Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека

На правах рукописи

ХОРЕВА МАРИНА ВИКТОРОВНА

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ СИСТЕМЫ ТОЬЬ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 — Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

С псц 2012

Москва-2012

005056390

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздрава России Салмаси Жеан Мустафаевич

доктор медицинских наук, профессор

кафедры клинической

иммунологии и аллергологии

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздрава России. Калюжин Олег Витальевич

доктор медицинских наук, профессор ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора зав. лабораторией госпитальных инфекций

и эпидемиологического анализа Тутельян Алексей Викторович

Ведущая организация: ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА

России

Защита состоится «.........» .................................2012 года в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................2012 года

Ковальчук Леонид Васильевич

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение механизмов врожденного иммунитета в настоящее время является одной из актуальных проблем современной фундаментальной и клинической иммунологии. В 90-х годах XX столетия Ch. Janeway и R. Medzhitov выдвинули гипотезу о том, что врожденный иммунитет обладает определенной специфичностью к чужеродным антигенам. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета являются сигнальные паттерн распознающие рецепторы (ПРР) - То11-подобные рецепторы (TLR) [Medzhitov R., Janeway Ch., 1997 Ковальчук JI.B., 2005]. За последние 20 лет достигнуты впечатляющие успехи в изучении роли TLR во врожденном и адаптивном иммунитете, что позволило совершенно по-новому взглянуть на природу иммунных процессов в организме. TLR распознают высоко консервативные структуры патогенных микроорганизмов, так называемые паттерны, ассоциированные с микроорганизмами (pathogen-associated molecular patterns — РАМР). Различные макромолекулы служат микробными лигандами для TLR, включая липиды, углеводы, белки и нуклеиновые кислоты. К наиболее известным лигандам TLR экзогенного происхождения относятся компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогликаны (ПГ), липополисахариды (ЛПС); флагеллин, ДНК микроорганизмов, вирусная РНК и многие другие. В настоящее время показано, что лигандами для TLR могут также являться эндогенные молекулы, высвобождающиеся в результате некроза клеток и массивной деструкции тканей, а также распада молекул внеклеточного матрикса. Такие лиганды получили обозначение как «сигналы опасности» или DAMP (damage-associated molecular pattern). К эндогенным активаторам TLRs относятся белки теплового шока - HSP60, HSP70, фибронектин, Р-дефензин и многие другие [Tsan Min-Fu. et al., 2004; ¿ianchi M. E. et al., 2007; Erridge C. et al., 2010]. Распознавание экзогенных и эндогенных лигандов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов, костимуляторных молекул, противомикробных пептидов и других молекул. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и в дальнейшем направляют развитие адаптивного

иммунного ответа [Hoebe К. et al.,2003; Akira S.,Takeda К.,2004; Parker L.С.,2007; Uematsu S, Akira S. et al., 2007; Kawai Т. Akira S.. 2010; Хаитов P.M., .Ярилин A.A., 2011;]. Интенсивность ответа и его направленность определяются несколькими компонентами, составляющими систему TLR. Система TLR включает лиганды, активирующие TLR, сами рецепторы, молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала — адапторные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты [Ковальчук Л.В., 2007]. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и других заболеваний [Cook D.N., Pisetsky D.S.,2004; Sandor F., Buc.M.,2005; Li Liwu,2004, Ulevitch R.J.,2004; MonteroVega M.Т.,2009]. Количество патологий с выявленными нарушениями в системе TLR растет.

Первичные иммунодефициты (ПИД) с дефектами антителообразования, такие как общая вариабельная иммунологическая недостаточность - ОВИН и Х-сцепленная агаммаглобулинемия - Х-АГГ характеризуются частыми рекуррентными бактериальными инфекциями. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы, и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Bayry. J.,2004; Cunningham-Rundles С. et al.,2005; Yong P.F.et al.,2008]. Изучение механизмов функционирования врожденной иммунной системы, оценка состояния компонентов системы TLR у больных ПЙД с дефектами антителообразования позволит прояснить нммунопатогенез ОВИН, оценить вклад механизмов врожденного иммунитета в развитие и тяжесть течения инфекций и других осложнений.

Со времени открытия TLR представление о них как о структурах, участвующих только в противоинфекционной защите, существенно видоизменилось. При многих

воспалительных заболеваниях, сопровождающихся массивной клеточной деструкцией таких, как инфаркт миокарда, острый панкреатит, происходит j высвобождение большого количества эндогенных лигандов, что приводит к | активации сигнальных путей TLR. Иногда высвобождаемые DAMP связывают с I так называемым "стерильным воспалением", которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной i инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов. Чрезмерная активация TLR и выработка неконтролируемого количества провоспалительных цитокинов могут способствовать развитию системной воспалительной реакции, дальнейшему повреждению тканей, формированию ! осложнений основного заболевания [Ковальчук JI.B., 2008]. Исследование системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза заболеваний, сопровождающихся деструкцией ткани.

I Для выявления дефектов, связанных с нарушением функционирования системы TLR, необходимы надежные методы. Комплексное исследование системы TLR при различных заболеваниях позволит оценить роль механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии. Выявление нарушений в системе То11-подобных рецепторов способствует проведению более точной своевременной диагностике, прогнозированию характера течения заболевания, дает возможность изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также научно обосновать и разработать новые подходы адекватной терапии.

Цель исследования: разработать аналитический подход комплексной оценки компонентов системы распознающих рецепторов врожденного иммунитета - Toll-годобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул TLR и уровня экспрессии мРНК TLR у здоровых людей, больных иммунодефицитами и у больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани, оценить возможность использования выявленных изменений в качестве маркеров прогноза течения заболевания.

Задачи исследования:

1 .Разработать комплексный подход к оценке системы То11-подобных рецепторов на уровне экспрессии генов, белков и секретнруемых молекул, опосредующих эффекторную функциональную активность TLR на мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови человека.

2.Разработать метод и провести оценку эффекторной функциональной активности TLR на МНК периферической крови in vitro у здоровых людей различных возрастных групп (взрослые здоровые доноры, дети 10-15 лет, дети 0,5-3 лет).

3.Провести анализ системы TLR у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования. Определить эффекторную функциональную активность TLR2 и TLR4, их экспрессию на поверхности моноцитов, а также уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью и Х-сцепленной агаммаглобулинемией.

4.Оценить значимость выявленных изменений уровня экспрессии функционирования TLR в иммунопатогенезе и развитии клинических проявлений у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

5.С помощью разработанного подхода проанализировать состояние системы TLR на МНК периферической крови больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит) в динамике.

б.Определить диагностическую значимость и возможность использования выявленных изменений уровня экспрессии мРНК TLR, экспрессии молекул рецепторов на поверхности клеток и эффекторной функциональной активности TLR у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитам в качестве маркеров прогноза течения и исхода заболевания.

I 7.0босновать возможность использования нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на основе оценки системы ТЫ1.

Научная новизна работы

В работе впервые представлен аналитический подход к оценке системы ТоИ-подобных рецепторов, заключающийся в поэтапном исследовании и анализе эффекторной функциональной активности ТЬЯ, экспрессии молекул ТЬЯ и уровне экспрессии мРНК ТЫ1МНК периферической крови человека.

Работа содержит новые данные о вовлечении механизмов врожденного иммунитета в иммунопатогенез первичных иммунодефицитов с дефектами антителообразования. Обнаружены нарушения в системе ТЬЯ у больных ОВИН и X-АГГ. Показано, что при данных ПИД снижена эффекторная функциональная активность ТЫ12 и ТШ14 на МНК, определяемая по индуцированной лигандами выработке ФНОа, экспрессия этих рецепторов на поверхности моноцитов, нарушена экспрессия мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4. У больных ОВИН выявлен дисбаланс ТЫ14-опосредовашюй выработки ФНОа и ИФНа МНК.

Впервые на основе нарушения функционирования системы ТЬЯ в динамике заболевания определены прогностические критерии развития неблагоприятного исхода острого инфаркта миокарда (ОИМ). Показано, что повышение эффекторной

функциональной активности и экспрессии ТЫ12 и ТЬЯ4 на МНК у больных ОИМ в

1

динамике заболевания может приводить к развитию осложнений.

Впервые проанализированы показатели системы ТЬЯ у больных острым деструктивным панкреатитом (ОДП) в динамике: эффекторная функциональная активность Т1Л2 и ТЬЯ4, экспрессия молекул на поверхности моноцитов и уровень экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЬЯ4 в МНК. В работе представлены новые данные о вовлечении рецепторов врожденного иммунитета - ТЫ12 и ТЬЯ4 в развитие и течение ОДП. Установлено, что снижение экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЬЯ4 к концу 1-

ой недели заболевания характерно для легкого течения, в то время как тяжелое течение ОДП сопровождается ростом уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в эти сроки.

Впервые показано, что у больных ОДП изменения в системе TLR, характеризующиеся низкими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 на 1-й неделе заболевания в сочетании со сниженными значениями индуцированной выработки провоспалительных цитокинов, могут приводить к развитию гнойно-деструктивных осложнений.

Установлено, что нестероидный противовоспалительный препарат Лорноксикш приводит к снижению индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) МНК периферической крсви здоровых доноров в культуре in vitro.

Впервые установлено, что применение Лорноксикама в комплексном лечекии больных ОДП на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и TLR4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мР Ж TLR2 и TLR4 МНК у этих больных.

Практическая значимость работы

В данной работе разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности TLR, основанный на определении индуцированной соответствующими лигандами TLR выработки провоспалительного цитокина - ФНОа и ИФНа МНК периферической крови человека. Проведена оценка выработки ФНОа и ИФНа МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых людей различных возрастных групп. Предложенный метод позволяет оценить эффекторную функциональную активность рецепторов врожденного иммунитета у здоровых людей и больных с иммунопатологией.

У больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) в ходе настоящего исследования обнаружены нарушения в системе

рецепторов TLR на МНК. Выявленные нарушения экспрессии и функционирования TLR2 и TLR4 у больных ОВИН свидетельствуют о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета, и позволяют уточнить иммунопатогенез ОВИН.

С использованием разработанного подхода выявлены новые маркеры развития осложнений у больных острым инфарктом миокарда. Показано, что увеличение TLR2 и ТЬЯ4-опосредованпой выработки ФНОа и экспрессии молекул TLR2 и TLR4 на моноцитах больных к 14-м суткам заболевания может служить прогностическим критерием развития осложнений ОИМ.

Предложены новые маркеры ранней диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на определении низких значений экспрессии мРНК TLR2 и TLR4, сопровождающихся угнетением индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки ФНОа и высоких значений ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки заболевания.

Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата -Лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания. Лорноксикам приводит к снижению TLR2 и TLR4-эпосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у больных на 3-й сутки заболевания и позволяет снизить риск ] развития системной воспалительной реакции.

Предложенный комплексный подход к оценке системы TLR открывает новые управления в раннем прогнозе течения, исхода заболевания и возможности г 1роведения целенаправленной патогенетической коррекции.

Основные положения, выносимые на защиту

. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы рецепторов врожденного иммунитета - То11-подобных рецепторов, основанный на определении э |>фекторноп функциональной активности TLR, экспрессии молекул и уровня экспрессии мРНК TLR мононуклеарными клетками периферической крови человека.

2. Использование разработанного подхода позволило выявить нарушения в системе врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) на уровне функционирования и экспрессии TLR2, TLR4 мононуклеарными клетками периферической крови.

3.Комплексное исследование системы TLR при патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит), позволило выявить активацию системы TLR на ранних сроках заболевания. Увеличение в динамике заболевания значений эффекторн ш функциональной активности, экспрессии молекул TLR2 и TLR4 и/или экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клетках периферической крови может служить критерием тяжести течения и развития осложнений при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани.

jcax ки

<ои

4. Использование нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикаі|і в лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сро заболевания приводит к снижению TLR2- и Т1^4-опосредованной вырабо провоспалительных цитокинов и экспрессии мРНК TLR2 и ТІЖ4 в мононуклеарйых клетках периферической крови больных, позволяет снизить риск развития системі воспалительной реакции.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова для студентов, аспирантов и ординато зов, используются в практической работе хирургических отделений ГКБ ]{°55 г.Москвы.

Апробация результатов диссертационной работы

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова

Минздрава России, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011 и 2012 году в Москве на XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), Европейском конгрессе педиатров (Москва, 2009 г.), III Всероссийском Конгрессе по детской аллергологии и иммунологии (Москва 2009 г.), IX Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2010 г.), XVIII международный Конгресс Хирургов - гепатологов стран СИГ «Актуальные проблемы Хирургической гепатологии» (Москва, 2011г.), XI Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011 г.).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 48 печатных работ, в том числе 19 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

I

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, состоит из , введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных : исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 422 источника, из которых 87 отечественных и 335 зарубежных. : Работа содержит 46 таблиц и 52 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы.

Для исследований использовали кровь здоровых доноров, больных первичными ммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ), больных с

острыми патологическими состояниями, сопровождающимися деструкцией ткани — острый инфаркт миокарда и острый деструктивный панкреатит. Критерием отбора доноров было отсутствие острых инфекционных и аллергических заболеваний. Кровь забирали из локтевой вены в пробирки, содержащие антикоагулянт (гепарин, из расчета 25 ед. на 1 мл крови). Забор крови проводился утром, натощак.

Характеристика групп обследованных пациентов. !

Больные первичными иммунодефицитами. Диагноз первичный иммунодефицит был поставлен всем больным в соответствии с диагностическими критериями, разработанными Европейским обществом иммунодефицитов (ESID).

Группу I больных ОВИН составили 9 человек: 5 мужчин в возрасте 20-30 лет и женщины в возрасте 20-45 лет. Больные находились в 4 аллергологическом отделении ГКБ № 7 Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач Афанасьев В. А., зав.отделением Андросов В.В.).

Группу II больных ОВИН составили 14 человек: 11 мальчиков в возрасте 7-17 лет и 3 девочки в возрасте 6-16 лет. [

Группу больных Х-АГГ составили 9 мальчиков в возрасте 4-17 лет. Больные находились в отделении клинической иммунологии ФГБУ «РДКБ» Минздрава России (главный врач д.м.н., профессор Ваганов H.H., зав.отделением д.м.н.профессор Кондратенко И.В).

В иммунном статусе всех пациентов отмечалось резкое снижение уровней сывороточных IgA, IgM, IgG, количества CD4+ Т-лимфоцитов, B-лимфоцитов и NK-клеток. Клинически у наблюдаемых пациентов в течение их жизни развивались тяжелые рецидивирующие, хронические бактериальные инфекции.

Все больные после постановки диагноза получали заместительную терапию иммуноглобулином для внутривенного введения. Кроме того, пациенты получали постоянную профилактическую антибактериальную терапию. Исследование проводили в 2006-2009гг. совместно с сотрудниками отделения клинической

иммунологии ФГБУ «РДКБ» Минздрава России (зав.отделением д.м.н., профессор Кондратенко И.В.)

Исследование показателей в группе больных острым инфарктом миокарда проведены в 2006-2009гг. совместно с сотрудниками кафедры факультетской терапии им. академика А.И.Нестерова лечебного факультета (зав. кафедрой д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ Шостак Н. А.), на базе ГКБ №1 и совместно с сотрудниками отделения реанимации ЦКБ РАН (главный врач профессор, д.м.н. Гончаров Н. Г.). Группу больных острым инфарктом миокарда составили 19 человек. Из них 16 мужчин и 3 женщины в возрасте 50-75 лет. У всех обследованных больных был трансмуральный инфаркт миокарда различной локализации. Для лечения больных применялась стандартная схема с использованием препаратов из группы ß-адреноблокаторов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, нитратов и антиагрегантов. Забор крови у больных проводился на 1 и 14 сутки острого инфаркта миокарда.

Анализ компонентов системы рецепторов врожденного иммунитета у больных острым деструктивным панкреатитом проводили совместно с сотрудниками кафедры экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России (зав. кафедрой д.м.н., профессор Шуркалин Б.К.) на базе хирургического отделения ГКБ №55 (И.о.главного врача Бышов A.A.) в 2007-2012гг. Группу больных ОДП составили 67 человек в возрасте от 20 до 60 лет с тяжелым и среднетяжелым течением острого панкреатита токсической этиологии. Деление по степени тяжести проводилось по международной шкале APACHE II. 30 больных, которым проводилась только стандартная консервативная терапия ОДП, были включены в 1-ю группу обследованных. 37 больных дополнительно получали лорноксикам - НПВС группы оксикамов и были включены во 2-ю группу обследованных. Забор крови у больных проводился на 1,3,7 и 14 сутки заболевания.

Здоровые доноры. Группа здоровых доноров включала 70 человек в возрасте 20-45 лет: 52 мужчины и 18 женщин. Донорская кровь была любезно предоставлена

отделением переливания крови и гравитационной хирургии ФГБУ «РДКБ» Минздрава России.

Контрольная группа включала также 15 здоровых детей в возрасте 10-14 лет (12 мальчиков и 3 девочки); и 15 здоровых детей в возрасте от 6 месяцев до 3 лет (5 девочек и 10 мальчиков).

МЕТОДЫ

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека. Выделен мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови здоровых доноров больных проводили в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-пака (р=1,0?7; РИагтшса, Швеция) по методу Воуиш [Воуиш, 1968]. Жизнеспособность клет оценивали с помощью 0,1% раствора трипанового синего.

не и

ок

Культивирование МНК периферической крови человека. МНК, выделенные из периферической крови, культивировали в полной среде RPMI 1640(НПП «ПанЭкЬ», Россия), содержащей гентамицин (ОАО «Дальхимфарм», г. Хабаровск) и 10% ЭТС (Sigma, США), в течение 24 часов при 37°С в присутствии лигандов TLR. Рабочая концентрация клеток составляла 1х10б в мл. Для стимуляции мононуклеарных клеток использовали следующие лиганды TLRs: пептидогликан (ПГ) (Staphylococcus aureus, «Sigma»,США), ЛПС (E.coli 0127: В8, «Sigma»,США), зимозан A (Saccharomyces cerevisiae, "Sigma",США); флагеллин (Salmonela thyphimurium, "InvivoGen",CUlA), полиинозин-полицитидин (Poly (I:C), ("InvivoGen", США), Имиквимод (R837) ("InvivoGen",CIIJA), Гардиквимод ("InvivoGen", США), ssRNA40/LyoVec ("InvivoGen", США) и олигодезоксинуклеотид (ОДН) CpG ("InvivoGen", США), действующие через TLR 1/2, TLR4, TLR2/6, TLR5, TLR3, TLR7, TLR7/8, TLR8 и TLR9, соответственно. Контролем служили МНК, культивируемые только в среде RPMI 1640. Полученные супернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -70°С.

Определение концентрации цитокинов в культурачьных супернатантах методом шшуноферментного аначиза. Для определения концентрации ФНОа, ИФНа, ИЛ-6, ИЛ-8 использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа

(BioSource, Бельгия) и (Bender Medsystems, Австрия). Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Оптическую плотность определяли на приборе Anthos 2020. Калибровочная кривая строилась автоматически по результатам, полученным для стандартов, по ней определяли содержание цитокинов в исследуемых образцах.

Оценка эффекторной функциональной активности TLR. При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию цитокинов МНК принимали спонтанную выработку цитокина за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию цитокина оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации цитокина в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации цитокина в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов TLR по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также с целью стандартизации метода.

Оценка экспрессии TLR на мо/юцишах периферической крови человека. Экспрессию молекул на поверхности клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител. Данное исследование проводили совместно с сотрудниками лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» (директор центра академик РАМН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т) и сотрудниками ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ» Минздрава России (директор академик РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.). В работе использовали МкАТ к CD 14. меченые PITC («Calta»», «e-Biosciences»,CHIA), а также к TLR2, меченые РЕ («e-Biosciences»,CI±IA), к TLR4, меченые РЕ Су-5 («e-Biosciences»,CIIIA) к TLR4, .меченые РЕ («e-Biosciences»,CLLIA). В качестве изотипического контроля использовали мышиные IgG2a, меченые PITC («Caltag», «e-Biosciences»,CLUA) и ]\|ышиные IgG2a, меченые РЕ («e-Biosciences»,CLLIA), Для определения экспрессии

молекул на поверхности моноцитов периферической крови МНК инкубировали с

1

мечеными МкАТ в течение 30 мин. при 4°С, отмывали при 1200 об/мин при 4°С и

фиксировали раствором BD Cell Fix. Анализ образцов клеточных суспензи S проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США). В каждоМ образце выявляли процент двойных позитивных (CD14TLR2" или CD14+TLR4[) клеток и оценивали экспрессию TLR2 и TLR4 на CD 14+моноцитах (ИФ).

Выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической крови человека. Выделение РНК из мононуклеарнвх клеток периферичекой крови человека проводили методом кисло-фенольной экстракции и с использованием коммерческих наборов для выделения РНК "RNeasy Plus Mini Kit" («Qiagen», Германия). Полученные образцы нуклеиновых кислот хранили при температуре минус 70°С.

Проведение реакции обратной транскрит/ии. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор реагентов "High capacity RNA to cDNA Master mix", (Applied Biosystems,США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Постановка полимеразной геенной реащии с детекцией в режиме реального времени, метод АД ct. Анализ проводили на приборе Applied Biosystems 7500 RealTime PCR System. Смесь для реакции готовили по инструкции к реагентам "Taqman Gene Expression Master Mix" (Applied Biosystems,США), использовали набор праймеров для определения генов tlr2, tlr4 (Applied Biosystems,США). Реакционная смесь содержала 12,5 мкл "Taqman Gene Expression Master Mix", 1,25 мкл праймеров, 2,5мкл кДНК в общем объеме 25 мкл. Уровни экспрессии TLR нормировали по гену ß-актина (Applied Biosystems,США). Режим для проведения реакции амплификации: 2 мин при t = 50 °С , 10 мин при t = 95 °С , 15 сек при t = 95 °С, 1 мин при t = 60 °С. Количество циклов 40. Расчет осуществлялся в программе к прибору Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, версия 2.0.5. Метод AACt - это относительный метод измерения, при применении которого получали результаты в виде относительных единиц (ОЕ), которые показывают уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце по отношению к калибратору. В качестве шага 1 проводили нормализацию по эндогенному контролю (Ct гена-мишени — Ct эндогенного контроля = ДО), шаг 2: нормализация по калибратору (ACt образца -ACt

14

калибратора = AACt), ОЕ=2"ДЛС'. ОЕ показывают уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце по отношению к калибратору (за калибратор принимали пулированную кДНК доноров).

Статистические методы обработки данных. Обработку данных проводили в программном пакете StatSoft Statistica 6.0. Результаты представляли как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение. Исследованные количественные показатели также выражали в виде Me (L-H), где Me - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием непараметрических критериев. Для сравнения групп данных использовали непараметрические критерии (критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящей работе разработан аналитический подход к изучению TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета в норме и при различных патологических состояниях человека. Сформулированный подход включает поэтапную оценку компонентов системы рецепторов врожденного иммунитета -Toll-подобных рецепторов на разных уровнях: определение эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии TLR на поверхности клетки и экспрессии мРНК TLR. Подобный подход был сформулирован ранее Л.В.Ковальчуком и А.Н.Чередеевым цля оценки иммунного статуса человека по патогенетическому принципу: лредлагалось последовательно оценивать различные этапы функционирования иммунной системы [Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.,1990]. Предложенный подход позволяет уточнить и локализовать дефекты в системе рецепторов врожденного иммунитета и впоследствии проводить направленную патогенетически-обоснованную коррекцию выявленных нарушений. Комплексный анализ оценки компонентов системы TLR был использован нами при исследовании состояния рецепторов врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) и у больных при острых

патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит).

На первом этапе для реализации предложенного комплексного подхода оценки TLR нами разработан метод определения эффекторной функциональной активности TLR на мононуклеарных клетках периферической крови человека in vitro. Связывание лигандов с TLR на клетках приводит к их активации и запуску сигнального каскада, приводящего к активации транскрипционных факторов -NF-кВ, IRF3 и др., что, в свою очередь, приводит к синтезу провоспалительнь.1х цитокинов, таких как . ФНОа, ИЛ-6, хемокинов. интерферонав, костимулирующих молекул на антигенпрезентирующих клетках и др. [Akira S ., Takeda К.,2004; Iwasaki A., Medzhitov R.,2004], В связи с этим для оцен ш эффекторной функциональной активности TLR нами предложен и разработан метод определения продукции ФНОа и ИФНа клетками, экспрессирующи! ли TLR, в ответ на действие лигандов TLR в культуре in vitro. При исследован ии влияния различных лигандов TLR на продукцию цитокинов МНК спонтанную выработку цитокина принимали за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию цитокина оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации цитокина в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации цитокина в супернатантах нестимулированных МНК. Выявлено, что все используемые нг ми лиганды TLR стимулируют выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров, тогда как продукция ИФНа активировалась только лигандами TLR3, TLR4, TLR7/8 и TLR9. Для отработки оптимальных условий постановки метода оценки эффекторной функциональной активности TLR использовали следующие концентрации лигандов TLR: Пептидогликан: 1,0 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5,0 мкг/мл; Зимозан: 1,0мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 100 мкг/мл; ЛПС: 0,01 мкг/мл,! 0,1 мкг/мл, 1,0 мкг/мл; Флагеллин: 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл; ОДН CpG: 1,0 мкг/мл и 10,0 мкг/мл; Р(1:С): 5,0 мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40,0 мкг/мл; Гардиквимод: 1 мкг/мл (рекомендации производителя); Имиквимод: 2,5 мкг/мл

(рекомендации производителя); бэЮ^А: 5 мкг/мл (рекомендации производителя); гН8Р70: 1 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 5 мкг/мл; 10 мкг/мл.

Мы проанализировали выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на выбранные нами оптимальные концентрации различных лигандов ТЬЯ: пептидогликан — 2,5 мкг/мл; зимозан - 10 мкг/мл; ЛПС - 0,1 мкг/мл; флагеллин - 0,5 мкг/мл; Р1(:С) - 10 мкг/мл; ОДН Срв — 1,0 мкг/мл. Максимальным стимулирующим эффектом обладают лиганды ТЬК4 и ТЬЯI /2,ТЬК2/6 - ЛПС, пептидогликан и зимозан, соответственно (Рис.1).

Рисунок 1. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНОа МНК здоровых доноров под влиянием лигандов ТЬЯ. *- статистически значимые различия показателей по сравнению со спонтанной выработкой цитокина,(р<0,05).

Анализируя опосредованную лигандами ТЬК выработку ФНОа в группе здоровых людей, нами выявлены индивидуальные особенности профиля стимулированной лигандами ТЬЯ выработки ФНОа. Максимальная выработка ФНОа МНК у одних доноров выявляется под влиянием ЛПС или в ответ на флагеллин и СрО. У других доноров максимальное количество ФНОа вырабатывается при стимуляции МНК пептидогликаном, зимозаном, в то время как показатели, полученные при стимуляции ЛПС, флагеллином, СрО - сравнимы с контролем. Индивидуальные различия выработки ФНОа среди здоровых доноров могут определяться

17

несколькими причинами: различной экспрессией TLR на МНК, полиморфизмом генов TLR и ФНОа, функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНОа и других цитокинов. В эпоху развития персонализированной медицины индивидуальные различия выработки ФНОа, не обнаруженные для других цитокинов, могут быть приняты во внимание. Некоторые лиганды TLR (CpG, липг д А) рассматриваются сейчас как адъюванты, входящие в состав вакцин, в связи с этим анализ профиля TLR-опосредованной выработки цитокинов может быть использован для подбора индивидуальной вакцины, с целью увеличения эффективности вакцинации.

i

Существуют противоречивые данные о возможности лигандов эндогенного происхождения активировать TLR [Geisler F. et al., 2005]. В связи с этим мы оценили влияние rHSP70 на выработку ФНОа МНК периферической крови здоровых доноров. Нами было выявлено, что rHSP70 также оказывал стимулирующее влияние на выработку ФНОа МНК здоровых доноров in vitro. Максимальное стимулирующее влияние на выработку ФНОа МНК здоровых доноров оказывал rHSP70 в дозе 5 мкг/мл (КС составил 2,5±0,8,р<0,05).

Активация TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 запускает сигнальный каскад, задействующий адапторные молекулы TRIF и MyD88, и приводит к выработке интерферонов I типа [Ito T.et al., 2002; Hoebe К., 2003; Akira S., Takeda JC., 2004; Levy O.et al.,2004; Uematsu S.et al.,2005].

Мы исследовали влияние лигандов TLR на выработку ИФНа. Спонтанная выработка ИФНа в группе здоровых доноров составила 29,94±9,78 пг/мл. Стимулированную лигандами TLR выработку ИФНа оценивали также как и для ФНОа в КС. Л .ПС, P(I:C), CpG, имиквимод и гардиквимод индуцировали выработку ИФНа, причем воздействие лигандов TLR7/8 и TLR9 оказывало наибольший стимулирующий эффект (Рис.2). Индивидуальных особенностей выработки ИФНа МНК здоровых доноров нами выявлено не было.

Рисунок 2. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФНа мононуклеарными клетками здоровых доноров под влиянием лигандов ТЬК,

* - статистически значимые различия показателей по сравнению со спонтанной продукцией цитокина (р< 0.05)

Возрастные особенности эффекторной функциональной активности и экспрессии То11-подобных рецепторов у здоровых людей.

В данном разделе приведены результаты исследования по определению эффекторной функциональной активности ТЬЯв на МНК периферической крови детей и взрослых здоровых доноров. Выявили, что у детей в возрасте 0,5 — 3 лет несколько снижена спонтанная выработка ФНОа по сравнению с детьми в возрасте 10-15 лет и взрослыми донорами (28,45±9,83 пг/мл; и 46,74±26,53пг/мл, соответственно). Спонтанная выработка ФНОа МНК в группе детей 10-15 лет достоверно не отличалась от спонтанной выработки цитокина в группе взрослых доноров. Индуцированная выработка цитокина у детей в возрасте 10-15 лет также сопоставима с индуцированной лигандами ТЬЯ выработкой ФНОа в группе взрослых доноров. Выявлены повышенные значения опосредованной лигандами ТТЛ 1/2, Т1Л14, ТЫ12/6 выработки ФНОа у детей в возрасте 0,5-3 лет по сравнению с детьми 10-15 - летнего возраста и взрослыми донорами (КС у детей 0,5-3 лет в ответ на лиганды ТЬЯ1/2, ТЬЯ4,ТЫ12/6 составили 12,33±3,73*; 10,74±5,68; 13,26±3,9*; КС

взрослых доноров: 5,33±1,39; 6,02±1,99; 5,86±2,33, р<0,05). Высокие значения эффекторной функциональной активности ТЫ12 и ТЫ14 у детей 0,5-3 лет по сравнению со значениями в группе взрослых доноров возможны за счет повышенного количества клеток, продуцирующих ФНОа у детей раннего возраста, показано, что у детей 1-2 летнего возраста процент клеток (дендритных клеток), продуцирующих ФНОа выше, чем у новорожденных и взрослых доноров [СогЬеи КР., 2011].

Анализировали также спонтанную и индуцированную лигандами выработку ИФНа МНК периферической крови здоровых людей в различных возрастных группах. Спонтанная выработка ИФНа МНК периферической крови у взрослых доноров и у детей в возрасте 10-15 лет достоверно не различалась. У детей в возрасте 0,5-3 лет спонтанная выработка ИФНа МНК достоверно снижена по сравнению со значения! ш в группе взрослых здоровых доноров (6,99±2,76пг/мл; 29,94±9,78пг/мл соответственно, р<0,05). Низкие значения индуцированной выработки ИФНа в исследуемых возрастных группах были выявлены на лиганды ТЫ13 и ТЬК4. Максимальным стимулирующим влиянием на выработку ИФНа обладали лиганды Т1Л7/8 и ТЫ19, как в группе взрослых доноров, так и у детей в возрасте 0,5-3 лет. При этом выявили, что индуцированная выработка ИФНа МНК периферической

крови взрослых доноров и детей в ответ на используемые нами лиганды ТЪЯ достоверно не различалась (КС: 7,88±2,65; 9,32±2,74; 4,22±0,78 - у взрослых доноров; 6,69±2,18; 9,25±3,94; 5,05±2,51 - у детей 0,5-3 лет).

I

Таким образом, нами был разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности ТЬЯ на МНК периферической крови человека. При анализе эффекторной функции ТЫ1 у здоровых доноров разных возрастных групп выявили статистически значимые различия эффекторной функциональной активности Т1ЛШ2 и ТЬЯ2/6 в группе взрослых доноров (20-40 лет) и детей (0,5-3 лет).

На следующем этапе оценивали экспрессию ТЬЯ2 и ТЬЯ4 на С014+ моноцитах периферической крови здоровых доноров. Полученные данные представлены в таблице 1. При анализе исследуемых параметров мы не выявили статистически значимых различий экспрессии ТЫ12 и ТЫ14 на моноцитах взрослых здоровых доноров и здоровых детей 10-15 лет; 0,5-3 лет.

Таблица 1.

Экспрессия ТЫ12 и ТЫ14 на поверхности С014+моноцитов периферической крови здоровых людей.

Исследуемые группы CD14+TLR2* % ИФ TLR2 CD14TLR4* % ИФ TLR4

Здоровые доноры (20-40 лет) 39,71±11,2 2,77±0,53 6,85±1,34 1,88±0,66

Дети (10-15 лет) 29,65±9,56 2.6 ± 0,7 7,5±2,44 2.1±0,83

Дети (0,5-3 года) 31,54±10,34 3,4± 0,82 6,8±2,34 2,4±1,2

Анализ компонентов системы То11-подобных рецепторов у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

Первичные иммунодефициты с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) характеризуются частыми рекуррентными бактериальными инфекциями, преимущественно респираторного и желудочно-кишечного тракта [Кондратенко И.В. и др., 2002]. В последнее время появились публикации, сообщающие о дефектах врожденного иммунитета у больных ОВИН [Amoras A.L.B.,2007; Bayry J.et al.,2005]. Возможным механизмом формирования нарушений врожденного иммунитета у этих больных может быть наличие дефектов в системе TLR. В литературе мы встретили противоречивые данные об индуцированной выработке цитокинов (ФНОа и ИЛ-6) клетками больных Х-АГГ [Horwood N.J.,2003; Pérez de Diego R.,2006, Schmidt N.W.,2006]. Недавние исследования показали, что В-клеточная тирозинкиназа - Btk взаимодействует с компонентами сигнальных путей TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 и, таким образом, участвует в этом процессе

[Horwood N.J.et al.,2006; Doyle S.L. et al.,2007; Sochorovä K.et al.,2007; Taneichi H.,2008].

С целью исследования вовлечения механизмов врожденного иммунитета в иммунопатогенез и клиническую картину ПИД с дефектами антителообразован] мы провели комплексную трехуровневую оценку системы TLR у больных ОВИН и Х-АГГ. На первом этапе оценивали эффекторную функциональную активность TLR в этой группе больных. В ходе исследования выявлено, что у больных ОВИН I и II групп и больных Х-АГГ повышена спонтанная выработка ФНОа (у больных ОВИН I группы спонтанная выработка цитокина составила 581,19±271,74 пг/мл; у больных ОВИН II группы - 209,74±124,01 пг/мл; у больных Х-АГГ -298,54±136,41пг/мл; у здоровых доноров - 46,74±26,53пг/мл; р<0,05.), что свидетельствует о повышенной функциональной активности клеток-продуцентов цитокина, вероятно, благодаря постоянной микробной стимуляции клеток врожденного иммунитета у этих больных. Во всех группах больных ПИД с дефектами антителообразования мы наблюдали нарушение индуцированной продукции ФНОа под влиянием пептидогликана, зимозана и ЛПС, лигандов TLR1/2, TLR 2/6 и TLR4, соответственно. Таким образом, у больных ОВИН и Х-АГГ нарушена потенциальная способность МНК «отвечать» на лиганды TLR2 и TLR4 т.е. нарушена эффекторная функциональная активность рецепторов (Таблица 2). Низкие значения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 у больных ОВИН сопровождались повышенной частотой развития инфекций.

Спонтанная продукция ИФНа МНК периферической крови больных ОВИН составила 5,41±0,87 пг/мл в группе I, и в группе 11 - 6,45±3,1 пг/мл, что ниже, чем в группе здоровых доноров (29,94±9,78пг/мл, р<0,05). Для оценки индуцированной выработки цитокина МНК периферической крови больных ОВИН активировали Р(1:С), ЛПС и CpG. У больных ОВИН II группы КС в ответ на ЛПС статистически значимо отличается от показателей в группе здоровых доноров (Рис.3).

Таблица 2.

Коэффициенты стимуляции индуцированной лигандами TLR выработки ФНОа мононуклеарными клетками больных Х-АГГ и больных ОВИН.

Исследуемые группы Используемые лиганды Спонтанная выработка ФНОа, пг/мл

Пептидогликан Зимозан лпс Флагелпин ОДН CpG

Больные Х-АГГ 2,61±1,17* 1,01±0,39* 1,61±0,47* 1,63±0,89 1,81±1,00 298,54±153,09*

Больные ОВИН, группа I 2,44±0,69* Н.о. 1,78±0,65* 1,45±0,36 1,49±0,51 581,19±271,74*

Больные ОВИН, группа II 2,27±0,61* 2,33±1,1* 1,92±0,47* 1,56±0,69 1,54±0,69 209,17±124,01*

Здоровые доноры 5.33±1,39 5,86±2.33 6,02±1,99 1,82±0,64 1,83±0,58 46,74±26,53

КС - коэффициенты стимуляции. Н.о. - ие определяли.

* - статистически значимые различия значений по сравнению с группой здоровых доноров, р<0,05

Полученные результаты свидетельствуют о наличии дисбаланса индуцированном ЛПС выработки ФНОа и ИФНа, который возможно обусловлен нарушение? i сигнальных путей от TLR4, вовлечением в активацию в ответ на действие лиганда TLR4 транскрипционного фактора TRIF, а не MyD88, что может приводить к нарушению развития адекватного ответа in vivo. Выявленный нами дисбаланс в Т1Л14-опосредованной продукции цитокинов может определять особенности клинической картины у больных ОВИН.

18 16 14 12 10

п доноры

8--- ■ больныеОВИН II группа

g --т- ■ больные Х-АГГ

4 2 О

ЛПС Polyl:C

Рисунок 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФНа МНК периферической крови больных ПИД под влиянием лигандов ТЫ*.

*- статистически значимые различия показателей по сравнению с группой здоровых доноров, (р<0,05).

Мы не выявили дисбаланса в выработке ФНОа и ИФНа у больных Х-АГГ . Лиганды Т1^4 и ТЬЮ (ЛПС и Р(1:С)) не оказывали стимулирующего влияния на выработку ИФНа МНК периферической крови больных Х-АГГ (Рис. 3). Таким образом, у больных Х-АГГ нами выявлено нарушение индуцированной лигандами TLR2, Т1Ж4 и ТЬЯЗ выработки цитокинов - ФНОа и ИФНа МНК периферической крови. Участие ВИс в сигнальных путях от Т1Л2, Т1^4, Т1ЖЗ, Т1^7, Т1Ж8 и TLR9 позволяет предположить, что мутации В1к, выявляемые у больных Х-АГГ приводят к дефекту в передаче сигнала от ИЛ1.

Выявленные изменения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 у больных ОВИН и Х-АГГ могут быть опосредованы нарушением экспрессии соответствующих рецепторов, полиморфизмом генов рецепторов, а также нарушением трансдукции сигнала от этих рецепторов. Нарушение выработки ФНОа МНК больных в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 может лежать в основе повышенной чувствительности больных ОВИН и Х-АГГ к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам in vivo.

На следующем этапе мы оценивали экспрессию CD14, TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов больных ОВИН I и II групп и больных Х-АГГ. Выявили, что у больных в исследуемых группах процент CDI4+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов статистически значимо не отличался от показателей в группе здоровых доноров.

Таблица 3.

Экспрессия СБ14, ТЫ*2 н ТЫ14 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров.

Исследуемые группы %CD14* клеток %CD14*TLR2* клеток ИФ TLR2 %CD14¥TLR4* клеток ИФ TLR4

Здоровые доноры 86,67±9.28 39,71±11.2 2,77±0.53 6.85±1,34 1,88±0,66

Больные ОВИН, группа I 63.55± 18.57 27.8±Ю,13 1.21 ±0.5* 6,73±1.71 1,2±0,37*

Больные ОВИН, группа II 64,66± 15,84 25,3±12,22 1,46±0,46* 8,08±1,5 1,4±0,5б*

Больные Х-АГГ 65,24±14,02 23,9±10,3* 1,34±0,67* 6,65±2,81 1.2±0,31*

*- статистически значимые различия показателей с группой здоровых доноров, р<0,05

Однако интенсивность флуоресценции ТШ12 и ТШ14 на поверхности С014-положительных моноцитов больных ОВИН и Х-АГГ была снижена (Таблица 3). Снижение экспрессии и Т1^4 на моноцитах больных ПИД с дефектами

антителообразования, в клинической картине которых наблюдаются рецидивирующие хронические бактериальные инфекции, может быть обусловлено

нарушением процессов регуляции поверхностной экспрессии молекул, а так£ нарушением процессов транскрипции и трансляции продуктов этих ген-Возможно, лекарственные препараты, используемые в лечении больных, та£ оказывают влияние на уровень экспрессии TLRs и их корецепторов на поверхнс^ клетки.

Во И группе больных ОВИН выявлено двое детей, у которых наряду с высой спонтанной выработкой ФНОа обнаружены крайне низкие значения индуцированй лигандами TLR4 и TLR2 выработки ФНОа МНК периферической крови, кроме то, определялись низкие уровни экспрессии TLR2, TLR4 и CD14 на понерхнси моноцитов. Обнаруженные дефекты у этих больных ОВИН сочетались с тяже^м течением заболевания, развитием злокачественных новообразований.

Следующий уровень оценки компонентов системы TLR включал оцеку экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 в МНК периферической крови болы>1х ОВИН и Х-АГГ. Обнаружили статистически значимое снижение экспрессии мПК TLR.9 в МНК больных ОВИН II группы (Таблица 4). Полученные нами данныепо экспрессии мРНК TLR9 согласуются с данными литературы: показано, что у болыых ОВИН снижена экспрессия мРНК и белка TLR9 в В лимфоцитах и пДК, нарутна также функциональная активность TLR9 при стимуляции CpG [Cunningham-Rumles С. et al.,2006; Clemente A. et al., 2011]. Выявленные нарушения экспрессш и функциональной активности TLR9 могут объяснить частые энтеровируспые инфекции у больных ОВИН. Выявили, что экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 в контрольной группе детей выше, чем в группе взрослых доноров, р<0,05. По уровню экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в группе детей больных ОВИН (II группа) выделены 2 подгруппы: больные с высокими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и с

низкими значениями экспрессии по сравнению с контрольными группами детей и

I

взрослыми донорами, различия между этими подгруппами достоверны (р<0,05). Продолжительность заболевания у больных ОВИН II группы с высокой экспрессией мРНК TLR2 и TLR4 составила более 6 лет. Известно, что больные ОВИН страдают частыми рекуррентными бактериальными инфекциями, возможно, в ответ на

26

микробную стимуляцию у этих больных происходит повышение уровня экспрессии мРНК тья.

Таблица 4.

Значения экспрессии мРНК генов ТЫ* в группах больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

Исследуемые группы 7ХЯ-2 7ЪЯ-4 тт-9

Здоровые дети (10-15 лет) 2,84±1,25* 3,03±1,57* 2,0±0,98

ОВИН I группа 1,56±0,67 1,33±0,79 1,05±0,48

ОВИН II группа 11,8±5,77** 4,32±2,08* 0,53±0,22*"

0,72±0,25* 0,76±0,34*

Х-АГГ 0,98±0,32* 1,17±0,45* 1,09±0,54

Данные в таблице представлены в относительных единицах

* статистически значимые различия показателей с группой здоровых доноров, р<0,05

# статистически значимые различия показателен с группой здоровых детей, р<0,05

У больных 2-ой подгруппы с продолжительностью заболевания от 1 года до 3 лет выявили низкие значения экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЫ14, в этой группе у 70% больных наблюдались тяжелые сопутствующие заболевания. В группе взрослых больных ОВИН статистически значимых нарушений в экспрессии мРНК ТЬЯ2, ТЬЯ4 и ТЫ19 в МНК периферической крови не выявлено. Выявили снижение экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЫ14 у детей с Х-АГГ по сравнению со значениями в группе здоровых детей.

Проведенная трехуровневая оценка системы ТЬЯ у больных ОВИН и Х-АГГ позволила выявить нарушения в системе врожденного иммунитета на уровне

эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4, экспрессии молекул этих рецепторов и экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9. Выявленные изменения носят неоднозначный характер: с одной стороны, снижение экспрессии рецепторов на поверхности клеток и их эффекторной функциональной активности предотвращав' гиперактивацию этих рецепторов, развитие неконтролируемой воспалительно: реакции у больных ОВИН и Х-АГГ. С другой стороны, выявленные дефекть) экспрессии и функциональной активности рецепторов могут приводить jc нарушению развития механизмов врожденного иммунитета, созревания дендритных клеток и в дальнейшем к нарушению развития адекватного адаптивного иммунного ответа, способствовать развитию тяжелых инфекций. Обнаруженные нами дефекты экспрессии и функционирования паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета у больных ПИД с дефектами антителообразования помогают уточнить иммунопатогенез, и в дальнейшем могут служить новой терапевтической мишенью в лечении больных ОВИН и Х-АГГ.

Оценка компонентов системы То11-подобных рецепторов у больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани.

Массивное повреждение тканей с большим количеством клеток, подвергающихся некрозу, приводит к выбросу DAMP - эндогенных лигандов TLR, активации TLR и развитию воспаления. Длительная и избыточная активация TLR, в свою очередь, приводит к высвобождению повышенных количеств ФНОа, который будет выполнять не только позитивную роль в организме, но может оказаться фактором тканевого повреждения, способствующим развитию осложнений основного заболевания. Известно, что TLR4 и TLR2 — рецепторы врожденного иммунитета, которые взаимодействуют с большим количеством разнообразных лигандов эндогенного происхождения [Kaczorowski D.J., 2008; Li Yu et al., 2010; Lome EJ et al., 2010].

На данном этапе исследования мы оценивали состояние компонентов системы TLR, в частности TLR2 и TLR4, у больных острым инфарктом миокарда. У больных

ОИМ в 1 сутки заболевания мы выявили повышение спонтанной выработки ФНОа по сравнению со здоровыми донорами. К 14-м суткам после развития ОИМ спонтанная выработка ФНОа у больных снижалась и приближалась к спонтанной выработке ФНОа МНК здоровых доноров. Повышенная спонтанная продукция ФНОа МНК ! больных в 1 сутки ОИМ может быть связана с воздействием различных молекул, I высвобождающихся при повреждении миокарда, например, белков теплового шока, активных форм кислорода и других молекул и свидетельствует о повышении | функциональной активности клеток врожденного иммунитета у этих больных [РгаШг Б., 2007]. Выявили, что у больных ОИМ повышена эффекторная функциональная активность Т1Л12/6 и ТЬЯ4 на МНК периферической крови в 1 сутки заболевания. Высокие значения эффекторной функции рецепторов сохраняются и к 14 суткам заболевания (Таблица 5).

Таблица 5.

Индуцированная лигандами Т1Л12 и ТЫ14 выработка ФНОа

мононуклеарными клетками больных острым инфарктом миокарда

Используемые стимуляторы Больные ОИМ 1 сутки Больные ОИМ 14 сутки Здоровые доноры

Спонтанная выработка (пг/мл) 147,61±37,38 84,77±7,73 46,74±26,53

ЛПС 10,8±4,98* 9,2±2,59* 6,02±1,99

Пептидогликан 7,98±2,59 6,92±2,59 5,33±1,39

Зимозан 15,4±4,66* 14,2±5,32* 5,86±2,33

Результаты представлены в КС-коэффициент стимуляции

* - статистически значимые различия по сравнению с группой здоровых доноров, р<0,05;

У некоторых больных ОИМ в обследованной нами группе к 14-м суткам заболевания наблюдалось повышение спонтанной и индуцированной лигандами ТЬЯ4 и ТЫ12/6 |продукции ФНОа по сравнению с соответствующими значениями в 1-е сутки (Рис.4). В дальнейшем у всех больных выделенной подгруппы (100% больных)

развились осложнения (формирование аневризмы сердца, повторный инфаркт миокарда). Не исключено, что у больных ОИМ избыточная выработка ФНОа в результате гиперактивации ТЬК4, Т1Л2 является одним из факторов, приводящим к развитию осложнений основного заболевания.

2500

£ 2000

О О

Є а э-

500

1 г и

ГШ" ■

РІВ* - Ш ■ ■ і ■

спонтанная, 1 спонтанная, ЛПС, 1 сутки ЛПС, 14 сутки Зимозан, 1 Зимозан, 14 сутки 14 сутки сутки сутки

I БольныеОИМ

[ Больные ОИМ с развитием осложнений

Рисунок 4. Спонтанная и индуцированная лигандами ТЫ*2/6 и ТЬИ4 выработка ФНОа у больных ОИМ. *-статистически значимые различия между группами, р< 0,05

I

Таким образом, дальнейшее увеличение выработки ФНОа МНК больных в ответ на лиганды ТЬЛ 4 и ТЬЯ2/6 - ЛПС и зимозан к 14 суткам после развития ОИМ в сравнении с индуцированной выработкой ФНОа на 1 сутки заболевания может служить прогностическим критерием неблагоприятного исхода заболевания.

Наряду с изучением эффекторной функции ТЫ12 и ТЫ14 проводили оценку экспрессии ТЬГ<2 и ТЬЯ4 на поверхности СГ.)14+ моноцитов больных ОИМ в 1 и 14 сутки заболевания. Выявили, что у больных ОИМ в 1 сутки заболевания, наряду с эффекторными функциями ТЬЯ2 и ТЬЯ4, повышено количество циркулирующих СБ 14+ТЬЛ2+ и С014+ТЫ14+ моноцитов. К 14 суткам количество С014+ТЬК2+ моноцитов снижается до значений, сопоставимых со значениями здоровых доноров, а количество С014ТЬК4" моноцитов еще остается повышенным. Достоверно

повышена в 1 сутки заболевания у больных и экспрессия ТЫ12 и ТЫ14 на СЭ14+ моноцитах (Таблица 6).

Таблица 6.

Экспрессия ТЫ*2 и ТЬК4 на С014+моноцитах больных острым инфарктом миокарда

Исследуемые группы CD14*TLR2* % ИФ TLR2 CD14+TLR4* % ИФ TLR4

Здоровые Доноры 39,71±11,2 2,77±0,53 6,85±1,34 1,88±0,66

Больные ОИМ 1 сутки 57,1±13,69 3,75±0,6* 12,2±2,12* 4,2±1,3*

Больные ОИМ 14 сутки 40,2±9,85 2,81±0,6 8,1±2,1 2,53,±0,7

"статистически значимые различия значений по сравнению с показателями в группе здоровых доноров, р<0,05

Важно, что источником провоспалительных цитокинов могут быть не только клетки иммунной системы, но и клетки миокарда. Кардиомиоциты экспрессируют широкий спектр TLR, включая TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 и TLR9, через NF-kB эти рецепторы инициируют высвобождение провоспалительных цитокинов и хемокинов самими кардиомиоцитами [Boyd J.H. et. al., 2006]. Длительная и чрезмерная активация TLR на моноцитах, кардиомиоцитах и других клетках, участвующих в процессах постинфарктного заживления, избыточным количеством высвобождающегося Hsp70 или других эндогенных лигандов у больных ОИМ сопровождается продукцией высоких уровней провоспалительных цитокинов, приводящих к дополнительному повреждению ткани, и способствует развитию системного воспалительного ответа. Затянувшийся воспалительный процесс, включающий продукцию повышенных уровней провоспалительных цитокинов, возможно, играет важную роль в формировании осложнений ОИМ, в частности, развития сердечной недостаточности [Satoh M. et al. 2006; Frantz S. 2007, Zhu X. et.al.,2007; Sun M. et.al., 2007].

Проведенное исследование позволило выявить нарушения в системе TLR у больных ОИМ в 1,14 сутки заболевания, характеризующиеся повышенными значениями спонтанной и индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 вырабопа ФНОа и экспрессии этих рецепторов на циркулирующих моноцитах, чт( > свидетельствует о вовлечении механизмов врожденного иммунитета в развитие и течение ОИМ. Развитие осложнений у больных ОИМ сопровождалось увеличением эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 и экспрессии эти: с рецепторов на поверхности моноцитов в динамике заболевания.

Оценка компонентов системы TLR у больных острым деструктивным панкреатитом.

Нарушения в иммунной системе, как в адаптивном иммунитете, так и во врожденном иммунитете играют ведущую роль в патогенезе острого панкреатита. Изучение системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза острого панкреатита, так как повышенная экспрессия TLR, особенно на ранней стадии заболевания, может приводить к чрезмерной активации иммунной системы, гиперпродукции провоспалительных цитокинов, развитию системной воспалительной реакции, и, в особо тяжелых случаях, полиорганной недостаточности. С другой стороны, дефицит TLR усугубляет транслокацию грамотрицательных бактерий, что в свою очередь может приводить к развитию инфекционных осложнений у больных острым панкреатитом.

Изучение влияния лорноксикама на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro.

В наше исследование наряду с группой больных ОДП, получающих стандартную терапию, были включены больные, дополнительно к стандартной терапии получающие нестероидный противовоспалительный препарат группы оксикамов -Лорноксикам в 1-3 сутки заболевания. В связи с этим мы оценили действие Лорноксикама на TLR-опосредованную выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров in vitro. Выявили, что Лорноксикам

достоверно ингибирует выработку ФНОа, ИЛ-1 и ИЛ-6 в ответ на ПГ и ЛПС, лиганды TLR1/2 и TLR4 МНК здоровых доноров в культуре in vitro. Максимальное j подавление продукции этих цитокинов достигается под действием Лорноксикама в 1 концентрации 300 мкМ. При этом наибольший подавляющий эффект наблюдался при индукции выработки цитокинов через TLR1/2 (Таблица 7).

Таблица 7

Подавление лорноксикамом выработки провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro.

Цитокины Используемые лиганды Стимулирован пая выработка (пг/мл) Ингибирование (%)

Лорноксикам 10 мкМ Лорноксикам ЗОмкМ Лорноксикам 300 мкМ

ФНОа ЛПС 612 ±262 не влияет 12,85±8,72 33,43±29,77

ПГ 1050±581 не влияет 29,71±13,27 70,86±19,96*

ИЛ-1 ЛПС 568±305 14,84±9,50 не влияет 42,69127,30

ПГ 2012±533 18,48±14,19 65,70±20,37* 85,71±5,19*

ИЛ-6 ЛПС 1736±443 9,35±6,09 4,76±3,64 29,47±7,29

ПГ 1624±615 13,09±7,09 15,05±4,18 50,22±26,11*

ИЛ-8 ЛПС 11153±4050 7,41 ±5,67 36.50t31.44 60,63±22,51 *

ПГ 9958±4316 10,93±6,55 43,16±28,53 70,63±12,67*

ИЛ-12 ЛПС 474±120 11,68±9,99 78,12±18,23* 85,11±11,08*

ПГ 362±125 4,53±3,47 58,83±40,17 91,22±5,00*

* - статистически значимые различия показателей, р< 0,05

Значительное снижение уровня провоспалительных цитокинов служит аргументом в пользу выраженного противовоспалительного эффекта Лорноксикама и его способности воздействовать не только на метаболизм арахидоновой кислоты, но и на пути трансдукции сигнала от активированных Т1Ж. Ингибирующее действие Лорноксикама на выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической

33

крови возможно опосредовано подавлением активации фактора транскрипции NF-kB [Yin J.et al., 2009].

У больных ОДП мы проводили трехуровневую оценку системы TLR в МНК периферической крови в динамике заболевания на 1, 3, 7 и 14 сутки. Первый уровень включал оценку эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4. Обнаружено, что у больных ОДП повышены значения эффекторной функции TLR2 и TLR4, начиная с 1-х суток заболевания (Рис.5,Таблица 8).

Рисунок 5. Индуцированная ЛПС выработка ФНОа мононуклеарными клетками больных острым деструктивным панкреатитом.

*- статистически значимые различия показателей между группами, (р< 0.05)

|

Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении ТЬЯ2 и Т1^4 в патогенез заболевания. Больные ОДП 1-ой группы получали только стандартную терапию; больные ОДП 2-ой группы, кроме стандартной терапии, получали Лорноксикам в 1-3 сутки. В 1-ой группе больных происходило дальнейшее повышение индуцированной ЛПС и ПГ выработки ФНОа на 3-й сутки, в группе больных, получающих Лорноксикам, мы не выявили повышения значений индуцированной лигандами ТЫ12 и Т1Ж4 выработки ФНОа на 3-й сутки. Повышенные значения эффекторной функции ТЬЯ2 и Т1^4 на МНК больных ОДП 1 -й и 2-й групп сохранялись на 7-е и 14-е сутки заболевания.

Таблица 8.

Индуцированная ПГ выработка ФНОа МНК больных ОДП.

1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки

Больные ОДП 1 группы 848,4 (779,66-980,32) 1859,2* (830,4-3813,7) 691,6 (321,6-1495,9) 973,6* (845,1-1102,3)

Больные ОДП 2 группы 886,1 (727,6-1356,9) 727,6 (472,9-1356,9) 762,9 (333,3-954,1) 850,6 (610,8-1160,5)

Здоровые доноры 478,2 (285,2-829,7) 478,2 (285,2-829,7) 478,2 (285,2-829,7) 478,2 (285,2-829,7)

Данные в таблице представлены как Me (25-75 процентили),

* - статистически значимые различия показателей по сравнению с группой здоровых доноров, р<0,05

Выявленное снижение TLR2 и TLR4 индуцированной выработки провоспалительных цитокинов на 3-й сутки заболевания у больных 2-ой группы возможно происходит за счет действия Лорноксикама, оказывающего ингибирующее действие на транскрипционный фактор - NF-кВ. Снижение индуцированной выработки провоспалительных цитокинов МНК больных ОДП, получающих Лорноксикам, согласуется с полученными нами данными по ингибированию Лорноксикамом выработки провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro. На первой неделе заболевания у больных ОДП может развиваться «цитокиновый шторм», который в свою очередь может привести к развитию

I

системной воспалительной реакции и полиорганнои недостаточности, поэтому необходим контроль за выработкой провоспалительных цитокинов на 1-ой неделе заболевания и использование препаратов, снижающих выработку провоспалительных цитокинов в этот период.

На втором этапе оценивали экспрессию TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови больных ОДП. Обнаружили снижение количества CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ клеток у этих больных по сравнению со здоровыми

Таблица 9.

Экспрессия ТЬК2 и ТЬЯ4 на моноцитах больных острым деструктивным панкреатитом.

Здоровые доноры Больные ОДП 1 сутки Больные ОДП 3 сутки Больные ОДП 7 сутки Больные ОДП 14 сутки

Больные 1 группа Больные 2 группа Больные 1 группа Больные 2 группа Больные 1 группа Больные 2 группа Больные 1 группа Больные 2 группа

С014+ТЬЫ2+ (% клеток) 39,71±11,16 27,40±12,39 26,00±5,65 55,50±2,12* 24,00±1,41 36,66±12,01 30,00±3,53 47,00±1,41 28,50±4,24

ИФ 2,77±0,53 2,31±0,57 2,43±0,35 3,62±0,76 2,67±0,63 1,65±0,09 2,14±0,25 1,87±0,37 2,4±0,26

:Ш4+ТЬИ4+ {% клеток) 6,85±1,34 3,93±1,08 5,00±2,82 6,47±0,67 3,89±1,22 3,78±0,33 1,80±0,91 5,9±1,67 5,83А0.23

ИФ 1,88±0,6б 1,24±0,16 1,58±0,36 1,44±0,23 1,42±0.2() 1,36±0,29 1,52±0,14 1,62-10,27 1,6810,20

»-статистически значимые различия по сравнению с показателями в группе здоровых доноров, р<0,05

донорами, низкие значения экспрессии TLR2 и TLR4 на CD14+ моноцитах на 1-14 сутки. При этом у больных 1-ой группы наблюдали повышение интенсивности флуоресценции и количества CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ клеток к 3-м суткам ¡аболевания. У больных 2-ой группы количество CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ 1 .юноцитов и экспрессия TLR2 и TLR4 не изменялась по сравнению с показателями в -е сутки (Таблица 10). Повышенная индуцированная лигандами TLR2 и TLR4 цыработка провоспалительных цитокинов у больных ОДП не сопровождалась в ысокими значениями базовой экспрессии этих рецепторов на поверхности клеток.

Третий уровень оценки системы TLR - оценка экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в г,1ононуклеарных клетках периферической крови больных ОДП. В результате проведенного исследования показано, что уровни экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в К IHK больных ОДП в 1-7 сутки заболевания повышены.

У больных с тяжелым течением ОДП выявлены более высокие значения экспрессии мРНК TLR2 и TLR4. При проведении исследования нами было выявлено, что у больных средней степени тяжести экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 снижается на 3,7 с) тки, а у больных с тяжелым течением заболевания и развитием осложнений уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 продолжает повышаться, что может приводить к ги перактивации системы TLR в случае тяжелого течения заболевания. У больных 2-ой группы, дополнительно к стандартной терапии получавших Лорноксикам, выявили достоверное снижение уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 по сравнению с больными 1-ой группы на 3-7 сутки. Уровень экспрессии мРНК TLR2 у больных с тяжелым течением, получавщих Лорноксикам, достоверно ниже, начиная с 3-х суток по 14 сутки по сравнению с пациентами 1-ой группы (Таблица 10). У больных со среднетяжелым течением снижение экспрессии мРНК TLR2 на 3 сутки происходило как в 1-ой, так и во и 2-ой исследуемых группах. При оценке экспрессии мРНК TLR4 на 1-е и 3-й сутки заболевания мы не выявили достоверного различия в экспрессии мРНК TLR4 между больными 1-ой и 2-ой групп, к 7-м суткам у больных 2-ой группы экспрессия мРНК TLR4 достоверно снижалась по сравнению с больными 1-ой группы, находящимися на стандартной терапии. Не выявили, достоверных различий в

экспрессии мРНК Т1Л4 в МНК периферической крови больных 1-ой и 2-ой групп с тяжелым и среднетяжелым течением .

Таблица 10.

Значения экспрессии мРНК ТЫ*2 и ТЬЯ4 у больных острым деструктивным

панкреатитом

Исследуемые группы 1сутки 3 сутки 7сутки 14сутки

Больные 1 группы Тяжелое течение 34,83* (34,77-43,75) 45,94*# (34,39-48,34) 26,7 (20,43-35,45) 23,92*# (12,81-35,6)

Средне-гяжелое течение 11,89 (10.12-21.27) 10,11 (9,42-10,81) 18,09 (10,97-27,85) 4,59 (3,72-5,46)

Больные 2 группы Тяжелое течение 28,96* (27,67-42.99) 27,72* (22,41-33,65) 17,81 (6,14-39,85) 9,56* (8,51-10,63)

Средне-тяжелое течение 18,09 (12,03-26,52) 11,43 (7,57-14,87) 7,84 (3,21-16,12) 5,72 (5,36-6,09)

Исследуемые группы 1сутки 3 сутки 7сутки 14сутки

Больные 1 группы Тяжелое течение 11,071 (8,21-11,83) 8,15* (5,6-11,74) 7,03 (5,07-8,24) 5,18*# (4,65-5,71)

Средне тяжелое течение 8,31 (5,1-9,16) 4,75 (4,57-4,92) 11,56* (9,48-13,64) 3,52 (2,44-4,19)

Больные 2 группы Тяжелое течение 9.68 (6,17-10,81) 8,199 (4,43-10,42) 5,59 (3,75-7,51) 2.87 (2,43-3,32)

Средне тяжелое течение 8,48 (5,06-11,9) 4,28 (3,94-4,89) 4,26 (2,54-6,45) 2,19 (2,09-2,29)

Данные в таблице представлены в относительных единицах, как Ме (25—75 процентили),

Значения экспрессии мРНК Т1Л2

Значения экспрессии мРНК Т1Л4

* - статистически значимые различия значений в группах между больными с тяжелым течением и больными с течением средней тяжести (р < 0,05)

#- статистически значимые различия значений по сравнению с больными 2 группы

Выявленная нами высокая функциональная активность клеток врожденного иммунитета у больных ОДП (определяемая по повышенной спонтанной и индуцированной выработке провоспалительных цитокинов) сопровождается высокими значениями уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4. Однако на поверхности клеток у этих больных мы не выявили повышения экспрессии молекул TLR2 и TLR4. В последние годы в литературе появляются сведения о растворимых формах TLR, в частности TLR2, TLR4 и TLR9 [Raby А-С., et al., 2009; Chockalingam А., et al., 2011; 2Aint S. L.et al., 2009]. Обсуждается протективная роль растворимых рецепторов в развитии системной воспалительной реакции и осложнений. При связывании лигандов с растворимым рецептором не происходит включение сигнальных путей, трансдукции сигнала и, соответственно, не происходит синтеза цитокинов. Другой возможный механизм сниженной экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОДП -интернализация этих рецепторов после их связывания эндогенными лигандами и активации. Было показано, что после связывания TLR4 с лнгандом (ЛПС) происходит его интернализация, доставка в эндолизосомы, где он подвергается деградации [Haas В., Leonard F. et al., 2011]. Цитокины, а также различные транскрипционные и посттранскрипционные механизмы могут приводить к снижению экспрессии белка, предотвращая развитие системной воспалительной реакции у больных острым деструктивным панкреатитом.

Таким образом, у больных ОДП нарушения в системе TLR характеризуются высоким уровнем экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и высокой эффекторной функцией этих рецепторов на МНК периферической крови на первой неделе заболевания. Применение лорноксикама на начальных этапах развития ОДП позволяет снизить экспрессию мРНК TLR2 и TLR4, чрезмерную выработку провоспалительных цитокинов и предотвратить развитие системной воспалительной реакции.

В исследуемых нами группах больных ОДП с тяжелой степенью тяжести исходного состояния были выявлены пациенты с низкими значениями оцениваемых показателей компонентов системы TLR на 1-ой неделе заболевания. В клинической картине у больных этой подгруппы наблюдали развитие гнойно-деструктивных

осложнений на второй, третьей неделе заболевания, кроме того 40 % больных 1 группы с низкими значениями показателей умерли на 2-3 день.

В 1-е сутки заболевания КС на ЛПС в этой подгруппе больных составили 1,3 (0,4-1,7) и 3,9 (2,3-4,1) в 1 и 2-й группах; КСЛпс в основных группах больных ОДП: 8,06 (3,7;!-15,54) и 10,9 (3,69-11,94), соответственно, р<0,05; у здоровых доноров КСЛпс = 5,77(4,15-6,97). Низкие значения показателей КС в 1-е сутки заболевания в этой подгруппе больных были выявлены и для лиганда ТЬЯ2, у 40% больных 1 группы обнаружены крайне низкие значения индуцированной выработки ФНОа в ответ на ЛПС и ПГ (спонтанная выработка ФНОа — 57,65±19,35пг/мл; индуцированная ЛПС: 64,4±14,8пг/мл; индуцированная ПГ: 60,8±9,6пг/мл), на 2-3 день заболевания этги больные умерли.

В этой подгруппе больных мы выявили, что значения экспрессии мРНК ТЬЯ2( и ТЫМ у больных, получающих только стандартную терапию, были низкими на протяжении всего периода обследования и не отличалась достоверно от значений в группе здоровых доноров, но при этом были достоверно ниже значений экспрессии в основной группе больных ОДП с тяжелым течением. Уровень мРНК ТЬИ2 у больных 2-й группы повышен в 1-е сутки заболевания по сравнению со значениями в группе здоровых доноров, но при этом достоверно ниже, чем у больных ОДП основной группы (4,66(3,73-5,54) и 28,96 (27.67-42.99) соответственно, р<0,01). Значения экспрессии мРНК ТЬЯ4 у больных 2-й группы достоверно не отличались от значений в группе здоровых доноров, но также были достоверно ниже значений в основной группе больных ОДП с тяжелым течением (уровень экспрессии мРНК ТПЫ в 1-е сутки составил 2,28 (2,13-3,63), в основной группе - 9,68(6,17-10,81), р<0,05). Мы предполагаем, что выявленные нами сниженные значения эффекторной функциональной активности и экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЬЯ4 в 1-е сутки у больных ОДП могут свидетельствовать о развитии у этих больных иммуносупрессии, которая наблюдается при тяжёлых острых воспалительных заболеваниях. Подобное ослабление компонентов врождённого иммунитета может приводить к последующему присоединению инфекции и развитию инфекционных осложнений ОДП [Ку1апраа М-

Ь.е1 а!.,2010; Ма1зишига N. е1 а!.,2007]. В нашем исследовании у 50% больных этой подгруппы на 2-3 неделе заболевания развивались гнойно-деструктивные осложнения,

которые сопровождались повышением экспрессии мРНК ТЬ112 и ТЬЯ4 и их

1

ффекторной функции на 14-28 сутки. Таким образом, выявленные нами низкие начения экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 и снижение эффекторной функциональной ктивности ТЬЯ2 и ТЫ14 на первой неделе заболевания у больных ОДП могут пособствовать развитию гнойных осложнений на второй неделе заболевания.

ы обнаружили, что у больных с неблагоприятным исходом заболевания (смерть на 1-й неделе заболевания) низкий уровень экспрессии мРНК ТЫ12, пониженная экспрессия Т1Л2 и ТЫ14 на моноцитах и отсутствие индуцированной ТЬЯ2 и ТЬЯ4 выработки ФНОа сочетались с высокой концентрацией ИЛ-6 в сыворотке периферической крови больных в 1 сутки заболевания (концентрация ИЛ-6 у больных ОДП с неблагоприятным исходом в 1 сутки составила 354,3±100,4пг/мл; здоровых доноров -31,5±12,8пг/мл, р<0,05). Выявленные изменения могут служить прогностическим критерием неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита.

Таким образом, проведение комплексной трехуровневой оценки системы ТЬЯ у больных острым деструктивным панкреатитом позволяет уточнить нарушения механизмов врожденного иммунитета, на основе выявленных изменений выдвинуть новые ранние маркеры тяжести течения и развития неблагоприятных исходов заболевания, а также осуществлять контроль за проводимой терапией у этих больных. Кроме того, выявленные дефекты функционирования системы ТЬЯ могут рассматриваться как мишени для терапевтического воздействия в лечении больных ОДП.

Предложенный в работе комплексный анализ системы ТЬЯб, включающий поэтапую оценку эффекторной функциональной активности ТШ1, экспрессии молекул ТЫ1 и мРНК ТЬЯ раскрывает новые подходы к пониманию роли механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии, позволяет оценить функциональное

Рисунок 6. Алгоритм проведения комплексной оценки системы ТЬКв .

На рисунке представлены выявленные в работе изменения в системе ТІ .К у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН,Х-АГГ), у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитом, в красной рамке - показатели, которые могут рассматриваться как маркеры прогноза течения и развития осложнений.

состояние клеток врожденного иммунитета, точно локализовать дефект в системе ТЬЯ и в дальнейшем проводить целенаправленную коррекцию выявленных нарушений.

а рисунке 6 представлен алгоритм проведения комплексной оценки системы ТЫ1, приведены выявленные нами изменения в системе ТЫ1 у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ), у больных с острыми патологическими состояниями, сопровождающимися деструкцией ткани (ОИМ и ОДП), представлены показатели, которые могут рассматриваться как маркеры ранней диагностики развития осложнений, неблагоприятного исхода заболевания при данных патологических состояниях. Разработанный подход оценки системы ТЫ1 дает возможность выявлять новые диагностические и прогностические критерии течения заболеваний, развития осложнений, оценить эффективность применения лекарственных препаратов. Выявляемые нарушения в системе ТЫ1 могут служить новой терапевтической мишенью и открывают возможности для проведения целенаправленной терапии.

выводы

1.Разработан аналитический подход комплексной оценки системы паттери-распознающих рецепторов врожденного иммунитета — То11-подобных рецепторов (ТЬК) на мононуклеарных клетках периферической крови человека, заключающийся в поэтапном определении эффекторной функциональной активности ТЬЛ, экспрессии молекул ТЬЯ на поверхности клеток и уровне экспрессии мРНК ТЬЫ.

2.Анализ системы ТЬЯ у здоровых людей различных возрастных групп позволил выявить повышенные значения эффекторной функциональной активности и поверхностной экспрессии ТЫ12 у здоровых детей в возрасте 0,5-3 лет по сравнению с детьми 10-15 лет и взрослыми донорами 20-40 лет.

3.Выявлены нарушения механизмов врожденного иммунитета у больных обшей вариабельной иммунологической недостаточностью (ОВИН), проявляющиеся низкими значениями эффекторной функции ТЫ12 и ТЫ14, дисбалансе ТЬК4-опосредованной выработки ФНОа и ИФНа; снижении экспрессии ТЬЯ2 и ТЫ14 на С014+ моноцитах больных, изменении уровня экспрессии мРНК ТЫ12, 1ЪЯ4 и ТЬЯ9. Выявленные изменения в системе ТЬЯ могут быть вовлечены в иммунопатогенез и клинические проявления ОВИН.

4.Комплексное исследование системы ТЬЯ у больных Х-сцеплен яой агаммаглобулинемией позволило выявить сниженные значения экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЬЯ4 мононуклеарными клетками больных и экспрессии этих рецепторов на поверхности моноцитов, сопровождающиеся уменьшением их эффекторной функциональной активности.

5.Показано, что у больных острым инфарктом миокарда происходит активация факторов врожденного иммунитета, которая выражается в повышении значений спонтанной и индуцированной лигандами ТЬЯ2 и ТЫ14 выработки ФНОа и уровня экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных в 1, 14 сутки заболевания.

6.Развитие осложнений острого инфаркта миокарда ассоциировано с гиперактивацией

I

в системе ТЫ1, выражающейся в увеличении ТЬЯ2- и ТЪЯ4-опосредованной

выработки ФНОа и экспрессии молекул ТЬЯ2 и ТЬЯ4 к 14-м суткам заболевания по

1

сравнению со значениями в 1-е сутки.

7.У больных острым деструктивным панкреатитом повышены эффекторная функциональная активность ТЬИ2 и ТЬЯ4, экспрессия мРНК этих рецепторов мононуклеарными клетками периферической крови в 1-7 сутки заболевания. Уровень

I

экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЫ14 может служить критерием тяжести течения острого панкреатита: легкое течение сопровождается снижением экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 на 3-7 сутки заболевания, повышение экспрессии в эти сроки наблюдается у больных с тяжелым течением.

8.Прогностическими критериями неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита могут служить нарушения в системе ТЬЯ в 1 сутки заболевания, характеризующиеся низкими значениями экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЫ14, молекул ТЬЯ2 и ТЫ14 на моноцитах, угнетением индуцированной лигандами ТЬЯ2 и ТЬЯ4 выработки ФНОа в сочетании с высокой концентрацией ИЛ-6 в сыворотке крови.

9.Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикам в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита на ранних сроках заболевания. При использовании Лорноксикама в лечении больных острым деструктивным панкреатитом отмечено снижение ТЬЯ2- и Т1Л14-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов (ИЛ-6,ФНОа) и уровня экспрессии мРНК ТЫ 12 и ТЬЯ4 мононуклеарными клетками периферической крови больных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Хорева М.В. Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-12 и ИФН-у МНК периферической крови у детей, больных ОВИН./ Хорева М.В., Долгина E.H.,Пащенко O.Ei и др.// Аллергология и иммунология. - 2004. -т.5, №1, С.153

2.Хорева M.B. Особенности выработки ФНО-а под влиянием различных стимулов в норме и при первичных иммунодефицитах./ Л.В.Ковальчук, М.В. Хорева, A.C. Варивода и др.//Аллергология и иммунология.-2005.- т.6, № 2, С.159.

3.Хорева М.В. Врожденные компоненты иммунитета: То11-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии./ Л.В.Ковальчук , М.В.Хорева, А.С.Варивода // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии.- 2005,- №4, С. 96-104.

I

4.Khoreva M.V. Cytokine-secretory function of human leukocytes of peripheral blood expressing Toll-like receptors. The role of different ligands./ Kovalchuk L.V., Khoreva M.V., Varivoda A.S.// Abstr.of the Congress "Immune-Mediated Diseases:from Theory to Therapy", JAPAIR. -2005. - v.6,suppl.l, P.91-92.

5.Хорева М.В. Изучение функциональной активности ТоП-подобных рецепторов у больных инфарктом миокарда./ М.В.Хорева, А.С.Варивода, Л.В.Ковальчук и др.// Аллергология и иммунология. - 2006.- т. 7, №3, С.352.

6.Хорева М.В. Анализ поверхностной экспрессии CD14 и CD62L молекул и выработки ИЛ-8 нейтрофилами периферической крови пациентов с инфарктом миокарда под влиянием агонистов TLR2/6 и TLR4./ И.Н.Николаева, А.С.Варивода, М.В.Хорева и др.//

Аллергология и иммунология. - 2006.- т. 7, №3, С.353. !

¡

7.Хорева М.В. Дефекты системы врожденного иммунитета у больных с первичными иммунодефицитами./ Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева, A.C. Варивода // Аллергология и иммунология в педиатрии. -2006.-, №2-3(9), С. 75. I

8.Хорева М.В. Опосредованные через То11-подобные рецепторы выработка цитокинов и экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами человека./ М.В. Хорева, Л.В.Ковальчук, A.C. Варивода и др.// Аллергология и иммунология. — 2006.- т.7, №2, С. 199-206.

9.Хорева М.В. Влияние лигандов ТоП-подобных рецепторов на выработку in vitro провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых людей и больных с общей вариабельной иммунологической недостаточностью./ Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева, A.C. Варивода и др.// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии.- 2007.-№1,С. 38-42.

Ю.Хорева М.В. Влияние лигандов TLR на выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных первичными иммунодефицитами./ Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева, A.C. Варивода и др.// Сборник материалов VIII конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (2 7-29 июня 2007),С.55.

11.Хорева М.В. Анализ зависимой от ТоИ-подобных рецепторов выработки провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека in vitro у здоровых доноров и больных первичным иммунодефицитом./ Л.В.Ковальчук, М.В.Хорева, А.С.Варивода и др. // БЭБИМ. - 2007. - т. 144, №7, С]. 6872.

12. Khoreva M.V.Expression and functional activity of TLR2 and TLR4 in patients with congenital disorders of antibody production./ Khoreva M.V., Varivoda A.S., Paschenco O.E.// Abstr.of the 2 Congress "Immune-Mediated Diseases: from Theory to Therapy" —JAPAIR.-2007.- v.ll, suppl.2, P.30.

13.Хорева M.B. Экспрессия и функциональная активность TLR2 и TLR4 на мононуклеарных клетках здоровых людей и больных ОВИН./ Варивода A.C., Ковальчук Л.В., Хорева М.В. и др.// Сборник материалов VI Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии»,- октябрь 2007.-С. 76-77.

14.Хорева М.В. Анализ поверхностной экспрессии и TLR2 TLR4 на моноцитах периферической крови больных первичными иммунодефицитами./ Л.В.Ковальчук, М.В.Хорева, А.С.Варивода и др.// Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- 2008.-С.161.

15.Хорева М.В. Подходы к оценке рецепторов врожденного иммунитета./ Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Варивода A.C. и др.// Российский иммунологический журнал.-2008.- т. 2(11),№2-З.С. 151.

16.Хорева М.В. Дефекты в системе То11-подобных рецепторов у детей с первичными иммунодефицитами./ Варивода A.C., Хорева М.В., Ковальчук Л.В. и др.// Российский иммунологический журнал. -2008,- т. 2(11), № 2-3. — С. 274.

17.Хорева М.В. Экспрессия и функциональная активность TLR2 и TLR4 у больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью./ Варивода A.C., Николаева М.А., Хорева М.В. и др.// Российский иммунологический журнал.-2008.- т. 2 (11), № 2-З.-С. 274.

18.Хорева М.В. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке То11-подобных рецепторов человека./ Ковальчук Л.В., Хорева М.Ь., Варивода A.C. и др.// Иммунология.- 2008,- №4, С.223-227.

19.Хорева М.В. Роль рецепторов врожденного иммунитета в развитии острого инфаркта миокарда./ Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода A.C.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008.- №4, С. 64-68.

20.Хорева М.В. Комплексный анализ системы То11-подобных рецепторов при первичных иммунодефицитах с дефектом антителообразования./ Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода A.C. и др.// Материалы научно-практической конференции «М ;дико-биологические науки для теоретической и клинической медицины»,- 2008,-Мооква, С 56.

21.Хорева М.В. Эффекторные функции То11-подобных рецепторов при алопеции у детей./ Варивода A.C., Костина C.B., Хорева М.В. и др.// Российский аллергологический журнал,- 2009.-№3, вып. 1.С.41.

22.Хорева М.В. Анализ провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у дет( й с очаговой алопецией./ Костина C.B., Варивода A.C., Шарова Н.М. и др.// Российский аллергологический журнал.- 2009,- №3, вып. 1. С.357.

23. Khoreva M.V. Systemic approach to Toll-like receptors analysis in patients with primary immunodeficiency./ Varivoda A.S., Koval'chuk L.V., Khoreva M.V.et al.// Materials of 4-th Europaediatrics Congress.- Moscow, July 2009.

24.Хорева M.B. Клиническое значение цитокинов при различных формах очаговой алопеции у детей./ С.В. Костина, Хорева М.В., Варивода A.C. и др.//Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии,- 2009.-, т.2, С.5-9.

25.Хорева М.В. Исследование цитокинов у детей с очаговой алопецией.// C.B. Костина, Варивода A.C., Шарова Н.М. и др.// Материалы 3-ей российской научно-практической конференции Санкт-Петербургские дерматологические чтения. -Сентябрь 2009.

26.Хорева М.В. Влияние ингибитора циклооксигеназы на опосредованную через TLR2 и TLR4 выработку цитокинов мононуклеарными клетками человека в норме и при остром панкреатите./Хорева М.В., Ковальчук JI.B., Варивода A.C. и др.// Российский иммунологический журнал.- 2009,- №3-4, 3(12), С.294-302.

I

27.Хорева М.В. Роль цитокинов в развитии острого панкреатита./ М.А. Агапов, В.А. Горский, М.В. Хорева и др.// Анналы хирургической гепатологии.- 2009.- №3, С.85-111.

28.Хорева М.В. Корригирующее действие ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояние мононуклеарных клеток, экспрессирующих Toll- подобные рецепторы./ Л.В.Ковальчук, М.В. Хорева, A.C. Никонова и др.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии .- 2010.- №1, С.45-50.

29.Хорева М.В. Антимедиаторная терапия в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита./ В.А. Горский, Л.В. Ковальчук,М.А. Агапов и др.// Хирургия. Журнал им. Н.И.Пирогова.- 2010,- №3, С. 54-61.

30.Хорева М.В. Применение нестероидных противовоспалительных препаратов в лечении панкреонекроза./ Шуркалин Б.К., Ковальчук Л.В., Агапов М.А. и др.// Хирург. — 2010.-№3, С.5-13. j

31.Хорева М.В. Кардиоиммунные взаимодействия на основе рецепторов врожденного иммунитета: состояние вопроса, перспективы развития./ Л.В. Ковальчук, A.C. Никонова, М.В.Хорева и др.// Вестник Российского государственного медицинского университета,-2010,-№1, С. 11-18.

32.Хорева М.В. Изучение системы То11-подобных рецепторов врожденного иммунитета в острый период после инфаркта миокарда./ Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева, АС. Никонова, Е.В. и др.// Вестник Российского государственного медицинского университета,- 2010,- №1, С.19-24.

33.Хорева М.В. Анализ функциональной активности и экспрессии То11-подо( >ных рецепторов на мононуклеарных клетках у детей с нейтропенией./ М.В.Хорева, A.C.

Никонова, JI.B. Ковальчук и др.// Материалы XVI конгресса «Человек и лекарство».-2010,- С. 476.

34.Хорева М.В. Синдром системной воспалительной реакции при остром панкреатите: особенности молекулярной патофизиологии и возможные пути коррекции./

B.А.Горский, М.А.Агапов, Л.В.Ковальчук и др.// Клиническая медицина.- 2010.- №2,

C.39-44.

I

35.Хорева М.В. Влияние нестероидных противоспалительных препаратов на медиаторы воспаления у больных панкреонекрозом./ Б.К.Шуркалин, В.А.Горский, М.А.Агапов и др.// Инфекции в хирургии,- 2010,- Т.8, №2, С.28-32.

I

36.Хорева М.В. Опосредованная То11-подобными рецепторами функциональная активность мононуклеарных клеток у детей с нейтропениями./Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева А.С. Никонова и др.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2010,- №2, С.45-50.

37.Хорева М.В. Цитокин-антагонистическая терапия острого деструктивного панкреатита./ М.А.Агапов, Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева и др.// Хирургия, приложение к журналу Consilium Medicum.- 2010,- №1,С.43-46.

38.Хорева М.В. Распознающие рецепторы врожденного иммунитета (NLR,RLR и CLR)./ Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева, А.С. Никонова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2011.- №1, С.93-100.

39j Khoreva М. Antimediator Therapy as a Part of the Complex Treatment of Acute Destructive Pancreatitis./ V. Gorsky, M. Agapov, M. Khoreva et al.// Pancreatology, 43rd European Pancreatic Club (EPC) Meeting. Magdeburg, Germany. - June 22-25, 2011,- № 11, P.178.

I

40.j Патент на изобретение №2408256: «Способ диагностики безболевой ишемии миокарда у женщин» Чукаева И. И., Клепикова М.В., Орлова Н.В., Ковальчук Л. В., Хо|)ева М. В., Никонова А.С., Речнова Н.П., Денисова Н.Н., Смирнова Т. В., Чура О.В. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 января 2011г.

41.Хорева М.В. Возможности коррекции синдрома системной воспалительной реакции при остром деструктивном панкреатите./ Агапов М.А., Хорева М.В., Горский В.А.// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология,- 2011.- №7, С. 18-23.

42. M.V. Khoreva . Mechanical Stretching of Cells of Different Tissues: The Role of Mediators of Innate Immunity./ L. V. Kovalchuk, M.V. Khoreva, A. Nikonova et al.// Mechanosensitivity in Cells and Tissues, 1, Volume 5, Mechanical Stretch and Cytokines, P. 35-58, 2012, Book Chapter.

43. ,M.V. Khoreva. The Role of Proinflammatory Cytokines in Regulation of Cardiac Bioelectrical Activity: Link to Mechanoelectrical Feedback ./ V. S. Kuzmin, D. V.

Abramochkin, V. M. Mitrochin et al.// Mechanosensitivity in Cells and Tissues, 1, Volume 5, Mechanical Stretch and Cytokines, P. 107-153, 2012, Book Chapter.

45. M.V. Khoreva. An Anti-inflammatory Cytokine Interleukin-13:Physiological Role in the Heart and Mechanoelectrical Feedback. / D. V. Abramochkin, E. Yu. Makarenko,V. M. Mitrochin et al.// Mechanosensitivity in Cells and Tissues, 1, Volume 5, Mechanical Stretch and Cytokines, P. 155-164,2012, Book Chapter.

46.Хорева M.B. Влияние антимедиаторной терапии на экспрессию матричной РНК в мононуклеарных клетках крови больных острым деструктивным панкреатитом./ } В.А.Горский, М.А.Агапов, М.В.Хорева и др. // Анналы хирургической гепатологий. -2012. - Т.17, № 3, С.94-100. |

47. M.V. Khoreva. Expression of TLR 2 in Mononuclear Cells in Peripheral Blood of Patients with Severe Acute Pancreatitis during the Treatment with NSAID"Lornoxicam/ V. Gorsky, M. Agapov, M. Khoreva et al.// 44rd European Pancreatic Club (EPC) Meeting. Prague,Czech Republic. June 20-23, 2012.-P.160

48.Хорева M.B. Оценка возможности влияния антимедиаторной терапии на экспрессию мРНК в мононуклеарных клетках крови больных острым деструктивным панкреатитом./В. А.Горский, М.А.Агапов, М.В.Хорева и др.//Вестник экспериментальной и клинической хирургии.-2012,- Т.5, №2, С.269-273.

49. Хорева М.В. Патогенетические аспекты применения антимедиаторной терапии в комплексном лечении панкреонекроза./ В.А.Горский, М.А.Агапов, М.В.Хорева и др.// Цитокины и воспаление.-2012,- T.l 1, №3,С.67-69.

Подписано в печать. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж ЮОэкз. Заказ № 2048 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Актуальность исследования. Изучение механизмов врожденного иммунитета в настоящее время является одной из актуальных проблем современной фундаментальной и клинической иммунологии. В 90-х годах XX столетия Ch. Janeway и R. Medzhitov выдвинули гипотезу о том, что врожденный иммунитет обладает определенной специфичностью к чужеродным антигенам. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета являются сигнальные паттерн распознающие рецепторы (ПРР) - Toll-подобные рецепторы (TLR) [31,279,280]. За последние 20 лет достигнуты впечатляющие успехи в изучении роли TLR во врожденном и адаптивном иммунитете, что позволило совершенно по-новому взглянуть на природу иммунных процессов в организме. TLR распознают высоко консервативные структуры патогенных микроорганизмов, так называемые паттерны, ассоциированные с микроорганизмами (pathogen-associated molecular patterns - РАМР). Различные макромолекулы служат микробными лигандами для TLR, включая липиды, углеводы, белки и нуклеиновые кислоты. К наиболее известным лигандам TLRs экзогенного происхождения относятся компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогликаны (ПГ), липополисахариды (ЛПС); флагеллин, ДНК микроорганизмов, вирусная РНК и многие другие. В настоящее время показано, что лигандами для TLR могут также являться эндогенные молекулы, высвобождающиеся в результате некроза клеток и массивной деструкции тканей, а также распада молекул внеклеточного матрикса. Такие лиганды получили обозначение как «сигналы опасности» или DAMP (damage-associated molecular pattern). К эндогенным активаторам TLR относятся белки теплового шока - HSP60, HSP70, фибронектин, (3-дефензин и многие другие [380,120,168]. Распознавание экзогенных и эндогенных лигандов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов, костимуляторных молекул, противомикробных пептидов и других молекул. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и в дальнейшем направляют развитие адаптивного иммунного ответа [46,76,86,206,91,321,384,235]. Интенсивность ответа и его направленность в дальнейшем определяются несколькими компонентами, составляющими систему ТЫ1. Система ТЪЯ включает лиганды активирующие ТЫ1, сами рецепторы, молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала - адапторные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации ТЪЯ и опосредуют их дальнейшие эффекты [34]. Дефекты в системе ТЬЯ: нарушения распознавания лигандов, экспрессии ТЪЯ, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов ТЬЯ могут приводить к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и других заболеваний [146,340,255,386,293]. Количество патологий с нарушениями в системе ТЪЯб растет.

Первичные иммунодефицита (ПИД) с дефектами антителообразования, такие как общая вариабельная иммунологическая недостаточность - ОВИН и Х-сцепленная агаммаглобулинемия - Х-АГГ характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы, и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [111,148,409]. Изучение механизмов функционирования врожденной иммунной системы, оценка состояния компонентов системы ТЫ1 у больных ПИД с дефектами антителообразования позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН, оценить вклад механизмов врожденного иммунитета в развитие и тяжесть течения инфекций и других осложнений.

Со времени открытия ТЬЯ представление о них как о структурах, участвующих только в противоинфекционной защите, существенно видоизменилось. При многих воспалительных заболеваниях, сопровождающихся массивной клеточной деструкцией таких, как инфаркт миокарда, острый панкреатит, происходит высвобождение большого количества эндогенных лигандов, что приводит к активации сигнальных путей TLR. Иногда высвобождаемые DAMP связывают с так называемым "стерильным воспалением", которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов. Чрезмерная активация TLR и выработка неконтролируемого количества провоспалительных цитокинов могут способствовать развитию системной воспалительной реакции, дальнейшему повреждению тканей, формированию осложнений основного заболевания [34]. Исследование системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза заболеваний, сопровождающихся деструкцией ткани.

Для выявления дефектов, связанных с нарушением функционирования системы TLR, необходимы надежные методы. Комплексное исследование системы TLR при различных заболеваниях позволит оценить роль механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии. Выявление нарушений в системе То11-подобных рецепторов способствует проведению более точной своевременной диагностике, прогнозированию характера течения заболевания, дает возможность изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также научно обосновать и разработать новые подходы адекватной терапии.

Цель исследования: разработать аналитический подход комплексной оценки. компонентов системы распознающих рецепторов врожденного иммунитета - То11-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул TLR и уровня экспрессии мРНК TLR у здоровых людей, больных с иммунодефицитами и у больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани, оценить возможность использования выявленных изменений в качестве маркеров прогноза течения заболевания.

Задачи исследования:

1 .Разработать комплексный подход к оценке системы То11-подобных рецепторов на уровне экспрессии генов, белков и секретируемых молекул, опосредующих эффекторную функциональную активность TLR на мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови человека.

2.Разработать метод и провести оценку эффекторной функциональной активности TLR на МНК периферической крови in vitro у здоровых людей различных возрастных групп (взрослые здоровые доноры, дети 10-15 лет, дети 0,5-3 лет).

3.Провести анализ системы TLR у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования. Определить эффекторную функциональную активность TLR2 и TLR4, их экспрессию на поверхности моноцитов, а также уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью и Х-сцепленной агаммаглобулинемией.

4,Оценить значимость выявленных изменений уровня экспрессии и функционирования TLR в иммунопатогенезе и развитии клинических проявлений у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

5.С помощью разработанного подхода проанализировать состояние системы TLR на МНК периферической крови больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит) в динамике. 6.Определить диагностическую значимость и возможность использования выявленных изменений уровня экспрессии мРНК TLR, экспрессии молекул рецепторов на поверхности клеток и эффекторной функциональной активности TLR у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитом в качестве маркеров прогноза течения и исхода заболевания.

7.Обосновать возможность использования нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на основе оценки системы тья.

Научная новизна работы

В работе впервые представлен аналитический подход к оценке системы То11-подобных рецепторов,) заключающийся в поэтапном исследовании и анализе эффекторной функциональной активности ТЪЯ, экспрессии молекул ТЬЯ и уровне экспрессии мРНК ТЪЯ МНК периферической крови человека.

Работа содержит новые данные о вовлечении механизмов врожденного иммунитета в иммунопатогенез первичных иммунодефицитов с дефектами антителообразования. Обнаружены нарушения в системе ТТЛ у больных ОВИН и Х-АГГ. Показано, что при данных ПИД снижена эффекторная функциональная активность ТЫ12 и ТЫ14 на МНК, определяемая по индуцированной лигандами выработке ФНОа, экспрессия этих рецепторов на поверхности моноцитов, нарушена экспрессия мРНК ТЬК2 и ТЫ14. У больных ОВИН выявлен дисбаланс ТЫ14-опосредованной выработки ФНОа и ИФНа МНК.

Впервые на основе нарушения функционирования системы ТЬЯ в динамике заболевания определены прогностические критерии развития неблагоприятного исхода острого инфаркта миокарда (ОИМ). Показано, что повышение эффекторной функциональной активности и экспрессии ТЬЯ2 и ТЬЯ4 на МНК у больных ОИМ в динамике заболевания может приводить к развитию осложнений.

Впервые проанализированы показатели системы ТЪЯ у больных острым деструктивным панкреатитом (ОДП) в динамике: эффекторная функциональная активность ТЫ12 и ТЬЯ4, экспрессия молекул на поверхности моноцитов и уровень экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЫ14 в МНК. В работе представлены новые данные о вовлечении рецепторов врожденного иммунитета - TLR2 и TLR4 в развитие и течение ОДП. Установлено, что снижение экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 к концу 1-ой недели заболевания характерно для легкого течения, в то время как тяжелое течение ОДП сопровождается ростом уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в эти сроки.

Впервые показано, что у больных ОДП изменения в системе TLR, характеризующиеся низкими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 на 1-й неделе заболевания в сочетании со сниженными значениями индуцированной выработки провоспалительных цитокинов, могут приводить к развитию гнойно-деструктивных осложнений.

Установлено, что нестероидный противовоспалительный препарат Лорноксикам приводит к снижению индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) МНК периферической крови здоровых доноров в культуре in vitro.

Впервые установлено, что применение Лорноксикама в комплексном лечении больных ОДП на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и Т1^4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у этих больных.

Практическая значимость работы

В данной работе разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности TLR, основанный на определении индуцированной соответствующими лигандами TLR выработки провоспалительного цитокина - ФНОа и ИФНа МНК периферической крови человека. Проведена оценка выработки ФНОа и ИФНа МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых людей различных возрастных групп. Предложенный метод позволяет оценить эффекторную функциональную активность рецепторов врожденного иммунитета у здоровых людей и больных с иммунопатологией.

У больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) в ходе настоящего исследования обнаружены нарушения в системе рецепторов ТЬЯ на МНК. Выявленные нарушения экспрессии и функционирования ТЪЫ2 и ТЪБМ у больных ОВИН свидетельствуют о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета, и позволяют уточнить иммунопатогенез ОВИН.

С использованием разработанного подхода выявлены новые маркеры развития осложнений у больных острым инфарктом миокарда. Показано, что увеличение ТЬИ2 и ТЬЯ4-опосредованной выработки ФНОа и экспрессии молекул ТЫ12 и ТЫ14 на моноцитах больных к 14-м суткам заболевания может служить прогностическим критерием развития осложнений ОИМ.

Предложены новые маркеры ранней диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на определении низких значений экспрессии мРНК ТЪЯ2 и ТЪЯ4, сопровождающихся угнетением индуцированной лигандами ТЫ12 и ТЬЯ4 выработки ФНОа и высоких значений ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки заболевания.

Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата - Лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания. Лорноксикам приводит к снижению ТЬЯ2 и ТЬЯ4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК ТЪЯ2 и ТЬЯ4 МНК у больных на 3-й сутки заболевания и позволяет снизить риск развития системной воспалительной реакции.

Предложенный комплексный подход к оценке системы ТЫ1 открывает новые направления в раннем прогнозе течения, исхода заболевания и возможности проведения целенаправленной патогенетической коррекции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы рецепторов врожденного иммунитета - То11-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности ТЬЯ, экспрессии молекул и уровня экспрессии мРНК ТЬЯ мононуклеарными клетками периферической крови человека.

2. Использование разработанного подхода позволило выявить нарушения в системе врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) на уровне функционирования и экспрессии ТЫ12, ТЫ14 мононуклеарными клетками периферической крови.

3. Комплексное исследование системы ТЬЯ при патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит), позволило выявить активацию системы ТЬЯ на ранних сроках заболевания. Увеличение в динамике заболевания значений эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул ТЪЯ2 и ТЫ14 и/или экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 в мононуклеарных клетках периферической крови может служить критерием тяжести течения и развития осложнений при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани.

4. Использование нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикам в лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания приводит к снижению ТЬК2- и ТЬЯ4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов и экспрессии мРНК ТЬИ2 и ТЬЯ4 в мононуклеарных клетках периферической крови больных, позволяет снизить риск развития системной воспалительной реакции.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России для студентов, аспирантов и ординаторов, используются в практической работе хирургических отделений ГКБ №55 г.Москвы.

Апробация результатов диссертационной работы

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011 и 2012 году в Москве на XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008), Европейском конгрессе педиатров (Москва, 2009), III Всероссийском Конгрессе по детской аллергологии и иммунологии (Москва 2009г.), IX Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2010 г.), XVIII международный Конгресс Хирургов - гепатологов стран СНГ «Актуальные проблемы Хирургической гепатологии» (Москва, 2011г.), XI Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 422 источника, из которых 87 отечественных и 335 зарубежных. Работа содержит 46 таблиц и 52 рисунка. Публикации

выводы

1. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета - То11-подобных рецепторов (ТЬЯ) на мононуклеарных клетках периферической крови человека, заключающийся в поэтапном определении эффекторной функциональной активности ТЪЯ, экспрессии молекул ТЪЯ на поверхности клеток и уровне экспрессии мРНК ТЬЯ.

2.Анализ системы ТЫ1 у здоровых людей различных возрастных групп позволил выявить повышенные значения эффекторной функциональной активности и поверхностной экспрессии ТЫ12 у здоровых детей в возрасте 0,5-3 лет по сравнению с детьми 10-15 лет и взрослыми донорами 20-40 лет.

3.Выявлены нарушения механизмов врожденного иммунитета у больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью (ОВИН), проявляющиеся низкими значениями эффекторной функции ТЫ12 и ТЬЯ4, дисбалансе ТЫ14-опосредованной выработки ФНОа и ИФНа; снижении экспрессии ТЫ12 и ТЬЯ4 на СБ14+ моноцитах больных, изменении уровня экспрессии мРНК ТЪЯ2, ТЫ14 и ТЬЯ9. Выявленные изменения в системе ТЬЯ могут быть вовлечены в иммунопатогенез и клинические проявления ОВИН. Показано, что низкие значения эффекторной функции ТЫ12 и ТЫ14 у больных ОВИН сопровождались повышенной частотой развития инфекций.

4.Комплексное исследование системы ТЪЯ у больных Х-сцепленной агаммаглобулинемией позволило выявить сниженные значения экспрессии мРНК ТЪЯ2 и ТЫ14 мононуклеарными клетками больных и экспрессии этих рецепторов на поверхности моноцитов, сопровождающиеся уменьшением их эффекторной функциональной активности.

5.Показано, что у больных острым инфарктом миокарда происходит активация факторов врожденного иммунитета, которая выражается в повышении значений спонтанной и индуцированной лигандами Т1Л2 и ТЬЫ4 выработки ФНОа и уровня экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных в 1, 14 сутки заболевания.

6.Развитие осложнений острого инфаркта миокарда ассоциировано с гиперактивацией в системе ТЪЯ, выражающейся в увеличении ТЬК2- и ТЬЯ4-опосредованной выработки ФНОа и экспрессии молекул ТЬЯ2 и ТЬЯ4 к 14-м суткам заболевания по сравнению со значениями в 1-е сутки.

7. У больных острым деструктивным панкреатитом повышены эффекторная функциональная активность ТЪЯ2 и ТЬЯ4, экспрессия мРНК этих рецепторов мононуклеарными клетками периферической крови в 1-7 сутки заболевания. Уровень экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 может служить критерием тяжести течения острого панкреатита: легкое течение сопровождается снижением экспрессии мРНК ТЪЯ2 и ТЬЯ4 на 3-7 сутки заболевания, повышение экспрессии в эти сроки наблюдается у больных с тяжелым течением.

8.Прогностическими критериями неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита могут служить нарушения в системе ТЬЫ в 1 сутки заболевания, характеризующиеся низкими значениями экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЬЯ4, молекул ТЪЯ2 и ТЬЯ4 на моноцитах, угнетением индуцированной лигандами ТЬЯ2 и ТЪЯ4 выработки ФНОа в сочетании с высокой концентрацией ИЛ-6 в сыворотке крови.

9.Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата

Лорноксикам в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита на ранних сроках заболевания. При использовании Лорноксикама в лечении больных острым деструктивным панкреатитом отмечено снижение ТЬЯ2- и

ТТЛ14-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов (ИЛ

6,ФНОа) и уровня экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЬЯ4 мононуклеарными клетками периферической крови больных.

245

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью прогнозирования развития осложнений у больных острым инфарктом миокарда необходимо проводить оценку эффекторной функции и экспрессии рецепторов ТЫ12 и ТЬЫ4 на поверхности СБ14+ моноцитов на 14-е сутки заболевания. Повышение оцениваемых показателей по сравнению с 1-ми сутками позволяет отнести данных пациентов в группу риска.

2. Комплексное исследование показателей системы ТЫ1 на мононуклеарных клетках периферической крови у больных острым деструктивным панкреатитом может быть использовано для оценки степени тяжести, прогнозирования развития осложнений и исхода заболевания:

2.1. Тяжелое течение ОДП характеризуется повышением уровня экспрессии мРНК Т1Л12 и ТЬЯ4 и эффекторной функции этих рецепторов у больных на 3-7 сутки заболевания по сравнению с показателями в 1-е сутки.

2.2. Развитие неблагоприятного исхода заболевания сопровождается низкими значениями уровня экспрессии мРНК ТЬЫ2 и Т1П4, отсутствием ТЬЯ2- и ТЬЯ4- индуцированной выработки ФНОа и высокими значениями ИЛ-6 в сыворотке больного в 1-е сутки заболевания.

2.3.Развитию гнойно-деструктивных осложнений на второй-третьей неделе заболевания предшествуют низкие показатели уровня экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЫ14 и эффекторной функции ТЬК2 и ТЫ14 на 1-й неделе заболевания.

3.Одним из возможных путей снижения риска развития системной воспалительной реакции у больных острым деструктивным панкреатитом может быть назначение препарата Лорноксикам на 1-3 сутки заболевания, проводимое под контролем оценки у больных экспрессии мРНК ТТК2 и ТЫ14 и их эффекторной функции.