Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клинико-иммунологические особенности врожденной генерализованной цитомегаловирусной и герпетической инфекций у детей первых трех месяцев жизни

На правах рукописи

ЛЕВКОВИЧ Александр Юрьевич

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОЙ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ И ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ ПЕРВЫХ ТРЕХ МЕСЯЦЕВ ЖИЗНИ

14.01.08 - педиатрия

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14 г'оя т

Ростов - на — Дону 2013

005537762

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Афонин Александр Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Сизякина Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

Болотова Нина Викторовна, доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет им.В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой пропедевтики детских болезней, детской эндокринологии и диабетологии

Сотникова Наталья Юрьевна, доктор медицинских наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им.В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая лабораторией клинической иммунологии Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «уРу, декабря 2013г. в > и часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.05. на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан « 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Шовкун В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Врожденная инфекционная патология у детей является одной из наиболее сложных и чрезвычайно важных медико-социальных проблем современной педиатрии и неонатологии. Врожденная инфекция выявляется у 27,4-36,6% новорожденных, при этом инфекционная патология занимает ведущее положение в структуре перинатальной смертности, обусловливая от 11% до 45% потерь, мертворождаемость достигает 14-18%, а удельный вес врожденных инфекций в структуре младенческой смертности составляет от 10 до 61% (Стрижаков А.Н. с соавт., 2006; Сучков C.B. с соавт., 2007; Бахарева И.В., 2009; Буданов П.В., 2010; Ожегов A.M., 2011; Сидорова И.С., Макаров И.О., 2011; Суслова М.А., 2012; Трошина И.Н., 2012; Johnston С. et al., 2008; Muller W.J. et al., 2010).

В настоящее время в структуре врожденной инфекционной патологии возросла роль герпесвирусных инфекций, ведущими из которых являются цитомегаловир'усная инфекция (ЦМВИ) и инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 1,2 типа (ВПГИ). Эти заболевания у новорожденных характеризуются склонностью к генерализации, высокой частотой поражения ЦНС, трудностью диагностики, прогнозирования течения, высокой частотой инвалидизации и снижением качества жизни в целом (Заплатников А.Л. с соавт.,2005; Сенчук А.Я., Дубоссарская З.М., 2005; Симованьян Э.Н. с соавт., 2007; Долгих Т.И. с соавт., 2008; Дегтярев Д.Н. с соавт., 2009; Яцык Г.В. с соавт., 2009; Лобзин Ю.В. с соавт., 2010; Новиков М.Ю., 2011; Picone О. et al., 2005; Abdel-Latif M., Sugo E., 2010; Dye D.W., Simmons G.T., 2010; Gleason C.A, Devaskar S.U., 2012).

Учитывая, что в реализации инфекционного процесса ведущая роль отводится состоянию защитных сил организма, изучению иммунного статуса новорожденных при ЦМВИ и ВПГИ посвящено большое количество исследований, касающихся преимущественно адаптивного иммунитета (Кравченко JT.B.,2009; Ожегов A.M. с соавт.,2011; Суслова М.А.,2012; Morein В. et al., 2007; Koyama S. et al., 2008).

В последние годы показана важная роль врожденной иммунной системы как в борьбе с патогенными микроорганизмами, так и в активации и регуляции системы приобретенного иммунитета. При этом, в системе врожденного иммунитета большое значение отводится Toll - подобным рецепторам (TLR), связывание которых микробными продуктами приводит к воспалительному ответу, опосредованному продукцией цитокинов, что в дальнейшем определяет характер, направление и интенсивность адаптивного иммунного ответа (Ковальчук JI.B. с соавт., 2007, 2010; Хаитов P.M. с соавт., 2010; Ярилин А.А., 2010; Iwasaki A., Medzhitov R., 2004; Sandor F., Bue M., 2005; Kawai T., Akira S., 2007; Koyama S. et al., 2008; O'Neill L.A., 2008; Barbalat R. et al., 2009; Beutler B.A., 2009; Dietrich N. et al., 2010; Kollmann T.R. et al., 2012; Lee C.C. et al., 2012; Oliveira-Nascimento L. et al., 2012).

Накапливаются сведения, свидетельствующие о том, что дефекты в системе TLR (снижение их экспрессии и функции в силу мутаций/полиморфизмов или эпигенетических нарушений регуляции TLR) лежат в основе развития иммунодефицитных состояний, реализации и генерализации инфекции (Ганковская О.А. с соавт., 2007; Хаитов P.M. с соавт., 2010; Corr S.C., J.O'Neill L.A., 2009; Khoo J.J. et al., 2011).

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения ключевых механизмов иммунопатогенеза врожденной ЦМВИ и ВПГИ, обусловливающих супрессию иммунного ответа и, следовательно, приводящих к генерализации и неблагоприятному исходу этих заболеваний.

Цель исследования: выявление патогенетических механизмов развития врожденной генерализованной цитомегаповирусной и герпетической инфекции у новорожденных детей и разработка иммунологических критериев формирования и прогноза течения заболевания.

Задачи исследования: 1.Выявить особенности клинического течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у детей первых трёх месяцев жизни.

2.0пределить уровень экспрессии Т1Ж-2, ТЬК-4, ТЬЯ-6 мононуклеарами периферической крови и частоту встречаемости полиморфизма их генов у наблюдаемых новорожденных.

3.Оценить параметры иммунного статуса, содержание Т-регуляторных клеток и характер нарушений процессов апоптоза на основании определения С095+, АппехтУ+, Р1+ у данного контингента детей.

4.Определить содержание в сыворотке крови моноцитарного хемо-аттрактантного протеина - 1 (МСР-1), интерлейкинов - 4, 6, 8, 12, интерферонов а и у у детей с генерализованной ЦМВИ и ВПГИ в динамике первых трех месяцев жизни.

5.Установить корреляционные взаимосвязи между параметрами врожденного и адаптивного иммунитета у наблюдаемых детей.

6.Разработать иммунологические критерии формирования и прогноза течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у новорожденных детей.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые:

- проведено комплексное клинико-иммунологическое исследование в аспекте изучения взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета у детей первых 3-х месяцев жизни с генерализованной ЦМВИ и ВПГИ, позволившее установить новые патогенетические механизмы формирования данной патологии;

- выявлены значимые маркеры развития врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой у новорожденных в виде снижения экспрессии ТЬЯ-2 и ТЫ1-6 на моноцитах, полиморфизма 5ег249Рго гена ТЬЯ-6, снижения уровня ИК-клеток с усилением маркеров поздней активации С095+ на их поверхности, снижения 1РЫ-а, Н'Ы-у, повышения маркеров апоптоза лимфоцитов АппехтУ+Р1+, количества Т-регуляторных клеток, повышения уровня 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8, МСР-1, приводящие к редукции противовирусного иммунного ответа; при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой отмечается только снижение ШЫ-а и повышение 1Ь-б;

- показано, что наиболее значимыми причинами развития врожденной генерализованной ВПГИ является снижение экспрессии TLR-2 на моноцитах, наличие полиморфизма Arg753 Gin гена TLR-2, снижение относительного количества CD3+, снижение CD25+ на поверхности NK-клеток, снижение продукции IFN-y, IFN -a, IL-12 в сочетании с повышением маркеров апоптоза лимфоцитов AnnexinV+PI+ и повышением уровня IL-4, IL-6, МСР-1;

- выявленное повышение синтеза МСР-1 при ЦМВИ приводит к усилению вирусной репликации и сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении Th2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа;

- установлено, что повышение количества Т-регуляторных клеток и IL-4 способствует формированию супрессивного иммунофенотипа при врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ;

- выявлены корреляционные взаимосвязи между показателями врожденного и адаптивного иммунитета, отражающие угнетение ранних этапов иммунного ответа, нарушение эффекторной функции иммунокомпетентных клеток, нарушение режима иммунорегуляции при герпесвирусной инфекции;

- разработаны иммунологические критерии формирования и прогноза течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у новорожденных детей.

Практическая значимость

1. Разработаны иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной цитомегаловирусной инфекции с полной клинической симптоматикой: повышение содержания CD16+CD95+, AnnexinV+PI+,T-регуляторных клеток, IL-8.

2. Разработаны иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной герпетической инфекции: снижение экспрессии TLR-2, снижение CD16+CD25+, повышение уровня IL-6.

3. Выявлены ранние маркеры стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода врожденной генерализованной инфекции: при ЦМВИ

- снижение уровня ШЫ-у; при ВПГИ - повышение содержания Т-регуляторных клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности клинического течения врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ ассоциированы с различными вариантами иммунного реагирования.

2. У детей с врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой ведущим в формировании врожденного и адаптивного иммунного ответа является снижение экспрессии ТЫ1-2 и ТЬЯ-б на моноцитах, наличие полиморфизма Бег249Рго гена ТЫ1-6, снижение уровня ЫК-клеток с усилением маркеров поздней активации СБ95+ на их поверхности, снижение 1РМ-а, ШЫ-у, повышение маркеров апоптоза лимфоцитов АппехтУ+Р1+, количества Т-регуляторных клеток, повышение уровня 1Ь-4,1Ь-6, 1Ь-8, МСР-1, а при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой - снижение уровня ШИ-а, повышение маркеров ранней активации СБ25+ на поверхности СО 16+, повышение уровня уровня 1Ь-б и 1§М.

3. Врожденная генерализованная ВПГИ формируется у детей на фоне нарушения ранних этапов врожденного иммунного ответа (снижение экспрессии ТЬЯ-2 на моноцитах, наличие полиморфизма Аг§753С1п гена ТЬЯ-2), снижения продукции 1Р1М-а, 1Р1Ч-у и 1Ь-12, дисбаланса в клеточном и гуморальном звене иммунной системы (снижение относительного количества СЭЗ+ и активационных маркеров СЭ25+ на поверхности Ж -клеток, в сочетании с повышением маркеров апоптоза лимфоцитов АппехтУ+Р1+, количества Т-регуляторных клеток, уровня 1Ь -4,1Ь-б, МСР- 1).

Апробация работы. Основные положения работы представлены на V Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины, Москва, 2010; IX Российском Конгрессе "Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии", Москва, 2010; XV Международном Конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, ОАЭ, 2010; Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, 2010; I

Международном Конгрессе по перинатальной медицине, посвященном 85-летию академика РАМН В.А.Таболина и VI Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины, Москва, 2011; IV Всероссийском образовательном Конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва,2011; Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология практическому здравоохранению», Москва, 2012; VII научно-практической конференции Юга России «Актуальные проблемы клинической иммунологии и аллергологии», Пятигорск, 2012; XII Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии», Москва, 2013; Региональной научно-практической конференции «Приоритетные задачи охраны репродуктивного здоровья и пути их решения», г.Ростов-на-Дону, 2013; V Конгрессе Федерации педиатров стран СНГ и VI Конгрессе педиатров и неонатологов Республики Молдова, Кишинев,2013; XI Всемирном Конгрессе по перинатальной медицине, Москва, 2013.

Внедрение результатов. Результаты работы внедрены в учебный процесс педиатрического отдела, а также в практику отделения патологии новорожденных и недоношенных детей ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе 7 -в журналах из перечня ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах компьютерного текста (Time New Roman 14), содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы с результатами собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список цитируемой литературы, включающей 198 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 42 таблицами, 15 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследования. Исследование проведено на базе ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России. Исследования выполнялись в течение 2010-2012г.г. Под наблюдением находилось 95 новорожденных (рис.1).

Рис. 1. Дизайн исследования

Наблюдаемые дети были распределены на две группы: I группа - дети с врожденной генерализованной ЦМВИ, которые согласно классификации К.В.Орехова (2002) были разделены на две подгруппы (подгруппу 1.1 - с типичной генерализованной формой с полной клинической симптоматикой и подгруппу 1.2 - с типичной генерализованной формой с неполной клинической симптоматикой), II группа - дети с врожденной генерализованной ВПГИ. Контрольную группу составили здоровые новорожденные, родившиеся у женщин с физиологическим течением беременности и родов.

Диагноз ЦМВИ и ВПГИ ставился при выявлении ДНК вирусов в крови и в моче методом ПЦР в режиме реального времени с использованием программируемого амплификатора с флуоресцентной системой детекции «Rotor-Gene» 6000 («Corbet Researc», Австралия) и наборов «АмплиСенс» для флуоресцентной детекции, а также при выявлении специфических антител

класса IgM в сыворотке крови у ребенка к ЦМВ и ВПГ 1,2 типа и при нарастании титров IgG в динамике, определяемых методом ИФА с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, уровень экспрессии маркеров активации, Толл-рецепторов (TLR), Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+high) проводили методом одно- и двухпараметрического фенотипирования с использованием реагентов фирмы Immunotex (Франция), Caltag (США), HyCultbiotechnology (Нидерланды): FITC (изотиоцианат флуоресцеина) - меченые CD3+ ,CD4+, CD8+, CD 16+, СД19+, CD282+, CD284+, CD286+ и РЕ (фикоэритрин ) -меченые CD95+, CD25+, CD69+, HLA-DR+, CD 14+; количество лимфоцитов, вступивших в апоптоз - с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V, меченый FITC и пропидий йодид (PI), (Caltag, США) по прилагаемому протоколу. Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре Beckman Coulter Epics XL-II. Концентрацию IL- 4, IL-6, IFN-y, IFN-a в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью набора реагентов «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург), IL-8 - с использованием тест-систем «Bender Medsistems» (Австрия), IL-12 - с помощью тест-систем «Biosource» (США). Определение содержания МСР-1 - с использованием тест-систем «Bender Medsistems» (Австрия).

Определение аллельных вариантов генов TLR проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом тест-системами ГосНИИгенетика (Москва) по программе, рекомендованной производителем набора.

Для формирования базы данных и при проведении статистического исследования эмпирических данных использовались возможности табличного процессора Excel 2003 и пакетов прикладных программ («Мегастат» и Statistica 6.0). При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп. Показатели описательной статистики

и

представлены в виде выборочной средней и стандартного отклонения. Для анализа различия частот в двух независимых группах применялся точный критерий Фишера-Ирвина. Для оценки тесноты связи отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену (Реброва О.Ю., 2002). Для выявления значимых признаков соответствующих клиническим группам был применен метод «деревьев решений», позволяющий выявить следственную связь между признаками и получить точки раздела клинических групп (СЩС^.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ клинических данных выявил, что большинство детей родились доношенными, недоношенными при сроке гестации 35-37 недель родились 37% новорожденных в I группе и 13,6% - во II группе. У всех матерей наблюдаемых детей с врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ отмечался отягощенный акушерско-гинекологический анамнез с одинаковой частотой во всех группах: у 78,3% матерей выявлялись гинекологические заболевания (преимущественно эндоцервицит, аднексит), у 71% неблагоприятные исходы предыдущих беременностей (преждевременные роды, самопроизвольные выкидыши, неразвивающаяся беременность), у 94,2% -отягощенное течение беременности (угроза прерывания беременности, внутриутробная гипоксия плода).

Оценка клинических данных в раннем неонатальном периоде показала, что у новорожденных детей с ЦМВИ, протекающей с полной клинической симптоматикой достоверно чаще по сравнению с детьми с неполной клинической симптоматикой выявлялся гепатит (37,9% и 5,6% соответственно), пневмония (51,7% и 11,1% соответственно), геморрагический синдром (44,8% и 11,1% соответственно); менингоэнцефалит и миокардит диагностировались только у новорожденных с полной клинической симптоматикой (6,9% и 10,3% соответственно). При ВПГИ выявлялись пневмония (31,8%), миокардит (18,2%), гепатит (13,6%), менингоэнцефалит (4,6%), геморрагический синдром (9,1%). У всех новорожденных отмечались

перинатальные поражения ЦНС.

Наблюдение в динамике позволило установить, что к концу острого периода заболевания (к трём месяцам жизни) клиническая симптоматика сохранялась у 23,4% детей с ЦМВИ, преимущественно у больных с полной клинической симптоматикой и у 27,3% детей с ВПГИ.

При изучении механизмов врожденного иммунитета установлено, что в раннем неонатальном периоде у новорожденных с ЦМВИ только в подгруппе 1.1 имело место снижение экспрессии ТЬЯ — 2 (СЭ282+) на моноцитах периферической крови по сравнению с подгруппой 1.2 и контрольной группой (45,4±8,9%, 65,1±6,1% и 76,2±5,6% соответственно, р<0,05). Выявлена обратная корреляционная зависимость с уровнем вирусной нагрузки (г=0,81, р<0,05). Аналогичные изменения были характерны и для ТЬИ. - 6 (С014+С0286+) (44,6±5,9%, 57,8±2,2% и 61,1±1,4% соответственно), что объясняет высокую чувствительность ТЫ1 - 2 и ТЬЯ - 6 к цитомегаловирусу. Во II группе у новорожденных с ВПГИ выявлено снижение только экспрессии ТЬ11 - 2 (СБ282+) по сравнению с группой контроля (43,8±8,3% и 76,2±5,6% соответственно, р<0,05), что согласуется с данными Х.Э.Уао, К.Ь.КоБегЦНа! (2011) об ингибировании ВПГ 1,2 ТЬЯ-2 и снижении противовирусного иммунного ответа. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ТЬЯ-2 и продукцией 1Ь-12 (г=0,60, р<0,05) и обратная с СО 16+С095+(г=-0,71, р<0,05), а также с 1Нч[-у (г=-0,60, р<0,05).

Общее количество Т - лимфоцитов в раннем неонатальном периоде в подгруппе 1.1 было ниже показателей подгруппы 1.2 и контрольной группы (45,9±7,1%, 64,6±10,7 и 69,3±7,5% соответственно, р<0,05). Аналогичные сдвиги были выявлены и у новорожденных во II группе относительно контрольных данных (52,4±2,1% и 69,3±7,5% соответственно, р<0,05). Выявленное в подгруппе 1.1 по сравнению с подгруппой 1.2 и контрольной группой снижение количества С04+ сопровождалось редукцией иммунорегуляторного коэффициента (р <0,05).

Сравнение средних значений натуральных киллеров СО 16+ выявило

снижение их количества только у новорожденных с ЦМВИ в подгруппе 1.1 относительно подгруппы 1.2 и контрольной группы (1,9±0,3%, 4,4±0,3% и 3,4±0,8% соответственно, р <0,05). При этом установлена прямая корреляция между количеством CD16+ и экспрессией TLR-2 (г=0,88, р<0,05) и обратная корреляционная зависимость с уровнем вирусной нагрузки (г=-0,63, р<0,05), что связано со снижением синтеза IFN-a и прямым повреждающим действием вируса на клетки иммунной системы (T.I.Arnon, 2005).

При изучении функциональной активности лимфоцитов периферической крови у новорожденных с ЦМВИ установлено, что для детей подгруппы 1.2 характерно повышение CD25+ на поверхности CD 16+ не только относительно контроля, но и относительно подгруппы 1.1 (1,1+0,4%, 0,4+0,07% и 0,5+0,1% соответственно, р<0,05). Во II группе у новорожденных с ВПГИ отмечено достоверное снижение CD16+CD25+ по сравнению с контролем (0,1+0,06% и 0,4+0,07% соответственно, р<0,05). Полученные данные свидетельствуют, что активация цитотоксической активности натуральных киллеров более благоприятно отражается на течении заболевания.

Анализ количества Т-регуляторных клеток обнаружил их повышение у новорожденных детей с ЦМВИ в подгруппе 1.1 по сравнению с подгруппой 1.2 и контрольной группой (3,4+0,6%, 2,2+0,1% и 1,9+0,3% соответственно, р<0,05). У детей с ВПГИ также обнаружено их повышение по сравнению с группой контроля (3,3+0,4% и 1,9+0,3% соответственно, р<0,05). Выявлена обратная корреляционная зависимость содержания Т-регуляторных клеток и CD4+ лимфоцитов (г=-0,82, р<0,05). Эти данные согласуются с выводами S.Suvas (2004) о подавлении иммунного ответа на ВПГ 1,2 и ЦМВ у новорожденных Т-регуляторными клетками.

Изучение процессов поздней активации лимфоцитов в раннем неонатальном периоде выявило, что при ЦМВИ в подгруппе 1.1 имело место статистически значимое повышение экспрессии CD95+ на поверхности CD16+ по сравнению с подгруппой 1.2 и контрольной группой (4,8+0,4%, 3,2+0,3% и 3,0+0,4% соответственно, р<0,05). Кроме того, в подгруппе 1.1 по сравнению с

подгруппой 1.2 и контролем выявлено усиление ранних (9,5±1,4%, 5,2±0,6% и 5,8±0,9% соответственно, р<0,05) и поздних маркеров апоптоза (1,0±0,1%, 0,1±0,03% и 0,1±0,03% соответственно, р<0,05). У новорожденных при ВПГИ также отмечалось повышение относительно контроля экспрессии С095+ на поверхности С016+ (4,9±0,6% и 3,1±0,4% соответственно, р<0,05), ранних (8,4±1,3% и 5,8±0,9% соответственно, р<0,05) и поздних маркеров апоптоза (0,9±0,5% и 0,1±0,03% соответственно, р<0,05). Наши результаты подтверждают данные АЛаппеПо (2011) о стимулирующем влиянии герпесвирусов на процессы апоптоза иммунокомпетентных клеток.

Средние значения содержания про- и противовоспалительных цитокинов в раннем неонатальном периоде представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Средние значения содержания про- и противовоспалительных цитокинов в раннем неонатальном периоде у новорожденных с ЦМВИ и ВПГИ

пг/ мл I группа II группа Контрольная группа

подгруппа 1.1 подгруппа 1.2

ШЫ -а 8,3±0,9* 10,7±1,1* 9,1±6,2* 15,9±2,1

1Ы2 1,5±0,9 2,0±0,8 0,7±0,01* 1,1±0,3

МСР-1 1083,2±258,4* 783,5±223,1 1187,2±342,4* 600,5±53,9

1Ь -6 25,8±5,2* 18,3±4,2* 33,6±10,8* 9,0±1,6

11.-8 71,3±5,8* ▲ 40,7±11,3 30,1±8,2 26,3±7,7

ШЫ -у 42,1±9,7* А 86,5±21,9 44,9±9,5* 100,8±27,4

1Ь -4 264,9±24,2* А 138,9±41,1 298,4±51,8* 74,1±24,8

"■-достоверность различий по сравнению с контрольной группой (р<0,05)

Ж - достоверность различий между подгруппами 1.1 и 1.2 (р<0,05)

Установлено, что в раннем неонатальном периоде у всех наблюдаемых детей с ЦМВИ и ВПГИ отмечалось снижение содержания ШЫ - а по сравнению с контрольной группой (р<0,05), что может быть следствием значительно более низкого уровня экспрессии ТЬЯ-2 у этих детей.

Обращают на себя внимание низкие значения 1РМ-у у новорожденных с ЦМВИ в подгруппе 1.1 не только по сравнению с контролем, но и относительно подгруппы 1.2 (р<0,05). При этом установленная прямая корреляционная зависимость содержания 1РЫ-у и СЭ16+ (г=0,80, р<0,05) подтверждает

снижение функциональной активности натуральных киллеров. У детей II группы с ВПГИ уровень 1РЫ- у был достоверно ниже значений по сравнению с контрольной группой (р<0,01).

У всех наблюдаемых детей как при ЦМВИ в обеих подгруппах, так и при ВПГИ содержание 1Ь-6 достоверно превышало показатели контрольной группы (р<0,05). Данные изменения могут приводить к сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении ТИ2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа.

Следует отметить, что концентрация 1Ь-8 только у детей с ЦМВИ в подгруппе 1.1 превышала контрольные данные и значения этого показателя в подгруппе 1.2 (р <0,05). Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания 1Ь-8 и уровнем вирусной нагрузки (г=0,81, р<0,05), что согласуется с исследованиями М.8аес1егир (2002) об усилении синтеза 1Ь-8 под воздействием цитомегаловируса.

Содержание МСР-1 в сыворотке крови превышало контрольные значения у новорожденных подгруппы 1.1 и II группы (р<0,05). Этот факт согласуется с данными С.Рарас1орои1ои (2008) о том, что ЦМВ и ВПГ могут использовать хемокиновые рецепторы для контроля репликации вирусов.

Снижение уровня 1Ь-12 относительно контроля, приводящее к нарушению формирования связи между механизмами неспецифической защиты и специфического иммунитета, установлено только у новорожденных во II группе (р<0,05). Выявленное повышение уровня 1Ь-4 у детей в подгруппе 1.1 и II группы по сравнению с контролем (р<0,05) отражает доминирование противовоспалительных цитокинов и ведет к снижению противоинфекционной защиты.

В динамике заболевания по сравнению с ранним неонатапьным периодом у детей с ЦМВИ в подгруппе 1.1 к 1 месяцу жизни отмечалось повышение содержания Т - лимфоцитов и НЬА-ОЯ (р<0,05), снижение концентрации 1Ь-8 (р<0,05), к 3 месяцам - повышение уровня СБ4+, С016+, ТЬЯ-2, ШЫ- а (р<0,05) и снижение содержания 1Ь-4, 1Ь-6, Т-регуляторных клеток,

CD95+CD16+, AnnexinV+, AnnexinV+ PI+ (p<0,05). В подгруппе 1.2 к 1 месяцу жизни показатели IFN- а повышались относительно раннего неонатального периода (р<0,05), к 3 месяцам - отмечалось снижение продукции IL-8, IL-6 и увеличение концентрации IFN-y. У детей с ВПГИ к 1 месяцу по сравнению с ранним неонатальным периодом отмечено достоверное снижение CD16+CD95+, усиление экспрессии TLR-2 (р<0,05), к 3 месяцам - повышение уровня CD3, IFN - a, IL-12, (р<0,05), снижение Т-регуляторных клеток, AnnexinV+PI+, IL -6, 1L -4 (р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о более медленном восстановлении иммунного гомеостаза к 3 месяцам жизни у детей с ЦМВИ с полной клинической симптоматикой и с ВПГИ по сравнению с детьми с ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой.

При анализе частоты полиморфизма генов TLR у детей с генерализованной ЦМВИ установлено (рис.2), что в подгруппе 1.1 у детей с полной клинической симптоматикой ЦМВИ по сравнению с подгруппой 1.2 у детей с неполной клинической симптоматикой частота генотипа Ser/Pro гена TLR-6 встречалась достоверно чаще (68,4% и 12,5% соответственно, р <0,05), а генотипа Pro/Pro гена TLR-6 достоверно реже (26,3% и 81,3% соответственно, р<0,05). Таким образом, у носителей аллеля Ser гена TLR-6 риск развития более тяжелого течения ЦМВИ выше, а генотип Pro/Pro является

протективным, что способствует более благоприятному течению ЦМВИ.

%./------

81,3

100 80 60 40 20 О

□ Ser/ Ser у Ser I Pro ■ Pro / Pro

Подгруппа 1.1

Подгруппа 1.2

А - достоверность различий по сравнению с подгруппой 1.2 (р<0,05)

Рис. 2. Распределение частоты генотипов гена ТЬЯ-б среди новорожденных с генерализованной ЦМВИ с учетом выраженности симптомов заболевания.

80 f f Щ 1 §

60 1 +................... 26.3 1 1 ........ж

40 1

20 - В п..................

0 ; . 1 1 1_J_1

В группе детей с ВПГИ (II группа) выявлено достоверное различие в распределении генотипа Arg753Gln гена TLR-2 по с равнению с контрольной группой (26,3% и 3,8% соответственно, р <0,05) (рис.3). Следовательно, аллельные варианты гена TLR-2 в точках полиморфизма Arg753Gln могут являться генетическими маркерами риска развития врожденной

генерализованной формы ВПГИ у новорожденных детей.

-------------

100 7?

к™:

I__ ■ Arg/Arg

| □ Arg/Gin

■3.8 |=|Г7

Группа 2 Контроль

"-достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,05) Рис. 3. Распределение частот генотипов гена TLR-2 у пациентов 2 группы.

На основании выявленных патогенетических механизмов развития врожденной генерализованной цитомегаловирусной и врожденной генерализованной герпетической инфекции разработаны объективные диагностические иммунологические критерии формирования генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой (повышение уровней CD16+CD95+, AnnexinV+PI+, Т-регуляторных клеток, IL-8) и развития генерализованной ВПГИ (снижение экспрессии TLR-2, снижение CD16+CD25+, повышение уровня IL-6) (рис.4,5).

Разработаны также прогностические маркеры стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода заболевания: при врожденной генерализованной ЦМВИ - снижение уровня IFN-y, при врожденной генерализованной ВПГИ - повышение содержания Т-регуляторных клеток (рис.6,7).

1 ' ШИН КнЕл: иУЙЗ 1Ыв1|' Периферическая кровь

«ЛОТ 5е Зр

С019+ 0095+ 3,7% 98,4% 98,3%

АЬПбХ^ Р1 + 2,7% 06,2* 80,1%

Т-рег. клеш* 2,5% 99% 88,8%

И-8 51,2пг/мл 91% ..............81%................|

Рис.4. Иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной цитомегаловирусной инфекции с полной клинической симптоматикой.

щ И щ ш ■ЯВвяВ

Периферическая кровь

' сиЮН .............§5.......... ................8р „ !

Т1Л-2 <С014+С0282+) 64,3% 06,7% 85,3% |

3,5% ЭС 9% 82,3°«1 1

11.-6 32,8 пг/мл 59.1 % 92,4 % '

Рис.5. Иммунологические критерии формирования врожденной генерализованной герпетической инфекции.

Рис.6. Иммунологические критерии прогноза течения врожденной генерализованной цитомегаловирусной инфекции.

Рис.7. Иммунологические критерии прогноза течения врожденной генерализованной герпетической инфекции.

Итогом проведенной работы явились новые данные о роли То11-подобных рецепторов и полиморфизма их генов, клеточных и цитокин-опосредованных механизмов в формировании врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ у новорожденных детей. Разработанные дополнительные объективные иммунологические критерии развития и прогноза течения заболевания открывают перспективу оптимизации не только диагностики, но и лечения детей с врожденной генерализованной ЦМВИ и ВПГИ.

ВЫВОДЫ

1. Врожденная генерализованная цитомегаловирусная и герпетическая инфекция характеризуется неспецифичностью клинической картины заболевания и полиморфностью поражения органов и систем. У новорожденных детей с генерализованной ЦМВИ, протекающей с полной клинической симптоматикой достоверно чаще по сравнению с детьми с неполной клинической симптоматикой выявляется гепатит (37,9% и 5,6% соответственно), пневмония (51,7% и 13,8% соответственно), геморрагический синдром (44,8% и 11,1% соответственно); менингоэнцефалит и миокардит диагностируется только у новорожденных с полной клинической симптоматикой (6,9% и 10,3% соответственно). При ВПГИ ведущими в клинике заболевания являются пневмония (31,8%), миокардит (18,2%), гепатит (13,6%), менингоэнцефалит (4,6%), геморрагический синдром (9,1%). У всех

новорожденных с ЦМВИ и ВПГИ отмечается перинатальное, преимущественно гипоксически-ишемическое поражение ЦНС.

2. К концу острого периода заболевания (к трём месяцам жизни) клиническая симптоматика сохраняется у 23,4% детей с ЦМВИ, преимущественно у больных с полной клинической симптоматикой, и у 27,3% детей с ВПГИ.

3. Снижение экспрессии ТЫ1-2 и ТЬЛ-б на моноцитах, приводящее к редукции синтеза №N-0 и нарушению противовирусного иммунного ответа, имеет место при генерализованной ЦМВИ только у детей с полной клинической симптоматикой. У новорожденных с генерализованной ВПГИ отмечается снижение экспрессии ТЬЯ-2, что ассоциируется с уменьшением уровня 1Ь-12, нарушением формирования связи между механизмами врожденного и адаптивного иммунитета.

4. Дефекты в генах ТЬЯ выявляются у 68,4 % детей при врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой в виде полиморфизма 5ег249Рго гена ТЬЯ-б и у 26,3% детей с врожденной генерализованной ВПГИ в виде полиморфизма Л^753С1п гена ТЫ1-2.

5. Врожденная генерализованная цитомегаловирусная и герпетическая инфекция характеризуется разнонаправленными изменениями в иммунном статусе: при ЦМВИ с полной клинической симптоматикой имеются выраженные нарушения этапов активации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, что верифицируется снижением СОЗ+, СЭ4+, СО 16+ и повышением числа Т-регуляторных клеток, тогда как при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой отмечается лишь повышение маркеров ранней активации СЭ25+ на поверхности СО 16+; при ВПГИ имеет место снижение количества С03+ и маркеров ранней активации СЭ25+ на поверхности СЭ16+, а также повышение числа Т-регуляторных клеток. Нарушение процессов апоптоза у пациентов с генерализованной ЦМВИ и ВПГИ характеризуются повышением уровня маркеров раннего и позднего апоптоза АппехтУ+, АппехшУ+Р1+, С095+ на поверхности СО 16+.

6. У детей при генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой

и генерализованной ВПГИ отмечается снижение содержания №N-0 и повышение уровня МСР-1, 1Ь-6 и смещение цитокинового баланса в сторону продукции противовоспалительного цитокина !Ь-4, при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой имеет место только снижение концентрации ШЫ-а и повышение 1Ь-6. Характерной особенностью цитокинового статуса у пациентов с полной клинической симптоматикой генерализованной ЦМВИ является повышение уровня 1Ь-8, а для пациентов с ВПГИ - снижение 1Ь-12, приводящее к редукции ТЬ-1 типа иммунного ответа.

7. Выявленные корреляционные зависимости между показателями врожденного и адаптивного иммунитета отражают угнетение ранних этапов иммунного ответа и нарушение иммунной регуляции у детей при генерализованной ЦМВИ и ВПГИ.

8. Иммунологическими критериями формирования врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой являются: снижение экспрессии ТЬЯ-2, ТЬЯ-б, полиморфизм гена ТЬЯ-б, повышение уровней С016+С095+, АппехтУ+Р1+, Т-регуляторных клеток, 1Ь-8; при генерализованной ВПГИ - снижение экспрессии ТЬЯ-2, полиморфизм гена

снижение С016+С025+, повышение уровня 1Ь-6.

9. Маркерами стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода заболевания (к 3 месяцам жизни) являются: при генерализованной ЦМВИ - снижение уровня ШЫ-у; при генерализованной ВПГИ - повышение содержания Т-регуляторных клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Детям с врожденной генерализованной цитомегаловирусной и герпетической инфекцией необходимо оценивать экспрессию ТЫ1-2, ТЬЯ-6, полиморфизм их генов, определять иммунный и цитокиновый статус.

2. Полиморфизм 8ег249Рго гена ТЬЯ-6, показатели СБ16+С095+ >3,7%, АппехтУ+Р1+>2,7%, Т-регуляторные клетки >2,5%, 1Ь-8 >51,2пг/мл являются

объективными иммунологическими критериями формирования врожденной генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой.

3. Уровень IFN-y <77,4 является ранним маркером стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода генерализованной ЦМВИ.

4. Наличие полиморфизма Arg753Gln гена TLR-2, показатели экспрессии TLR-2<64,3%, CD16+CD25+<3,5%, IL-6>32,6 пг/мл являются объективными иммунологическими критериями формирования генерализованной герпетической инфекции.

5. Уровень Т-регуляторных клеток >2,54% является ранним маркером стойкого сохранения клинической симптоматики к концу острого периода генерализованной ВПГИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Левкович АЛО., Афонин A.A., Кравченко Л.В., Левкович М.А. Показатели врожденного иммунитета при герпесвирусной инфекции новорожденных детей // Международный журнал по иммунореабилитации. - 2010. - Том 12, № 2 .-С.201.

2. Левкович А.Ю., Афонин A.A. Показатели иммунного статуса у детей раннего возраста из группы высокого инфекционного риска// Современная перинатология: организация, технология качество:Материапы V Ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины. - М.,2010. - С.41.

3. Левкович А.Ю., Афонин A.A. Клинико-иммунологические варианты внутриутробной инфекции у новорожденных//Цитокины и воспаление. -2010.-Том 9, N3. - С.67-68.

4. Левкович А.Ю., Афонин A.A., Шокарев A.B., Кравченко Л.В., Левкович М.А.Диагностика реализации внутриутробного инфицирования у детей от матерей сурогенитальной инфекцией// Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии: Материалы IX Российского конгресса. -М.,2010.-С.196-197.

5. Левкович АЛО., Афонин A.A., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова

M.B. Клинико-иммунологический статус новорожденных с цнтомегаловирусной инфекцией// Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине, посвященного 85-летию академика РАМН

B.А.Таболина и VI Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины. -М.,2011,- С. 102-103.

6. Кравченко Л.В.,Левкович М.А.,Левковнч А.Ю.,Демидова М.В.Уровень интеферонов в сыворотке крови у новорожденных с цнтомегаловирусной инфекцией//Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине, посвященного 85-летию академика РАМН В.А.Таболина и VI Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины. - М.,2011. -

C.98.

7. Левкович А.Ю., Афонин A.A., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В., Павленко Г.В. Показатели врожденного иммунитета у детей с внутриутробной герпесвирусной инфекцией// Аллергология и иммунология. - 2011.-Том 12, N2-3. - С.311.

8. Афонин А.А, Левкович А.Ю., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В, Механизмы риска манифестации цитомегаловирусной инфекции// Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии: Сборник материалов IV Всероссийского образовательного конгресса. - М., 2011. - С.128-129.

9. Афонин A.A., Линде В.А., Левкович А.Ю., Левкович М.А. Современное состояние проблемы внутриутробных герпесвирусных инфекций у новорожденных детей// Журнал Фундаментальной медицины и биологии. -Ростов-на-Дону,2012. - №3. - С.19-22.

10. Левкович А.Ю., Афонин A.A., Левкович М.А., Андреева В,О., Кравченко Л.В., Демидова М.В., Плахотя Т.Г. Дисфункция показателей врожденного и адаптивного иммунитета при манифестации герпесвирусной инфекции у новорожденных детей//Росс1шскиГ| аллергологический журнал. -2012. -N.1, Вып. 1. - С.186-187.

11. Левкович А.Ю., Афонин A.A., Сизякина Л.П., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Андреева В.О., Плахотя Т.Г., Демидова М.В. Особенности иммунного

реагирования новорожденных при внутриутробной герпесвирусной инфекции// Цитокины и воспаление. - 2012. - Т.11, № 3.-3,- С. 111-112.

12. Левкович М.А., Афонин А.А., Кравченко JI.B., Левкович А.Ю., Демидова М.В., Заурова Л.М. Показатели иммунного статуса и функциональной активности лимфоцитов у новорожденных детей с герпесвирусной инфекцией// Российский аллергологический журнал. - 2013. - N2. - С. 174-176.

13. Левкович А.Ю., Афонин А.А., Кравченко Л.В., Левкович М.А., Демидова М.В. Особенности иммунного ответа новорожденных с инфекцией, вызванной вирусами герпеса 1,2 типа, в раннем неонатальном периоде//Приоритетные задачи охраны репродуктивного здоровья и пути их решения: Материалы региональной научно-практической конференции г.Ростов-на-Дону ,2013 .-С.7-8.

14. Афонин А.А., Левкович А.Ю., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Демидова М.В., Заурова Л.М. Особенности иммунного реагирования новорожденных с герпесвирусной инфекцией// Материалы V Конгресса Федерации педиатров стран СНГ и VI Конгресса педиатров и неонатологов Республики Молдова. -Кишинев, 23-24 мая 2013. - С.231.

15. Афонин А.А., Левкович А.Ю., Левкович М.А., Кравченко Л.В., Андреева В.О. Нарушение иммунного гомеостаза при герпесвирусной инфекции у новорожденных детей//Журнал Фундаментальной медицины и биологии. -Ростов-на-Дону,2013. - №1. - С.33-35.

16. Левкович АЛО., Афонин А.А. Особенности врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с генерализованной цитомегаловирусной инфекцией// Современные проблемы науки и образования.-2013.-№3. URL: www.science-education.ru/109-9217.

17. Levkovich A., Afonin A., Levkovich M., Kravchenko L. Condition of system of innate immunity in infants with cytomegalovirus infection // J. Perinat. Med. 2013. Vol.41.P.316.

Список сокращении

АппехтУ+ маркер раннего апоптоза

АппехтУ+Р1+ маркер позднего апоптоза

СЭ кластер дифференцировки

СЭЗ+ Т-лимфоциты

С04+ хелперно-индукторная субпопуляция Т-лимфоцитов

С08+ супрессорно-цитотоксическая субпопуляция Т-лимфоцитов

С016+ натуральные киллеры

СЭ19+ В -лимфоциты

СЭ25+ маркер ранней активации клеток

СЭ69+ маркер ранней активации клеток

С095+ маркер поздней активации клеток

СБ 14+ рецептор моноцитов

НЬА-ОЯ+ маркер поздней активации клеток

интерферон

¡8, иммуноглобулины

1Ь интерлейкин

ык натуральные киллеры

ТИ Т-хелперы

тья То11-подобные рецепторы

Т-рег. Т-регуляторные клетки

ВПГИ инфекция, вызванная вирусом простого герпеса

ВПГ 1,2 типа Вирус простого герпеса 1,2 типа

ИФА иммуноферментный анализ

МСР-1 моноцитарный хемотаксический протеин-1

ПЦР полимеразная цепная реакция

ЦМВ цитомегаловирус

ЦМВИ цитомегаловирусная инфекция

ЦНС центральная нервная система

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 3188. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88