Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Рецепторы врожденного иммунитета: ассоциированные Той-подобными рецепторами функции клеток иммунной системы в норме и при первичных иммунодефицитах
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Автореферат диссертации по медицине на тему Рецепторы врожденного иммунитета: ассоциированные Той-подобными рецепторами функции клеток иммунной системы в норме и при первичных иммунодефицитах
На правах рукописи
ВАРИВОДА Анна Сергеевна
РЕЦЕПТОРЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА: АССОЦИИРОВАННЫЕ С ТОЬЬ-ПОДОБНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В НОРМЕ И ПРИ ПЕРВИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТАХ
14 00 36 - аллергология и иммунология
Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва-2008
003444935
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель
доктор медицинских наук, профессор Леонид Васильевич Кованьчук Научный консультант:
кандидат медицинских наук МаршиВшсгоровнаХорева
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук; профессор МфинаАлександровпаСгенина
Российский Государственный Медицинский Университет доктор р.кдицинских наук, профессор Леонид Петрович Алексеев
Инсппуг иммунологии ФМБА Росши
Ведущая организация:
Московская медицинская академия им И М Сеченова
Защита диссертации состоится «22» сентября 2008 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 208 072 05 при Российском государственном медицинском университете по адресу 117997, г Москва, ул Островитянова, д 1
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета по адресу 117997, Москва, ул Островитянова, д 1
Автореферат разослан «15» июля 2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент
ТЕ. Кузнецова
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической иммунологии является изучение врожденного иммунитета Врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов Он реализуется через клеточные и гуморальные факторы Факторы врожденного иммунного ответа предсуществуют или индуцируются быстро (минуты, часы) после инфекции Компоненты врожденного иммунного ответа не изменяются в процессе жизни организма, контролируются генами зародышевой линии и передаются по наследству
Важным компонентом системы врожденного иммунитета являются патгерн-распознающие рецепторы (ПРР), участвующие в распознавании консервативных молекулярных структур микроорганизмов, так называемых РАМР (паттерны, ассоциированные с микроорганизмами)
Реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится, в большей степени, на семейство эволюционно консервативных рецепторов, известных как ТоИ-подобные рецепторы (TLR), которые играют решающую роль в ранней защите организма от патогенов TLR являются сигнальными ПРР и рассматриваются исследователями, как ключевые рецепторы врожденного иммунитета [RMedzhitov, CJ Janeway, 1997]. Изучение TLR выявило связь между врожденным и приобретенным иммунитетом Распознавание микробных компонентов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФНа/р и других), костимуляторных молекул и некоторых других генов Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и, в дальнейшем, направляют развитие адаптивного иммунного ответа [Т Kawai, S Akira, 2007, L С Parker et al, 2007, F Sandor et M Buc, 2005] Характер и интенсивность ответа, опосредуемого TLR, определяется несколькими компонентами, составляющими систему TLR Система TLR включает лиганды TLR, сами рецепторы (гены, кодирующие TLR, мРНК, белок), молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала — адаптерные белки, а также
1
эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации Т1Л1 и опосредуют их дальнейшие эффекты
В последние годы накапливается все больше сведений о патологиях, связанных с То11-подобными рецепторами Широкий спектр лигандов ТТЛ и представленность этих рецепторов на большинстве клеток организма способствуют вовлечению ТЪЯ в патогенез многих заболеваний Дефекты в системе ТЬЯ нарушения распознавания лигандов, экспрессии ТЪИ, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов ТЫ1 могут приводить к развитию тяжелых инфгхцнс::::ых заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и др Выявленные дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от ИЛ, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекциям, как, например, у больных с дефектом гена, кодирующего 1ЯАК4 киназу
Для выявления состояний, связанных с нарушением функционирования системы ТЬЯ необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы ТЬЛ, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории
Первичные иммунодефицита с дефектами антителообразования (ОВИН и X-АГГ) характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями Иммунопатогенез ОВИН до конца не ясен Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Ваугу I е1 а1, 2004, Сиппи^Ьат-ЯипсИез С., 11ас1щап Ь, 2005, Уо!^ РЕ й а1, 2008] Изучение механизмов нарушений функционирования врожденной иммунной системы у этих больных позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН
На кафедре иммунологии РГМУ (зав кафедрой - профессор Л В. Ковальчук) с 2005 года проводится работа по оценке системы TLR в норме и при различных иммунопатологических состояниях ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить функциональное состояние экспрессирующих TLR мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1) Отработать оптимальные условия оценки функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR in vitro
2) Оценить эффективность действия различных лигандов TLR на цитокинсинтезирующую функцию МНК периферической крови здоровых доноров
3) Изучить влияние лигандов ТоН-подобных рецепторов на выработку ФНОа МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ)
4) Оценить экспрессию TLR на поверхности моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных ОВИН и Х-АГГ методом проточной цитофлуорометрии
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Работа содержит новые данные о дефектах в системе ТоН-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и X-АГТ). Показано, что при данных ПИД нарушена выработка ФНОа в ответ на стимуляцию лигандами TLR2 и TLR4 Выявлен дисбаланс индуцированной лигандом TLR4 ЛПС выработки ФНОа, ИЛ-12 и ИФН-а МНК больных ОВИН Показаны различия в экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови здоровых доноров и больных ПИД с дефектами антителообразования Обнаружены различия количества моноцитов, несущих
на своей поверхности исследуемые ТЬП, у здоровых доноров и больных ПИД и плотности экспрессии ТЫ12 и ТЫН на одной клетке
Полученные данные позволяют предположить, что дефекты созревания антигенпрезентирующих клеток, выявляемые у больных ОВИН, могут быть связаны с нарушениями в системе ТЬК
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
В данной работе определены оптимальные условия оценки цитокинсиктезирующей функции активированных лигандами ТЫ1 МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией Оценена выработка ФНОа и ИФН-а МНК в ответ на лиганды ТЫ1 у здоровых доноров Выявлено, что максимальным стимулирующим влиянием на выработку ФНОа МНК обладают лиганды ТЪЯ2 и ТЫ14, а на выработку ИФН-а лиганды Т1Л4, ТЬКЗ и ТЬЯ9 Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией У больных ПИД с дефектами антителообразования в ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНОа в ответ на лиганды ТЫ12 и ТЫ14 и нарушение экспрессии ТЬН.2 и Т1*Я4 на моноцитах больных ОВИН, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, используются в практике лечебно-диагностической работы в отделении клинической иммунологии РДКБ
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях
кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в
2005 году на Конференции молодых ученых Института иммунологии, в 2006
году на II Всероссийском кош-рессе по детской аллергологии и иммунологии, в
4
2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007 и 2008 году в Москве на XIII, XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» и на Объединенном иммунологическом форуме (г Санкт-Петербург, 2008)
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.
СТРУКТУРА II ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 40 рисунков Библиографический указатель включает 11 отечественных и 149 иностранных источников
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе исследования проведено обследование 31 больного с ПИД и 37 здоровых доноров Критерием отбора доноров было отсутствие инфекционных и аллергических заболеваний. Всем больным первичными иммунодефицитами диагноз был поставлен в соответствии с диагностическими критериями, разработанными Европейским обществом иммунодефицитов (ЕБГО)
Методы исследования Источником МНК служила гепаринизированная венозная кровь обследованных доноров и больных Фракция мононуклеарных клеток выделялась на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/мл После выделения оценивалась жизнеспособность клеток окрашиванием 0,1% раствором трипанового синего
Для культивирования мононуклеарных клеток использовали 24-луночные
планшеты «Соэгаг» Культивирование проводили при I 37°С в атмосфере 5%
С02 в термостате В качестве питательной среды использовали ЯРМ1 1640 с
добавлением инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 300
мкг/мл Ь-глутамина и 0,02 М НЕРЕБ-буфера и 100 мкг/мл гентамицина
5
Рабочая концентрация клеток составляла 1х106/мл В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы ЛПС, зимозан, пептидогликан, Флагеллин, Р(1 С) и ОДН CpG Контролем служили МНК, культивируемые только в среде RPMI 1640 или в присутствии ОДН, не содержащего CpG последовательности По окончании культивирования МНК осаждали центрифугированием. Полученные супернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -70°С Концентрацию цитокинов в полученных супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА)
Экспрессию молекул на поверхности кчеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием МкАТ Для определения экспрессии антигенов на поверхности моноцитов периферической крови МНК инкубировали с мечеными МкАТ в течение 30 мин при 4°С, отмывали при 1200 об/мин при 4°С и фиксировали раствором BD Cell Fix Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США)
В каждом образце выявляли процент двойных позитивных (CD14+TLR2+ или CD14+TLR4+) клеток и количество ФИТЦ-меченых и ФЭ-мечекых антител, оценивая интенсивность флуоресценции (ИФ)
Статистическую обработку данных проводили в программном пакете StatSoft Statistica Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение. Для сравнения групп по количественным признакам использовали непараметрические критерии U-критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона Различие групп полагали статистически значимым при Р<0,05
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Активация TLR запускает сигнальный каскад, приводящий к активации NF-кВ, что, в свою очередь, приводит к синтезу ФНОа и других провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6 и др ФНОа - один из
основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции
На первом этапе работы мы оценивали спонтанную и стимулированную выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров В качестве стимуляторов продукции ФНОа были выбраны пептидогликан, зимозан, ЛПС, флагеллин, Р(1.С) и CpG, действующие через TLR1/2, TLR2/6, TLR4, TLR5, TLR3 и TLR9, соответственно
При анализе спонтанной выработки ФНОа МНК здоровых доноров нами были выявлены 2 группы с нормальным и повышенным исходным уровнем секреции цитокина Средняя спонтанная продукция ФНОа в I группе доноров составила 4б,74±26,53 пг/мл, а во II группе - 261,86±111,08 пг/мл (рис 1) Группа I включает 30 человек, группа II-7 человек
Гетерогенность исходного уровня продукции цитокина известна также по литературным данным [Дьяконова В А. и др, 2004, Deering RP,Orange JS, 2006] Высокая спонтанная продукция ФНОа может быть связана с предстимуляцией клеток in vivo, а также с физиологической гетерогенностью в группе здоровых доноров
При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию ФНОа МНК принимали спонтанную выработку ФНОа за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию ФНОа оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС) КС рассчитывали как отношение концентрации ФНОа в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации ФНОа в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также для повышения стандартизации метода
На основании проведенных исследований, данных литературы и рекомендаций фирм производителей в дальнейшем для оценки функциональ-
350 300 250
£
5 200
С
150 100 50 0
Рисунок 1. Спонтанная продукция ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров.
ной активности клеток, экспрессирующих TLR, нами были отобраны оптимальные концентрации лигандов TLR: пептидогликак - 2,5 мкг/мл; зимозан - 10 мкг/мл; ЛПС - 0,1 мкг/мл; флагеллин - 0,5 мкг/мл; Р(1:С) - 10 мкг/мл; ОДН CpG - 1,0 мкг/мл. Средние значения по выработке ФНОа МНК здоровых доноров I и II групп под действием лигандов TLR представлены в табл. 1.
Все использованные лиганды оказывали стимулирующее влияние на выработку ФНОа МНК здоровых доноров I к II групп. Проанализировав КС в обеих группах, мы не обнаружили статистически значимых различий в КС различных лигандов TL.R в двух группах здоровых доноров. Учитывая также, что высокая спонтанная выработка ФНОа может быть следствием вирусной инфекции, стрессовых воздействий и др, в качестве контрольной группы в дальнейшем мы рассматривали здоровых доноров I группы (рис. 2).
Максимальным стимулирующим эффектом обладают лиганды TLR1/2 и TLR2/6 - пептидогликан и зимозан, соответственно, а также лиганд TLR4 -
-Среднее i } ±SE ~Т~ ±50
Группа ! Группа II
ЛПС. Меньшей стимулирующей активностью на выработку ФНОа обладают лиганды Т1Л5 и ТЬЯ9.
В группе здоровых людей выявлены индивидуальные особенности профиля | стимулированной лигандами ТЬИ. выработки ФНОа. У одних доноров | максимальное количество ФНОа вырабатывается при стимуляции МНК зимозаном и пептидогликаном, в то время как показатели, полученные при | стимуляции ЛПС, флагеллином и СрО сравнимы с контролем. Максимальная I выработка ФНОа МНК других доноров выявляется под влиянием ЛПС или в ответ на флагеллин и Срв.
Индивидуальные различия выработки ФНОа среди здоровых доноров могут определяться несколькими причинами: различной экспрессией ТЬЯ на МНК, полиморфизмом генов как ТЬЯ, так и ФНОа, исходным функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНОа и других цитокинов.
Рисунок 2. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНОа МНК здоровых доноров в ответ на оптимальные дозы лигандов ТЬЯ.
Для оценки действия исследуемых нами лигандов ТЫ1 на индукцию ИФН I
типа МНК здоровых доноров мы исследовали влияние лигандов ТЬЯ на
9
выработку ИФН-а, который вместе с ИФН-Р принадлежит к интерферонам I типа. В основном синтез ИФН-а индуцируется под действием паттернов вирусного происхождения, таких как одно- и двухцепочечная РНК, вирусная или бактериальная ДНК, а также лигандами ТЪЯ4.
Спонтанная выработка ИФН-а в группе здоровых доноров (п=10) составила 29,94^9,78 пг/мл. Стимулированную лигандами ТЬЯ выработку ИФН-а оценивали также как и для ФНОа, в КС. Выработка ИФН-а стимулировалась под действием ЛПС, Р(1;С) и СрО, причем воздействие СрО оказывало наибольший стимулирующий эффект (рис. 3). Зимозан и фяагеллин не оказывали существенного влияния на выработку ИФН-а. Индивидуальных особенностей в выработке ИФН-а МНК здоровых доноров нами выявлено не было.
з
2,5 2
1
0,5 О
Рисунок 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН-а МНК здоровых доноров под действием оптимальных доз лигандов ТШ.
у 1"
—.....-
-ь т., - —
! 1 ! 1 ! ! — 1
Спонтанная Р(1:С) 20 ЛПС 0,1 Зимозан 10 Флагеллин СрС 10,0
0,5
Таблица 1. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНОа МНК здоровых доноров в ответ на оптимальные дозы лигандов ИЛ
Концентрация лиганда, мкг/мл Псптидогликан 2,5 Знмозан 10,0 лпс 0,1 Флагеллпн 0,5 Р(1:С) 10 ОДИ Срв 1,0 Спонтанная выработка, пг/мл
Группа I 5,33±1,39* 5,86±2,33* 4,02±1,99* 1,89±0,52* 3,82±0,53* 1,83±0,58* 46,74±26,5 3
Группа II 2,13±1,19 5,22±2,77* 3,47±1,29* 1,98±0,66* 2,24±0,18* 1,83±1,09* 261,86±11 1,08
Данные в таблице представлены в КС * - сравнение стимулированной и спонтанной выработки ФНОа в каждой группе доноров по критерию Вилкоксона, р<0,05
Таким образом, определение выработки ИФН-а под влиянием лигандов TLR не дает возможности провести полную оценку стимулирующей активности всех используемых нами основных лигандов TLR, но проведение данного исследования параллельно с изучением выработки ФНОа позволяет получить дополнительную информацию о функциональной активности клеток, экопрессируюших TLR
На следующем этапе работы оценивали спонтанную и стимулированную продукцию ФНОа и ИФН-а у больных ПИД с дефектами антителообразования
• Группа I больных ОВИН - состояла из 9 человек (4 женщины и 5 мужчин) в возрасте от 20 до 45 лег,
• Группа II больных ОВИН - состояла из 14 детей G девочки и 11 мальчиков) в возрасте от 6 до 17 лет
• Группа III больных Х-АГТ - состояла из 13 мальчиков в возрасте от 5 до 17 лет
ОВИН и Х-АГГ характеризуются низким содержанием сывороточных иммуноглобулинов и основными осложнениями данных ПИД являются хронические бактериальные инфекции, преимущественно респираторного и желудочно-кишечного тракта ОВИН является гетерогенной группой, отличающейся многообразием клинических проявлений Патогенез ОВИН обусловлен множественными дефектами и адаптивного, и врожденного иммунитета [Schaffer et al, 2007, Kopecky, Lukesova, 2007, Amoras et al, 2007, Bayry et al, 2005] В основе патогенеза Х-АГГ лежит нарушение дифференцировки В-лимфоцитов, вызываемое мутацией гена btk, кодирующего В-клеточную тирозинкиназу
Во всех группах больных ПИД выявлена повышенная спонтанная продукция ФНОа по сравнению с группой здоровых доноров (табл 2) Все использованные нами лиганды TLR оказывали стимулирующее влияние на продукцию ФНОа МНК больных ОВИН I и II групп Однако при анализе КС
лигандов ТЬЯ мы выявили нарушения в обеих группах больных ОВИН Данные представлены в табл 3
Таблица 2 Спонтанная выработка ФНОгх МНК больных ОВИН. Х-АГТ и здоровых доноров.
Больные Х-АГГ Больные ОВИН, ГруППа 1 Больные ОВИН, группа II Здоровые доноры, rnvmno I ■fJ"""1
Концентрация ФНОа, пг/мл 298,54±153,09 581,19±271,74* 209,74Ü 24,0! 46,74±26,53*
* - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой
больных Х-АГГ, р<0,05
Выявленные нарушения выработки ФНОа МНК больных в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 могут лежать в основе повышенной чувствительности больных ОВИН и Х-АГГ к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам Известно, что наиболее частыми возбудителями инфекции у больных ОВИН и Х-АГГ являются Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae
Дефекты гуморального звена приобретенного иммунитета больных ОВИН приводят к развитию хронических бактериальных инфекций Тогда как развитие клеточного иммунного ответа у данных больных считается сохранным и, по всей видимости, лежит в основе устойчивости к вир* сным инфекциям ИФН-а является одним из основных факторов противовирусной защиты организма, поэтому мы проанализировали спонтанную и стимулированную лигандами TLR выработку цитокина МНК периферической крови больных ОВИН.
Спонтанная продукция ИФН-а МНК периферической крови больных ОВИН оказалась -значительно ниже по сравнению с группой здоровых доноров и составила 5,43±0,87 пг/мл в группе I, и в группе II — 6,45±3,1 пг/мл
Поскольку стимулирующей активностью на выработку ИФН-а МНК периферической крови здоровых доноров в наших экспериментах обладают
13
Таблица 3 Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНОа МНК больных ПИД в ответ на оптимальные дозы лигандов ТЬЯ
Концентрация лиганда, мкг/мл Пептидогликан 2,5 Зимозан 10,0 ЛПС 0,1 Флагеллин 0,5 ОДН СрО 1,0 Спонтанная выработка ФНОа, пг/мл
Больные Х-АГГ 2,61±1,17* 1,01±0,39* 1,61±0,47" 1,63±0,89 1,81±1,00 298,54±153,09
Больные ОВИН, группа I 2,44±0,6 9" Но 1,78±0,65* 1,45±0,36 1,49±0,51 581,19±271,74*
Больные ОВИН, группаП 2,27±0,61# 2,33±1,1* 1,92±0,47* 1,5б±0,69 1,54±0,69 209,17± 124,01*
Здоровые доноры, группа I 5,33±1,39 5,86±2,33 4,02±1,99 1,82±0,64 1,83±0,58 46,74±26,53
КС - коэффициенты стимуляции Н о - не определяли
* - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01
* - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,05
лиганды ТЬКЗ, ТЫ14 и ТЫ19, МНК периферической крови больных ОВИН активировали Р(1:С), ЛПС и ОДН СрО. У больных ОВИН 1 и И группы КС ЛПС, Р(1:С) и СрО статистически значимо отличаются от показателей в группе здоровых доноров. Причем у детей КСлпс. выше как по сравнению с взрослыми больными, так и со здоровыми донорами (рис. 4). Полученные результаты свидетельствуют о дисбалансе в продукции цитокинов (ФНОа и ИФН-а), с которым могут быть связаны особенности клинической картины больных ОВИН.
юо
и ю
|оДаноры я Больные ОВИН ! □ Больные ОВИН |! |
Рисунок 4. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН-а МНК здоровых доноров и больных ОВИН под действием оптимальных доз лигандов ТЬК.
В литературе не описаны прямые молекулярные дефекты, свидетельствующие о нарушениях функционирования ТЬК в клетках больных ОВИН. На основании полученных нами данных о нарушенном ответе МНК периферической кров;; на сткцуляцктс лкггндами Т1Л, мы можем предполагать о существовании дефекта системы ТЬК у больных ОВИН.
Снижение стимуляции ФНОа в ответ на лиганды у больных ОВИН и Х-АГТ может бьггь связано с нарушением экспрессии Л Ж Следующим этапом нашей
ЛПС 0,1 Р(|;С) 20 СрО 1,0
ыкгУмя
работы стало исследование экспрессии ТЬЯ2 и ТЬК4 на поверхности моноцитов периферической крови человека.
Процент моноцитов, несущих на своей поверхности СП 14 антиген, у больных ОВИН статистически значимо не отличался от значения показателя в группе здоровых доноров, тогда как средняя интенсивность флуоресценции СОМ на моноцитах больных была ниже по сравнению с группой здоровых доноров. Также не было выявлено значимых отличий в проценте С014 ТЬК2" и СО!4+Т1Л14+ моноцитов. Однако средняя интенсивность флуоресценции ТЬЯ2 и ТЫ14 на поверхности С014-положительных моноцитов была ниже у больных ОВИН в I и II группах (рис. 5Б и 6Б) по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 3 и 4, рис. 5А и 6А).
10° 1С' ■ ti? 103 10
К)' 11?. I03
TLR2 РЕ
Рисунок 5. Диаграммы Dot Plot и гистограммы свечения TLR2 на моноцитах периферической крови: А - здоровый донор; Б - больной ОВИН.
Анализируя экспрессию TLR2 и TLR4 на CD 14-положительных моноцитах больных Х-АГГ, мы не выявили изменения содержания CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов, но средняя интенсивность флуоресценции TLR2, TLR4 и CD14 ниже по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 4 и 5).
Выявленное нами снижение экспрессии ТЬК. на моноцитах больных. ПИД с дефектами антителообразования, в клинической картине которых наблюдаются рецидивирующие хронические бактериальные инфекции, что может бьггь обусловлено полиморфизмом или мутациями в генах ТЬЯ, нарушением процессов транскрипции и трансляции продуктов этих генов, а также нарушением регуляции поверхностной экспрессии молекул. Известно, что цитокины участвуют в регуляции экспрессии ТЬЯ. Возможно, различные лекарственные препараты также оказывают влияние на уровень экспрессии ТЬЯ и их корецегггоров на поверхности клетки.
е5
в.
i
а.:
o-L é
. .ц jj^fei.............
tf é TLR4 PE-C>í
Рисунок 6. Диаграммы Dot Plot и гистограммы свечения TLR4 на моноцитах периферической крови: А - здоровый донор; Б - больной ОВИН.
Согласно литературным данным у больных с бактериальными и вирусными инфекциями экспрессия TLR2, TLR4 и корецепторных молекул на лейкоцитах периферической крови (моноцитах, дендритных клетках, нейгрофилах и др.) возрастает [Miyazaki et a!, 2008; Sato et al, 2007; Orihara et a!, 2007]. Таким образом, снижение плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН вносит сбой вклад в развитие клинической картины, наблюдаемой у этих больных ОВИН,
Таблица 4. Экспрессия СР14 и ТЫ12 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров
%С014+ % СЭ14+ТЬЯ2+ СИФ С014 СИФ ТЫ12
Здоровые доноры 66,87±9,28 55,45±10,84 272,17±3 7,43 99,45±31,93
Больные ОВИН, группа I 63,55±18,57 39,08±20,13 18б,71±43,68* 40,21±13,39*
Больные ОВИН, 64,66±15,84 35,03±25,22 168,03±50,55* 50,39±18,46*
группа II
Больные Х-АГГ 65,24±14,02 33,43±13,36 222,56±28,69* 47,96±11,67*
*- сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01
Таблица 5 Экспрессия СР14 и Т1Л \ на поверхности моношггов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров
% СО 14* % СБ14+Т1Л14+ СИФ СЭ14 СИФ ТЫ14
Здоровые доноры 66,87±9,28 51,09±11,75 301,57±53,57 105,56±15,01
Больные ОВИН, группа I 63,5'>±18,57 50,16±17,87 187,98±46,63* 23,04±17,97*
Больные ОВИН, 64,66±15,84 60,29±15,21 197,35±41,25* 28,24Ы9,99*
группа II
Больные Х-АГГ 65,24±14,02 49,69±23,81 221,93±35,08* 22,34±11,83*
*- сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01
Выявленные изменения в экспрессии TLR и опосредованной лигандами TLR цитокинсинтезирующей функции МНК у больных ПИД с дефектами антителообразования помогают уточнить патогенез ОВИН и могут служить новой терапевтической мишенью й лечении больных ОВИН и Х-АГГ Анализ профиля выработки цитокинов стимулированными лигандами TLR мононуклеарными клетками периферической крови человека и определение поверхностной экспрессии CD 14 и TLR можно использовать в оценке функционального состояния клеток врожденного иммунитета и рассматривать как маркеры диагностики и прогноза течения иммунопатологий человека
ВЫВОДЫ
1. Отработаны оптимальные условия для определения функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR, по продукции ФНОа in vitro Максимальным стимулирующим действием обладают пептидогликан, зимозан и ЛПС - лиганды TLR1/2, TLR2/6 и TLR4 рецепторов, соответственно.
2 Показатели выработки ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на различные лиганды TLR, оцениваемые в коэффициентах стимуляции (отношение стимулированной лигандом TLR продукции ФНОа к спонтанной продукции цитокина) варьируют у разных доноров Вариабельность коэффициентов стимуляции выработки ФНОа менее выражена у больных ПИД с дефектами антителообразования.
3 У взрослых и детей, больных ОВИН, и детей с Х-АГГ по сравнению с нормой нарушена выработка ФНОа спонтанная продукция цитокина повышена, а индуцированная лигандами TLR - снижена
4 У больных ОВИН коэффициенты стимуляции лигандов TLR2 и TLR4 снижены по сравнению с теми же показателями в группе здоровых доноров и значимо не различаются между возрастными группами ОВИН
5 У больных ОВИН обнаружен дисбаланс выработки цитокинов, характеризующийся пониженной выработкой ФНОа и повышенной выработкой ИФНа в ответ на стимуляцию лигандом TLR4 - ЛПС
6 Процентное содержание С014+ТЫ12+ и С014+ТЫ14+ моноцитов периферической крови сходно у больных ОВИН и здоровых доноров Однако количественная экспрессия Т1Л2 и ТЫ14, оцениваемая по средней интенсивности флуоресценции, статистически значимо снижена у больных ОВИН
7 Выявленные нарушения ТЬЯ-зависимой выработки ФНОа и экспрессии ТЫ12 и ТЫ14 на моноцитах не отличаются достоверно между больными ОВИН и больными Х-АГГ
Практические рекомендации Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета (ТЬК) у здоровых людей и больных с иммунопатологией
Анализ профиля выработки цитоккнов стимулированными лигандами ТЫ*, мононуклеарными клетками периферической крови человека и определение поверхностной экспрессии СБ14 и ТЬН. можно использовать в оценке функционального состояния клеток врожденного иммунитета и рассматривать как маркеры диагностики н прогноза течения иммунопатологии человека
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1 Хорева М В , Долгина Е Н , Пащенко О Е, Лаврова Ю В , Варивода л С , Кондратенко ИВ, Ковальчук Л В Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-12 и ИНФ-у МНК периферической крови у детей, больных ОВИН Аллергология и иммунология -2004 -т5, >Г°1.-С 153
2 Ковальчук Л В , Хорева М В , Варивода А С, Галухина Е Р , Пащенко О Е, Грачева Л А , Кондратенко И В , Бологое А А Особенности выработки ФНО-а под влиянием различных стимулов в норме и при первичных иммунодефицитах Ал^голошя и иммунология.-2005 -т 6,№2 -С 159
3 А С Варивода Изучение функциональной активности клеток мсноцитарно-макрофагального звена больных. первичными иммунодефицитами под влиянием стимуляции То11-подобных рецепгоров различными лигандами Вестник РГМУ - 2005 - спец выпуск, №3 (42) -С 159.
4 Ковальчук JIВ, Хорева М В , Варивода А С Врожденные компоненты иммунитета То11-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии ЖМЭИ -2005 -№4 - С. 96-104
5 Kovalchuk L V, Khoreva М V., Varivoda A S Cytokme-secretoiy function of human leukocytes of peripheral blood expressing Toll-like receptors The role of different ligands Abstr of the Congress "Immune-Mediated Diseases from Theory to Therapy", JAP AIR -2005 -v6,suppll -P.91-92
6 Николаева И H, Варивода А.С, Хорева М В , Ковальчук Л В Анализ поверхностной экспрессии CD 14 и CD62L молекул и выработки ИЛ-8 нейтрофилами периферической крови пациентов с инфарктом миокарда под влиянием агонистов TLR2/6 и TLR4. Аллергология и иммунология -2006 -т7,№3 -С. 353.
7. Хорева М В., Варивода А С, Ковальчук Л В , Константинова Е В Изучение функциональной активности То11-подобных рецепторов у больных с инфарктом миокарда Аллергология и иммунология - 2006 -т.7,№3 -С 352
8. Ковальчук Л В, Хорева М В, Варивода А С Дефекты системы врожденного иммунитета у больных с первичными иммунодефицитами Аллергология и иммунология в педиатрии -2006.-№2-3(9) -С 75
9 Хорева М В , Ковальчук Л В , Варивода А С., Николаева И Н , Грачева Л А., Галухина Е Р, Захаров М.В., Болотов А.А. Опосредованные через ТоИ-подобные рецепторы выработка цитокинов и экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами человека Аллергология и иммунология -2006 -т7,№2.-С. 199-206
10.Ковальчук Л.В , Хорева MB., Варивода АС, Пащенко ОЕ, Грачева Л А., Быкова Л.П, Кондратенко И В , Болотов А А. Влияние лигандов То11-подобных рецепторов (TLR) на выработку in vitro провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых людей и больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью ЖМЭИ.-2007 -№1,-С. 38-42
11.Ковальчук ЛВ, Хорева MB, Варивода АС., Пащенко ОЕ, Грачева Л А, Быкова Л П, Кондратенко И В , Болотов А А. Анализ зависимой от То11-подобных рецепторов выработки провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека m vitro у
здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами БЭБИМ. - 2007. - т 144, № 7 - С. 68-71.
12 Ковальчук JIВ, Хорева М.В., Варивода А С, Пащенко О Е, Кондратенко И.В., Грачева JIA Влияние лигандов TLR на выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных первичными иммунодефицитами Сборник тезисов VIII конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармаколо! ии» (27-29 июня 2007). - 2007 - С 55
13 Варивода А С , Ковальчук JIВ , Хорева М В., Пащенко О Е , Кондратенко ИВ Сборник материалов VI Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - 2007 - С 76-77
14.Khoreva М V, Varivoda A S , Paschenko О Е. Expression and functional activity of TL.R2 and TLR4 in patients with congenital disorders of antibody production Abstr of the 2nd Congress "Immune-Mediated Diseases from Theory to Therapy", JAP AIR - 2007 - v 11, suppl 2 - P 30
15 Ковальчук JI В , Хорева M В , Варивода А С, Кондратенко И В , Грачева JI А , Николаева М А Анализ поверхностной экспрессии и TLR2 TLR4 на моноцитах периферической крови больных первичными иммунодефицитами Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - 2008 - С. 161
16 Хорева М В, Ковальчук Л В , Варивода А С , Грачева Л А Подходы к оценке рецепторов врожденного иммунитета. Российский иммунологический журнал -2008 -т 2(11),№2-3.-С 151
17 Варивода А С , Хорева М В, Ксвапьчук Л В, Дерипапа Е В , Кондратенко И В . Грачева Л А, Болотов А А Дефекты в системе Toll-подобных рецепторов у детей с первичными иммунодефицитами Российский иммунологический журнал -2008 -т 2(11),№2-3 -С. 274
18 Варивода АС, Николаева МА, Хорева MB, Ковальчук Л В, Сидоренко И В Экспрессия и функциональная активность TLR2 и TLR4 у больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью Российский иммунологический журнал -2008 -т 2(11),№2-3 -С 274
Список сокращений
ИЛ - интерлейкин
ИФН - интерферон
КС - коэффициент стимуляции
ЛПС - липополисахарид
МкАТ - моноклональные антитела
МНК - мононуклеарные клетки
ОВИН - общая вариабельная иммунологическая недостаточность
ОДН - олигодезоксинуклеотид
ПИД - первичные иммунодефицита
СИФ - средняя интенсивность флуоресценции
Х-АГГ - Х-сцепленная агаммаглобулинемия
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоционат
ФНОа - фактор некроза опухолей а
ФЭ - фикоэритрин
Срй - цитозин полигуанин
Р(1.С) - полиинозин-полицитидин
ТЬЯ - То11-подобные рецепторы
Подписано в печать 08 07 2008 г Печать трафаретная
Заказ №598 Тираж 120 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское щ, 36 (495) 975-78-56» (499) 788-78-56 \vvvw аиЮгсЛга! ги
Оглавление диссертации Варивода, Анна Сергеевна :: 2008 :: Москва
Список сокращений.
Введение.
Глава I. Обзор литературы.
То11-подобные рецепторы, история открытия.
Характеристика То11-подобных рецепторов.
Сигнальные пути То11-подобных рецепторов.
Лиганды То11-подобных рецепторов.
Лиганды TLR2 — пептидогликан и зимозан А.
Лиганд TLR4 - липополоисахарид (ЛПС).
Лиганд TLR5 — флагеллин.
Лиганды TLR3 и TLR9.
Значение То11-подобных рецепторов в норме и при патологии
Возрастные особенности функционирования То11-подобных рецепторов
То11-подобные рецепторы и патология.
Иммунодефицита, связанные с То11-подобными рецепторами
Глава II. Материалы и методы исследования.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Клиническая характеристика обследованных больных.
2.3. Реактивы.
2.4. Методы исследования
2.5 Выделение МНК из периферической крови человека.
2.6. Культивирование МНК периферической крови человека
2.7. Определение концентрации цитокинов в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа.
2.8. Фенотипический анализ клеток.
2.9. Статистическая обработка результатов.
Глава III. Результаты и обсуждение.
3.1. Влияние лигандов То11-подобных рецепторов на выработку ФНОа мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров.
3.1.1. Изучение выработки ФНОа МНК периферической крови человека при стимуляции разными концентрациями лигандов TLR.
3.1.2. Сравнительный анализ продукции ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на различные лиганды TLR.
3.2. Влияние лигандов То11-подобных рецепторов на выработку ИФН-а МНК периферической крови здоровых доноров.
3.3. Влияние лигандов То11-подобных рецепторов на выработку
ФНОа МНК больных ОВИН.
3.3.1. Определение спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови больных ОВИН.
3.3.2. Определение стимулированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК больных ОВИН.
3.4. Влияние лигандов TLR на выработку ФНОа МНК больных Х-АГГ.
3.4.1. Определение спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови больных Х-АГГ.
3.4.2. Определение стимулированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК больных Х-АГГ.
3.5. Влияние лигандов TLR на выработку ИФН-а МНК больных ПИД с дефектами антителообразования.
3.6. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови человека.
3.6.1. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови здоровых доноров.
3.6.2. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных ОВИН.
3.6.3. Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных Х-АГГ.
Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Варивода, Анна Сергеевна, автореферат
Актуальность темы исследования
В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической иммунологии является изучение врожденного иммунитета. Врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов. Он реализуется через клеточные и гуморальные факторы. Факторы врожденного иммунного ответа предсуществуют или индуцируются быстро (минуты, часы) после инфекции. Компоненты врожденного иммунного ответа не изменяются в процессе жизни организма, контролируются генами зародышевой линии и передаются по наследству [3,11,26,27].
Важным компонентом системы врожденного иммунитета являются паттерн-распознающие рецепторы (ПРР), участвующие в распознавании консервативных молекулярных структур микроорганизмов, так называемых РАМР (паттерны, ассоциированные с микроорганизмами) [103].
Реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится, в большей степени, на семейство эволюционно консервативных рецепторов, i> известных как То11-подобные рецепторы (TLR), которые играют решающую роль в ранней защите организма от патогенов. TLR являются сигнальными
ПРР и рассматриваются исследователями, как ключевые рецепторы врожденного иммунитета [103,116,140]. Изучение TLR выявило связь между врожденным и приобретенным иммунитетом [70]. Распознавание микробных компонентов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12,
ИФНа/р и других), костимуляторных молекул и некоторых других генов.
Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и, в дальнейшем, направляют развитие адаптивного иммунного ответа
6,69,120,140,145]. Характер и интенсивность ответа, опосредуемого TLR, определяется несколькими компонентами, составляющими систему TLR.
Система TLR включает лиганды TLR, сами рецепторы (гены, кодирующие TLR, мРНК, белок), молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала — адаптерные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты.
В последние годы накапливается все больше сведений о патологиях, связанных с То11-подобными рецепторами. Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на большинстве клеток организма способствуют вовлечению TLR в патогенез многих заболеваний [94,131,146]. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и др. [9,12,14,19]. Выявленные дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекциям, как, например, у больных с дефектом гена, кодирующего IRAK4 киназу [43,122].
Для выявления состояний, связанных с нарушением функционирования системы TLR необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории.
Первичные иммунодефицита с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Иммунопатогенез ОВИН до конца не ясен. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [24,40,157]. Изучение механизмов нарушений функционирования врожденной иммунной системы у этих больных позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН.
Цель исследования
Изучить функциональное состояние экспрессирующих TLR мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования
Задачи исследования
1) Отработать оптимальные условия оценки функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR in vitro.
2) Оценить эффективность действия различных лигандов TLR на цитокинсинтезирующую функцию МНК периферической крови здоровых доноров.
3) Изучить влияние лигандов То11-подобных рецепторов на выработку ФНОа МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ).
4) Оценить экспрессию TLR на поверхности моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных ОВИН и Х-АГГ * методом проточной цитофлуорометрии.
Научная новизна работы
Работа содержит новые данные о дефектах в системе То11-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (общая вариабельная иммунологическая недостаточность - ОВИН, и Х-сцепленная агаммаглобулинемия - Х-АГГ). Показано, что при данных ПИД нарушена выработка ФНОа в ответ на стимуляцию лигандами TLR2 и TLR4. Выявлен дисбаланс индуцированной лигандом TLR4 ЛПС выработки ФНОа, ИЛ-12 и ИФН-а МНК больных ОВИН.
Показаны различия в экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови здоровых доноров и больных ПИД с дефектами антителообразования. Обнаружены различия количества моноцитов, несущих на своей поверхности исследуемые TLR, у здоровых доноров и больных ПИД и плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на одной клетке.
Полученные данные свидетельствуют о том, что дефекты врожденного иммунитета, выявленные у больных ОВИН, могут быть связаны с нарушениями в системе TLR.
Практическая значимость диссертации
В данной работе определены оптимальные условия оценки цитокинсинтезирующей функции активированных лигандами TLR МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией. Оценена выработка ФНОа и ИФН-а МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых доноров. Выявлено, что максимальным стимулирующим влиянием на выработку ФНОа МНК обладают лиганды TLR2 и TLR4, а на выработку ИФН-а лиганды TLR4, TLR3 и TLR9. Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией. У больных ПИД с дефектами антителообразования в ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНОа в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 и нарушение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН.
Апробация результатов диссертационной работы
Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в 2005 году на Конференции молодых ученых Института иммунологии, в 2006 году на П Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007 и
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 160 источников (11 отечественных и 149 зарубежных). Работа содержит 23 таблицы и 40 рисунков.
Заключение диссертационного исследования на тему "Рецепторы врожденного иммунитета: ассоциированные Той-подобными рецепторами функции клеток иммунной системы в норме и при первичных иммунодефицитах"
выводы
1. Отработаны оптимальные условия для определения функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR, по выработке ФНОа in vitro. Максимальным стимулирующим действием обладают пептидогликан, зимозан и ЛПС - лиганды TLR1/2, TLR2/6 и TLR4 рецепторов, соответственно.
2. Показатели выработки ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на различные лиганды TLR, оцениваемые в коэффициентах стимуляции (отношение стимулированной лигандом TLR продукции ФНОа к спонтанной продукции цитокина) варьируют у разных доноров. Вариабельность коэффициентов стимуляции выработки ФНОа менее выражена у больных ПИД с дефектами антителообразования.
3. У взрослых и детей, больных ОВИН и детей с Х-АГГ по сравнению с нормой нарушена выработка ФНОа: спонтанная продукция цитокина повышена, а индуцированная лигандами TLR - снижена.
4. У больных ОВИН коэффициенты стимуляции лигандов TLR2 и TLR4 снижены по сравнению с теми же показателями в группе здоровых доноров и значимо не различаются между возрастными группами ОВИН.
5. У больных ОВИН обнаружен дисбаланс выработки цитокинов, характеризующийся пониженной выработкой ФНОа и повышенной выработкой ИФНа в ответ на стимуляцию лигандом TLR4 - ЛПС.
6. Процентное содержание CD 14 TLR2 и CD14+TLR4+ моноцитов периферической крови сходно у больных ОВИН и здоровых доноров. Однако количественная экспрессия TLR2 и TLR4, оцениваемая по
7. Выявленные нарушения TLR-зависимой выработки ФНОа и экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах не отличаются достоверно между больными ОВИН и больными Х-АГГ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Система TLR играет важную роль в активации врожденного и приобретенного иммунитета. Запуск сигнальных путей TLR приводит к выработке широкого спектра эффекторных молекул, вовлеченных в развитие воспалительного ответа на патогенные факторы, однако, неадекватная (чрезмерная или наоборот, недостаточная) активация TLR может приводить к негативным последствиям. В связи с нарастающим количеством патологий, в развитие которых вовлекаются TLR, необходимо разрабатывать надежные и воспроизводимые в клинической лаборатории методы оценки функционирования TLR.
Нами разработан подход к оценке функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови человека, экспрессирующих TLR, in vitro. Взаимодействие TLR с лигандами приводит к запуску MyD88-зависимых и Му088-независимых сигнальных путей, в результате активируя выработку провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8 и др), хемокинов, а также ИФН I типа и продуктов ИФН-индуцибельных генов. В работе исследована выработка ФНОа и ИФН-а МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых доноров. Мы определили оптимальные условия оценки цитокинсинтезирующей функции активированных лигандами TLR МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией. Наиболее информативным является определение ФНОа в 24-х часовых супернатантах культур МНК периферической крови, стимулированных различными лигандами TLR. В качестве стимуляторов TLR мы использовали высокоспецифичные лиганды TLR: пептидогликан, зимозан, ЛПС, флагеллин, ОДН CpG и Р(1:С). ФНОа является одним из основных провоспалительных цитокинов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции в организме. Выявлено, что все лиганды TLR стимулируют выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров, тогда как продукция ИФН-а активировалась только лигандами TLR3, TLR4 и TLR9.
Максимальным стимулирующим влиянием на продукцию ФНОа МНК периферической крови обладают лиганды TLR2 и TLR4.
Отмечены индивидуальные особенности выработки ФНОа, но не ИФН-а, в ответ на различные лиганды TLR. Индивидуальные различия продукции ФНОа среди здоровых доноров, возможно, определяются несколькими причинами: различной экспрессией TLR на мононуклерных клетках, полиморфизмом генов как TLR, так и ФНОа, исходным функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНОа и других цитокинов.
Данный метод позволяет оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у человека. В работе впервые изучена опосредованная лигандами TLR цитокинсинтезирующая функция МНК больных ОВИН.
Молекулярно-генетические дефекты, локализуемые при ОВИН, касаются в основном адаптивного звена иммунной системы [86,132]. В последнее время появились публикации, сообщающие о дефектах врожденного иммунитета у больных ОВИН [16,25,]. В том числе обсуждаются нарушения в функционировании антигенпрезентирующих клеток (рис 40). Описываются дефекты созревания и дифференцировки дендритных клеток, нарушение экспрессии костимулирующих молекул CD80/86, CD83, CD40, различных активационных маркеров дендритных клеток, таких как HLA-DR, CD la, CD 11с [24,134], также у некоторых больных отмечается снижение содержания дендритных клеток (в особенности плазмацитоидных) в периферической крови по сравнению с здоровыми людьми [148,157]. Дендритные клетки больных ОВИН характеризуются сниженной выработкой ИЛ-12 в ответ на различные стимуляторы (ЛПС, CD40L и ФНОа) [21,24,25,40]. В ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНОа в ответ на лиганды TLR2 и TLR4. Полученные нами данные свидетельствуют о дефекте выработки ФНОа МНК периферической крови под влиянием лигандов TLR2 и TLR4 и сниженной плотности экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных ОВИН и позволяют предположить, что выявляемые дефекты
100 антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН, связаны с нарушениями в системе TLR.
В нашем исследовании мы показали, что индуцированная лигандами TLR4 и TLR9 выработка ИФН-а МНК периферической крови больных ОВИН не нарушена. Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии дисбаланса индуцированной ЛПС выработки ФНОа, ИЛ-12 и ИФН-а, который возможно обусловлен нарушением сигнальных путей, ведущих к активации транскрипционного фактора NF-kB.
Экспрессия TLR2, TLR4 и корецепторной молекулы CD 14 на поверхности моноцитов периферической крови больных ОВИН существенно ниже по сравнению с группой здоровых доноров. Вероятно, снижение плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН вносит свой вклад в развитие клинической картины, наблюдаемой у больных ОВИН. В литературе имеются противоречивые данные о выработке цитокинов в ответ на лиганды TLR и уровне экспрессии TLR на клетках иммунной системы больных с различными заболеваниями и наблюдается зависимость этого показателя от тяжести течения заболевания, например у больных хроническим гепатитом С и хронической гранулематозной болезнью [62,130]. В обследуемой нами группе больных ОВИН выявлено двое детей, у которых наряду с высокой спонтанной выработкой ФНОа полностью отсутствовала стимуляция выработки цитокина МНК периферической крови лигандами TLR и определялись низкие уровни экспрессии TLR2, TLR4 и CD 14 на поверхности моноцитов. Обнаруженные дефекты у этих больных ОВИН сочетались с тяжелым течением заболевания, развитием злокачественных новообразований и аутоиммунных осложнений. Полученные нами данные свидетельствуют о дефекте выработки ФНОа МНК периферической крови под влиянием лигандов TLR2 и TLR4 и сниженной плотности экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных ОВИН и позволяют предположить, что выявляемые дефекты созревания и функционирования антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН, связаны с нарушениями различных компонентов системы TLR.
У больных Х-АГГ мы также выявили снижение стимулирующей активности лигандов TLR2 и TLR4 на выработку ФНОа МНК периферической крови, что может быть связано с мутациями в гене btk. Показано, что Btk вовлечена в сигнальные пути от TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 [47,57,73,133] и участвует в индукции синтеза ФНОа. Анализируя экспрессию TLR2 и TLR4 на CD 14-положительных моноцитах больных X-АГГ, мы не выявили изменения содержания CD14 TLR2 и CD 14 TLR4 моноцитов, но средняя интенсивность флуоресценции TLR2, TLR4 и CD 14 ниже по сравнению с группой здоровых доноров. В работе Taneichi et al показано нарушение созревания дендритных клеток под влиянием лигандов TLR2, TLR4 и TLR7/8 и снижение выработки ФНОа в ответ на эти лиганды, при этом экспрессия TLR на дендритных клетках больных Х-АГГ не изменялась. Противоречивые данные об уровнях экспрессии TLR на клетках больных Х-АГГ могут быть связаны с гетерогенностью, обусловленной различными мутациями Btk, встречающимися у больных Х-АГГ [56,141].
Выявленные изменения в экспрессии TLR и опосредованной лигандами TLR цитокинсинтезирующей функции МНК у больных ПИД с дефектами антителообразования помогают уточнить патогенез ОВИН и могут служить новой терапевтической мишенью в лечении больных ОВИН и Х-АГГ. Анализ профиля выработки цитокинов стимулированными лигандами TLR мононуклеарными клетками периферической крови человека и определение поверхностной экспрессии CD 14 и TLR можно использовать в оценке функционального состояния клеток врожденного иммунитета и рассматривать как маркеры диагностики и прогноза течения иммунопатологий человека.
Дендритная клетка
Нарушение созревания Снижение экспрессии костимуляторных молекул
Дисбаланс в продукции цитокинов
Дефекты костимуляторных молекул Нарушения дифференцировки i
Нарушение эффекторных механизмов приобретенного иммунитета
Рисунок 40. Роль выявленных нарушений в системе TLR в патогенезе ОВИН.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Варивода, Анна Сергеевна
1. Ковальчук Л.В. Антигенные маркеры клеток иммунной системы человека CD (cluster differentiation) система. — Учеб-метод, пособ.- 2003. Москва, РГМУ. - 76 С.
2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. — Учеб-метод, пособ. — 2001. — Москва, РГМУ.- 158 С.
3. Кондратенко И.В., Резник И.Б. Первичные иммунодефициты // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.- 2002. т. 1(2). - С. 40-46.
4. Кондратенко И.В., Болотов А.А. Первичные иммунодефициты / М. Медпрактика-М. - 2005. - 232 с.
5. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет / М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2007. 176 с.
6. Резник И.Б. Современное состояние вопроса о первичных иммунодефицитах // Педиатрия. 1996. — №2. — С. 4-14.
7. Рябиченко Е.В., Веткова Л.Г.Бондаренко В.М. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2004. - №3. - С. 98-105.
8. Тумкина М.Е., Pahl А. Альтернативный сплайсинг гена TLR4 в миелоидных клетках при воздействии эндотоксином // Молекулярная медицина. 2003. - № 3. - С.49.
9. Хаитов М.Р. Роль респираторных вирусов в патогенезе бронхиальной астмы // Иммунология. — 2003. — №24. С. 58-65.
10. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. 1999. — М. — Медицина. - 608 с.
11. Abreu М.Т., Arditi М. Innate immunity and Toll-like receptors: clinical implications of basic science research // J. of Pediatry. — 2004. Vol. 144. -P. 421-429.
12. Agren J., Thiemermann C., Foster S.J. et al. Cytokine response to CpG DNA in human leukocytes // Scand. J. Immunol. 2006. - Vol. 64. - P. 61-68.
13. Akira S.,Takeda K., Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity // Nature Immunology. 2001. -Vol. 2(8). - P. 675-681.
14. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signaling // Nature Reviews Immunology. 2004 - Vol. 4. - P. 499-511.
15. Amoras A.L.B., da Silva M.T.N., Zollner R.L. et al. Expression of Fey and complement receptors in monocytes of X-linked agammaglobulinemia and common variable immunodeficiency patients // Clin. Exp. Immunol. 2007. - Vol.150. - P.422-28.
16. Anders H.J., Banas В., Schlondorff. Signalling danger: Toll-like receptors and their potential roles in kidney disease // J. Am. Soc. Nephrol. 2004. - Vol. 15. -P. 854-867.
17. Anderson K.V., Bokla L., Nusslein-Volhard C. Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll gene product // Cell. 1985. Vol. 42. - P. 791798.
18. Arkwright P.D., Abinun M., Cant A.J. Autoimmunity in human primary immunodeficiency diseases // Blood. 2002. - Vol. 99(8). — P. 2694-2702.
19. Armant M.A., Fenton M.J. Toll-like receptors family of pattern-recognition receptors in mammals // Genome Biology. 2002. — Vol. 3(8). -P. 3011.1-301 1.6.
20. Bacchelli C., Buckridge S., Thrasher A.J. et al. Translational mini-review series on immunodeficiency: molecular defects in common variable immunodeficiency // Clin Exp Immunol. 2007. — Vol.149(3). - P. 401-409.
21. Barchet W, Cella M, Colonna M. Plasmacytoid dendritic cells — virus experts of innate immunity // Sem Immunol. — 2005. Vol. 17. -P. 253-261.
22. Toll-like receptors (TLR) and innate immunity. Handbook of experimental pharmacology / Bauer S, Hartmann G. Springerlink. -2008. - VII. - 240 p.
23. Bayry. J., Lacroix-Desmazes S., Kazatchkine M.D. et al. Common variable immunodeficiency is associated with defective functions of dendritic cells // Blood. 2004. - Vol.104(8). - P. 2441-2443.
24. Bayry J., Hermine. O., Webster D. et al. Common variable immunodeficiency: the immune system in chaos // Trends Mol. Med. — 2005. V.l 1(8). - P. 370-6.
25. Beutler В., Hoebe H.,Ulevitch R.J. How we detect microbes and respond to them: the Toll-like receptors and their transducers. J.Leukoc.Biol.2003,74:479-485.
26. Bellocchio S., Montagnoli C., Bozza S. et al. The contribution of the Toll-like/IL-1 receptor superfamily to innate and adaptive immunity to fungal pathogens in vivo // The Journal of immunology. -2004. Vol. 172. - P. 3059-3069.
27. Bihl F., Salez L., Beaubier M.et al. Overexpression of Toll-like receptor 4 amplifies the host response to lipopolysaccharide andprovides a survival advantage in transgenic mice // The Journal of Immunology. 2003. - Vol. 170. - P. 6141-6150.
28. Bjork P. Dormant or deficient? Dendritic cells in CVID // Blood. -2004. Vol. 4(8). - P. 213.
29. Boehme K.V., Compton T. Innate sensing of viruses by Toll-like receptors // Journal of Virology. 2004. - Vol. 78(15). - P. 78677873.
30. Borden E.C., Sen G.C., Uze G. et al. Interferons at age 50: past, current and future impact on biomedicine // Nature Rev. Drug Discov.- 2008. Vol. 6. - 975-990.
31. Boyum A. Separation of lymphocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1968. - Vol. 21(1). - P. 97-98.
32. Cambronero R., Sewell W.A., North M.E. et al. Up-regulation of IL-12 in monocytes: a fundamental defect in common variable immunodeficiency // J. Immunology. 2000. - Vol. 161(1). - P. 488494.
33. Caroff M.D., Karibian J.M. Cavaillon et al. Structural and functional analyses of bacterial lipopolysaccharides // Microbes Infect. 2002. - Vol. 4. - P. 915-920.
34. Castigli E, Wilson SA, Garibyan L, Rachid R, Bonilla F, Schneider L, Geha RS. TACI is mutant in common variable immunodeficiency and IgA deficiency // Nature Genetics. 2005. - Vol. 17(8). - P. 829834.
35. Chelvarajan R.L., Collins S., Doubinskaia I.E. et al. Defective macrophage function in neonates and its impact on unresponsiveness of neonates to polysaccharide antigens // Journ. of Leukocyte Biology.- 2004. -Vol. 75. P. 982-994.
36. Ciacci-Woolwine F., Kucera LS, Richardson SH., Iyer NP, Mizel SB. Salmonellae activate tumor necrosis factor alpha production in a human promonocytic cell line via a released polypeptide // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 4624-33.
37. Cook D.N., Pisetsky D.S., Schwartz D.A. Toll-like receptors in the pathogenesis of human disease // Nature Immunology. — 2004. Vol. 5(10). - P. 975 - 979.
38. Cunningham-Rundles C., Radigan L. Deficient IL-12 and dendritic cell function in common variable immune deficiency // Clin. Immunol.- 2005. V.115. - P. 147-153.
39. Cunningham-Rundles C, Radigan L, Knight AK, Zhang L., Bauer L, Nakazawa A. TLR9 activation is defective in common variable immune deficiency // J. Immunol. 2006. - Vol. 176. - P. 1978-1987.
40. Erridge C., Stewart J, Poxton I.R. Monocytes heterozygous for the Asp299Gly and Thr399Ile mutations in the Toll-like receptor 4 gene scow no deficit lipopolysaccharide signaling // J.Exp.Med.2003. Vol. 197. - P. 1787-1791.
41. Day N., Tangsinmankong N., Ochs H. et al. Interleukin receptor-associated kinase (IRAK-4) deficiency associated with bacterial infections and failure to sustain antibody responses // J. Pediatr.2004. Vol. 144. - P. 524-526.
42. Deane JA, Bolland S. Nucleic acid-sensing TLRs as modifiers of autoimmunity // J. Immunol. 2006. - Vol. 177. - P. 6573-6578.
43. Deering R, Orange JS. Development of a clinical assay to evaluate Toll-like receptor function // Clin Vaccine Immunol. 2006. - Vol. 13(1). - P. 68-76.
44. Dmitriev BA, Ehlers S., Rietschel E.Th. Layered murein revisited: a fundamentally new concept of bacterial cell wall structure, biogenesis and function // Med Microbiol Immunol. 1999 — Vol.187.- P. 173-181.
45. Doyle S.L., Jefferies С.A., Feighery C., O'Neill L.A. Signaling by Toll-like receptors 8 and 9 requires Bruton's tyrosine kinase // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282(51). - P. 36953-60.
46. Durand V., Wong S.Y.C., Tough D.F., Bon A. Shaping of adaptive immune response to soluble proteins by TLR agonists: a role of IFN-a/p // Immunology and Cell Biology. 2004. - Vol. 82. - P. 596-602.
47. Farina C., Thiel D., Semlinger B. et al. Distinct response of monocytes to Toll-like receptor ligands and inflammatory cytokines // International Immunology. 2004. - Vol. 16(6). - P. 799-809.
48. Fischer A. Human primary immunodeficiency diseases: a perspective // Nature Immunology. 2004. - Vol. 5. - P. 23-30.
49. Folwaczny M., Glas J.,Torok H.-P. Toll-like (TLR)- 2 and 4 mutations in periodontal disease // Clin.Exp.Immunol. — 2004. — Vol. 135. P. 330-335.
50. Fournier B, Philpott DJ. Recognition of Staphylococcus aureus by the innate immune system // Clin Microbiol Rev. 2005. - Vol. 18(3). - P. 521-40.
51. Fuchsberger M, Hochrein H, Keeffe M. Activation of plasmacytoid dendritic cells // Immunology and Cell Biology. 2005. - Vol. 83. -P. 571-577.
52. Ghosh Т.К., Mickelson D.J., Solberg J. et al. TLR-TLR cross talk in human PBMC resulting in synergistic and antagonistic regulation of type-1 and 2 interferons, IL-12 and TNFa // Int. Immunopathol. — 2007. Vol. 7. P. 1111-1121.
53. Halliman M., Ramet M., Ezekowitz R.A. Toll-like receptors as Sensors of Pathogen // Pediatric Research. 2001. - Vol. 50(3). - P. 315-321.
54. Han J, Ulevitch RJ. Limiting inflammatory responses during activation of innate immunity // Nature Immunology. 2005. - Vol V 6(6). - P. 1198-1205.
55. Hammarstrom L., Vorechovsky I. Webster D. Selective IgA deficiency (SIgAD) and common variable immunodeficiency (CVID) // Clinical&Experimental Immunology. 2000. - Vol. 120 (2). -P. 225231.
56. Hartl D., Lehmann N., Hoffmann F. et al. Dysregulation of innate immune receptors on neutrophils in chronic granulomatous disease // J. Allergy Clin. Immunol. 2008. - Vol. 121(2). - P.375-382.
57. Hashimoto C., Hudson K.L., Anderson K.V. The Toll gene of Drosofila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein // Cell. 1988. - Vol. 52. - P. 269279.
58. Hatao F.,Muroi M., Hiki N. Et al. Prolonged Toll-like receptor stimulation leads to down-regulation of IRAK-4 protein // Journ.of Leukocyte Biology. 2004. - Vol. 76. - P. 904-908.
59. Hayashi F., Smith D.K., Ozinsky A. et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5 // Nature. 2001. - Vol. 410. - P. 1099-1103.
60. Haynes L.M., Moore D.D., Kurt-Jones E.A. et al. Involvement of Toll-like receptor 4 in innate immunity to respiratory syncytial virus // Journal of Virology. 2001. - Vol. 75 (22). - P. 10730-10737.
61. Heil F., Hemmi H. et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like receptor 7 and 8 // Science. 2004. - Vol. 303. - P. 1526-1529.
62. Hoebe K., Du X., Georgel P. et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signaling // Nature. 2003. -Vol. 424. - P. 743-748.
63. Hoebe K., Janssen E., Kim S. O. et al. Upregulation of costimulatory molecules induced by lipopolysaccharide and double-stranded RNA occurs by Trif-dependent and Trif-independent pathways // Nature Immunology. 2003. - Vol.4 (12). - P. 1223-1229.
64. Hoebe K., Janssen E., Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity // Nature Immunology. 2004. - Vol. 5. - P. 971974.
65. Holm A.M., Aukrust P., Damas J. et al. Abnormal interleukin-7 function in common variable immunodeficiency // Blood. 2005. -Vol. 105(7). - P. 2887-2890.
66. Horwood N.J., Mahon Т., McDaid J.P. Bruton's tyrosine kinase is required for lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor alpha production // J. Exp. Med. 2003. - Vol. 197(12). - P. 1603-11.
67. Horwood N.J., Page Т.Н., McDaid J.P. et al. Bruton's tyrosine kinase is required for TLR2 and TLR4-induced TNF, but not IL-6, production // J Immunol. 2006. - Vol. 176(6). - P. 3635-41.
68. Hoshino K., Kaisho Т., Inabe T. Et al. Differential involvement of IFN-P in Toll-like receptor-stimulated dendritic cell activation // Int.Immunol. 2000. - Vol. 14. - P. 1225-1231.
69. Imler J-L., Zheng L. Biology of Toll receptors and their transducers // J.of Leucocyte Biology. 2004 - Vol. 75. - P. 18-26.
70. Ito T. et al. Interferon-a and interleukin 12 are induced differentially by Toll-like receptor 7 ligands in human blood dendritic cells subsets // J. Exp. Med. 2002. - Vol. 195. - P. 1507.
71. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune response // Nature Immunology. 2004. - Vol. 5(10). - P. 987-995.
72. Kaisho T.,Takeuchi O., Kawai T et al. Endotoxin-induced maturation of Myd88-deficient dendritic cells // J.Immunol. 2001. -Vol. 166. - P. 5688-5694.
73. Kaparakis M, Philpott DJ, Ferrero RL. Mammalian NLR proteins: discriminating foe from friend // Immunology and Cell Biology. -2007. Vol. 85. - P. 495-502.
74. Kawai T et Akira S. TLR signaling // Semin. Immunol. 2007. -Vol.19(1). - P. 24-32.
75. Kline JN, Krieg AM. CpG oligodeoxynucleotides // New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. 2001. - Vol. 31. - P. 229-232.
76. Klinman D. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides // Nature Rev. Immunol. 2004. - Vol. 4. - P. 1-10.
77. Klis FM, Mol P, Hellingwerf K, Brul S. Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiology Reviews. -2002. Vol. 26 - P. 239-256.
78. Kopecky O., Lukesova S. Genetic defects in common variable immunodeficiency // Int. J. Immunogenet. 2007. - Vol. 34(4). - P. 225-9.
79. Kurt-Jones E.A., Mandell L., Whitney C. et al. Role of Toll-like receptor 2 (TLR2) in neutrophil activation: GM-CSF enhances TLR2 expression and TLR2-mediated interleukin-8 responses in neutrophils // Blood. 2002. - Vol. 100 (6). - P. 1860-1868.
80. Lancaster G.I., Khan Q., Drysdale P. et al. The physiological regulation of toll-like receptor expression and function in humans // J. Physiol. 2005. - Vol.3. - P. 945-955.
81. Lapaque N, Takeuchi O, Corrales F, Akira S, et al. Differential inductions of TNF-a and IGTP, IIGP by structurally diverse classic and non-classic lipopolysaccharides // Cel. Microbiol. 2006. - Vol. 8(3). - P. 401-13.
82. Latz E., Schoenemeyer A., Visintin A. et al. TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome // Nature Immunology. 2004. - Vol.5 (2). - P. 190-198.
83. Lemaitre B. The road to Toll // Nature Reviews Immunology. -2004. Vol.4. - P. 521-527.
84. Lenert P. Inhibitory oligodeoxynucleotides-therapeutic promise for systemic autoimmune diseases? // British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology 2005 - Vol. 140. - P. 1-10.
85. Li Liwu. Regulation of innate immunity signaling and its connection with human diseases // Current drug targets-Inflammation and Allergy. 2004. - Vol. 3. - P. 81-86.
86. Li K, Chen Z, Kato N, Gale M, Lemon SM. Distinct PolyliC and virus-activated signaling pathways leading to interferon-P production in hepatocytes // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280 (17). - P.16739-16747.
87. Liew FY, Brint EK. Negative regulation of Toll-like receptor-mediated immune responses // Nature. 2005. - Vol. 5(6). - P. 446458.
88. Ligoxygakis P., Pelte N., Hoffman J.A., Reichhart J.-M. Activation of Drosophila Toll during fungal infection by a blood serine protease // Science. 2003. - Vol. 297. - P.114-116.
89. Marshall J.S. Mast-cell responses to pathogens // Nature Reviews Immunology. 2004. - Vol. 4. - P. 787-799.
90. Marshal-Clarke S, Downes JE, Haga IR, Bowie AG, Borrow P, Pennock JL, Grencis RK, Rothwell P. Polyinosinic acid is a ligand for a Toll-like receptor 3 // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282(34). - P. 24759-24766.
91. Mazzoni A. et Segal D.M. Controlling the Toll road to dendritic cell polarization // J. of Leukocyte Biology. 2004. -Vol. 75. - P. 721-730.
92. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P.,Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity // Nature. 1997. -Vol. 388. - P. 394-397.
93. Medzhitov R., Janeway C. Innate immunity // The New England Journal of Medicine. 2000. - Vol. 8. - P. 338-344.
94. Miao E.A., Alpuche-Aranda C.M., Dors M. et al. Cytoplasmic flagellin activates caspase-1 and secretion of interleukin lb via Ipaf // Nat. Immunol. 2006. Vol. 7(6). - P. 569-75.
95. Miller I.S., Ernst R.K., Bader M.V. LPS, TLR4 and infectious disease diversity // Nature Reviews Microbiology. — 2005. Vol. 3. — P. 36-46.
96. Misch E.A., Hawn T.R. Toll-like receptor polymorphism and susceptibility to human disease // Clinical Science. 2008. Vol. 114.- P.347-360.
97. Mitchell JA, Paul-Clark MJ, Clarke GW, McMaster SK, Cartwright N. Critical role of toll-like receptors and nucleotide oligomerisation domain in the regulation of health and disease // J. Endocrinol. 2007. - Vol. 193. - P. 323-330.
98. Murpy T.J., Paterson H.M.,Mannick J.A. et al. Injury, sepsis, and regulation of Toll-like receptor responses // Journal of Leukocyte Biology. 2004. - Vol. 75. - P. 400-407.
99. Muta Т., Takeshige K. Essential roles of CD14 and lipoplysaccharide-binding protein for activation of Toll-like receptor (TLR) 2 as well as TLR4 // Eur. J. Biochem. 2001. - Vol. 268. - P. 4580-4589.
100. Myhre AE, Aasen AO, Thiemermann C, Wang JE. Peptidoglycan- an endotoxin in its own right? // Shock. 2006. - Vol.25(3). - P. 227-235.
101. Nagai Y.,Akashi S.,Nayfuku M. Et al. Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution // Nat.Immunol. 2002. Vol. 3. - P. 667-675.
102. Netea MG, Van der Graaf C, Van der Meer JWM, Kullberg В J. Recognition of fungal pathogens by Toll-like receptors // J Clin Microbiol Infect Dis. 2004. - Vol. 23. - P. 672-676.
103. Netea MG, Van der Meer JWM, Kullberg BJ. Role of the dual interaction of fungal pathogens with pattern recognition receptors in the activation and modulation of host defence // Clin Microbiol Infec. 2006. - Vol. 12. - P. 404-409.
104. O'Mahony D.S., Pham U., Iyer R. et al. Differential constitutive and cytokine-modulated expression of human Toll-like receptors in primary neutrophils, monocytes, and macrophages // Int. J. Med. Sci. — 2008. Vol. 5(1). - P. 1-8.
105. O'Neill L. J., Brown Z., Ward S. G. Toll-like receptors in the spotlight // Nature Immunology. 2003. - Vol. 4. - P. 299.
106. Ooi J.Y., Yoshimasa Y., Ни X., Ip T.Y. The Drosophila Toll-9 activates a constitutive antimicrobial defense // EMBO reports. — 2002. Vol. 31(1). - P. 82-87.
107. Orihara K., Nagata K., Hamasaki et al. Time-course of Toll-like receptor 2 expression, as a predictor of recurrence in patients with bacterial infectious diseases // Clin. Exp. Immun. 2007. - V.148. -P.260-270.
108. Palsson-Mcdermott E.M. O'Neill L.A.J. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor,Toll-like receptor-4 // Immunology. — 2004. Vol. 113. - P. 153-162.
109. Parker L.C., Prince L.R., Sabroe I. Translational mini-review series on Toll-like receptors: networks regulated by Toll-like receptors mediate innate and adaptive immunity // Clin. Exp. Immunol. 2007. - Vol.147. - P. 199-207.
110. Perez de Diego R., Lopez-Granados E., Pozo M. et al. Bruton's tyrosine kinase is not essential for LPS-induced activation of human monocytes // J.Allergy.Clin. Immunol. 2006. - Vol. 117(6). - P. 1462-9.
111. Picard С., Puel A., Bonnet M. Et al. Pyogenic bacterial infections in humans with IRAK-4 deficiency // Science. 2003. - Vol. 299. - P. 2076-2079.
112. Pisetsky D.S. The role of nuclear macromolecules in innate immunity // Proc.Am.Thorac.Soc. 2007. - Vol.4. - P. 258-262.
113. Qureshi S.T.,Medzhitov R. Toll-like receptors and their role in experimental models of microbial infection // Genes and Immunity. — 2003. Vol. 4. - P. 87-94.
114. Renshaw M., Rockwell J., Engleman C. et al. Impaired Toll-like receptor expression and function in aging // J. of Immunology. 2002. - Vol. 169. - P. 4697-4701.
115. Rubartelli A., Lotze M.T. Inside, outside, upside down: damage-associated molecular pattern molecules (DAMPs) and redox // Trends Immunol. 2007. - V.28(10). - P. 429-436.
116. Salazar-Gonzalez R.M., McSorley S.J. Salmonella flagellin, a microbial target of the innate and adaptive immune system // Immunol. Lett. 2005. - Vol. 101. - P. 117-22.
117. Sandor F. et Buc.M. Toll-like receptors. I. Structure, function and their ligands // Folia Biologica (Praha). 2005. - Vol.51. - P. 148-156.
118. Sandor F. et Buc.M. Toll-like receptors. II. Distribution and Pathways involved in TLR signaling // Folia Biologica (Praha). — 2005. Vol.51. - P.188-197.
119. Sato K., Ishikawa Т., Okumura A. et al. Expression of Toll-like receptors in chronic hepatitis С virus infection // Heptology. 2007. -Vol.22. - P. 1627-1632.
120. Sandor F. et Buc.M. Toll-like receptors. III. Biological significance and impact for human medicine // Folia Biologica (Praha). 2005. - Vol.51. - P. 198-203.
121. Schaffer A.A., Salzer U., Hammarstrom L et Grimbacher B. Deconstructing common variable immunodeficiency by genetic analysis // Curr.Opin.Genet.Dev. 2007. - Vol. 17(3). - P. 201-12.
122. Schmidt N.W., Thieu V.T., Mann B.A. et al. Bruton's tyrosine kinase is required for TLR-induced IL-10 production // J. Immunol. — 2006. Vol. 177(10). - P. 7203-10.
123. Scott-Taylor Т.Н., Green M.R.J., Eren E., Webster A.D.B. Monocyte derived dendritic cell responses in common variable immunodeficiency // Clin. Exp. Immunol. 2004. — Vol. 138. - P. 484-90.
124. Sen G.C., Sarkar S.N. Transcriptional signalling by double-stranded RNA: role of TLR3 // Cytokine&Growth Factor Reviews. -2005. Vol. 16. - P. 1-14.
125. Singh B.P.,Chauhan R.S.,Singhal L.K. Toll-like receptors and their role in innate immunity // Current Science. 2003 - Vol. 85(8).- P. 1156-1164.
126. Smith D.K., Andersen-Nissen E., Hayashi F. et al. Toll-like receptor 5 recognises a conservered site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility // Nature Immunology.- 2003. Vol. 4. P. 1247-1253.
127. Sochorova K., Horvath R., Rozkova D. et al. Impaired Toll-like receptor 8-mediated IL-6 and TNF-alpha production in antigen-presenting cells from patients with X-linked agammaglobulinemia // Blood. 2007. - Vol. 109(6). - P. 2553-6.
128. Takeda K.,Kaisho Т., Akira S. Toll-like receptors // Annu.Rev.Immunol. 2003. - Vol. 21. - P. 335-376.
129. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity // International Immunology. 2005. - Vol. 17 (1). - P. 1-14.
130. Taneichi H., Kanegane H., Sira M.M. et al. Toll-like receptor signaling is impaired in dendritic cells from patients with X-linked agammaglobulinemia // Clin. Immunol. 2008. — Vol. 126(2). - P. 148-54.
131. Triantafilou M, Triantafilou K. The dynamics of LPS recognition: complex orchestration of multiple receptors // J. Endotox. Res. 2005.- V. 11 (1). P. 5-11.
132. Tsan Min-Fu, Gao Baochong. Endogenous ligands of Toll-like receptors // Journal of leukocyte Biology. 2004. -Vol. 76. - P. 1-6.
133. Uematsu S., Sato S., Yamamoto M. et al. Interleukin-1 receptor-associated kinase-1 plays an essential role for Toll-like receptor (TLR)7- and TLR9-mediated interferon-a production // Journal of Experimental Medicine. 2005. - Vol. 201(6). - P. 915-923.
134. Uematsu S, Akira S. Toll-like receptors and type I interferons // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282(21). - P. 15319-15323.
135. Ulevitch R.J. Therapeutics targeting the innate immune system // Nature Reviews Immunology. 2004. - Vol. 4. - P. 512-520.
136. Underhill D.M. Toll-like receptors and microbes take aim at each other // Current Opinion in Immunology. 2004. - Vol. 16. - P. 483487.
137. Viallard J.-F., Camou F., Andre M. et al. Altered dendritic cell distribution in patients with common variable immunodeficiency // Arthr, Res&Therapy. 2005. Vol. 7. - P. R1052-R1055.
138. Visintin A., Latz E., Monks B. Et al. Lysins 128 and 132 enable lipopolysaccharide binding to MD-2, leading to Toll-like receptor4 agregation and signal transduction // J.Biol.Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 48313-48320.
139. Weiner JG. The immunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides // J. Leukoc. Biol. -2000. Vol. 68. - P. 455-463.
140. Wen Li, Peng Jian, Li Zh. The effect of innate immunity on autoimmune diabetes and the expression of Toll-like receptors on pancreatic islets //The J.of Immunology. 2004. - Vol. 172. - P. 1733180.
141. Wit D., Tonon S., Olislagers V. et al. Impaired response to tolllike receptor 4 and toll-like receptor 3 ligands in human cord blood // Journal of Autoimmunity. 2003. - Vol. 21. - P. 277-281.
142. Wright J.J., Wagner D.K., Blaese R.M. et al. Characterisation of common variable immunodeficiency: identification of a subset of patients with distinctive immunophenotypic and clinical features // Blood. 1990. - Vol. 76 (10). - P. 2046-2051.
143. Yang I.A., Barton S.J., Rorke S. et al. Toll-like receptor 4 polymorphism and severity of atopy in asthmatics // Genes and Immunity. 2004. - Vol. 5. - P. 41-45.
144. Yan S.R., Qing D.M., Stadnyk A.W. et al. Role of MyD88 in diminished tumor necrosis factor a production by newborn mononuclear cells in response to lipopolysaccharide // Infect. Immunol. 2004. - Vol. 72. - P. 1223.
145. Young S.H., Ye J., Frazer D.G., Shi X., and Castranova V. Molecular mechanism of tumor necrosis factor-a production in 1-3-beta-glucan (zymosan)-activated macrophages // J. Biol. Chem 2001. - Vol. 276(23). - P. 20781-787.
146. Zarember K.A., Godowski P.J. Tissue expression of human Tolllike receptors mRNA in leukocytes in response to microbes, their products,and cytokines // J.Immunol. 2002. - Vol. 168. - P. 554561.
147. Zhang D., Zhang G., Hayden M.S. et al. A Toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria // Science. — 2004. Vol. 303. - P. 1522-1526.1. БЛАГОДАРНОСТИ
148. Автор также благодарен всему коллективу кафедры иммунологии за уютную обстановку и поддержку во время выполнения данной работы.
149. Особую благодарность автор выражает своим родным и близким за любовь, понимание и терпение.