через 3, 4, 5, 6 недель после моделированного межвертельного перелома бедра. Животное размещалось и фиксировалось на предложенном нами столике (рис. 3). Затем выполнялся оперативный доступ к проксимальному метафизу бедра. Для получения показателя микроциркуляции в костной ткани и межотломковой костной мозоли рассверливалось отверстие диаметром до 1,5 мм и глубиной 2,5-3 мм в проксимальном метафизе бедра. В него с целью стабилизации игольчатого

датчика, используемого для измерения микроциркуляции в кости, вводили предложенный нами стержень-кондуктор (рис. 4).

Для получения данных о состоянии микроциркуляции в кости использовали оборудование производства компании Віорас вузІеМз: полиграф МРЮО с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) ЬЭИЮОС и инвазивным игольчатым датчиком Т50144, который через канал стержня-кондуктора вводился непосредственно в ткань проксимального метафиза бедренной кости.

После измерения внутрикостного уровня микроциркуляции, не изменяя положения датчика, проводили сосудистые пробы - на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг (Ьаигееп .1.В., 1997) и эндотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991). В ответной реакции на системное введение растворов ацетилхолина и нитропруссида отмечалось снижение уровня микроциркуляции с последующей нормализацией показателей. Для объективной оценки развития нарушения функции эндотелия при развивающемся генерализованном остеопорозе, а также с целью контроля эффективности применения исследуемых препаратов на основе результатов измерения микроциркуляции в кости и проведения функциональных сосудистых проб рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД). Для этого определяли площади прямоугольных треугольников над кривыми восстановления показателей микроциркуляции после проведения реакций ЭЗВД и ЭНВД. При этом за меньший из катетов треугольника принимали абсолютную величину падения уровня микроциркуляции до минимального значения, за больший катет -время восстановления и стабилизации показателя микроциркуляции. Площади треугольников выражали в условных единицах (усл. ед.). КЭД рассчитывался по формуле (1) как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида (Бцп) к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина (8ЛХ): КЭД = Бнп / $дх • (О

Шшт

Рисунок 3. Общий вид стола для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных.

Рисунок 4. Общий вил

кашолированного

стержня-кондуктора.

5. Биохимические маркеры дисфункции сосудистого эндотелия. Для

количественного определения дисфункции эндотелия был применен модифицированный метод определения стабильных метаболитов оксида азота. Данная методика позволяет после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.А., 2004). В основе метода лежит реакция одновременного восстановления нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяется спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

6. Обоснование доз исследуемых препаратов и дизайн эксперимента. Для

изучения остеопротективного действия нами были выбраны препараты, эндотелиопротективное действие которых было доказано в ходе ранее проведенных исследований в лаборатории кардиофармакологии НИИ ЭМ КГМУ: эналаприл (Корокин М.В., Носов A.M., Покровский М.В. и др., 2006), клопидогрел (Цепелев В.Ю., 2009), лозартан, тетрагидробиоптерин (Корокин М.В., 2012), этоксидол (Стабровская Н.В., 2011), резвератрол (Кочкаров В.И., 2009), а также изучались свойства комбинаций препаратов, состоящих из резвератрола и эналаприла, развератрола и лозартана. В качестве лекарственного препарата сравнения был использован кальций Дз Никомед как наиболее распространенный, доступный и эффективный препарат на российском рынке для профилактики и коррекции остеопоротических нарушений костей скелета.

Ингибитор АПФ эналаприла малеат («Рениприл» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) животные получали ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в виде взвеси в 1% крахмальном клейстере в дозе 0,5 мг/кг. Блокатор ATI-рецепторов лозартан калия («Блоктран» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) так же, как и эналаприл, вводился однократно в сутки в дозе 6,0 мг/кг и клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг («Плавике» производства «Sanofi-Winthrop Industrie», Франция). Новое производное 3-оксипиридина - этоксидол крысам вводили инъекционно внутрибрюшинно ежедневно однократно в сутки в дозе 12,5 мг/кг. Тем же способом применялся представитель группы фитоалексинов резвератрол («Greensyn», GuangzHou Ltd.) в дозе 2 мг/кг и кофактор птерина - тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг (ВН4) (Sigma-Aldrich, USA). Также исследовались комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном в описанных ранее дозах и методах введения. Дозы этих веществ соответствуют сведениям из доступной литературы, и их эндотелиотропные свойства подтверждены ранее проведенными в нашей лаборатории экспериментами.

Расчет доз производился методом эквивалентного межвидового переноса доз по площади тела с использованием коэффициентов пересчета по Freireich et al., 1966 (2). Так, суточная терапевтическая доза препарата Кальций Дз составляет 1000 мг. Коэффициент пересчета для взрослого человека с массой тела 70 кг равен 39. Для крысы массой 200 г коэффициент пересчета равен 6,5. Таким образом, расчетная доза (RD) изучаемого препарата будет равняться:

RD = IOOO :70 .39 =85>7 (м,./к1. } в сутки. (2)

Все исследуемые препараты животным с моделированным остеопорозом вводились в течение восьми недель (57 дней). Животные, не подвергавшиеся лечению, получали по той же схеме 1% крахмальный клейстер. В группах крыс, которым через восемь недель после овариэктомии выполнялась поперечная остеотомия проксимального метафиза бедренной кости, продолжалась терапия данными препаратами еще четыре недели (28 дней).

В ходе эксперимента крысы содержались в виварии, в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24°С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.

Согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.2010 г., все животные были распределены по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Дизайн эксперимента представлен в таблицах 1,2.

7. Статистическая обработка результатов исследования. Стастисти-ческий анализ полученных данных осуществляли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±М). Оценка статистической значимости различий при межгрупповых сравнениях производилась по «двухвыборочному t-тесту с различными дисперсиями» Стьюдента для независимых групп. Различия считали статистически значимыми при значениях р<0,05. Наличие, степень и направление зависимости между различными параметрами внутри одной группы оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (г), а также посредством построения точечных диаграмм с проведением линий регрессии.

Ввиду невозможности применения критерия х2 (ожидаемые значения таблицы сопряженности 2x2 были менее пяти), для оценки достоверности различий между долями использовали двусторонний вариант точного критерия Фишера. Для статистических расчетов использовалась программа «Microsoft Excel 2003» при помощи средств пакета анализа.

Дизайн экспериментов по исследованию остеопротектнвпой активности препаратов при моделированном остеопорозе

Группы животных Количество крыс в группе Ход эксперимента

Ложнооперированные (Л-О) 42 Ложная билатеральная овариэктомия -» 1% крахмальный раствор ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель -» измерение микроциркуляции в кости, проведение функциональных сосудистых проб, взятие крови для биохимических исследований и костного биоматериала для гистоморфометрических исследований (бедро, плечо, тело поясничного позвонка)

Остеопороз (после овариэктомии) 30 Билатеральная овариэктомия -» 1% крахмальный раствор ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель -* измерение микроциркуляции в кости, проведение функциональных сосудистых проб, взятие крови для биохимических исследований и костного биоматериала для гистоморфометрических исследований (бедро, плечо, тело поясничного позвонка)

Остеопороз + кальций ДЗ 85,7 мгкг 25 Билатеральная овариэктомия -» введение препаратов ежедневно однократно в сутки в течение восьми недель -» измерение микроциркуляшш в кости, проведение функциональных сосудистых проб, взятие крови для биохимических исследовании и костного биоматериала для гистоморфометрических исследовании

Остеопороз + эналаприл 0,5 мг/кг 35

Остеопороз + лозартан 6 мг/кг 35

Остеопороз + клопидогрел 3,3 мг/кг 25

Остеопороз + этоксидол 12,5 мг/кг 28

Остеопороз + резвератрол 2 мг/кг 20

Остеопороз + тетрагидробпоптерин 10 мг/кг 25

Остеопороз + резвератрол 2 мг/кг + эналапрнл 0,5 мг/кг 20

Остеопороз + резвератрол 2 мг/кг + лозартан 6 мг/кг 20

Группа животных Количество крыс в группе Ход эксперимента

Ложнооперированные (Л-О) с моделью переломов 30 Ложная билатеральная овариэктомия -» 1% крахмальный раствор ежедневно однократно в сутки внугрижелудочно в течение восьми недель -» моделирование перелома бедра, остеосинтез перелома -» 1% крахмальный раствор ежедневно однократно в сутки внугрижелудочно в течение четырех недель -» измерение микроциркуляции в костной мозоли, взятие крови для биохимических исследований и костного биоматериала для гистоморфометрических исследований, рентгенологическое исследование бедренной кости

Остеопороз + перелом 30 Билатеральная овариэктомия -» 1% крахмальный раствор ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель -» моделирование перелома бедра, остеосинтез перелома -* 1% крахмальный раствор ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение четырех недель -» измерение микроциркуляции в костной мозоли, взятие крови для биохимических исследований и костного биоматериала для гистоморфометрических исследований, рентгенологическое исследование бедренной кости

Остеопороз+перелом+ кальций ДЗ 85,7 мг/кг 30 Билатеральная овариэктомия -» введение препарата/комбинации препаратов по описанным ранее схемам ежедневно однократно в сутки в течение восьми недель -» моделирование перелома бедра, остеосинтез перелома -» продолжение лечения препаратом или комбинациями препаратов в течение четырех недель -* измерение микроциркуляции в костной мозоли, взятие крови для биохимических исследований и костного биоматериала для гистоморфометрических исследований, рентгенологическое исследование бедренной кости

Остеопороз+ перелом + этоксидол 12,5 мг/кг 30

Остеопороз + перелом + эналаприл 0,5 мг/кг 30

Остеопороз + перелом + лозартан 6 мг/кг 30

Остеопороз + перелом + резвератрол 2 мг/кг 30

Остеопороз + перелом + резвератрол 2 мг/кг + эналаприл 0,5 мг/кг 30

Остеопороз + перелом + резвератрол 2 мг/кг + лозартан 6 мг/кг 30

Остеопороз+перелом + тетрагидробиоптерин 10 мг/кг 30

Остеопороз+перелом+клопидогрел 3,3 мг/кг 30

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОПОРОЗА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Комплексная оценка развития экспериментального генерализованного гипоэстрогенного остеопороза с использованием результатов гистоморфометрии, данных измерения микроциркуляции в кости, функциональных проб, биохимических показателей. Серия исследований проводилась на 305 самках белых крыс линии \Vistar. Моделировался генерализованный гипоэстрогенный остеопороз, изучались остеопротективные свойства различных веществ, обладающих эндотелио-протективными эффектами. Согласно дизайну эксперимента животные были разделены на 11 групп (табл. 1). Изучение микроциркуляции в костной ткани и гистологические исследования проводились совместно с О.С. Гудыревым (2009).

Гипоэстрогенно-индуцированные остеопоротические изменения в костях скелета были гистологически подтверждены у всех крыс через восемь недель после овариэктомии. При проведении микроскопии субъективно были отмечены патологические процессы в бедренной и плечевой костях, в телах поясничных позвонков у крыс с экспериментальным генерализованным остеопорозом. В губчатом веществе наблюдались истончение решетчатой сети трабекул и перфорация костных пластинок; сеть трабекул была местами частично прервана в результате исчезновения горизонтальных трабекул (рис. 5).

Рисунок 5. Морфологическая картина срезов костей скелета (окр. Г-Э, у в. 100). Примечание. 1, 2 - проксимальный метафиз бедра у Л-0 крысы и крысы с остеопорозом; 3, 4 - проксимальный метафиз плеча у Л-О крысы и крысы с остеопорозом; 5, 6 - тело поясничного позвонка у Л-О крысы и крысы с остеопорозом.

Кроме того, в отдельных гистологических препаратах отмечались микропереломы костных трабекул (рис. 6). О прижизненном возникновении микропереломов (в отличие от возможного повреждения препаратов во время забора биоматериала или изготовления гистологического препарата) судили по прорастанию соединительной ткани в месте перелома трабекулы.

Рисунок 6. Морфологическая картина проксимального метафиза бедренной кости у крысы с генерализованным остеопорозом (окр. Г-Э, ув. 400). Примечание. 1 - микроперелом костной трабекулы.

При программном анализе изображений гистологических препаратов измеряли ширину костных трабекул у каждого животного отдельно, а затем находили среднее значение ширины костных трабекул для каждой локализации в каждой группе. Объективным критерием развития генерализованного остеопороза через восемь недель после билатеральной овариэктомии стало достоверное уменьшение средней ширины костных трабекул во всех изучаемых локализациях (рис. 7).

1Л-0 Постеолороз

плечо

тело позвонка

Ьедро

Рисунок 7. Средняя ширина костных трабекул в различных локализациях у ложнооперированных крыс и животных с генерализованным остеопорозом. Примечание. * -р<0,05 по сравнению с группой Л-О животных.

Средняя ширина костных трабекул в проксимальном метафизе бедра у крыс с экспериментальным остеопорозом была равна 61,7± 1,2 мкм, что на 36,8% меньше, чем данный показатель у Л-О животных (97,7+1,0 мкм). Та же тенденция наблюдалась в проксимальном метафизе плеча: средняя ширина костных трабекул у Л-О животных (80,5±1,0 мкм) превышала таковую у крыс с остеопорозом (50,1 ±0,7 мкм) на 37,8%. Наиболее ярко патологические процессы были выражены в телах поясничных позвонков крыс с генерализованным остеопорозом. Это объясняется тем, что процессы костного ремоделирования более быстро протекают в губчатой кости, нежели в кортикальной, а тело

позвонка в большей степени состоит именно из спонгиозной костной ткани. Различие в средней ширине костных трабекул в данной локализации составило 43,7% (36,6±0,6 мкм у крыс с остеопорозом против 65,0±1,6 мкм у Л-О животных) (рис. 7).

Таким образом, после овариэктомии через восемь недель у самок крыс линии \Vistar развиваются явные признаки системных остеопоротических изменений костей скелета, характеризующиеся истончением костных трабекул, приводящим к уменьшению их механической прочности и, как следствие, возникновению микропереломов.

Биохимические исследования крови показали, что концентрация стабильных метаболитов оксида азота (Т^Ох) у животных с гипоэстрогенным остеопорозом составила 68,9±3,2 мкМоль/л, тогда как аналогичное значение у Л-О животных составило 116,5±4,9 мкМоль/л. Перед выведением крыс из эксперимента изучались особенности микроциркуляции в проксимальном метафизе правой бедренной кости у Л-О крыс и животных после овариэктомии. Результаты лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) в костной ткани крыс указанных групп позволили констатировать достоверно более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс с экспериментальным остеопорозом (61,5±3,7 ПЕ) по сравнению с Л-О животными (100,5±4,4 ПЕ).

При проведении функциональных сосудистых проб ответной реакцией на системное введение ацетилхолина и нитропруссида было снижение уровня микроциркуляции с последующей нормализацией показателей кровотока (рис. 8).

1 2

3 »W'i" 4 SmJ

Рисунок. 8. Динамика уровня микроциркуляции в костной ткани при проведении функциональных сосудистых проб.

Примечание. 1 - реакция ЭЗВД у Л-О крыс; 2 - реакция ЭНВД у Л-О крыс; 3 - реакция ЭЗВД у крыс после билатеральной овариэктомии; 4 - реакция ЭНВД у крыс после билатеральной овариэктомии.

Уменьшение уровня микроциркуляции при проведении пробы эндотелийзависимой вазодилатации в группе Л-О животных в среднем составило 55,8±11,4 ПЕ (46,7%) от исходных показателей, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом - 28,9±3,9 ПЕ (38,9%). Восстановление исходных значений происходило в среднем за 22,2±3,8 и 17,2±3,3 секунды соответственно.

При проведении пробы эндотелийнезависимой вазодилатации уровень микроциркуляции в Л-0 крыс снизился в среднем на 36,1±8,7 ПЕ или 29% от исходного значения, в группе животных с генерализованным остеопорозом данные показатели составили 21,2±4,6 ПЕ (27,3%). Последующая нормализация показателей микроциркуляции происходила в среднем за 40,3±4,6 и 47,7±4,0 секунд соответственно.

Используя формулу (1), вычисляли значения коэффициента эндотелиальной дисфункции для микроциркуляторного звена проксимального метафиза бедренной кости у крыс. В группе Л-О животных получили КЭД=Т,3±0,2, в группе крыс с экспериментальным генерализованным остеопорозом КЭД=2,4±0,2.

Из этого следует, что у самок крыс линии Wistar через восемь недель после овариэктомии развиваются изменения, свидетельствующие о дисфункции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, являющейся частным проявлением системной эндотелиальной дисфункции (Гудырев О.С., 2009; Корокин М.В., 2012).

Изучая индивидуальные показатели микроциркуляции и средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости в обеих группах животных, обратили внимание на наличие определенной зависимости между двумя указанными параметрами. Для подтверждения наличия таковой зависимости рассчитали коэффициент корреляции Пирсона (г) между уровнем микроциркуляции и средней шириной костных трабекул в обеих группах. Кроме того, для сравнения парных значений в группах построили точечные диаграммы зависимости ширины костных трабекул от уровня регионарной микроциркуляции и провели на диаграммах линии регрессии (рис. 9).

Рисунок 9. Диаграммы зависимости ширины костных трабекул от значений регионарной микроциркуляции.

Примечание. I - в группе Л-О крыс; 2 - в группе крыс с остеопорозом.

Получили следующие значения: в группе Л-О животных г=0,67, в группе крыс с остеопорозом г=0,60. Эти значения коэффициента Пирсона свидетельствуют о наличии достаточно тесной прямой зависимости между уровнем микроциркуляции и средней шириной костных трабекул в проксимальном метафизе бедра у крыс в обеих группах.

Таким образом, через восемь недель после проведения билатеральной овариэктомии у самок белых крыс линии \Vistar развивается системная эндотелиальная дисфункция, частным проявлением которой является нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани.

Доказательством этого является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам проведения ЛДФ в костной ткани при проведении функциональных сосудистых проб, и снижение концентрации стабильных метаболитов оксида азота в крови. Формирование дисфункции эндотелия проявляется в значительном ухудшении регионарного кровотока в костной ткани, приводящем к дисбалансу процессов костного ремоделирования. В конечном счете, это ведет к развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных балок и возникновением в них микропереломов. Подтверждением данному положению служит наличие прямой тесной зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости и шириной костных трабекул в этой локализации у крыс.

Следовательно, из всего вышеизложенного можно сделать заключение о значительной роли нарушения функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани в развитии генерализованного остеопороза. Таким образом, исследование остеопротективного действия препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью и их комбинаций является патогенетически обоснованным.

2. Комплексная оценка остеопротективных эффектов ингибитора АПФ эналаприла, блокатора АТ1-рецепторов лозартана, фитоалексина резвератрола и их комбинаций при экспериментальном генерализованном остеопорозе. По результатам лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) было выявлено, что эналаприл, лозартан и резвератрол в качестве монотерапии эффективно предотвращали снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани проксимального отдела бедра, сохраняя значения микроциркуляции на уровне Л-О крыс. Было обнаружено, что комбинированная фармакотерапия резвератролом с эналаприлом и лозартаном полностью предотвращала нарушение микроциркуляции в костной ткани, более того, уровень микроциркуляции при использовании лозартана превышал показатели Л-О животных, а также показатели в группах животных, получавших лечение резвератролом, эналаприлом в качестве монотерапии (рис. 10).

■л-о

пОстеопороз ЕОП+Эналаприл НОП+Лозартан ЕЭ ОП+Резвератрол 0ОП+Резвератрол +Энзлалрмл □ ОП+Резвератрол +Лозартан

Рисунок 10. Влияние эналаприла, лозартана, резвератрола на показатели микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс. Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-О животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорочом.

Сравнительная оценка результатов функциональных проб показала, что резвератрол, эналаприл и лозартан в качестве монотерапии, а также комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном приводили пропорции между площадями треугольников над кривыми восстановления уровня микроциркуляции в кости в ответ на внутривенное болюсное введение нитропруссида и ацетилхолина к таковым у Л-О животных. Данные препараты и их комбинации статистически значимо снижали коэффициент эндотелиальной дисфункции. Было выявлено, что эналаприл, лозартан и резвератрол в качестве монотерапии статистически значимо снижали КЭД до значений 1,6±0,1, 1,5±0,2 и 1,3±0,2 соответственно (рис. 11).

Как и в случае измерения уровня микроциркуляции в костной ткани, значения КЭД у крыс, получавших эналаприл, лозартан и резвератрол, достоверно не отличались от таковых в группе Л-О животных (р>0,1) и не различались между собой. Также было установлено, что комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном, так же как и резвератрол, эналаприл и лозартан в качестве монотерапии, статистически значимо снижали КЭД до значений 1,2±0,1 и 1,1±0,1.

КЭД

и [1-І".

оОртеопрроз Е ОП Эчалагрил

иооЛозартан □ ОП+Реэверэтрог йОП+Реэвератрог +Энэлапри1 ЕЭОГКРеэеерэтрог *-Лозарта-|

Рисунок II. Влияние эналаприла, лозаргана и резвератрола, а также комбинированного применения резвератрола с эналаприлом и лозартаном на коэффициент эндотелиальной дисфункции по данным лазерной допплеровской флоуметрии в костной ткани проксимального метафиза бедра.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой ** - р<0,05 но сравнению с группой крыс с остеопорозом.

Л-О

животных.

При биохимическом анализе было выявлено, что концентрация 1МОх в крови экспериментальных животных, получавших в качестве монотерапии эналаприл и лозартан, составила 67,3±2,9 мкМоль/л и 65,8±4,0 мкМоль/л соответственно. Полученные значения практически не отличаются от показателей у крыс с остеопорозом без лечения (68,9±3,2 мкМоль/л). Резвератрол и комбинации резвератрола с эналаприлом и резвератрола с лозартаном достоверно значительно повышают соответствующие показатели (95,3±3,8; 101,2±3,7; 107,4±2,6 мкМоль/л соответственно). Уровень 1МОх у ложнооперированных крыс равен 100,5±4,4 мкМоль/л.

Эти данные дают возможность предположить, что важную роль в поддержании адекватного кровоснабжения костной ткани играет сохранение

функции эндотелия сосудов, питающих кость, а также удержание уровня микроциркуляции в кости на значениях, близких к значениям у Л-О животных, способствует поддержанию нормального протекания процессов костного ремоделирования и препятствует развитию остеопороза.

Предложенная гипотеза подтверждается результатами

гистоморфометрического исследования костей скелета у крыс, получавших в течение восьми недель после овариэктомии исследуемые препараты и их комбинации. При световой микроскопии срезов костей скелета у крыс, получавших лечение указанными препаратами, обнаружили отсутствие микропереломов трабекул, сохранение структуры костной ткани и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом, не получавших лечения, во всех исследуемых локализациях (рис. 12).

При гистоморфометрии костной ткани срезов костей скелета у крыс выявили, что эналаприл, лозартан, резвератрол и их комбинации эффективно препятствовали снижению средней ширины костных трабекул в исследуемых локализациях (рис. 13, 14, 15).

1 2 3

Рисунок 12. Морфологическая картина срезов проксимального метафиза бедренной кости (окр. Г-Э, ув. 100).

Примечание. 1 - у крысы после овариэктомии, получавшей лечение эналаприлом; 2 — у крысы после овариэктомии, получавшей лечение лозартаном; 3 - у крысы после овариэктомии, получавшей резвератрол; 4 — у крысы после овариэктомии, получавшей комбинацию резвератрола с эналаприлом; 5 - у крысы после овариэктомии, получавшей комбинацию резвератрола с лозартаном.

Данные лекарственные средства и их комбинированное применение статистически значимо увеличивали среднюю ширину костных трабекул во всех изучаемых локализациях. Эналаприл повышал ширину трабекул в среднем на

22%, лозартан - на 45%, резвератрол - на 51%, комбинация резвератрола с эналаприлом - на 61% и комбинация резвератрола с лозартаном - на 57% по сравнению с крысами, страдающими остеопорозом.

Рисунок 13. Сравнительная оценка эффективности влияния эналаприла, лозартана, резвератрола и их комбинаций на значение средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с г руппой Л-О; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

Рисунок 14. Сравнительная оценка эффективности влияния эналаприла, лозартана, резвератрола на значение средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе плечевой кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-О животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

■ Л-О

□ Остеопороз ООГИ Эналаприл а ОГН Лозартан о ОП+Резвератрол

□ ОП+Резвератрол Оналаприл

мкм аоП+Резвератрол »-Лсэарган

Рисунок 15. Сравнительная оценка эффективности влияния эналаприла, лозартана, резвератрола на значение средней ширины костных трабекул в телах поясничных позвонков.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-О животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальных мегафизах бедренной и плечевой костей и в телах поясничных позвонков у крыс, получавших исследуемые препараты, статистически значимо отличались от значений как у животных с остеопорозом, так и у Л-О крыс. Большей эффективностью обладали и резвератрол и комбинированная терапия резвератролом с зналаприлом и лозартаном.

Таким образом, эналаприл, лозартан и резвератрол в качестве монотерапии и при комбинированном применении этих препаратов через восемь недель после билатеральной овариэктомии обладают выраженным эндотелиопротективным действием, сопровождающимися снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции, по данным лазерной допплеровской флоуметрии до уровня ложнооперирванных животных. Также резвератрол и его комбинации с эналаприлом и лозартаном увеличивают показатели стабильных метаболитов оксида азота в крови. Все это ведет к эффективному предупреждению ухудшения регионарного кровотока в костной ткани и позволяет частично компенсировать нарушения процессов костного ремоделирования при развивающемся генерализованном остеопорозе, свидетельством чего явилось замедление истончения костных трабекул в губчатой костной ткани, сохранение микроархитектоники и предотвращение возникновения микропереломов трабекул. Более выраженным эффектом обладал резвератрол и его комбинации с эналаприлом и лозартаном.

3. Комплексная оценка остеопротективных действий этоксидола, клопидогреля, тетрагидробиоптерина и кальций ДЗ при экспериментальном гипоэстрогенном остеопорозе. Было обнаружено, что клопидогрел и тетрагидробиоптерин статистически значимо предупреждали снижение уровня микроциркуляции в костной ткани верхнего отдела бедра (89,2±4,5 и 87,6±3,8 ПЕ, соответственно) до показателей у крыс с остеопорозом без лечения. Этоксидол и препарат сравнения кальций ДЗ не предотвращали ухудшения регионарного кровотока в костной ткани бедра через восемь недель после билатеральной овариэктомии. Уровень микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра составил у этоксидола 65,5±3,4 ПЕ, а у кальция ДЗ 61,5±3,9 ПЕ (рис. 16).

Рисунок 16. Влияние клопидогреля, тетрагидробиоптерина, этоксидола и кальция ДЗ па показатели микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс. Примечание. * - р<0,05 но сравнению с группой Л-О животных; ** р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

Выявлено, что тетрагидробиоптерин и клопидогрел оказывали позитивное влияние на величину коэффициента эндотелиальной дисфункции, который составил в первом случае 1,6±0,2, во втором - 1,5±0,2. Этоксидол и кальций ДЗ статистически значимого воздействия на данный показатель не оказывали. КЭД у этоксидола составил 2,1 ±0,2, а у кальция ДЗ - 2,2±0,1 (рис. 17).

Концентрация 1МОх в крови экспериметальных животных, которым проводилось лечение тетрагидробиоптерином, клопидогрелем и этоксидолом, составила 80,5±3,3 мкМоль/л, 77,2±4,1 мкМоль/л и 74,4±4,2 мкМоль/л соответственно. Полученные значения были несколько выше, чем показатели у крыс с остеопорозом без лечения (68,9±3,2 мкМоль/л). Кальций ДЗ статистически значимого влияния на данный параметр не оказывал (66,1±2,5 мкМоль/л).

■ л-о

аОстеопороз ВОП+Кальций ДЗ

□ ОП+Этоксидол 0 Тетрагидробиоптерин

□ Клопидогрел

Рисунок 17. Влияние клопидогреля, тетрагидробиоптерина, этоксидола и кальция ДЗна коэффициент эндотелиальной дисфункции по данным лазерной допплеровской флоуметрии в костной ткани проксимального метафиза бедра.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-О животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с остеопорозом.

При микроскопии срезов проксимального отдела бедренных костей крыс, получавших терапию этоксидолом, обнаружили сохранение тех же структурных изменений, что и в группе животных с остеопорозом, ширина костных трабекул в спонгиозной ткани проксимального отдела бедра составила 64,7±2,0 мкм. У кальция ДЗ, тетрагидробиоптерина и клопидогреля обнаружили отсутствие микропереломов трабекул и сохранение структуры костной ткани в проксимальном отделе бедра (рис.18).

Установили, что кальций ДЗ, тетрагидробиоптерин и клопидогрел препятствовали снижению показателей средней ширины костных трабекул до уровня животных с экспериментальным остеопорозом в исследуемых локализациях. Однако данные параметры не приближались к значениям Л-О крыс и составили - 70,5±1,0 мкм, 80,6±0,8 мкм и 71,7±1,1 мкм, соотвественно (рис. 19).

Таким образом, тетрагидробиоптерин и клопидогрел в ранее указанных дозах, через восемь недель после билатеральной овариэктомии обладают эндотелиопротективными действиями, что позитивно сказывается на кровоснабжение костной ткани.

Рисунок 18. Морфологическая картина срезов проксимального метафиза бедренной кости (окр. гематоксилин-эозином, ув. 100).

Примечание. 1 - у крысы после овариэктомии, получавшией лечение этоксидолом; 2-у крысы после овариэктомии, получавшией лечение кальцием ДЗ; 3 - у крысы после овариэктомии, получавшей лечение тетрагидробиоптерином; 4-у крысы после овариэктомии, получавшей лечение клопидогрелем.

■ Л-0

□ Остеопороз

■ ОП+Кальции ДЗ

□ ОП+Этоксидол

¡2 Тетрагидробиоптерин ЕКлопидогрел

Рисунок 19. Влияние клопидогреля, тетрагидробиоптерина, этоксидола и кальция ДЗ на значения средней ширины костных трабекул через восемь недель после овариэктомии в проксимальном метафизе бедренной кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-0 животных; ** -р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

Этоксидол, хотя и обладает эндотелио- и кардиопротективными свойствами (Стабровская Н.В., 2011), через восемь недель после билатеральной овариэктомии у крыс не улучшает значение регионарной микроциркуляции в проксимальном отделе бедра и не оказывает остеопротективный эффект. Препарат сравнения кальций ДЗ не обладает эндотелиопротективными эффектами, но ежедневное введение экспериментальным животным этого препарата позволило в слабой

степени замедлить истончение костных трабекул благодаря повышению концентрации кальция в организме экспериментальных животных.

4. Интегральный векторный анализ эффективности фармакотерапии экспериментального остеопороза эналаприлом, лозартаном, этоксидолом, тетрагидробиоптерином, клопидогрелем, кальцием ДЗ, резвератролом и комбинациями резвератрола с эналаприлом и лозартаном. Интегральный векторный анализ микроциркуляторных, функциональных, биохимических и морфологических показателей позволил провести комплексную визуальную характеристику остеопротективных свойств эналаприла, лозартана, этоксидола, тетрагидробиоптерина, клопидогреля, резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном с использованием нескольких основных параметров. Значение каждого показателя представлено в виде вектора, каждый из которых соответствовал определенному параметру. Векторы были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат, полюсом для всех них было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат. Длина вектора равнялась относительной величине каждого из четырех показателей комплексного исследования в изучаемых группах. Каждый вектор имел жесткую направленность: 1-й вектор - уровень микроциркуляции в проксимальной метафизарной части бедра (МБ) совпадал с осью Оу. Другие векторы располагались по часовой стрелке, при этом угол между ними составлял 90°. Следующими векторами обозначены показатели: коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), средняя ширина костных трабекул в проксимальном метафизе бедра (ТБ), концентрация стабильных метаболитов оксида азота (ЫОх).

Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы Л-О животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

Различия при проведении исследований между изучаемыми группами животных отражаются площадью диаграмм, образованных соединением конечных точек векторов указанных ранее параметров. При сравнении площади векторных диаграмм выявлены существенные различия между группой Л-О животных и группой крыс с моделированным остеопорозом (рис. 20).

Эналаприл, лозартан, резвератрол и их комбинации, а также тетрагидробиоптерин, клопидогрел, так или иначе, усиливают интегральную остеопротективную активность при развивающихся остеопоротических нарушениях, что выражается в приближении значения площади диаграммы к значению Л-О животных. У этоксидола и кальция ДЗ интегральная активность была практически не обнаружена, так как значения площади диаграмм у животных, получавших данные препараты, приближались к площади диаграмм у крыс с остеопорозом без леченеия (рис. 21).

Л-0 (5=20000)

Остеопороз (3=59377)

КЭД

Рисунок 20. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей группы Л-О животных и крыс после овариэктомии. Примечание. Слева - Л-0 крысы; справа - животные с моделированным остеопорозом; МБ -уровень микроциркуляции в проксимальной метафизарной части бедра; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ — средняя ширина костных трабекул в проксимальном метафизе бедра; ЫОх — концентрация стабильных метаболитов оксида азота.

Интактные

Кальций ДЗ

Клопидогрел

Тетрагидробиоптерин

Резвератрол+Лозартан

Остеопороз

Эналаприл

Лозартан

Резвератрол

Резвератрол+Эналаприл Этоксидол

— МБ—КЭД—ТБ—К10х

Рисунок 21. Визуальное отображение результатов интегрального векторного анализа результатов изучения эндотелио- и остеопротективной активности исследованных препаратов.

На основании интегрального векторного анализа исследованные препараты и комбинации препаратов расположились в следующей последовательности (в порядке увеличения эффективности, в скобках указаны площади лепестковых диаграмм в усл. ед.): Кальций ДЗ (54513) - Этоксидол (52066) - Эналаприл (36182) - Клопидогрел (35764) - Тетрагидробиоптерин (34439) - Лозартан (31155) - Резвератрол (26361) - Резвератрол+Эналаприл (20045) -Резвератрол+Лозартан.

Из вышесказанного можно сделать заключение, что комбинации резвератрола в дозе 2 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии у крыс имеют более выраженные остеопротективные эффекты, чем при использовании монотерапии резвератролом в дозе 2 мг/кг, эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, лозартаном в дозе 6 мг/кг, тетрагидробиоптерином в дозе 10 мг/кг, клопидогрелем в дозе 3,3 мг/кг. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг на основании векторного анализа практически не обладает активностью на выбранной модели патологии. Кальций ДЗ Никомед в дозе 85,7 мг/кг не влиет на уровень микроциркуляции в костной ткани, но в слабой степени задерживает истончение костных трабекул.

Основываясь на положении о том, что резвератрол, эналаприл, лозартан и их комбинации, а также тетрагидробиоптерин, клопидогрел благотворно влияют на процессы костного ремоделирования, в дальнейших исследованиях нами изучено влияние данных препаратов на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов в сравнении с препаратом Кальций ДЗ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ПЕРЕЛОМОВ НА ФОНЕ МОДЕЛИРОВАННОГО ГИПОЭСТРОГЕННОГО ОСТЕОПОРОЗА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Комплексная оценка консолидации экспериментальных переломов на фоне моделированного гипоэстрогенного остеопороза. В этой серии исследований опыты проводили на 330 белых крыс линии \Vistar (табл. 2). Согласно дизайну эксперимента на 85 сутки (через 12 недель) после начала исследования оперативным способом визуально оценивали качество консолидации перелома, измеряли уровень микроциркуляции в межотломковой зоне в случае несращения перелома, а в случае сращения - в костной мозоли. По выведению животных из эксперимента проводилась рентгенография конечностей с последующей оценкой признаков консолидации переломов, выполнялось гистологическое исследование зоны моделированного перелома бедренной кости. Изучения остеопоротических нарушений при экспериментальных переломах проводились совместно с Гудыревым О.С. (2009).

При выполнении лазерной допплеровской флоуметрии в группах крыс с экспериментальными переломами было обнаружено, что при сращении переломов на фоне генерализованного остеопороза средний уровень микроциркуляции в межотломковой зоне был на 25% достоверно ниже, чем у крыс без остеопороза. Уровень микроциркуляции в межотломковой костной мозоли у Л-О животных в среднем был равен 87,6±6,3 ПЕ, а у крыс после овариэктомии он составил 69,7±5,9 ПЕ.

Биохимические исследования выявили, что концентрация стабильных метаболитов оксида азота у животных с остеопоротическими переломами бедер составила 71,3±3,6 мкМоль, а у крыс с переломами бедер данный показатель был равен 117,3±5,1 мкМоль.

При макроскопическом изучении зоны перелома проксимального метафиза правой бедренной кости было выявлено, что у большинства животных в группах Л-О с переломами и крыс с экспериментальным остеопорозом через четыре

недели после моделирования перелома наблюдались признаки формирования костной мозоли (рис. 22).

Рисунок 22. Результаты консолидации экспериментальных переломов проксимального метафиза бедра через четыре недели после моделирования.

Также встречались случаи неудовлетворительных результатов консолидации переломов. В группе крыс после остеотомии бедра без остеопороза в шести случаях из 30 наблюдалось несращение перелома с развитием тугого ложного сустава. Причиной формирования ложного сустава является то обстоятельство, что у крыс диаметр просвета костномозгового канала бедра незначительно превышал диаметр спицы, фиксирующей перелом, то есть более 1 мм. Это допускало наличие подвижности спицы по оси бедренной кости и, соответственно, костных отломков относительно друг друга, что и явилось причиной несращения переломов, тем не менее опороспособность правой нижней конечности у всех этих животных была сохранена в полном объеме. В группе крыс с остеопоротическими переломами бедра число неудовлетворительных результатов было вдвое больше (12 против 6 из 30). У этих животных отмечались значительная подвижность интрамедуллярно введенной спицы и отсутствие признаков костного сращения в зоне перелома: фиксирующая спица свободно перемещалась по костномозговому каналу бедренной кости, приводя к нестабильности в зоне перелома, а в некоторых случаях даже мигрировала за пределы линии перелома. Прижизненно у половины, т.е. у шести крыс, это обстоятельство проявлялось в нарушении опороспособносги конечности. Подобное явление можно объяснить тем, что наряду с генерализованным остеопорозом в результате билатеральной овариэктомии на «качество» бедренной кости также влиял металлический имплантат, который увеличивает скорость резорбции костной ткани и тем самым ускоряет процессы развития остеопоротических изменений костных структур в непосредственной близости от места введения спицы (рис. 22).

Рентгенография бедренных костей с моделированными переломами у крыс обеих групп проводилась после выведения животных из эксперимента. При изучении рентгенограмм оценивали качественные и количественные критерии консолидации переломов.

Перелсм бедра

14; 80«

Свтеопоротичеалй перелсм бедзэ 18; 60«

6; 10%

12; 40%

□ Сражение перелзма И НзсЕзщение гереломз

Во всех случаях удовлетворительных результатов консолидации переломов отмечали рентгенологические признаки сращения - отсутствие диастаза между костными отломками, сохранение оси бедренной кости, формирование костной мозоли. При несращении переломов у крыс с остеопорозом на рентгенограммах бедренных костей наблюдали деформацию сегмента конечности, угловые и ротационные смещения отломков относительно друг друга, наличие диастаза между костными фрагментами, отсутствие признаков формирования костной

Рисунок 23. Примеры рентгенограмм бедренных костей крыс через четыре недели после моделирования и остеосинтеза перелома.

Примечание. Слева - консолидация перелома у крысы без остеопороза; справа - несращение перелома, миграция спицы у животного из группы с переломами бедра на фоне остеопороза.

Морфологическое исследование полученных образцов зоны перелома правой бедренной кости производилось по ранее описанной схеме (рис. 24).

2 ^ЙШШЗ!

.../V: чШшЕ^ЧнЛнБ

Рисунок 24. Микроскопия межогломковой костной мозоли у крыс: 1 - зона экспериментального перелома бедра. Завершение дифференцировки инкорпорированных в остеоиде остеобластов в остеоциты. Соединительнотканая капсула вокруг отломка пластинчатой костной ткани и пролиферирующие осгеогенные клетки и остеобласты на поверхности формирующейся костной балки (ув. 400); 2 - продольный срез через центральную зону экспериментального перелома у Л-О крысы. Костная мозоль, состоящая из грубоволокнистой костной ткани; 3 — зона экспериментального перелома у крысы с генерализованным остеопорозом. Видимое истончение костных трабекул. Врастание волокнистой соединительной ткани в межтрабекулярное пространство. В соединительной ткани - кровеносные сосуды различного диаметра (окраска гематоксилин-эозином. Ув. 200). Примечание. 1 - зона перелома.

О качестве консолидации экспериментальных переломов судили по степени развития грубоволокнистой костной ткани и ширине костных трабекул в области

консолидации перелома. При моделировании переломов в проксимальных отделах правых бедренных костей на фоне гипоэстрогенного остеопороза признаки последнего были гистологически подтверждены у всех исследуемых крыс после овариэктомии. В губчатом веществе наблюдалось истончение трабекул и перфорация костных пластинок. Объективным критерием оценки развития остеопоротических нарушений в зоне экспериментальных переломов являлось достоверное уменьшение средней ширины трабекул губчатой костной ткани. Так, средняя ширина костных трабекул в зоне перелома у животных после овариэктомии составила 59,02±1,7 мкм, а у крыс без остеопороза - 92,93±1,67 мкм, что на 36% меньше, чем у крыс без остеопороза.

Таким образом, полученные данные наглядно показывают, что сращение экспериментальных переломов проксимального метафиза бедренной кости на фоне моделированного остеопороза у самок крыс линии Wistar через двенадцать недель после билатеральной овариэктомии протекает на фоне значительного снижения кровоснабжения зоны перелома (по сравнению с переломами у животных без остеопороза). Это, несомненно, негативно отражается на консолидации переломов, приводя к двойному увеличению числа неудовлетворительных исходов.

2. Оценка эффективности воздействия фитоалексина резвератрола, ингибитора АПФ эналаприла, блокатора ATI-рецепторов лозартана и их комбинаций на качество консолидации экспериментальных переломов на фоне моделированного остеопороза. Согласно протоколу исследований, в пяти группах крыс (по 30 животных в каждой группе) после билатеральной овариэктомии проводилась фармакотерапия эналаприлом, лозартаном и резвератролом, а также изучалось сочетанное использование фитоалексина резвератрола с ингибитором АПФ эналаприлом и резвератрола с блокатором АТ1-рецепторов лозартаном в течение восьми недель. В те же сроки, что и в группе животных с остеопорозом, моделировали переломы проксимального метафиза правой бедренной кости с последующей фиксацией повреждений интрамедуллярным остеосинтезом спицей Киршнера. Изучаемые препараты вводились в тех же дозах в течение еще четырех недель. В дальнейшем производились те же исследовательские мероприятия, что и в предыдущих группах животных.

При выполнении ЛДФ в межотломковой зоне проксимального отдела бедренной кости было выявлено, что в группе крыс с остеопорозом, получавших лечение эналаприлом, лозартаном и резвератролом, средний уровень микроциркуляции повышался у животных, которым вводили эналаприл, - на 46%, лозартан - на 74%, резвератрол - на 41% по сравнению с группой крыс, не получавших лечение. Комбинация резвератрола с эналаприлом увеличивала данный параметр на 50,6%, а комбинации резвератрола с лозартаном на 60,4% (рис. 25).

■ Л-О+переломы

120

100

ПЕ «О

□ ОП переломы+Лозартан

60

40

20

□ ОП переломы+Резвератрол +Эналаприл

О

ИОП переломы+Резвератрол +Лозартан

Рисунок 25. Влияние эналаприла, лозаргана, резвератрола и их комбинаций на показатели микроциркуляции в межотломковой зоне проксимального метафиза бедра через четыре недели после перелома.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой животных с переломом бедренной кости; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с остеопоротическим переломом бедренной кости.

При этом у животных, которым вводился эналаприл, отмечается достоверное превышение среднего уровня микроциркуляции над аналогичным параметром у животных с переломами бедра без остеопороза (р=0,008). Среднее значение микроциркуляции в зоне перелома у крыс, получавших лозартан, было достоверно выше такового у крыс с переломами бедра без остеопороза (р=0,0001). Результаты, полученные в группе крыс при применении резвератрола, в сравнении с группами животных с переломами без остеопороза и животных с экспериментальными остеопоротическим и переломами достоверно различались.

Показатели микроциркуляции в межотломковой костной мозоли свидетельствуют о том, что комбинации резвератрола с эналаприлом и резвератрола с лозартаном не только эффективно предупреждают снижение регионарного кровотока в этой области, но и сращение поврежденной костной ткани протекает при значительном повышении кровоснабжения.

Изучаемые препараты и их комбинированное введение приближают конценрацию стабильных метаболитов оксида азота в крови до значений у животных с перломами без остеопороза (117,3±5,1 мкМоль/л). Так, МОх у крыс, которым вводился резвератрол, составил 94,3±4,2 мкМоль/л, комбинация резвератрола с эналаприлом - 103,5±4,4 мкМоль/л, комбинация резвератрола с лозартаном - 108,6±2,9 мкМоль/л.

При визуальном осмотре с последующей рентгенографией зоны остеопоротических переломов обнаружено, что через четыре недели после остеотомии лишь один неудовлетворительный результат - несращение перелома с развитием тугого ложного сустава из 30 крыс, получавших эналаприл. В других группах крыс, которым весь период проводилось лечение лозартаном и резвератролом и комбинацией резвератрола с эналаприлом и лозартаном, консолидация переломов отмечалась в 100% случаев (рис. 26, 27).

Рисунок 26. Примеры рентгенограмм бедренных костей крыс, получавших резвератрол и комбинацию резвератрола с эналаприлом, через четыре недели после моделирования и остеосинтеза перелома.

Примечание. 1 - консолидация многофрагментарного перелома проксимального отдела бедра у крысы в боковой проекции, получавших резвератрол; 2 - сращение перелома у этого же животного в прямой проекции; 3 - рентгенограмма бедра крысы с остеопорозом через четыре недели после моделирования и остеосинтеза перелома, получавшей комбинацию резвератрола с эналаприлом, фиксатор прошел мимо проксимального фрагмента кости.

яЛ-О+переломы

10 " ........

0ОП переломы+резвератрол +Лозартан

Рисунок 27. Влияние эналаприла, лозартана, резвератрола на частоту сращения экспериментальных остеопоротических переломов по данным визуального осмотра и рентгенографии поврежденных конечностей крыс.

Качество консолидации экспериментальных межвертельных переломов бедренных костей у крыс на фоне моделированных гипоэстрогенных остеопоротических нарушений было подтверждено морфометрическими измерениями ширины костных трабекул в межотломковой мозоли (рис. 28).

Надо отметить достоверные увеличения параметров средней ширины трабекул у крыс, которым проводилось лечение указанными препаратами, почти до значений животных с переломами без остеопороза. Показатели ширины костных трабекул в межотломковой костной мозоли были достоверно значительно выше, чем у крыс с моделированными остеопоротическими переломами, не получавших лечение (рис. 29).

1 2 З

Рисунок 28. Трабекулы проксимального метафиза бедра у крысы с экспериментальным переломом у крысы с гипоэстрогенным остеопорозом (Окраска гематоксилин-эозином. У в. 200):

Примечание. 1 - получавшей терапию эналаприлом; 2 - получавшей терапию лозартаном; 3 - получавшей терапию резвератролом; 4 - получавшей терапию комбинацией резвератрола с эналаприлом; 5 - получавшей терапию комбинацией резвератрола и лозартана.

ШЛ-О+переломы

□ Остеопороз+переломы

□ ОП переломы+Эналаприл

0ОП переломы+Лозартан

□ ОП переломы+Резвератрол

□ ОП переломы+Резвератрол +Эналаприл

0ОП переломы+Резвератрол +Лозартан

Рисунок 29. Сравнительная оценка влияния эналаприла, лозартана, резвератрола на значение средней ширины костных трабекул в межотломковой мозоли проксимального метафиза бедренной кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-0 животных с переломами; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

Так, средняя ширина трабекул в спонгиозной ткани проксимального отдела бедренной кости на фоне остеопороза, которым проводилось лечение эналаприлом, на 30% больше, чем у животных без лечения, лозартаном - на 37%, резвератролом - на 68%. Сочетанное лечение резвератролом с эналаприлом и лозартаном увеличивает данный параметр на 53% и 56% соответственно.

Таким образом, резвератрол, эналаприл, лозартан, а также сочетания этих веществ - статистически значимо улучшают кровоснабжение в

микроциркуляторном русле зоны повреждения кости, тем самым увеличивают среднюю ширину костных трабекул в зоне экспериментальных повреждений на фоне гипоэстрогенного остеопороза, что позитивно влияет на процессы консолидации переломов.

3. Оценка эффективности фармакотерапии экспериментальных остеопоротических переломов проксимальных метафизов бедренных костей этоксидолом, тетрагидробиоптерином, клопидогрелем п кальцием Дз. В соответствии с дизайном эксперимента в четырех группах (по 30 самок крыс в каждой) после моделирования гипоэстрогенного остеопороза и экспериментального перелома бедренной кости в течение двенадцати недель проводилась терапия остеопоротических нарушений этоксидолом, тетрагидробиоптерином, клопидогрелем и кальцием Дз.

При измерении показателей ЛДФ в межотломковых мозолях проксимальных отделов бедра у животных данных групп было выявлено, что кальций Дз и этоксидол достоверно не предотвращали снижения показателей регионарного кровотока в зоне повреждения (69,5±5,4 и 64,2±3,7 ПЕ). Клопидогрел и тетрагидробиоптерин статистически значимо повышали уровни микроциркуляции в костной ткани верхнего отдела бедра (96,2+4,1 и 91,3±3,4 ПЕ, соответственно) до показателей у крыс с остеопорозом без лечения (рис. 30).

64.21

"Т '

щж 1

'Ин 1

* М1 ш »

Ни В ::

■ П-О+переломы □ Остеопороз+переломы ЯОП переломы +Кальций ДЗ СЭОП переломы +Этоксидол ВОП переломы +Тетрагидробиоптерин 0ОП переломы +Клопидогрел

Рисунок 30. Влияние тетрагидробиоптерина, клопидогреля, этоксидола, кальция ДЗ на показатели микроциркуляции в костной мозоли проксимального метафиза бедренной кости у крыс.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-0 с переломами животных; ** р<0.05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

При биохимическом исследовании крови было выявлено, что тетрагидробиоптерин и клопидогрел повышали уровень 1МОх крови (83,3±4,7 и 80,7±3,3 мкМоль/л соответственно) выше значений животных с переломами на фоне остеопороза, что нельзя сказать об этоксидоле и кальции Дз, у которых данный показатель составил 72,8±3,8 и 69,2±3,1 мкМоль/л соответственно.

Визуальный осмотр зоны остеопоротического перелома проксимального отдела правого бедра обнаружил один неудовлетворительный результат консолидации перелома с образованием тугого ложного сустава у крысы.

получавшей эналаприл, два - кальций ДЗ и три у животных, которым проводилась терапия клопидогрелем, что подтверждено рентгенографическим исследованием конечности крысы (рис. 31). В группе животных, которым вводился этоксидол, отмечено 10 случаев несращения переломов, а в группах крыс, получавших лечение тетрагидробиоптерином, сращение переломов бедра отмечалось в 100% случаев.

1 2 3

Рисунок 31. Рентгенограмма бедренной кости у крыс с остеопорозом через четыре недели после моделирования и остеосинтеза перелома, получавших кальции ДЗ, этоксидол, клогшдогрел, тетрагидробиоптерин.

Примечание. 1 - ложный сустав бедренной кости крысы, получавшей терапию кальцием ДЗ; 2 - ложный сустав бедра у крысы, получавшей терапию этоксидолом; 3 - консолидирующимся перелом бедра у животного, получавшего терапию клопидогрелем; 4 - срастающийся перелом бедра у животного, получавшего терапию тетрагидробиоптерином.

При микрокопическом исследовании консолидирующихся межвертельных переломов бедер у крыс, которым вводились указанные препараты, было выявлено что в группе животных, получавших этоксидол, сохраняются те же структурные изменения, что и в группе животных с остеопорозом, без лечения (рис. 31.). Кальций ДЗ, тетрагидробиоптерин и клопидогрел улучшают структуру костной ткани по сравнению с крысами, неполучавшими лечение (рис. 32).

Отмечается увеличение ширины костных трабекул в гистологических срезах у групп животных, которым вводились кальций ДЗ, тетрагидробиоптерин и клопидогрел, в сравнении с крысами с экспериментальными остеопоротическими переломами, не получавшими лечение. Этоксидол на показатель трабекулярнои

ширины влияния не оказывал (рис. 33).

Таким образом, тетрагидробиоптерин и клопидогрел статистически значимо улучшают кровоснабжение в микроциркуляторном русле в зоне перелома бедренной кости, тем самым увеличивают среднюю ширину костных трабекул в межотломковой костной мозоли. Кальций Дз в фармакологической коррекции гипоэстрогенных остеопоротических нарушений при экспериментальных переломах через двенадцать недель после начала эксперимента незначительно увеличивает ширину трабекул в губчатой костной ткани проксимального отела бедра но не влияет на кровоснабжение костной ткани. Этоксидол не оказывает воздействие на внутрикостную микроциркуляцию в межотломкой мозоли, а также

не влияет на значения ширины костных трабекул в области консолидирующего перелома.

1 2

Рисунок 32. Состояние трабекул в межотломковой костной мозоли проксимального отдела бедра у крыс, получавших лечение кальцием ДЗ, этоксидолом, клопидогрелем, гетрагидробиоптерином. Окраска Г-Э. Ув. 200.

Примечание. 1 - ложный сустав бедренной кости крысы, получавшей терапию кальцием ДЗ;

2 - ложный сустав бедра у крысы, получавшей терапию получавшей терапию этоксидолом;

3 - консолидирующийся перелом бедра у животного, получавшего терапию клопидогрелем;

4 - срастающийся перелом бедра у животного, получавшего терапию гетрагидробиоптерином.

100 80 50 40 20

ЕЮП переломы +Клопидогрел

Рисунок 33. Влияние гетрагидробиоптерина, клопидогреля, этоксидола, кальция ДЗ на значение средней ширины костных трабекул в межотломковой мозоли проксимального метафиза бедренной кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой Л-0 с переломами животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

ИЛ-О+переломы

□ Остеопороз+переломы

■ ОП переломы +Кальции ДЗ

□ ОП переломы +ЭТОКСИДОЛ

ВОП переломы ч-Тетрагидробиоптерин

Из всего вышесказанного можно сделать заключение, что тетрагидробиоптерин Ю мг/кг, клопидогрел 3,3 мг/кг, резвератрол 2 мг/кг, эналаприл 0,5 мг/кг, лозартан 6 мг/кг и комбинации резвератрола с лазортаном и

резвератрола с энапаприлом в течение двенадцати недель после двусторонней овариэктомии у крыс, благодаря своим эндотелиопротективным свойствам, значительно улучшают параметры регионарной микроциркуляции в межотломковой костной мозоли проксимального метафиза бедренной кости, а также резвератрол и сочетанное применение его с энапаприлом и лозартаном значительно повышают концентрацию стабильных метаболитов оксида азота. Вследствие этого улучшаются процессы остеорепарации при экспериментальных межвертельных переломах бедра на фоне развившегося гипоэстрогенного остеопороза, свидетельством чему явилось значительное увеличение ширины костных трабекул в зоне консолидирующегося перелома, даже по сравнению с животными без остеопоротических нарушений. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг не влияет кровоснабжение микроциркуляторного русла в костной ткани проксимального отдела бедра и не повышает концентрацию 1МОх, что отрицательно сказывается на консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза, приводя к значительному увеличению числа несращений. Кальций Дз в дозе 85,7 мг/кг не обладает эндотелиопротективными свойствами, за счет этого незначительно увеличивает ширину костных трабекул в области срастающихся остеопоротических переломов проксимальных отделов бедренных костей. Можно думать, что по завершении консолидации этих экспериментальных повреждений будет страдать механическая прочность костной ткани. Резвератрол и его комбинации с эналаприлом и лозартаном обладают более позитивным остеопротективным действием по сравнению с монотерапией эналаприлом и лозартаном.

'Основываясь на положении о том, что тетрагидробиоптерин и клопидогрел, резвератрол, эналаприл, лозартан и их комбинации благотворно влияют на консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов бедер, можно рекомендовать проведение клинических исследований с использованием данных лекарственных средств.

Выводы

1. Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии \Vistar развивается нарушение функции эндотелия сосудов, в том числе микроциркуляторного русла костной ткани, свидетельством чего является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции и снижение концентрации стабильных метаболитов оксида азота в крови. Значительно ухудшается кровенаполнение капилляров в костной ткани, что приводит к развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул и возникновением в них микропереломов.

2. Консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии \Vistar по сравнению с аналогичными переломами у крыс без остеопороза протекает на фоне снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота в крови и уровня микроциркуляции в межотломковой зоне, что негативно сказывается на морфометрических показателях в области межотломковой мозоли, тем самым

отрицательно отражаясь на результатах сращения переломов, приводя к увеличению вдвое числа неудовлетворительных исходов консолидации.

3. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг на выбранных моделях патологии, обладая эндотелиопротективными эффектами, проявляющимися, несмотря на отсутствие влияния на концентрацию стабильных метаболитов оксида азота, в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, предупреждают ухудшение показателей микроциркуляции в костной ткани бедра и ткани костной мозоли при остеопоротических переломах, предотвращают уменьшение средней ширины костных трабекул и возникновение микропереломов, а также эффективно повышают количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов, то есть обладают остеопротективным действием.

4. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг на моделях экспериментального остеопороза и остеопоротических переломов проксимального метафиза бедра у самок крыс линии \Vistar не оказывает статистически значимого эндотелио- и остеопротективного воздействия.

5. Резвератрол в дозе 2 мг/кг обладает выраженным эндотелиопротективным действием на модели гипоэстрогенного остеопороза: эффективно снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции, предотвращает снижение концентрации стабильных метаболитов оксида азота, а также предупреждает ухудшение регионарной микроциркуляции и истончение костных трабекул в костной ткани и костной мозоли при остеопорозе и переломах на его фоне, то есть обладает остеопротективной активностью.

6. Комбинации резвератрола в дозе 2 мг/кг с энапаприлом в дозе 0,5 мг/кг и с лозартаном в дозе 6 мг/кг обладают более выраженным, чем монотерапия резвератролом, эналаприлом и лозартаном, эндотелиопротективным действием, что выражается в более эффективном предотвращении увеличения коэффициента эндотелиальной дисфункции и снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота. При этом наблюдается статистически значимое повышение показателей микроциркуляции в проксимальном метафизе бедра, а также увеличение параметров средней ширины костных трабекул и увеличение частоты сращения экспериментальных переломов, что свидетельствует о выраженном остеопротективном эффекте.

7. Тетрагидробиоптерин в дозе 10 мг/кг хотя и незначительно повышает коцентрацию стабильных метаболитов оксида азота, но обладает эндотелиопротективными свойствами, что благоприятно сказывается на показателе средней ширины трабекул в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости и на сращении экспериметальных переломов, то есть обладает остеопротективным действием.

8. Клопидогрел в дозе 3,3 мг/кг, обладая эндотелиопротективным эффектом, заключающимся в предупреждении повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции и снижении концентрации стабильных метаболитов оксида азота, при этом предотвращает ухудшение регионарной микроциркуляции и истончение костных трабекул в костной ткани и костной мозоли при остеопорозе и переломах на его фоне, то есть обладает остеопротективной активностью.

9. На модели экспериментального остеопороза результаты комплексной оценки морфофункциональных характеристик, а именно: уровня микроциркуляции и средней ширины трабекул в костной ткани проксимального метафиза бедра, коэффициента эндотелиальной дисфункции и концентрации стабильных метаболитов оксида азота, с помощью интегрального векторного анализа позволили выявить различную степень эффективности изучаемых препаратов и их комбинаций и выстроить их в следующем порядке увеличения активности: Кальций ДЗ < Этоксидол < Эналаприл < Клопидогрел < Тетрагидробиоптерин < Лозартан < Резвератрол < Резвератрол+Эналаприл < Резвератрол+Лозартан.

Практические рекомендации

В практике фармакологических лабораторий при изучении эндотелио- и остеопротективных свойств разных лекарственных веществ рекомендуется использовать методику исследования эндотелиальной дисфункции, включающую комплекс физиологических, биохимических, морфологических методов с учетом показателя эндотелиальной дисфункции - коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), а также рентгенологические обследования костей скелета при моделированной остеологической патологии.

Полученные экспериментальные результаты позволяют рекомендовать проведение широких клинических исследований тетрагидробиоптерина, клопидогреля, резвератрола, эналаприла, лозартана и комбинаций резвератрола и лозартана на добровольцах - лицах с явными остеопоротическими нарушениями различной этиологии.

Провести исследования клинической эффективности монотерапии указанными препаратами и сочетанного применения их у женщин с гипоэстрогенными состояниями в постклимактерическом периоде и у мужчин пожилого возраста.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки РФ

1. Сравнительное исследование эндотелио- и кардиопротективных свойств фуростаноловых гликозидов из культуры клеток dioscorea deltoidea 17а-эстрадиола / M.B. Корокин, A.M. Носов, M.B. Покровский, A.B. Файтельсои [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. -№9 (90).-С. 137-140.

2. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, М.М. Корнеев, A.B. Файтельсои [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. -№9 (90).-С. 150-152.

3. Микроциркуляторные изменения в надкостнице и костной ткани у крыс с экспериментальным остеопорозом / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2007. -№ '/2 (94/95). - С. 179-181.

4. Перспективы изучения микроциркуляции в костной ткани в поиске новых звеньев патогенеза остеопороза / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский, Г.М. Дубровин // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2007. - № 3. - С. 17-20.

5. Комбинированная фармакологическая и хирургическая коррекция хронической ишемии конечности в эксперименте / А.Д. Мясников, Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, A.B. Файтельсон [и др.] // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2007. - № 4. - С. 17-21.

6. Эндотелий костных сосудов как мишень фармакологического воздействия при экспериментальном остеопорозе / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. -№5 (110).-С. 116-121.

7. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза и переломов на его фоне / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев [и др.] // Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. -2010. -№ 3. - С. 47-51.

8. Влияние антиоксидантов на эндотелиальную дисфункцию при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / В.И. Якушев, Н.В. Стабровская, В.А. Рагулина, A.B. Файтельсон [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 9 (123). - С. 186-190.

9. Протективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2011. — № 2. — С. 9-14.

10. Остеопротективное действие эналаприла, лозартана и резвератрола при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - Белгород, 2011. - № 22 (117), вып. 16/2.-С. 9-14.

11. Фармакологическая коррекция метаболического пути L-apmHHH/eNOS/NO / М.В. Покровский, М.В. Корокин, Т.Г. Покровская, A.B. Файтельсон // Биомедицина. - 2011. - № 4. - С. 115-117.

12. Сравнительная оценка фармакологической коррекции эндотелий-ассоциированной коррекции экспериментального остеопороза резвератролом и этоксидолом / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев [и др.] // Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. - 2012. — № 1. - С. 8-11.

13. Влияние резвератрола на моделирование костной ткани в эксперименте / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев [и др.] // Медицинский альманах. -2012.-№ I (20).-С. 160-163.

14. Фармакологическая коррекция экспериментальных остеопоротических переломов эналаприлом и лозартаном / A.B. Файтельсон, М.В. Покровский, О.С. Гудырев [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного

университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - № 4 (123), вып. 17/1. -С. 232-238.

15. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза комбинацией резвератрола с энапаприлом / A.B. Файтельсон // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. -2012. -№ 4 (123), вып. 17/1. - С. 239-244.

16. Сравнительная оценка остеопротективного действия резвератрола и комбинации резвератрола с энапаприлом при лечении экспериментального остеопороза / A.B. Файтельсон, Н.Ю. Коклина, О.С. Гудырев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2012. - Т. 75, № 5.- С. 35-38.

17. Фармакологическая эндотелий-ассоциированная коррекция экспериментального остеопороза / Е.В. Горбарь, A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев [и др.] // Военно-медицинский журнал. - Москва. - Февраль 2013. — № 2. - С. 56-57.

18. Комплексная оценка остеопротективных эффектов эналаприла, лозартана, резвератрола и их комбинаций при экспериментальном генерализованном остеопорозе / Н.Ю. Коклина, A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - Белгород 2012. -№ 22 (141), вып. 20/3. С. 152-157.

19. Оценка эффективности воздействия резвератрола, эналаприла, лозартана и их комбинаций на качество консолидации экспериментальных переломов на фоне моделированного остеопороза / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский, Н.Ю. Коклина // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - Белгород 2012. -№22(141), вып. 20/3. С. 158-163.

Публикации в научных сборниках и журналах

20. Влияние овариэктомии на микроциркуляцию в костной ткани у крыс / A.B. Файтельсон, М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова [и др.] // Университетская наука: Взгляд в будущее : сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН.-Курск, 2006.-Т. 1.-С. 193-194.

21. Микроциркуляторные нарушения в костной ткани у крыс при моделировании остеопороза после овариэктомии / A.B. Файтельсон, М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова [и др.] // Проблема остеопороза в травматологии и ортопедии : сб. тез. Докл. III конф. с междунар. участием (Москва, 14-15 фев. 2006 г.).-М., 2006.-С. 23.

22. Моделирование остеопороза с нарушением микроциркуляции в костной ткани / A.B. Файтельсон, М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова [и др.] // Факультет последипломного образования: 20 лет на службе здравоохранения : сб. материалов регион. Науч.-практ. конф., посвящ. 20-летию ф-та последиплом. Образования КГМУ (Курск, 24 марта 2006 г.). - Курск : Изд-во КГМУ, 2006. -С. 433-434.

23. Изменение параметров микроциркуляции в костной ткани у крыс при моделировании остеопороза после овариэктомии и экспериментальных переломов / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, М.П. Гладченко [и др.] //

Травматология и ортопедия XXI века : сб. тез. Докл. VIII съезда травматологов-ортопедов России (Самара, 6-8 июня 2006 г.). - Самара : ОФОРТ, 2006. - С. 347.

24. Уровень микроциркуляции в надкостнице и костной ткани у крыс в норме при экспериментальном остеопорозе / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев,

A.И. Маяков [и др.] // Университетская наука: Взгляд в будущее : сб. тр. 72-й науч. конф. КГМУ и сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск, 2007. Т. 2.-С. 193-195.

25. Микроциркуляторные нарушения при экспериментальных остеопоротических переломах / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровский // Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органам и системным изменениям) : сб. тр. VI Междунар. конф. (Ярославль, 10-13 июня 2007 г.). - Ярославль, 2007. - С. 101.

26. Оценка параметров микроциркуляции в костной ткани у крыс при экспериментальных переломах на фоне моделированного гипоэстроген-индуцированного остеопороза / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Г.М. Дубровин, [и др.] // Университетская наука: теория, практика, инновации : сб. тр. 74-й науч. конф. КГМУ и сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН. -Курск, 2009. - Т. 1. - С. 369-372.

27. Коррекция микроциркуляторных нарушений в костной ткани у крыс при экспериментальном остеопорозе / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Г.М. Дубровин [и др.] // Проблема остеопороза в травматологии и ортопедии : сб. тез. Докл. IV конф. с междунар. участием (Москва, 11-12 фев. 2009 г.). -М„ 2009. - С. 30.

28. Модель экспериментального гипоэстрогенного . эндотелий-опосредованного остеопороза / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. Межвуз. науч. конф., посвящ. Памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С. 157-159.

29. Влияние микроциркуляции в межотломковой зоне на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. Межвуз. науч. конф., посвящ. Памяти проф.

B.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С. 159-161.

30. Фармакологическая коррекция экспериментальных остеопоротических переломов / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. Межвуз. науч. конф., посвящ. Памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. -

C. 161-163.

31. Оценка эффективности применения костных трансплантатов, обогащенных L-аргининов / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. Межвуз. науч. конф., посвящ. Памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. -С. 163-164.

32. Оценка фармакологической коррекции микроциркуляторных нарушений экспериментального остеопороза / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Г.М. Дубровин [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр.

Межвуз. науч. конф., посвящ. Памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. -Курск, 2009.-С. 342-343.

33. Оценка эффективности фармакотерапии экспериментального остеопороза резвератролом / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина// Сб. тез. Докладов IX съезда травматологов-ортопедов России (Саратов, 15-17 сент. 2010 г.).-Саратов, 2010.-Т. И.-С. 839-840.

34. Влияние микроциркуляторных нарушений в костной ткани на развитие остеопороза / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина // Современные технологии лечения и реабилитации повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы : сб. тр. Межрегион. Юбилейн. Науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию каф. травматологии, ортопедии и ВПХ. -Курск, 2010.-С. 90-92.

35. Оценка эффективности фармакотерапии экспериментального остеопороза резвератролом в комбинации с энапаприлом / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина// Современные технологии лечения и реабилитации повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы : сб. тр. Межрегион. Юбилейн. Науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию каф. травматологии, ортопедии и ВПХ. - Курск, 2010. - С. 92-94.

36. Оценка эффективности фармакологической коррекции экспериментального остеопороза резвератролом / A.B. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина // Современные технологии лечения и реабилитации повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы : сб. тр. Межрегион. Юбилейн. Науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию каф. травматологии, ортопедии и ВПХ. - Курск, 2010. -С. 94-95.

37. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза резвератролом / A.B. Файтельсон, Н.Ю. Коклина, О.С. Гудырев [и др.] // Приволж. Науч. вестн. - Ижевск, 2011. -№ 2. - С. 96-100.

38. Роль дисфункции сосудистого эндотелия в патогенезе остеопороза / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский [и др.] // Инновации в современной фармакологии : сб. материалов IV съезда фармакологов России (Казань, 18-21 сент. 2012 г.). - М.: Фолиум, 2012. - С. 52.

39. Оценка остеопротективных свойств комбинации резвератрола с лозартаном на модели гипоэстрогенного остеопороза / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский, Д.С.Р. Раджкумар // Инновации в современной фармакологии : сб. материалов IV съезда фармакологов России (Казань, 18-21 сент. 2012 г.). - М.: Фолиум, 2012. - С. 184.

40. Изменения параметров микроциркуляции в надкостнице и костной ткани у животных с экспериментальным гипоэстрогенным остеопорозом / A.B. Файтельсон, Д.С.Р. Раджкумар, А.Н. Захиров // Вестн. Курск, гос. сельскохоз. Акад. - 2012. -№ 5. - С. 72-73.

41. Способ моделирования и оценка развития экспериментального остеопороза у животных / О.С. Гудырев, Д.С.Р. Раджкумар, М.В. Покровский, A.B. Файтельсон [и др.] // Вестн. Волгоград. Гос. ун-та : прил. (Материалы IV Всерос. Науч.-практ. семинара молодых ученых с междун. Участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»).- Волгоград : Изд-во ВолгГМУ, 2012. -С. 141-142.

42. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза комбинацией резвератрола с лозартаном / Н.Ю. Коклина, A.B. Файтельсон, Д.С.Р. Раджкумар, М.В. Покровский // Вестн. Волгоград. Гос. ун-та : прил. (Материалы IV Всерос. Науч.-практ. семинара молодых ученых с междун. Участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»), - Волгоград : Изд-во ВолгГМУ, 2012. -С. 146-147.

43. Микроциркуляторные изменения в надкостнице и костной ткани у крыс с экспериментальным остеопорозом / Д.С.Р. Раджкумар, A.B. Файтельсон, Н.Ю. Коклина, М.В. Покровский // Вестн. Волгоград. Гос. ун-та : прил. (Материалы IV Всерос. науч.-практ. семинара молодых ученых с междун. Участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»). - Волгоград : Изд-во ВолгГМУ, 2012. -С. 162-163.

44. Comparative Evaluation of Enalapril and Losartan in Pharmacological Correction of Experimental Osteoporosis and Fractures of Its Background / A.V. Faitelson, O.S. Gudyrev, G.M. Dubrovin, [et al.] // Journal for Bloomers of Research. - February 2013. - College Sadhana. - Vol. 5. - № 2. - P. 627-631.

Патенты

1. Патент на полезную модель № 62505. МПК7 А61В 17/68. Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экстремальных измерений / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Г.М. Дубровин [и др.] ; заявители и патентообладатели: A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев. - № 2006144474/22 ; заявл. 13.12.06; опубл. 27.04.07, Бюл. № 12.-6 с.

2. Патент на полезную модель № 62512. МПК7 A61D 3/00. Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Г.М. Дубровин [и др.] ; заявители и патентообладатели: A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев. - № 2006144475/22 ; заявл. 13.12.06 ; опубл. 27.04.07, Бюл. № 12. - 6 с.

3. Патент 2369390 Российская Федерация. МПК7 А61Р 19/10. Способ коррекции остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов эналаприлом / М.В. Покровский, О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон [и др.] ; заявители и патентообладатели: М.В. Покровский, О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон. - № 2008122134/14; заявл. 02.06.08 ; опубл. 10.10.09, Бюл. № 28. - 6 с.

4. Патент 2369391 Российская Федерация. МПК7 А61Р 19/10. Способ коррекции остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов лозартаном / Покровский М.В, Гудырев О.С., Файтельсон A.B., [и др]; заявители и патентообладатели: Покровский М.В., Гудырев О.С., Файтельсон A.B. - 2008122136/14; заявл. 02.06.08; опубл. 10.10.09, Бюл. № 28. -6 с.

5. Патент 2437160 Российская Федерация. МПК7 А61К 31/045. Способ коррекции остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов резвератролом в комбинации с эналаприлом / М.В. Покровский,

О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон [и др.] ; заявитель и патентообладатель Курск, гос. мед. ун-т. - № 2010114475/14 ; заявл. 12.04.10 ; опубл. 20.12.11, Бюл. № 35. - 8 с.

6. Патент 2437161 Российская Федерация. МПК7 А61К 31/045. Способ коррекции остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов резвератролом / М.В. Покровский, О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон [и др.] ; заявитель и патентообладатель Курск, гос. мед. ун-т. -№2010114475/14 ; заявл. 12.04.10 ; опубл. 20.12.11, Бюл. № 35.-8 с.

Рационализаторские предложения

1. Рационализаторское предложение № 1793 — 07. Способ моделирования метафизарных переломов у мелких лабораторных животных / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, А.И. Маяков, В.Ю. Чердаков. - заявл. 05.10.07; опубл. 30.10.07.

2. Рационализаторское предложение № 1794 - 07. Способ остеосинтеза метафизарных переломов у мелких лабораторных животных / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, А.И. Маяков, В.Ю. Чердаков. - заявл. 05.10.07; опубл. 30.10.07.

3. Рационализаторское предложение № 1795 - 07. Способ моделирования генерализованного остеопороза у самок крыс линии Wistar / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, А.И. Маяков, В.Ю. Чердаков. - заявл. 05.10.07; опубл. 30.10.07.

4. Рационализаторское предложение № 1974 - 11. Способ закрытого остеосинтеза метафизарных переломов у мелких лабораторных животных / A.B. Файтельсон, М.С. Соболев, П.П. Ремизов. - заявл. 15.11.11; опубл. 23.11.11.

5. Рационализаторское предложение № 1975 - 11. Способ закрытого моделирования метафизарных переломов у мелких лабораторных животных / A.B. Файтельсон, М.С. Соболев, П.П. Ремизов. - заявл. 15.11.11; опубл. 23.11.11.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

AT - ангиотензин

Г-Э - гематоксилин-эозин

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия

Л-О - ложная операция

ПЕ - перфузионные единицы

ЭД - эндотелиальная дисфункция

ЭЗВД - эндотелийзависимая вазодилатация

ЭНВД - эндотелий независимая вазодилатация

NO - оксид азота

NOS - синтаза оксида азота

Nox - стабильные метаболиты оксида азота

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 08.07.2013 г. Подписано в печать 10.07.2013 г. Формат 30x42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 251 "А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3..