Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Противовоспалительное, кардио- и эндотелиопротективное действие ингибиторов ГМК-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и L-аргинина, и резвератрола в эксперименте.

На правах рукописи

Долженкова Татьяна Владимировна

ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ, КАРДИО-II ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ГМГ-КО-А-РЕДУКТАЗЫ СИМВАСТАТИНА, АТОРВАСТАТИНА, РОЗУВАСТАТИНА И L-АРГИНИНА, И РЕЗВЕРАТРОЛА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ИЮН 2011

Курск-2011

4849609

Работа выполнена на базе государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

ПОКРОВСКИЙ Михаил Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

ЛАЗАРЕВА Галина Анатольевна

доктор медицинских наук ФИЛИППОВА Ольга Всеволодовна

Ведущая организации: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « JL<Z> » ЬЫЮИаЯ- 2011 г. в Y£> часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «» е^Сб&сЯ' 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндотелиальные клетки сосудистого русла, осуществляя синтез локально действующих медиаторов, морфофункционально ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока. Общая масса эндотелия у человека колеблется в пределах 1600-1900 г, что даже больше массы печени. Поскольку клетки эндотелия выделяют большое количество различных веществ в кровь и окружающие ткани, их комплекс можно рассматривать как самую большую эндокринную систему. В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия (Бабак ОЛ., 2004; Сидоренко Б.А., 2003; Napoli С., 2001; Шестакова М.В., 2011). При этих заболеваниях он предстает в роли первоочередного органа мишени, поскольку эндотелиальная выстилка сосудов участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции. Как известно, NO синтезируется из L-аргинина под влиянием NO-синтетазы путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина (Марков Х.М., 2005; Яковлев В.М., 2000; Loscalzo J., 2004).

В связи с вышеизложенным представляется актуальным проведение углубленного исследования эндотелиопротекторных и противовоспалительных эффектов симвастатина и правастатина в широком диапазоне доз в сочетании с L-аргинином и резвератролом в рамках активно разрабатываемого в последние годы научного направления кафедры фармакологии Курского государстве!того медицинского университета. Сформировалась фармакологическая мишень «ADMA-eNOS», которая, на наш взгляд, будет объектом повышенного интереса фармакологов к этой проблеме в предстоящие годы (Покровский М.В. и соавт., 2010).

Ранее было показано, что L-аргинин и резвератрол как ионотерапия, и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMA-подобной модели L-NAME-индуцированной эндотелиалыюй дисфункции эффективно увеличивали активность эндотелиалыюй NO-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращали развитие эндотелиалыюй дисфункции у крыс-самцов. Эффективными на данной модели оказались также антиоксиданты, потенцированные поликлональные антитела к eNOS и др. Более того, определенное развитие получили исследования эндотелиопротективной активности на других «ADMA-eNOS-ассоциированных» экспериментальных моделях «метаболического X синдрома», гомоцистеин-индуцированной, гипоэстроген-индуцированной, сепсис-индуцированной эндотелиалыюй дисфункции и при реактивном поствакциналыюм васкулите, что вплотную приблизило понимание необходимости исследования взаимосвязи противовоспалительной и эндотелиопротективной активности сердечнососудистых средств.

Одним из возможных направлений может быть использование плейотропных (то есть дополнительных эффектов, не зависящих от их основного действия) свойств ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы - статинов. В последние годы среди плейотропных эффектов статинов выделяют следующие: антиишемические, сосудорасширяющие, эндотелиопротекторные,

противовоспалительные, антитромботическнс, антипролиферативные ГМК, аптиаритмические, антионкогенные, иммунодепрессивные, антиосгеопоретические, а также способность предотвращать развитие болезни Альцгеймера и др.). Более того, в статье «Статины - гиполипидемические или противовоспалительные средства?» (Грацианский Н.А., 2008) проблема эндотелиопротекции рассматривается в акценте на плейотропные свойства статинов, проявляющиеся независимо от гиполипидемических, или в диапазоне доз, еще не вызывающих гиполипидемическое действие.

По мнению многих исследователей, плейотропные эффекты статинов не связаны с их гиполипидемическим действием. Мевалонат является основным метаболитом не только для синтеза ХС, но и для синтеза изопреноидных промежуточных соединений, таких как фарнезилфосфат (FPP) или геранилгеранилпирофосфат (GGPP). Эти молекулы участвуют в активации и внутриклеточном транспорте белков Rho и Ras, которые, в свою очередь, являются ключевыми для пролиферации, дифференциации клеток, в том числе гладкомышечных клеток и клеток иммунной системы (Аронов Д.М., 2010, 2011).

В то же время открытым остается вопрос о возможности комбинированного использования прямых донаторов NO (L-аргинина) и активаторов eNOS (резвератрола и др.) в сочетании со статинами в части потенцирования эндотелиопротекторной и противовоспалительной активиости.

С другой стороны, статины предеставляют собой далеко не однородную группу препаратов, обладающих различной липофильностыо и, следовательно, различной тропностыо к внепеченочным тканям. Не исключено, что именно данным обстоятельством могут быть объяснены, во-первых, разное воздействие статинов с гидро- (правастатин) или липофильными (симвастатин) свойствами на пролиферацию, проапоптоз ГМК эндотелия, экспрессию цитокинов и, во-вторых, различия в их плейотропном действии, полученные in vivo и in vitro. Создается впечатление, что липиднезависимое, плейотропное действие, статинов - это явление характерно не для класса лекарств в целом, а для отдельных его представителей (Арутюнов Г.П., 2010).

Среди фармакологических агентов, планируемых к комплексному изучению в контексте вышеизложенного, предполагается исследование эффективности симвастатина («ЗОКОР» (Merk, Германия), агорвастатина («ЛИПТОНОРМ», «Фармстандарт, РФ), розувастатина («Акорта» («Фармстандарт», РФ), "EUROBIOPHARM JmgH", Гамбург) и резвератрола , а также их сочетанного применения.

Цель работы: провести комплексное изучение противовоспалительных, эндотелио- и кардиопротективных эффектов симвастатина, аторвастатина и розувастатина, а также их сочетаний с L-аргинином и резвератролом.

Задачи исследовании:

1. Исследовать противовоспалительную активность ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и эндотелиопротекторов L-аргшшна и резвератрола на моделях формалинового отека лапки мышей и экссудации на аппликацию ксилола при введения синьки Эванса у кроликов.

2. Исследовать противовоспалительную активность сочетанного применения ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина и эндотелиопротекторов L-аргинина и резвератрола.

3. Изучить влияние монотерапии ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином, аторвастатином и розувастатином на развитие L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

4. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного использования ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина с L-аргинином при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Исследовать эндотелиопротективную актавность сочетанного использования ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина с резвератролом при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Номер государственной регистрации темы - 01.2011.57807.

Научная новизна.

В работе впервые изучена эндотелиопротективиая активность ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина и их комбинаций с L-аргинином и резвератролом на модели L-NAME-индуцированного NO-дефицитного оксида азота. Продемонстрировано, что статины проявляли дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов, улучшении показателей сократимости при проведении нагрузочных проб и предотвращении развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и гипертрофии кардиомиоцитов. Наиболее активным оказался розувастатин в дозе 8,6 мг/кг.

Параллельно исследована противовоспалительная активность статинов и их комбинаций с L-аргинином и резвератролом на моделях формалинового отека лапки у мышей и экссудативного воспаления у кроликов. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин в терапевтическом диапазоне доз проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на моделях формалинового отека лапы у мышей и экссудативного воспаления у кроликов по методу Ойвина. Эндотелиопротектор L-аргинин оказывал противовоспалительное действие у мышей и не влиял на площадь «синих пятен» и время их появления у кроликов. Резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие на обеих моделях. Сочетанное использование

статинов с L-аргинином при формалиновом отеке у мышей нивелирует противовоспалительный эффект аргинина. Резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказывает аддитивное

противовоспалительное действие, достигающее максимума для комбинации розувастатин 35 мг/кг + резвератрол 4,0 мг/кг.

Комбинированное использование эндотелиопротектора L-аргинина (200 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатином (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание L-аргинина с розувастатином.

Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола (2 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатином (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с розувастатином.

Научная новизна подтверждается заявкой на получение патента РФ.

Практическая значимость.

В работе обоснована эффективность сочетанного применения симвастатина, аторвастатина и розувастатина с L-аргинином и резвератролом для коррекции эндотелиалыюй дисфункции в эксперименте.

Материалы, касающиеся кардио- и эндотелиопротекторных эффектов розувастатина («Акорта» производства ОАО «Томскхимфарм-Фармстандарт»), вошли в регистрационное досье на препарат.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленное клиническое комплексное использование сочетания статинов с L-аргинином и резвератролом в терапии дислипопротеинемий в сочетании с артериальной гипертензией и при положительной «манжеточной пробе».

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр ГОУ ВПО КГМУ, ГОУ ВПО БелГУ, ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010 и 2011 гг., XIV и V национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии,

патофизиологии, гистологии, внутренних болезней №2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин оказывают дозозависимое противовоспалительное действие.

2. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатии и розувастатин на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO проявляют дозозависимос эндотелио- и кардиопротективное действие. Наибольшей активностью обладает розувастатин в дозе 8,6 мг/кг.

3. Комбинированное использование эндотелиопротектора L-аргинина с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином, аторвастатином и розувастатином проявляет аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание L-аргинина с аторвастатином.

4. Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином, аторвастатином и розувастатином проявляет аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с симвастатином.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных данных, выводов и списка использованной литературы, включающего 162 источника, из них 53 отечественных и 109 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 140 страницах машинописи, содержит таблиц - 23, рисунков - 25.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы п методы исследовании

Эксперименты проведены на 300 крысах линии Wistar массой 250-300 г, 40 лабораторных кроликах массой 2-2,5 кг, 60 лабораторных мышах массой 18-22 г. Для исследования взяты животные без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24°С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.

Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Наркотизацию осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Выведение животных из эксперимента - их передозировкой.

Животных распределяли по группам (не менее 10 животных в группе при проведении исследований на крысах и мышах, не менее 6 животных в группе при проведении исследования на кроликах) путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания .и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.

Противовоспалительный эффект статинов и элдотелиопротекторов оценивали на модели формалинового отека стопы у мышей и по методу И.А. Ойвина у кроликов.

Кардно- и эндотелиопротскторное действие. Опыта проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. М-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг/сут. На 8 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP 100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997), эпдотелийнезависимая вазодилатация - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP 100, производства Biopac System регистрировали показатели кардиогемодинамики: левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), ЧСС и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение ЧСС и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт.ст. х уд. мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы (Покровский М.В. и соавт., 2002-2011).

Биохимические маркеры эндотелнальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метельс-кая В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Методы морфологического исследования. Для морфологического исследования после выведения животных из эксперимента производили забор материала органов: сердце, почки. Материал фиксировали в 10% растворе формалина. Сердца рассекали через середину во фронтальной плоскости в виде пластин толщиной 2 мм, в которых содержались оба предсердия, правый и левый желудочки, межжелудочковая перегородка. Кусочки почек вырезали в поперечном направлении строго через центральную часть, включающую почечный сосочек. Окраску срезов гематоксилином и эозином производили в автоматическом режиме в автостейнере HMS 740 (Microm Int. GmbH, Германия). Определяли диаметры кардиомиоцитов левого желудочка, кровеносных сосудов, в почках измеряли диаметры почечных клубочков. Просмотр, анализ и морфометрию осуществляли с помощью программы просмотра и анализа изображений Mirax Viewer 1.12.

Дизайн эксперимента. Противовоспалительный эффект оценивали в условиях острого асептического воспаления стопы мышей, вызванного формалином, по степени ингибирования прироста отека стопы на фоне

препаратов по сравнению с контролем - группой нелсченных животных. Ингибирующий эффект рассчитывали по формуле:

Э - -АЛ/о)х100% А М,

где ЭШ1Г . ингибирующий эффект, ЛЛ/0 и &Мк - средний прирост массы отечной стопы в контрольной и опытной группах.

Для исследования противовоспалительной активности препаратов по методу Ойвина кролики фиксировались, предварительно выстригалась шерсть на коже живота (участок 13x5 см).

Трипановую синь (индикатор проницаемости) вводили в краевую вену уха в виде 1% раствора на 0,9% растворе натрия хлорида из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. Затем на участок кожи живота наносили 6-12 капель о-ксилола. Показателями проницаемости капилляров служили время появления на коже сине окрашенных пятен и их диаметр. По разнице во времени появления пятен и их диаметру до и после введения препарата судили о его действии на проницаемость капилляров.

Исследована кардио- и эндотелиолротекторная активность ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина и их комбинаций с L-аргинином и резвератролом на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

В хронических экспериментах у крыс при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота вводили N-HHTpo-L-aprnnnH метиловый эфир ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME.

Учитывая, что мы в наших экспериментах проводили сравнительное исследование противовоспалительной и кардио- и эндотелиопротективной активности ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и эндотелиопротекторов L-аргинина и резвератрола, нами производился межвидовой пересчет доз, учитывался объем внутрижелудочного введения вещества, исходя их требований руководств по доклиническому исследованию лекарственных средств.

В таблице 1 представлены использованные в работе дозы ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и эндотелиопротекторов L-аргинина и резвератрола.

Таблица 1

Соотношение доз ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и эндотелнопротскторов L-аргишша и резвератрола для человека

Препарат Доза у человека, Кролик Крыса Мышь

мг мг/кг мг/кг мг/кг

Симвастатин 5 2,2 4,3 9

10 4,3 8,6 19

20 8,5 17,2 35

Аторвастатин 2,5 1,1 2,2 5

5 2,2 4,3 9

10 4,3 8,6 19

Розувастатин 5 2,2 4,3 9

10 4,3 8,6 19

20 8,5 17,2 35

L-аргинин 2330 102 200 430

Резвератрол 23 1 2 4

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование противовоспалительного действия ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы снмвастатпна, аторвастатина, розувастатина и эндотелнопротскторов L-аргишша и резвератрола на модели формалинового отека стопы мышеи и экссудативной модели воспаления у кроликов по Ойвину.

Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин, розувастатин оказывают дозозависимое антиэкссудативное действие, проявляющееся в уменьшении степени прироста массы стопы по сравнению с интактными животными (табл. 2). Расчетный коэффициент ингибирующего эффекта (КИЭ) с увеличении дозы симвастатина от 9 до 35 мг/кг увеличивался с 12,7+4,6 до 46,3+4,9 у.е. (р<0,05).

Для аторвастатина начальная эффективная противовоспалительная доза оказалась меньше и составила 5 мг/кг при КИЭ 23,3+4,5 у.е. При увеличении дозы до 19 мг/кг КИЭ составил 39,7+4.5 у.е.

Розувастатип на данной экссудативной модели воспаления в виде монотерапии также проявлял дозозависимое действие, сопоставимое с симвастатином (табл. 2).

Эндотелиопротекторы L-аргинин 430 мг/кг и резвератрол 4 мг/кг оказывали разнонаправленное действие. Резвератрол проявлял слабое антиэкссудативное действие с КИЭ 15,0+3,7 у.е. L-аргинин 200 мг/кг, напротив, увеличивал отек лапки.

Сочетанное использование L-аргинина 430 мг/кг с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы в наиболее эффективных противовоспалительных дозах симвастатина 35 мг/кг, аторвастатина 19 мг/кг и розувастатина 35 мг/кг обнаружило, что статины не только не уменьшали своей противовоспалительной активности в сочетании с L-аргинином, а сохраняли ее на прежнем уровне, соответственно 45,0+4,8,43,8+4,7 и 44,8+4,4 у.е.

Напротив, резвератрол 4 мг/кг в сочетании со статинами проявил аддитивное действие, и ингибирующий эффект от сочетанного применения существенно увеличился, достигнув для комбинации розувастатин 35 мг/кг + резвератрол 4,0 мг/кг 72,9+5,6 у.е., что достоверно выше, чем при монотерапии розувастатином и резвератролом

Таблица 2

Противовоспалительная активность ингибиторов ГМГ-Ко-А-рсдуктазы

симвастатина, аторвастатина, розувастатина и эндотелнопротскторов

L-пргшшна п резвератрола на модели формалинового отека ___стопы мышей (М±т, п=12)__

№ Группа

Ингибирующий эффект

1 Симвастатин 9 мг/кг 12,7+4,6*

Симвастатин 19 мг/кг 28,0+5,2»

Симвастатин 35 мг/кг 46,3+4,9*

2 Аторвастатин 5 мг/кг 23,3+4,5*

Аторвастатин 9 мг/кг 26,7+4,2*

Аторвастатин 19 мг/кг 39,7+4.5*

3 Розувастатин 9 мг/кг 18,7+4,4*

Розувастатин 19 мг/кг 29,8+5,1*

Розувастатин 35 мг/кг 46,8+4,9*

4 L-аргинин 430 мг/кг -23,5+4,8*

5 Резвератрол 4 мг/кг 15,0+3,7*

6 Симвастатин 35 мг/кг + L-аргинин 430 мг/кг 45,0+4,8*у

7 Аторвастатин 19 мг/кг + L-аргинин 430 мг/кг 43,8+4,7*у

8 Розувастатин 35 мг/кг + L-аргинин 430 мг/кг 44,8+4,4* у

9 Симвастатин 35 мг/кг + Резвератрол 4,0 мг/кг 61,8+5,1 *у

10 Атовастатин 19 мг/кг + Резвератрол 4,0 мг/кг 62,8+5,7*у

И Розувастатин 35 мг/кг + Резвератрол 4,0 мг/кг 72,9+5,6*у

Примечание: * - значения при р< 0,05 в сравнении с контролем;у - значения при Р< в сравнении с моно-Ь-аргинином и монорезвсратролом.

Результаты исследования противовоспалительной активности препаратов по методу И.А. Ойвина представлены в таблице 3.

Симвастатин в дозах 4,3 и 8,5 мг/кг оказывал дозозависимое противовоспалительное действие, выражающееся в уменьшении площади пятен до 3,5±0,3 и 3,1±0,3 см2, увеличении времени появления до 397,1±12,3 и 397,1±12,3 с. По сравнению с контрольными значениями 5,4±0,3 см2 и 236,1±6,4 с.

Аторвастатин, так же как и в экспериментах на мышах, начинал проявлять противовоспалительное действие в меньшей дозе 1,1 мг/кг и оказывал более выраженное действие, достигая максимума при 4,3 мг/кг (табл. 3).

Розувастатин оказался наиболее эффективен и в дозах 2,2, 4,3 и 8,5 мг/кг, замедляя время появления пятен соответственно до 501,9±21,7, 531,5±13,8 и 601,7±13,6 с. По сравнению с контролем 236,1±6,4 с. Размер пятен также оказался минимален и составил в большей дозе 1,51,5±0,2 см2.

Эндотелиопротектор L-аргинин 102 мг/кг не оказывал существенного влияния на время появления и размер пятен экссудативной реакции на ксилол. Резвератрол 1 мг/кг оказывал слабое противовоспалительное действие (табл. 3).

Таблица 3

Противовоспалительная активность ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина

и эндотелиопротскторов L-аргшпша н резвератрола _по методу И.А. Ойвина (M±m, 11=18)_

Препараты •ч Средняя площадь пятен, см2 Время появления пятен, с.

Интактные 5,4±0,3 236,1±6,4

Симвастатин 2,2 мг/кг Симвастатин 4,3 мг/кг Симвастатин 8,5 мг/кг 5,5±0,2 3,5±0,3* 3,1±0,3* 288,3±11,2* 350,2±ю,8* 397,1±12,3*

Аторвастатин 1,1 мг/кг Аторвастатин 2,2 мг/кг Аторвастатин 4,3 мг/кг 3,6±0,2* 2,9±0,2 1,7±0,2 387,4±11,8* 441,3±13,2* 491,2±16,7*

Розувастатин 2,2 мг/кг Розувастатин 4,3 мг/кг Розувастатин 8,5 мг/кг 3,6±0,2* 2,2±0,2* 1,5±0,2* 501,9±21,7* 531,5±13,8* 601,7±13,б*

L-аргинин 102 мг/кг 5,4±0,3 245,4±46,0

Резвератрол 1 мг/кг 4,4±0,2 316,2±21,1*

Симвастатин 8,5 мг/кг + L-аргишш 102 мг/кг 4,1±0,3 367,б±13,7*

Аторвастатин 4,3 мг/кг + L-аргинин 102 мг/кг 3,4±0,1 *>' 412,8±15,8* у

Розувастатин 8,5 мг/кг + L-аргинин 102 мг/кг 3,8±0,2*у 423,8±15,7* у

Симвастатин 8,5 мг/кг + Резвератрол 1,0 мг/кг 3,0±0,2*у 508,0±13,8* у

Атовастатин 4,3 мг/кг + Резвератрол 1,0 мг/кг 2,7±0,3*у 523,9±15,9* у

Розувастатин 8,5 мг/кг + Резвератрол 1,0 мг/кг 2,5±0,2*у 567,9±12,0*у

Примечание: * - значения при р<0,05 в сравнении с контролем ' - значения при Р< в сравнении с моно-Ь-аргиниром и монорезвератролом.

Сочеташюе использование L-аргинина 102 мг/кг с иигибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы в наиболее эффективных противовоспалительных дозах симвастатина 8,5 мг/кг, аторвастатина 4,3 мг/кг и розувастатина 8,5 мг/кг обнаружило, что статины несколько уменьшали эффективность своих противовоспалительных эффектов, но значения увеличения времени появления пятен и площади пятен оставались на уровне, значительно отличающемся от интактных животных (табл. 3).

Комбинированное применение статинов с резвератролом оказалось более эффективным, и максимальные показатели наблюдались при использовании комбинации розувастатина 8,5 мг/кг с резвератролом 1,0 мг/кг, площадь 2,5±0,2 см2 и время 567,9±12,0 с.

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что статины проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на моделях формалинового отека лапы у мышей и экссудативного воспаления у кроликов по методу Ой вина.

Исследование кардио- и эндотелиопротекторного действия ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина при L-NAME-нндуцнрованном дефиците NO.

Симвастатин дозозависимо уменьшал коэффициент эндотелиальной дисфункции, в большей дозе значения которого достигали 2,5±0,01 по сравнению с 5,4±0,01 у.е. у животных с патологией. Параллельно обнаружено снижение АД, значения которого в большей дозе мало отличались от исходных, тогда как в контроле составляли 190 и 145 мм рт.ст. Кроме того, симвастатин предупреждал развитие повышенной адренореактивности и улучшал показатели сократимости при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. В то же время экспрессия e-NOS и концентрация нитрит-ионов не претерпевали существенных изменений. Диаметр кардиомиоцитов незначительно уменьшался в большей дозе (рис. 1).

I ссад i «Дад

II ТТТ TV V VI vr VTTT

НИд-L-NАМЕ+симвастатин <■

- L-NAME+симвастатин 17,2 мг/кг"

Ь-ЫАМЕ1аторвастахшь2,2. мг/кг__

о-- L-NAME+аторвастатин 8,6 мг/кг

S"

Рис. 1. Влияние ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, eNOS - экспрессия NO-синтазы, NQx - суммарная концентрация нитритов и питратов плазмы, ДМ - диаметр кардиомиоцитов.

1 - интактные, 2 - L-NAME, 3 - L-NAME+ симвастатин 4,3, 4 - L-NАМЕ+симвастатин 17,2, 5 -L-NAME+ аторвастзтин 2,2, 6 - L-NAME+аторвастатин 8,6, 7 - L-NAME+розувастатин 2,2, 8 L-NAME+розувастатин 8,6 мг/кг.

Примечание: * - р < 0,05 - в сравнении с L-NAME, ** - р < 0,05 - в сравнении с интактными.

Аторвастатин, так же как и при изучении противовоспалительных эффектов, начинал проявлять кардиопротективное и эндотслиопротектлвное действие в дозах, в два раза меньших в сравнении с симвастатином, и эффект малой дозы 2,2 мг/кг в отношении КЭД и АД оказался сопоставим с эффектом большей - 4,6 мг/кг. В то же время при проведении нагрузочных проб малая доза оказалась неэффективной. Обращает на себя внимание, что в отличие от симвастатина большая доза аторвастатина увеличивала экспрессию eNOS, концентрацию нитрин-ионов и уменьшала диаметр кардиомиоцитов (рис. 1).

Розувастатин проявил более высокую эффективность, снижая КЭД до уровня 1,7. Однако существенно не предотвращал развитие гипергензии в малой дозе. Несущественно отличались от контрольных значений и результаты нагрузочных проб. В то же время концентрация нитриг-ионов в экспериментах с розувастатином оказалась в два раза более высокой, чем у контрольных животных. Существенно уменьшился и диаметр кардиомиоцитов (рис. 1).

Таким образом, ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0 проявляли дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов, улучшении показателей сократимости при проведении нагрузочных проб и предотвращении развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и гипертрофии миокардиоцитов. Наиболее активным оказался розувастатин 8,6 мг/кг.

Исследование кардио- и эндотелиопротекторного действии комбинированного применения ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина с L-аргинином при L-NAME-iiiwynnpoBaiiiioM дефиците NO.

Аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие L-аргинина и симвастатина проявлялось в отношении КЭД и АД. В нагрузочных пробах показатели сократимости достигали значений интактных животных. Выраженная аддиция обнаружена в отношении экспрессии <?NOS (рис. 2).

Ещё более выраженный аддитивный эффект обнаружило комбинированное использование L-аргинина с аторвастатином. Так, КЭД составил 1,5±0,01, АД - 148 и 105 мм рт.ст. (рис. 2). Аналогичная тенденция сохранялась и в отношении нагрузочных проб, где значения ЛЖД при проведении пробы па адренореактивность оказались даже ниже, чем у интактных животных. Обращает на себя внимание, что комбинированное использование аторвастатина и L-аргинина практически восстанавливало экспрессию eNOS и концентрацию нитрит-ионов (рис. 2).

Аддитивность кардио- и эндотелиопротективных эффектов статинов и L-аргинина сохранилась и в отношении розувастатина. В то же время значения АД в отличие от аторвастатина не достигали величин у интактных животных. Тенденция сохранилась при проведении нагрузочных проб.

кэд

АД т

а сад |

ИДАД 1

► — L-NAME+CHMBacTaTmf k — L-N АМЕ+аторвастатин

- О- • L-NAM Е+рсжувастатин

- -О—rL-jiyAME-^ L-apnniHH-^CHMBacTaTytc,, -аргинин+аторваста ЛнТ

— L-N AM E+L-аргинин+ рочуаастатин

25м

Рис. 2. Влияние комбинированного применения L-аргигоша с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита N0.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, eNOS - экспрессии NO-синтазы, NOx суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ - диаметр кардиомиоцитов. 1 - интактные, 2 - L-NAME, 3 -L-NAME+ L-аргинии, 4 - L-N АМЕ+симваетатин, 5 -L-NAME+ аторвастатин, 6 - L-NAME+ розувастатин, 7 - L-NAME+ симвастатин+Ь-аргинин, 8 - L-NAME+ аторвастатик+Ь-аргинин, 9 - L-NAME+розувастатин аргинин 6 мг/кг.

Примечание: * - р < 0,05 - в сравнении с L-NAME, ** - р < 0,05 - в сравнении с интактными.

Аналогично проявили себя показатели eNOS, концентрации нитрит-ионов и диаметра кардиомиоцитов.

Таким образом, комбинированное использование эндотелиопротектора L-аргинипа с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином, аторвастатином и розувастатином показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание L-аргинина с аторвастатином.

Исследование кардио- и эидотслиопротскторного действия комбинированного применения ингибиторов ГМГ-Ко-А-рсдуктазы симвастатина, аторвастатина н розувастатина с резвератролом при L-NAME-индуцированпом дефиците NO.

В экспериментах с использованием комбинации симвастатина с резвератролом достигнуты максимально низкие значения КЭД - 1,2±0,01, как и при монотерапии симвастатином - 3,5±0,02. Нагрузочные пробы не выявили аддитивного действия комбинации. Экспрессия eNOS и концентрация нитрит-ионов приближались к значениям у интактных животных. Кардиопротективное действие в отношении гипертрофии кардиомиоцитов в комбинации симвастатина с резвератролом было ниже, диаметр - 10,1 мкм, чем комбинация с L-аргинином - 9,3 мкм.

Схожие значения обнаружены при комбинированном использовании аторвастатина и резвератрола в отношении КЭД и АД, нагрузочных проб, экспрессии eNOS, концентрации нитрит-ионов и диаметра кардиомиоцитов (рис. 3).

Розувастатин при комбинированном использовании с резвератролом также обнаружил кардиопротективное действие, сопоставимое с аторвастатином и симвастатином. Однако по выраженности адциции в отношении КЭД и АД наиболее эффективным оказалось сочетание резвератрола с симвастатином.

Подводя итог представленным экспериментальным данным об эндотелио- и кардиопротективном действиях статинов и их комбинации с L-аргинином и резвератролом можно предположить несколько точек приложения действия статинов, представленных на схеме (рис. 4):

- ингибирование протеинкиназы С;

- снижение ПОЛ;

- мембраностабилизирующее действие;

- повышение внутриклеточных уровней цАМФ и цГМФ;

- повышение экспрессии eNOS;

- ингибирование продукции вазоконстрикторов эндотелина 1 и тромбоксана В2;

- снижение уровня кальция в цитозоле через воздействие на кальциевые каналы;

- а также увеличение уровня глюкокортикоидов.

а сад ДДАД I

"L-N

"L-NAME+peSl . §0 —г* — L-NAME+симаастатш?-" — -А — L-NAME+аторвастатнн - Q- • L-NAME+розуваститин

[)U —аддчГА М h +рс:)вс ратрол ♦ аторв иста'кй -J-Ь-ММЕ+рсчвсратрол+розувастатин

-5й-

Рис. 3. Влияние комбинированного применения резвератрола с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, eNOS - экспрессия NO-синтазы, NOx - суммарная концентрация нитритов и нитратов плазмы, ДМ - диаметр кардиомиоцитов. 1 - интактные, 2 - L-NAME, 3 -L-NAME+ резвератрол, 4 - L-NAME+симвастатин, 5 -L-NAME+ аторвастатин, 6 - L-NAME+ розувастатин, 7 - L-NAME+ симвастатин резвератрол, 8 - L-NAME+ аторвастатин+резвератрол, 9 - Ь^АМЕ+розувастатин+ резвератрол.

Примечание: * - р < 0,05 в сравнении с L-NAME, ** - р < 0,05 - в сравнении с интактными.

противовоспалительных эффектов комбинации ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы с эндотелиопротекторами, на наш взгляд, могут быть в основном связаны с модуляцией функций нейтрофилов.

Статины регулируют внутриклеточные сигнальные системы в целом, подавляя активацию факторов транскрипции: нуклеарного фактора карраВ) и активатора протеина-1, ответственных за продукцию многих цитокинов, хемокинов, ферментов и адгезинов, вовлеченных в хронический воспалительный процесс.

Таким образом, представленные результаты оценки кардио- и эндотелиопротективных эффектов статинов указывают на то, что наши исследования раскрывают перспективу дальнейшего целенаправленного и патогенетически осмысленного изучения возможностей использования статинов с эндотелиопротекторами таргентной направленности действия.

ВЫВОДЫ

1. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин в терапевтическом диапазоне доз проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на моделях формалинового отека лапы у мышей. Эндотелиопрогектор L-аргинин оказывал провоспалительное действие у мышей. Резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие. Сочетанное использование статинов с L-аргинином при формалиновом отеке у мышей нивелирует провоспалительный эффект аргинина. Резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказывает аддитивное противовоспалительное действие, достигающее максимума для комбинации розувастатин 35 мг/кг + резвератрол 4,0 мг/кг.

2. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин в терапевтическом диапазоне доз проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на модели экссудативного воспаления у кроликов по методу Ойвина. Эндотелиопротектор L-аргинин не влиял на площадь «синих пятен» и время их появления, резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие на обеих моделях. Резвератрол в сочетании с

ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказался эффективнее L-аргинина. Наиболее эффективной комбинацией оказалось сочетание розувастатина 8,5 мг/кг + резвератрола 1,0 мг/кг.

3. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин 4,6 и 17,2 мг/кг, аторвастатин 2,2 и 8,6 мг/кг и розувастатин 2,2 и 8,6 мг/кг, на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0 проявляли дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие, что выражалось в преобладании эидотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx, улучшении показателей сократимости при проведении нагрузочных проб и предотвращении развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и гипертрофии кардиомиоцитов. Наиболее активным оказался розувастатин 8,6 мг/кг.

4. Комбинированное использование эндотелиопротектора L-аргинина (200 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатином (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание L-аргинина с аторвастатином.

5. Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола (2 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатином (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с симвастатином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Эндотслиопротективные, кардиопротсктивные эффекты аторвастатина и его комбинаций с L-арппншом и резвератролом в эксперименте / Т.В. Должспкова, В.И. Якушев, М.В. Покровский [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар, 2010. - JV» 7, -С. 61-65. (Перечень ВАК)

2. Фармакологическая коррекция морфологических изменений в сердце и почках при L-NAME-индуцированном дефиците NO / B.C. Барсуков, В.Т. Дудка, Т.В. Должспкова [и др.] // «Человек и лекарство»: XVII Российский национальный конгресс, Москва, 12-16 апр. 2010 г.: сб. материалов конгр. (тез. докл.). -М., 2010. - С. 576.

3. Исследование противовоспалительного действия различных дозировок препаратов симваститина и аторвастатина и их комбинаций с L-аргинином в эксперименте / Т.В. Должспкова, В.И. Якушев, Т.Г. Покровская [и др.] // «Человек и лекарство»: XVII Российский национальный конгресс, Москва, 12-16 апр. 2010 г.: сб. материалов конгр. (тез. докл.). - М., 2010. - С. 606.

4. Якушев В.Hi, Долженкова Т.В., Бесхмельницына Е.А., Белоус А.С. Возможности коррекции эндотелиальной дисфункции симвастатином и его комбинациями с модуляторами синтеза оксида азота // Мат. Третьей международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине». - Курск, 2010. - С. 226-230.

5. Дозозавнсимые противовоспалительные, эндотелиопротективные, кпрдиопротектнвные эффекты аторвастатина / Т.В. Долженкова,

B.И. Якушев, М.В. Покровский [и др.]. // Курский научно-практический всстнпк «Человек и его здоровье» / Курск, 2010. - № 3. - С. 26-31. (Перечень ВАК)

6. Сравнительная характеристика эндотелиопротективпых эффектов розувастатина и аторвастатина при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / Т.Н. Долженкова, В.И. Якушев, М.В. Покровский и др. // Сборник научных материалов V конгресса «Рациональнвая фармакотерапия и клиническая фармакология». - СПб, 2010. - С. 103-107.

7. Эндотелиопротективные эффекты аторвастатина и его комбинаций с резвератролом и L-аргинином в эксперименте / Т.В. Долженкова, В.И. Якушев, М.В. Покровский и др. // Сборник научных материалов V конгресса «Рациональнвая фармакотерапия и клиническая фармакология» - СПб, 2010. -

C. 107-111.

8. Дозозависимые противовоспалительные, эндотелиопротективные и кярднопротектнвные эффекты симвастатина в эксперименте / Т.В. Долженкова, В.И. Якушев, М.В. Покровский [и др-J // Кубанский научный медицинский вестник. Краснодар, 2011. - № 2. - С. 31-35. (Перечень ВАК)

9. Исследование дозозависнмого характера противовоспалительных и эндотслиопротсктивных эффектов аторвастатина в эксперименте / Т.В. Долженкова, В.И. Якушев, А.А. Арустямова [и др.] // Научные ведомости БелГУ (Серии Медицина, Фармации). Белгород, 2011. - № 4. -Выи. - С. 121-127. (Перечень ВАК)

10. Пат. 2412714 Российская Федерация, МПК7 Способ моделирования эндотелиальной дисфункции путем воспроизведения метаболических нарушений: / Покровский М.В., Маяков А.И., Долженкова Т.В. [и др.]; заявитель и патентообладатель Покровский М.В. [и др.] - №2009130143/15, заявл. 05.08.2009; опубл. 27.02.2011, Бюл. № 6. 4 с.

11. Эндотелиопротективные, кардиопротектнвные эффекты симвастатина и его комбинаций с L-аргпнином м резвератролом в эксперименте / Т.В. Долженкова, В.И. Якушев, М.В. Покровский ]и др.] И Курский научно-практический вестник «Человек н его здоровье»/ Курск, 2011. - № 1. - С. 5-9. (Перечень ВАК)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота (NOS - индуцируемая синтаза оксида азота NO - оксид азота АГ - артериальная гипертензия

ГМК-Ко-А - гидроксиметилглутарил коэнзимА редуктаза ХС - холестерин

ЭД - эндотелиальная дисфункция

L-NAME - ^нитро-Ь-аргинин метиловый эфир

НП - нитропруссид натрия

ИФС - интенсивность функционирования структур ЛЖД - левожелудочковое давление ПОЛ - перекисное окисление липидов цАМФ - циклический моноаминофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат ГМК - гладкомышечные клетки

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 14.05.2011 г. Подписано в печать 16.05.2011 г. Формат 30х421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 157 "А" Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Эндотелиальные клетки сосудистого русла, осуществляя синтез локально действующих медиаторов, морфофункционально ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока. Общая масса эндотелия у человека колеблется в пределах 1600-1900 г, что даже больше массы печени. Поскольку клетки эндотелия выделяют большое количество различных веществ в кровь и окружающие ткани, поэтому их комплекс можно рассматривать как самую большую эндокринную систему [16, 17, 30-33, 45]. В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия. При этих заболеваниях он предстает в роли первоочередного органа мишени, поскольку эндотелиальная выстилка сосудов участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции. Как известно N0 синтезируется из Ь-аргинина под влиянием ЫО-синтетазы путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы Ь-аргинина [16,17,30,33,45].

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным проведение углубленного исследования эндотелиопротекторных и противовоспалительных эффектов симвастатина и правастатина в широком диапазоне доз в сочетании с Ь-аргинином и резвератролом в рамках активно разрабатываемого в последние годы научного направления кафедры фармакологии Курского государственного университета [35, 37, 46, 49, 52, 56, 58, 60-67]. Сформировалась фармакологическая мишень «АОМА-е>Ю8», которая на наш взгляд, будет объектом повышенного интереса фармакологов к этой проблеме в предстоящие годы [8, 58, 61, 63, 65].

Ранее было показано, что Ь-аргинин и резвератрол как монотерапия, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на АОМА-подобной модели Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно, увеличивал активность эндотелиальной ЫО-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов. Эффективными на данной модели оказались так же, антиоксиданты потенцированные поликлональные антитела к еЫОЗ [63-67] и др. Более того, определенное развитие получили исследования эндотелиопротективной активности на других «АЕ)МА-е1чЮ8 - ассоциированных» экспериментальных моделях «метаболического X синдрома, гомоцистеин-индуцированной, гипоэстроген-индуцированной, сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции и при реактивном поствакцинальном васкулите, что в плотную приблизило понимание необходимости исследования взаимосвязи противовоспалительной и эндотелиопротективной активности сердечно-сосудистых средств [3, 4, 5].

Одним из возможных направлений может быть использование плеотропных (т.е. дополнительных эффектов, не зависящих от их основногодействия) свойств ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы - статинов. В последние годы среди плеотропных эффектов статинов выделят следующие: антиишемические, сосудорасширяющие, эндотелиопротекторные; противовоспалительные, антитромбические, антипролиферативные ГМК, антиаритмические, антионкогенные, иммунодепрессивные, антиостеопоретические, а такжеспособность предотвращать развитие болезни Альцгеймера и др.) Более того, в заголовках статей «Статины гиполипидемичечские или противовоспалительные средства?» (Н.А.Грацианский, 2008) уже проблема эндотелиопротекции рассматривается в акценте на плейтропные свойства статинов, проявляющиеся независимо от гиполипидемичечских или в диапазоне доз, еще не вызывающих гиполипидемическое действие [3, 4, 59, 69, 71].

По мнению многих исследователей, плейотропные эффекты статинов не связаны с их гиполипидемическим действием. Мевалонат является основным метаболитом не только для синтеза ХС, но и для синтеза изопреноидных промежуточных соединений, таких как фарнезилфосфат

FPP) или геранилгеранилпирофосфат (GGPP). Эти молекулы участвуют в активации и внутриклеточном транспорте белков Rho и Ras, которые, в свою очередь, являются ключевыми для пролиферации, дифференциации клеток, в т.ч. гладкомышечных клеток и клеток иммунной системы [71, 75, 85, 93, 106, 108, 128].

В то же время, открытым остается вопрос о возможности комбинированного использования прямых донаторов N0 (L-аргинина) и активаторов eNOS (резвератрола и др) в сочетании со статинами в части потенцирования эндотелиопротекторной и противовоспалительной активности.

С другой стороны статины предеставляют собой далеко не однородную группу препаратов, обладающих различной липофольностью и, следовательно, различной тропностью к внепеченочным тканям. Не исключено, что именно данным обстоятельством могут быть объяснены, во первых, разное воздействие статинов с гидро- (правастатин) или липофильными (симвастатин) свойствами на пролиферацию, проапоптоз ГМК эндотелия, экспрессию цитокинов и, во вторых, различия в их плейотропном действии полученные in vivo и in vitro. Создается впечатление, что липид незавасимое, прейотропное действие статинов - это явление не характерное для класса лекасрств в целом, а отдельных его представителей.

Среди фармакологических агентов, планируемых к комплексному изучению в контексте вышеизложенного, предполагается исследование эффективности симвастатина («ЗОКОР» (Merk, Германия), аторваститина («ЛИПТОНОРМ», «Фармстандарт, РФ), розувастатин («Акорта» («Фармстандарт», РФ), «EUROBIOPHARM JmgH», Гамбург) и резвератрол , а также их сочетанного применения.

Цель работы: провести комплексное изучение противовоспалительных, эндотелио- и кардиопротективных и эффектов симвастатина, аторвастатина и розувастатина, а также их сочетаний с L-аргинином и резвератролом.

Задачи исследования:

1. Исследовать противовоспалительную активность ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина, розувастатина и эндотелиопротекторов Ь-аргинина и резвератрола на моделях каррагенинового отека лапки мышей и введения синьки эвванса.

2. Исследовать противовоспалительную активность сочетанного применения ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина и эндотелиопротекторов Ь-аргинина и резвератрола.

3. Изучить влияние монотерапии ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина на развитие Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

4. Изучить эндотелиопротекгивную активность сочетанного использования ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина с-Ь-аргинина при моделировании Ь-ИАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Исследовать эндотелиопротекгивную активность сочетанного использования ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина с резвератролом при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной* эндотелиальной дисфункции.

Научная новизна исследования.

В работе впервые изучена эндотелиопротективная активность ингибиторов , ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатина, аторвастатина и розувастатина и их комбинаций с Ь-аргинином и резвератролом на модели Ь-НАМЕ-индуцированной ЫО-дефицитного дефицита оксида азота. Продемонстрировано, что статины проявляли дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого рассабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ЫОх, улучшении показателей сократимости при проведении нагрузочных проб и предотвращении развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и гипертрафии миокардиоцитов. Наиболее активным оказался розувастатин 8,6 мг/кг.

Паралельно исследована противовоспалительная активнсть статинов и их комбинаций с Ь-аргинином и резвератролом на моделях формалинового отека лапки у мышей и экссудативного воспаления у кроликов. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин в терапевтическом диапазоне доз проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на моделях формалинового отека лапы у мышей и экссудативного воспаления у кроликов по методу Ойвина. Эндотелиопротектор Ь-аргинин оказывал провоспалиьтельное действие у мышей и не влиял на площадь «синих пятен» и время их появления у кроликов. Резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие на обеих моделях. Сочетанное использование статинов с Ь-аргинином при формалиновом отеке у мышей нивелирует провоспалительный эффект аргинина. Резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказывает аддитивное противовоспалительное действие, достигающее максимума для комбинации розувастатин 35 мг/кг + резвератрол 4,0 мг/кг.

Комбинированное использование эндотелиопротектора Ь-аргинина (200 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатин (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание Ь-аргинина с аторвастатином.

Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола (2 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатин (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с симвастатином.

Научная новизна подтверждается 1 заявкой на получение патента РФ.

Практическая значимость:

В работе обоснована эффективность сочетанного применения симвастатина, аторвастатина и розувастатина с Ь-аргинином и резвератролом для коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте.

Материалы, касающиеся кардио- и эндотелиопротекторных эффектов розувастатина («Акорта» производства ОАО «Томскхимфарм-Фармстандарт») вошли в регистрационное досье на препарат.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания сочетанного использования статинов с Ь-аргинином и резвератролом в комплексной терапии гипирлипидемий в сочетании с артериальной гипертензией и положительной «манжеточной пробе».

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, ГОУ ВПО БелГУ, ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010 и 2011 гг., XIV и V национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, патофизиологии, гистологии, внутренних болезней №2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 в журналах рекомендуемых перечнем ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин оказывают дозозависимое противовоспалительное действие.

2. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин, на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0, проявляют дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие. Наибольшей активностью обладает розувастатин в дозе 8,6 мг/кг.

3. Комбинированное использование эндотелиопротектора Ь-аргинина с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином, аторвастатином и розувастатином проявляет аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание Ь-аргинина с аторвастатином.

4. Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином, аторвастатином и розувастатином проявляет аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с симвастатином.

Структура и объем работы. Диссертация выполнена на базе лаборатории кардиофармакологии НИИ Экологической медицины КГМУ в период с 2008 по 2011 годы. Диссертация состоит из введения, обзора; литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 139 источника, из-них 71 отечественных и 68 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 146 страницах машинописи, содержит таблиц - 38, рисунков - 29.

128 ВЫВОДЫ

1. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин в терапевтическом диапазоне доз проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на моделях формалинового отека лапы у мышей. Эндотелиопротектор Ь-аргинин оказывал провоспалительное действие у мышей. Резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие. Сочетанное использование статинов с Ь-аргинином при формалиновом отеке у мышей нивелирует провоспалительный эффект Ь-аргинина. Резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказывает аддитивное противовоспалительное действие, достигающее максимума для комбинации розувастатин в дозе 35 мг/кг + резвератрол в дозе 4,0 мг/кг.

2. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин, аторвастатин и розувастатин в терапевтическом диапазоне доз проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на модели экссудативного воспаления у. кроликов по методу Ойвина. Эндотелиопротектор Ь-аргинин не влиял на площадь «синих пятен» и время их появления, резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие на обеих моделях. Резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказался эффективнее Ь-аргинина. Наиболее эффективной комбинацией оказалось сочетание розувастатина в дозе 8,5 мг/кг + резвератрола в дозе 1,0 мг/кг.

3. Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин в дозах 4,6 и 17,2 мг/кг, аторвастатин в дозах 2,2 и 8,6 мг/кг и розувастатин в дозах 2,2 и 8,6 мг/кг, на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0, проявляли дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие,что выражалось в преобладании эндотелийзависимого рассабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ЫОх, улучшении показателей сократимости при проведении нагрузочных проб и предотвращении развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и гипертрофии кардиомиоцитов. Наиболее активным оказался розувастатин в дозе 8,6 мг/кг.

4. Комбинированное использование эндотелиопротектора Ь-аргинина (200 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатин (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание Ь-аргинина с аторвастатином.

5. Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола (2 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатин (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с симвастатином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что статины проявляют дозозависимое противовоспалительное действие на моделях формалинового отека лапы у мышей и экссудативного воспаления у кроликов по методу Ойвина. Эндотелиопротектор Ь-аргинин оказывал провоспалительное действие у мышей и не влиял на площадь «синих пятен» и время их появления у кроликов. Резвератрол оказывал слабое противовоспалительное действие на обеих моделях. Сочетанное использование статинов с Ь-аргинином при формалиновом отеке у мышей нивелирует провоспалительный эффект Ь-аргинина,приближая коэффициент ингибирующего эффекта к значениям монотерапии статинами. Резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказывает аддитивное противовоспалительное действие, достигающее максимума для комбинации розувастатин в дозе 35 мг/кг + резвератрол в дозе 4,0 мг/кг. На модели Ойвина у кроликов резвератрол в сочетании с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы оказался эффективнее Ь-аргинина, однако, не проявлял аддиции как в экспериментах на мышах. Наиболее эффективной комбинацией оказалось сочетание розувастатина в дозе 8,5 мг/кг + резвератрола в дозе 1,0 мг/кг.

Длительное в течение 7 суток внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг вызывает у лабораторных животных комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0 вследствие блокады ТчЮ-синтетазы. В частности, на 8-е сутки развивалась выраженная гипертензия и эндотелиальная дисфункция, гипереактивность на адреналовую пробу, снижалась сократительная способность миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением, резко уменьшался уровень нитрит-ионов в экспрессия еЫ08. Гистологически обнаруживалась гипертрофия миокарда и мышечного фосфолипазы прос ациклин

Повода

Оксидаза

I. - цитрупин хемоаттрактанть еЫОв ыр х карраВ ЯДРО,

Кальмодулин Тетрагидробиоптерин ФАД, ГЕМ оыоо

ЦГМФ

РЕЛАКСАЦИЯ слоя сосудистой стенки. Описанный симптомокомплекс клинически можно экстрапалировать на злокачественную гипертензию.

Схема механизма возможных путей реализации эндотелиопротективных эффектов ингибиторов ГМГ-Ко-А-редуктазы В протеинкиназа С Ь-ЫАМЕ, АРМА адмзивны« молекулы, УСАЫ-1.1САМ-1. МСР1 г\——

НАДФ НАДФН

ЬАРГИНИН цАМФ

РЕЛАКСАЦИЯ

Диссертационное исследование Долженковой Т В

Рис. 4.1. Схема возможных путей реализиции эндотелиопротективных эффектов ингибиторов ГМК-Ко-А-редуктазы. Объяснения в тексте.

Ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатин в дозах 4,6 и 17,2 мг/кг, аторвастатин в дозах 2,2 и 8,6 мг/кг и розувастатин в дозах 2,2 и 8,6 мг/кг, на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, проявляли дозозависимое эндотелио- и кардиопротективное действие, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого рассабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов >Юх, улучшении показателей сократимости при проведении нагрузочных проб и предотвращении развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и гипертрофии кардиомиоцитов. Наиболее активным оказался розувастатин в дозе 8,6 мг/кг.

Комбинированное использование эндотелиопротектора Ь-аргинина (200 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатин (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание Ь-аргинина с аторвастатином.

Комбинированное использование эндотелиопротектора резвератрола (2 мг/кг) с ингибиторами ГМГ-Ко-А-редуктазы симвастатином (4,6 мг/кг), аторвастатин (2,2 мг/кг) и розувастатином (2,2 мг/кг) показало аддитивное эндотелио- и кардиопротективное действие. Наиболее эффективной комбинацией является сочетание резвератрола с симвастатином.

Комбинации эндотелиопротекторов Ь-аргинина и резвератрола со статинами на модели Ь-ИАМЕ индуцированного дефицита N0 следует рассматривать как рациональные, что позволяет за счет патогенетически оправданного воздействия на различные механизмы рекомендовать их к клиническому изучению.

Подводя итог представленным экспериментальным данным, об эндотелио- и кардиопротективном действиях статинов и их комбинации с Ь-аргинином и резвератролом можно предположить несколько точек приложения действия статинов, представленных на схеме (рис. 4):

- ингибирование протеинкиназы С;

- снижение ПОЛ;

- мембранстабилизирующее действие;

- повышение внутриклеточных уровней цАМФ и цГМФ;

- повышение экспрессии еЫОБ;

-- ингибирование продукции вазоконстрикторов эндотелина 1 и тромбоксана В2;

L - цитрулин

1NOS

L-АРГИНИН

ONOO

Лпнп

Поврежден! мембран

NF ^ карраВ

ЦИТОКИНЫ. ■*хемоаттрактанты

NF карраВ ядро

Повреждение ьдмбран

ЦИТО КИ НЬI,

02- У ядро макрофаг пенистая клетка г f цАМФ

РЕЛАКСАЦИЯ]

ТФ, ммп, про тромбин,ФВ эгация грегация цАМФ

Су б э ндотш! и ал ь н ое пространство цитотоксичность

1^^^^яяш^ш

Рис. 4.2. Схема возможных путей реализиции противовоспалительных эффектов ингибиторов ГМК-Ко-А-редуктазы. Объяснения в тексте.

-снижение уровня кальция в цитозоле через воздействие на кальциевые каналы;

- а также увеличение уровня глюкокортикоидов.