Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Молекулярно-клеточные механизмы активации врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей



МАКАРЕНКОВЛ ИЛОНА ДАМИРОВНЛ

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА СУЛЬФАТИРОВАННЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

2 «НОЯ 2013

00554ио«'

Москва - 2013

005540307

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук Семенова Ирина Борисовна

Доктор медицинских наук, профессор Леонова Галина Николаевна

Официальные оппоненты:

Киселевский Михаил Валентинович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточного иммунитета ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина" Российской академии медицинских наук

Калюжин Олег Витальевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Прокопенко Владимир Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, г. Москва

Защита диссертации состоится «2013 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» Российской академии медицинских наук, по адресу г. Москва, Малый Казённый переулок, д. 5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» РАМН

Автореферат разослан « 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета ^гч

кандидат биологических наук И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Согласно современным представлениям, иммунная система человека, представлена двумя интегрированными между собой компонентами - врожденным и адаптивным иммунитетом, в основе функционирования которых лежат разные механизмы действия, в целом обеспечивающие защиту организма. Активация врожденного иммунитета является обязательным условием для формирования неспецифической резистентности к инфекции и развития адаптивного иммунного ответа [Р. Меджитов, Ч. Джаневей, 2004; F. Blasi, 2005; Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, 2007]

Эффекторные механизмы врожденного иммунитета многофакторны, однако универсальная система их действия была сформулирована лишь в последние десятилетия. Это касается ключевой роли рецепторного аппарата, и прежде всего Tolllike рецепторов (TLRs), которые являются первым звеном взаимодействия с лигандами патогенных микроорганизмов и определяют дальнейшие пути развития иммунного ответа [В. Beutler, 2009; Т. Kawai, S. Akira, 2010; Л.В. Ковальчук и соавт., 2005 и 2011; Н. Kumar et al., 2011]. Установлена центральная роль дендритных клеток (ДК), обеспечивающих распознавание, процессинг и презентацию антигенов наивным Т-лимфоцитам. Направленность пути активации ДК является важным элементом, программирующим взаимодействие клеток и развитие иммунного ответа по Th-1 или Th-2 типу [Р. Меджитов, Ч. Джаневей, 2004; М.В. Пащенков, Б.В. Пинегип, 2006]. Важным компонентом врожденного иммунитета являются и NK-клетки (natural killer), основной ключевой функцией которых является киллинг инфицированных, трансформированных и опухолевых клеток организма [K.Takeda, 2004; L.L. Lanier, 2008; М.С. Друцкая и соавт., 2011].

Одним из перспективных направлений активации системы врожденного иммунитета является использование иммуномодулирующих препаратов -модификаторов эффекторных функций, изучение механизма действия которых на молекулярном и клеточном уровнях позволит определить рациональный спектр их дальнейшего использования при различных заболеваниях, связанных с развитием иммунопатологических состояний [Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, 2007; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008].

Приоритетным направлением в изучении механизма действия иммунобиологически активных веществ, является исследование их специфических лиганд-рецепторных взаимодействий с TLRs, инициирующих развитие сигнального каскада, активацию ядерных факторов и экспрессию генов иммунного ответа, что позволит использовать их в качестве молекулярных адъювантов для создания противоинфекционной защиты организма [И.О. Чикелева и соавт., 2010; S.K. Drexler, В.М. Foxwell, 2010; G.C. Xie, Z.J Duan, 2012; V.D. Pradhan, 2012].

Среди большого числа природных и синтетических иммуномодуляторов, особый интерес для изучения представляют сульфатированные полисахариды - фукоиданы бурых водорослей. Биологическое разнообразие водорослей в Мировом океане создает неограниченный ресурс для создания новых активных соединений за счет уникальной химической структуры, низкой токсичности и широкого полифункционального спектра действия [T.N. Zvyagintseva et al., 2003; А.И. Усов, М.И. Билан, 2009; M.I. Bilan, 2010].

Установлено, что сульфатированные полисахариды за счет универсальных углеводспецифических взаимодействий с мембранными рецепторами иммунокомпетентных клеток инициируют развитие различных внутриклеточных биохимических процессов, что приводит к активации, морфологическим, метаболическим и функциональным изменениям нейтрофилов и макрофагов [Т.С. Запорожец 2006; Т.А. Кузнецова, 2009; T. Teruya et al., 2010; S.B. Park et al., 2010; H.H. Беседнова, Т.С. Запорожец, 2011].

Несмотря на многочисленное количество исследований, имеющих фрагментарный характер, механизм активации системы врожденного иммунитета под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей остается малоизученным. Отсутствуют данные о влиянии фукоиданов на функциональную активность ключевых эффекторов врожденного иммунитета, обеспечивающих неспецифическую резистентность и развитие адаптивного иммунного ответа, активацию транскрипционных ядерных факторов при взаимодействии с TLRs, практически отсутствуют исследования, показывающие связь химической структуры с противовирусным действием фукоиданов.

Настоящая работа раскрывает механизмы активации системы врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей и является

экспериментальным обоснованием возможности конструирования на их основе фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов.

Цель исследования

Исследование молекулярных и клеточных механизмов активации врожденного иммунитета различными по химической структуре фукоиданами из бурых водорослей Fucus evanescens, Laminaría cichorioides и Laminaria japónica и оценка их влияния на формирование противовирусной защиты.

Задачи исследования

1. Установить влияние фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica на экспрессию TLRs на иммунокомпетентных клетках (ДК и MJI) и их взаимодействие с TLRs на эукариотических линиях клеток эмбрионального почечного эпителия человека.

2. Определить влияние фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica на созревание (экспрессия маркеров активации и терминальной дифференцировки, адгезивных, костимулирующих и антигенпредставляющих молекул) морфологию и продукцию цитокинов дендритными клетками.

3. Провести сравнительное изучение влияния фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica на субпопуляционный состав MJI, продукцию цитокинов, пролиферативную и цитотоксическую активности спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo.

4. Исследовать действие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на морфологическую структуру первичных и вторичных органов иммуногенеза.

5. На экспериментальных вирусных моделях в системах in vitro и in vivo изучить антиадсорбционное, вирусингибирующее и протективное действие различных по химической структуре сульфатированных полисахаридов бурых водорослей в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1, хантавируса и вируса клещевого энцефалита.

Научная новизна работы

Впервые установлено увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на поверхности дендритных клеток и MJI селезенки мышей, что определяет дальнейшие пути активации проводящих путей для передачи сигналов, индуцирующих экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферониндуцибельных генов.

Впервые доказано, что различные по химической структуре сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica при взаимодействии с TLR-2, TLR-2/6 и TLR-4 на клеточных линиях эмбрионального почечного эпителия человека НЕК-293 активируют транскрипционный ядерный фактор NF-kB через MyD88 сигнальный путь, а при взаимодействии с TLR-4 дополнительно через адаптерную пару TRIF/TRAM. Наибольшим действием обладает частично ацетилированный фукоидан из F. evanescens. Отсутствие токсического действия и содержания ЛПС грамотрицательных бактерий в их структуре исключает возможность неспецифической активации NF-kB, и доказывает, что сульфатированные полисахариды являются лигандами для TLR-2, TLR-4 и TL-R2/6.

Показано, что различные по химической структуре сульфатированные полисахариды бурых водорослей обладают универсальным индуцирующим действием на созревание ДК, о чем свидетельствуют характерные морфологические изменения (клетки округлой неправильной формы с эксцентрично расположенным ядром, вакуолизированной цитоплазмой и многочисленными цитоплазматическими псевдоподиями разнообразной формы) и увеличение экспрессии маркеров связанных с созреванием ДК (CD83, CD38, CDllc, CD40, CD86, МНС II класса). Различие в действии фукоиданов установлено только при исследовании экспрессии молекулы адгезии CDllc, наибольшей активностью по этому показателю обладал полностью сульфатированный фукоидан из L. cichorioides.

Выявлено, что под действием сульфатированных полисахаридов увеличивается продукция иммунорегуляторного (IL-12) и провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-6, IL-ip) созревшими ДК. Установлено, что в системе ex vivo фукоиданы увеличивают продукцию как Thl -цитокинов (IL-2, IL-12, IFNy, TNFa,), так и ТМ-цитокииов (IL-6), что способствует дифференцировке активированных Т-клеток в эффекторные Т-клетки адаптивного иммунитета и поляризации развития иммунного ответа по Th-1 типу. Наибольшим цитокининдуцирующим действием на продукцию IFNy обладал фукоидан из F. evanescens, а на продукцию IL-12 - фукоидан из L. japónica, которые являются частично ацетилированными сульфатированными полисахаридами, но различаются по типу связи, соотношению моносахаридного состава и молекулярной массе. Впервые установлено, что под действием фукоиданов происходит изменение морфологической

структуры первичных и вторичных органов иммуногенеза (активация гемопоэза, выраженная макрофагальная реакция и пролиферация лимфоидных клеток).

В системах in vitro и ex vivo установлено, что фукоиданы оказывают стимулирующее влияние на иммунофенотип MJI селезенки (увеличение экспрессии CD 19, NK, NKT, CD25, МНС II, TCR, TLR-2 и TLR-4), пролиферативный потенциал и цитотоксическую активность спленоцитов мышей по отношению к NK-чувствительной линии клеток эритробластного лейкоза человека К562. Данные цитологического исследования подтверждают, что активированные фукоиданами спленоциты вызывают лизис и деструкцию опухолевых клеток линии К562.

Впервые на моделях трех экспериментальных вирусных инфекциях установлена противовирусная активность фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica, которая связана с их химической структурой, схемой и дозой введения фукоиданов.

Установлено вирусингибирующее и протективное действие частично ацетилированного сульфатированного полисахарида из L. japónica в отношении высокопатогенного варианта вируса гриппа A/H5N1. Присутствие в структуре фукоидана высокого содержания галактозы обеспечивает конкурентное углеводспецифическое взаимодействие с гликопротеином вируса гриппа птиц, распознающим специфические рецепторы галактозы и сульфатированные рецепторы.

При экспериментальной хантавирусной инфекции на моделях культуры клеток Vero Е6 и перитонеальных макрофагов мышей показано, что наибольшим антиадсорбционным и ингибирующим действием на развитие инфекционного процесса обладают сульфатированные полисахариды из L. japónica и L. cichorioides, которые являются 1—»З-а-Ь-фуканами, но различаются по молекулярной массе, степени сульфатирования и моносахаридному составу.

В системах in vitro и in vivo при экспериментальном клещевом энцефалите установлено, что наибольшей ингибирующей активностью на адсорбцию вируса, и протективным действием обладают частично ацетилированные фукоиданы из F. evanescens и L. japónica.

Практическая значимость работы

Активация клеточных и молекулярных механизмов системы врожденного иммунитета под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей, с учетом их химической структуры и механизмов действия, является экспериментальным

обоснованием целесообразности конструирования на их основе новых фармакологических субстанций и лекарственных препаратов для коррекции различных иммунопатологических процессов, в том числе при вирусных инфекциях.

Алгоритм активации ключевых эффекторов врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей может быть применен для скрининга новых иммунобиологически активных препаратов, предназначенных для коррекции нарушений иммунной системы и активации неспецифической резистентности к инфекции.

По материалам диссертации получен патент РФ № 2304443 от 20.08.2007 «Средство, обладающее противовирусной активностью». 0публ.20.08.2007. Бюлл. № 23.

Материалы диссертации автора включены в научно-экспериментальную работу лаборатории иммунологии ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова» СО РАМН и лаборатории химии ферментов ФГБУН «ТИБОХ им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, в отчеты по грантам РФФИ 09-04-00761 а и программам фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки медицины».

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке научно-технической документации (ТИ и ТУ 9284-065-02698170-2005) на БАД "Фуколам" на основе фукоидана из бурой водоросли F.evanescens Охотского моря (свидетельство Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.739.1.06 от 30.01.06.). Материалы диссертации использованы для подготовки научно-технической документации к проекту МНТЦ №4000 от 01.05.2010 г. «Клинико-иммунологическая эффективность нового синбиотического продукта категории функционального питания (кисломолочный напиток с В. bifîdum, обогащенный полисахаридами из бурой водоросли Fucus evanescens)».

Основные положения, выносимые на защиту 1. Увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на поверхности дендритных клеток и активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L japónica с TLR-2, гетеродимером TLR-2/6 и TLR-4 на клеточных линиях эмбрионального почечного эпителия человека НЕК-293 свидетельствуют о том, что фукоиданы являются лигандами и способствуют активации

сигнальной передачи для последующей индукции и экспрессии генов иммунного ответа.

2. Фукоиданы из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica являются индукторами созревания ДК, о чем свидетельствуют их иммунофенотипические, морфологические и функциональные (увеличение продукции иммунорегуляторного IL-12 и провоспалительных цитокинов - IL-ip, IL-6, TNF-a) характеристики, что определяет направленность дифференцировки и активации Т-лимфоцитов и поляризации развития иммунного ответа по Thl типу.

3. Влияние фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica на субпопуляционный состав МЛ селезенки мышей (экспрессия CD 19, NK, NKT, CD25, МНС II, TCR, TLR-2 и TLR-4), динамику продукции провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов (увеличение уровня IFNy, IL-2, IL-12, TNF-a, IL-6), пролиферативную и цитотоксическую активности спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo свидетельствует об активации механизмов системы врожденного иммунитета и реализации пути развития адаптивного иммунного ответа по Thl типу.

4. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют активации гемопоэза, выраженной макрофагальной реакции и пролиферации лимфоидных клеток в первичных и вторичных органах иммуногенеза.

5. Сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica при экспериментальных вирусных инфекциях обладают антиадсорбционным, вирусингибирующим и протективным действием, в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1, хантавируса и вируса клещевого энцефалита в системах in vitro и in vivo. Установлено, что противовирусная активность фукоиданов при различных вирусных инфекциях связана с особенностями их химического строения.

Личный вклад автора

Автором лично выполнен анализ литературных данных по теме диссертации, проведено исследование влияния сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на экспрессию TLR на ДК, активацию ядерного фактора NF-kB при взаимодействии с TLRs человека, на созревание и функциональные характеристики ДК, субпопуляционный состав МЛ селезенки, морфологические изменения первичных и вторичных органов иммуногенеза, пролиферативную и цитотоксическую активность

спленоцитов мышей, продукцию цитокинов и противовирусную активность, выполнена статистическая обработка и анализ результатов диссертационной работы.

Апробация материалов диссертации Результаты диссертационной работы были представлены на научно-практических конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровня: International Symposium on Marine Drugs (Qingdao, China, 2004), IV Научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), 6й International Conference on Hantaviruses (Seoul, Korea, 2004), IV научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), II Объединенном иммунологическом форуме (IV Съезд иммунологов России, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2008), Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск 2009), XV International Scientific Conference «FAMILY HEALTH IN THE XXI CENTURE» (Torremolinos, Spain, 2011), VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине» (Владивосток, 2011), X Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2012), XIII Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2012), VII Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения» (Челябинск, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 19 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных положений диссертации, получен 1 патент.

Апробация диссертации состоялась 29 мая 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 18 июня 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Объём и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения в медицинскую науку и практику, списка литературы и приложений. Диссертация изложена на 278 страницах машинописного текста,

иллюстрирована 29 таблицами и 46 рисунками. Список литературы включает 482 источника, из них 107 отечественных и 375 - иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Экспериментальные исследования проведены в ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. П. Сомова» СО РАМН, ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава РФ, ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. Е.А. Вагнера» Росздрава РФ, ФГБУН «ТИБОХ им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН с использованием современных методов исследования (табл.1). Автор выражает огромную благодарность коллегам за помощь в процессе выполнения работы.

Таблица 1. Материалы и методы исследований

№ Материалы и направление исследования Методы исследования

1 Фукоиданы 1. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens - частично ацетилированый 1—>3;1—>4-а-Ь-фукан (М.м. 40-60 кДа), сульфатированный в основном по положениям С-2 и в меньшей степени по С-4 остатков фукозы. Моносахаридный состав: Fuc:Gal:Xyl:Man в соотношении: 70:9:10:8 моль, %). Соотношение фукозы и сульфатов (Fuc:S042 ) - 1:0,92 моль/моль. 2. Фукоидан из бурой водоросли L. cichorioides - (1—>3)-а-Ь-фукан (М.м. 40-80 кДа) полностью сульфатированный по положениям С-2 и по С-4 остатков фукозы, Fuc:S04 - 1:1,7 моль/моль. 3. Фукоидан из бурой водоросли L. japónica - частично ацетилированный 1 —»З-а-Е-фукан, сульфатированный в основном по положению С-4 и в меньшей степени по С-2 остатков фукозы (М.м. 10-30 кДа), отличается высоким содержанием галактозы. Моносахаридный состав: Fuc:Gal:Man: Xyl:Glc в соотношении 65:20:8:4:3, мол. %, Fuc:S042' - 1:0,9 моль/моль [T.N. Zvyagintseva et al., 2003].

2 Лабораторные животные Исследования проведены на 530 мышах линии СВА (питомник НЦ Биомедицинских технологий «Андреевка», Московская область) и 2970 неинбредных мышах (питомник РАМН "Столбовая") в соответствии с рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах и согласно приложению №4 к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.

3 Культуры клеток В работе использовали линию клеток эритробластнго лейкоза человека К562, культуру эпителиальных клеток почек эмбрионов свиней (СГТЭВ), культуру клеток Vero Е6 (CI 106-CRL-1586 American Type Collection).

4 Микроорганизмы Для моделирования вирусных инфекций использовали: высокопатогенный штамм вируса гриппа птиц A/duck/Novosibirsk/02/05 H5N1 (Genbank DQ864711), выделен из органов домашней птицы во время эпизоотии в Новосибирской области 2005г. и депонирован в государственную коллекцию вирусов (инфекционный титр вируса 108 ТЦИД5о/1,0 мл); прототипный штамм 76-118 вируса Hantaan, выделен из

суспензии легких полевой мыши Apodemus agrarius koreae, Корея (инфекционный титр вируса 105 ТЦИД5о/0,2 мл) и штамм Primorye-73, Дальневосточный субтип, выделен из мозга человека с очаговой формой клещевого энцефалита (инфекционный титр вируса 107 ТЦИД5о/0,2 мл, 107,5lg 10 LD5o/0,2 мл и 108-5Ig 5 LD50/0,2 мл).

5 Исследование влияния фукоиданов на экспрессию ТЪКэ Экспрессию TLR-2, TLR-4 и TLR9 на ДК, генерированных из костного мозга мышей определяли методом проточной цитофлюориметрии (FacsCalibur, «Becton Dickinson» США) [Ахматова Н.К., 2006, Lutz М.В., 1999].

6 Исследование активации ЫР-кВ при взаимодействии фукоиданов с ТЬЯз 1. Взаимодействие фукоиданов с TLR-2, TLR-2/6, TL-R3, TLR-4, TLR-5, TLR-7, TLR-8 и TLR-9 изучали на эукариотических линиях клеток эмбрионального почечного эпителия человека НЕК293, в геном которых генно-инженерным методом введены гены различных TLRs человека, ген фермента ß-галактозидазы или ген щелочной фосфатазы под контролем NF-кВ зависимого промотера для детекции взаимодействия лигавда с соответствующим TLR. Анализ активации транскрипционного ядерного фактора NF-kB в клетках проводили на спектрофотометре iEMS Reader MF (Thermolabsystems, США) при длине волны 414 нм. В качестве отрицательного контроля, использовали линии клеток НЕК293 не экспрессирующие TLR. В качестве положительного контроля использовали лиганды соответствующих TLR [Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., 2008, Логунов ДЮ.,2011]. 2. Токсическое действие фукоиданов на клетки линии НЕК293 определяли на спектрофотометре iEMS Reader MF (Thermolabsystems, США) при длине волны 540 нм и 620 нм. 3. Определение ЛПС в структуре фукоиданов проведено с использованием ЛАЛ-теста - Kinetic QCL-1000 (Cambrex Bio Science, США) согласно инструкции производителя, и методов газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и ГЖХ-масс-спектрометрии (хроматограф Agilent 6850 SERIENTS GL SISTEMS, Германия, масс-спектрометр Hewlett Packard 5973, США).

7 Исследование действия фукоиданов на созревание ДК 1. Имунофенотип ДК генерированных из костного мозга мышей и моноцитов периферической крови человека определяли методом проточной цитофлюориметрии с использованием изотопических контролей и моноклональных антител против соответствующих антигенов CD34, CD 11с, CD 14, CD38, CD40, CD86, CD83, МНС I и II класса (HLA-DR), F4/80 («Caltag Laboratories», «Beckman Coulter», США) [Чкауда Г.З., 2002]. 2. Цитологическое исследование ДК методом фазово-контрастной и иммунофлюорисцентной микроскопии клеток проведено с использованием компьютерной системы AxioVision 4 и фотосистемы Axiocam HS (Carl Zeiss. Германия).

8 Исследование влияния СПС на продукцию цитокинов ДК Продукцию цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a, IFN-y) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностических тест-систем «Biosource» (Бельгия) и Вектор-Бест (Россия), согласно инструкции производителя.

9 Исследование влияния фукоиданов на клетки- эффекторы врожденного иммунитета и развитие адаптивного иммунного ответа 1. Субпопуляционный состав МЛ селезенки мышей линии СБА (CD3, CD4, CD8, CD 19, CD25, NK, CD3/NK, МНС I и II класса, TCR, TLR-2, TLR-4, «Caltag Laboratories» США) через 72 часа после внутрибрюшинного введения фукоиданов изучали методом проточной цитофлюориметрии [Boyum А., 1968, Lutz М.В., 1999]. 2. Исследование влияния фукоиданов на морфологическую структуру первичных и вторичных органов иммуногенеза мышей линии СВА с использованием гистологических и гистохимических методов [Лилли Р., 1969] проведено с использованием электронных компьютерных систем (JEM-100CX, «LEOL», Япония; Axiocam HS, Carl Zeiss, Germany). 3. Продукцию цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА (IL-2, IL-6,

IL-12, IL-17, TNF-a, IFN-y, TGFß) при внутрибрюшинном введении фукоиданов изучали методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «Bender MedSystems GmbH» (Австрия), согласно инструкции производителя. 4. Пролиферативную активность спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo исследовали в реакции бласттрансформации лимфоцитов [Самойлина Н.Л., 1970, Петров Р.В. и соавт. 1984]. 5. Цитотоксическую активность спленоцитов мышей в системах in vitro и ех vivo исследовали в МТТ-тесте с использованием NK-чувствительной линии клеток К-562 [Рыкова М.П. и соавт. 1981]. 6. Цитологическое исследование спленоцитов мышей линии СВА проведено с использованием компьютерной системы AxioVision 4 и фотосистемы Axiocam HS (Carl Zeiss, Germany).

10 Исследование противовирусной активности фукоиданов 1. Цитотоксическое действие фукоиданов изучали на культуре клеток СПЭВ и Vero Е-6. 2. Исследование вирусингибирующего действия и противовирусной активности фукоидана из L. japónica в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 проведено на культуре клеток СПЭВ. 3. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, исследование ингибирующего действия фукоиданов на адсорбцию хантавируса проведены на культуре клеток Vero Е-6 и модели перитонеальных Мф мышей с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител (НМФА) [Ткаченко Е.А. соавт., 1982]. 4. Исследование противовирусной активности фукоиданов при экспериментальной хантавирусной инфекции в системе ex vivo проведено на модели перитонеальных Мф мышей (НМФА). 5. Исследование вирусингибирующего действия фукоиданов в отношении вируса КЭ в системе in vitro проведено на культуре клеток СПЭВ [Хабриев Р.У., 2005]. 6. Исследование протективного действия фукоиданов системе in vivo проведено на модели экспериментального клещевого энцефалита мышей.

11 Статистический анализ Статистическую обработку результатов проводили с помощью прикладных программных пакетов Exel, «WinMdi 2.8», «Statistika 1», Primer of Biostatistics (Version 4.03) используя W-критерий Шапиро-Уилка, F-критерий Фишера, t-критерий Стьюдента. Выживаемость животных рассчитывали по С.А. Гланцу (1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние фукоиданов на экспрессию TLR-2, TLR-4 и TLR-9 дендритными клетками мышей, костномозгового происхождения

Результаты исследования показали, что сульфатированные полисахариды из бурых водорослей L. cichorioides и L. japónica (табл. 2) способствуют увеличению экспрессии TLR-2 и TLR-4 на дендритных клетках, генерированных из костного мозга мышей линии СВА по сравнению с незрелыми ДК, но не влияют на экспрессию TLR-9. Полученные результаты свидетельствует об активации сигнального каскада для реализации эффекторных механизмов врожденного иммунитета и формирования защиты организма.

Таблица 2. Влияние фукоиданов на экспрессию То11-рецепторов на дендритных клетках

Уровень экспрессии TLRs, % Незрелые ДК TNF-a L. cichorioides L. japónica

М±а М±а М±а М±а

TLR2 14,80±0,53 29,83±1,79 р=0,000 26,50±1,80 р=0,000 25,80±6,56 р=0,044

TLR4 1,46±0,15 5,50±0,45 р=0,000 8,13±0,15 р=0,000 7,20±1,55 р=0,003

TLR9 3,53±0,30 3,46±0,35 р=0,816 2,10±0,17 р=0,002 2,67±0,47 р=0,056

Примечание: М±о - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем - незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента).

Взаимодействие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей с Toll-подобными рецепторами человека в системе in vitro

Результаты исследования специфического взаимодействия фукоиданов из F. evanescens, L. japónica и L. cichorioides с TLRs на эукариотических клеточных линиях эмбрионального почечного эпителия человека НЕК293 показали, что сульфатированные полисахариды инициируют экспрессию р-галактозидазы и способствуют активации транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии с TLR-2, TLR-2/TLR-б и TLR-4, но не оказывают влияния на клетки HEK293-null, не экспрессирующие TLRs, и не вызывают активацию ядерного фактора при связывании с TLR-3, TLR-5, TLR-7, TLR-8 и TLR-9. Наибольшим действием на активацию NF-kB обладал фукоидан из бурой водоросли F. evanescens.

При взаимодействии сульфатированных полисахаридов с TLR-2 установлено, что фукоидан из F. evanescens при (рис. 1) вызывает активацию NF-kB в концентрации от 1000 до 10 мкг/мл (2,432±0,06; 1,661±0,038 и 0,804±0,06 ОЕ соответственно), фукоидан из L. cichorioides в концентрации 1000 и 100 мкг/мл (1,852±0,16 и 0,744±0,01), а фукоидан из L. japónica - в дозе 1000 мкг/мл (1,531±0,147) по сравнению с контролем (0,423±0,02). Функциональная активность рецептора подтверждена действием синтетического липопептида (2,669±0,07 ОЕ).

Результаты специфического взаимодействия полисахаридов с гетеродимером TLR-2/TLR-6 (рис. 2) показали, что фукоидан из F. evanescens вызывает активацию NF-kB в концентрации от 100 до I мкг/мл (2,282±0,06 и 1,746±0,049 ОЕ соответственно) по сравнению с контролем (1,15±0,11), а фукоиданы из L. japónica и L. cichorioides в

концентрации 100 и 10 мкг/мл. Действие синтетического липопептида на активацию NF-kB составило 2,679±0,156 ОЕ.

При взаимодействии сульфатированных полисахаридов с TLR-4 (рис. 3) выявлено, что фукоидан из F. evanescens вызывает активацию NF-kB в концентрации от 1000 до 1,0 мкг/мл (1,784±0,04; 1,905±0,07; 1,407±0,029 и 0,890±0,013 ОЕ, соответственно), фукоидан из L. cichorioides - от 1000 до 10 мкг/мл, а фукоидан из L. japónica - в концентрации 1000 и 100 мкг/мл по сравнению с контролем (0,641±0,024) и классическим лигандом - ЛПС Е. coli (2,005±0,2 ОЕ).

Отсутствие токсического действия сульфатированных полисахаридов на клетки линии HEK293-hTLRnull, HEK293-TLR-2/CD14, HEK293-TLR-2/TLR-6 и HEK293-TLR-4/CD14-MD2 исключает возможность повышения уровня экспрессии ß-галактозидазы и неспецифической активации NF-kB.

Доказательством того, что сульфатированные полисахариды бурых водорослей не содержат в своем составе ЛПС, который специфически взаимодействует с TLR4 и TLR2, являются результаты ЛАЛ-теста Kinetic QCL-1000 показавшие отсутствие примеси эндотоксинов грамотрицательных бактерий (<0,25 ЕЭ). Кроме того, результаты исследований с использованием методов ГЖХ и ГЖХ-масс-спектрометрии подтвердили отсутствие основного жирнокислотного компонента ЛПС - 3-ОНС¡4 кислоты и других 3-гидроксижирных кислот в составе фукоидана из F. evanescens, обладающего наибольшим действием на активацию NF-kB.

Таким образом, сульфатированные полисахариды из бурых водорослей L. japónica, L. cichorioides и F. evanescens являются лигандами и специфически взаимодействуют с TLR-2, гетеродимером TLR-2/6 и TLR-4 человека, вызывая активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB через MyD88 сигнальный путь или адаптерную пару TRIF/TRAM, что индуцирует экспрессию генов цитокинового каскада, необходимых для реализации эффекторных механизмов врожденного иммунитета и поляризации развития адаптивного иммунного ответа по Thl типу.

НЕК293-ЬТЫ12/СО!4

I-1аротса /_ ¿сИог'гШеэ р. еуапсхсспй

Рисунок 1. Активация ядерного фактора М-'-кВ при взаимодействии фукоиданов с ТЬК-2. Примечание: СЮ - оптическая плотность; К(-) - клетки линии НЕК293, содержащие ТЪК2 и адаптерную молекулу СО 14; К(+) - липопептид (10 нг/мл); р - достоверность различий по отношению к отрицательному контролю.

Рисунок 2. Активация ядерного фактора №-кВ при взаимодействии фукоиданов с НЕК293-ТЫ12/ТШ16. Примечание: СЮ - оптическая плотность; К(-) - клетки линии НЕК293, содержащие гетеродимер ТЬЯ2/ТЬЯ6, К(+) - липопептид (10 нг/мл); р -достоверность различий по отношению к отрицательному контролю.

/.. ^арапия /.. аскопой!^ р. егапжсепх

Рисунок 3. Активация транскрипционного ядерного фактора КР-кВ при взаимодействии фукоиданов с НЕК293-ТЫ14/СО14-МВ2.

Примечание: СЮ - оптическая плотность; К(-) - клетки линии НЕК293, содержащие в своем геноме комплекс ТЬЯ4, адаптерную молекулу СЭ14 и белок МЭ-2; К(+) - липополисахарид Е.соИ (10 нг/мл); р - достоверность различий по отношению к отрицательному контролю.

Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на созревание дендритных клеток

На двух альтернативных моделях, позволяющих непосредственно на клеточном уровне установить биологическую активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica в проекции на организм человека установлено, что фукоиданы индуцируют созревание ДК, генерированных из костного мозга мышей (табл. 3) и моноцитов периферической крови человека (табл. 4), о чем свидетельствовало выраженное увеличение экспрессии маркера терминальной дифференцировки (CD83) при отрицательном контроле и снижение экспрессии маркера незрелых ДК (CD34).

Увеличение экспрессии активационного маркера (CD38) под действием фукоиданов и молекулы адгезии (CDllc) указывало на способность созревших ДК взаимодействовать с Т-лимфоцитами, а повышение экспрессии костимулирующих (CD86) и антигенпредставляющих молекул (МНС II класса) свидетельствовало о способности ДК к дальнейшей активации наивных Т-клеток. При этом отмечено, что фукоидан из L. cichorioides, способствовал выраженному увеличению экспрессии CD11 с по сравнению с фукоиданами, TNF-a и незрелыми ДК.

Присутствие F4/80 молекул и CD14 - маркера моноцитов на ДК указывало на наличие в культуре определенного процента Мф, однако снижение их экспрессии под действием фукоиданов подтверждало дифференцировку клеток в ДК.

Процесс созревания ДК подтвержден и результатами цитологического исследования (рис. 4). Установлено, что фукоиданы (В-Д) как и TNF-a (Б) в процессе культивирования вызывают морфологические изменения мононоцитов периферической крови человека (А). Клетки приобрели крупную неправильную форму с эксцентрично расположенным базофильным ядром, вакуолизированную цитоплазму и многочисленные цитоплазматические отростки.

Иммунофлюресцентное исследование ДК показало (рис. 5), что по сравнению с контролем (А) и TNF-a (Б), фукоиданы (В, Г, Д) индуцируют экспрессию как CDla, так и CD14. Возможно, что подобно ЛПС, фукоиданы увеличивают не только экспрессию TLR-4 и костимулирующих молекул, но и CD14 на поверхности ДК.

Таким образом, различные по химической структуре сульфатированные полисахариды бурых водорослей являются индукторами созревания ДК. о чем свидетельствуют фенотипические и морфологические изменения клеток.

шштж ъ " v ж j 9 *** ♦ »

• ó; ч -te? Чр 1 ж дм * ь ^ 4е ^

А Б В Г Д

Рисунок 4. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на морфологию дендритных клеток. Примечание: Фазовоконтрастная микроскопия с использованием системы AxioVision 4, А - первичная культура моноцитов, Б - ДК созревшие под действием TNF-ct, В - ДК, созревшие под действием фукоидана из F. evanescens, Г - ДК, созревшие под действием фукоидана из L. cichorioides, Д - ДК, созревшие под действием фукоидана из L. japónica (ув. 400).

А Б В Г Д

Рисунок 5. Иммунофлюоресцентное исследование ДК, созревших под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей. Примечание: Флуоресцентная микроскопия ДК, меченных антителами к CDla и CD14, с использованием системы AxioVision 4, А - контроль (незрелые ДК на 6 сутки культивирования в присутствии факторов роста GM-CSF и IL-4), Б - ДК, созревшие под действием TNF-a, В - ДК, созревшие под действием фукоидана из F. evanescens, Г - ДК, созревшие под действием фукоидана из L. cichorioides, Д - ДК, созревшие под действием фукоидана из L. japónica (ув. 400).

Уровень экспрессии молекул, % (п=30) Контроль Незрелые ДК (GM-CSF и IL-4) TNF-a Фукоидан (L. cichorioides) Фукоидан (L. japonica)

М± а Me (LQ-UQ) М± а Me (LQ-UQ) P M± a Me (LQ-UQ) P M± a Me (LQ-UQ) P

CD34 23.23±1,42 23,5 (21,7-24,5) 0,19±0,27 0,07 (0,0-0,5) p=0,000 0.66±0,57 0,5 (0,2-1,3) p=0,000 0,24±0,24 0,2 (0,2-0,5) p=0,000

CD83 о±о 0 27.5±2.11 26,7 (25,9-29,9) p=0,000 10,27±1,10 10,2(9.2-11,4) p=0,000 16,13±2.51 17,0(13,3-18,1) p=0,000

CD38 5.43±0,25 5,4 (5,2-5,7) 68,70±10,86 65,50 (59,8-80,8) p=0,000 58,0±6,68 57,3 (51,7-65,0) p=0,000 63,67±6,65 62,0 (58,0-71,0) p=0,000

CDllc 43,13±0,96 43,3 (42,1-44,0) 47.47±2,67 47,10 (45,0-50,3) p=0,057 73.63±3,87 74,50 (69,4-77) p=0,000 48,76±3,27 49,8 (45,1-51,4) p=0,046

CD40 5,23±0,87 5,0 (4,5-6,2) 9,76±1,46 9,60 (8,4-11,3) p=0,009 7.53±2,05 7,50 (5,9-9,2) p=0,148 7,97±1,55 8 (6,4-9,5) p=0,100

CD86 4,0±0,2 4,0 (3,8-4,2) 11,67±1,27 11,90(10,2-12,8) p=0,000 16.20±2.20 16,2(13,5-18,9) p=0,001 16,17±3,35 16,2(12,8-19,5) p=0,003

МНС I 2,13±0,11 2,2 (2,0-2,24) 8.30±1,11 8,50(7,1-9,3) p=0,000 3.43±0,38 3,10(3,0-4,2) p=0,029 3,57±0,81 3,70 (2,7-4,3) p=0,038

МНС II 19.07±1.10 19,0(18,0-20,2) 8.43±1,06 8,60 (7,3-9,4) p=0,000 41.80±5,04 41,0(37,2-42,2) p=0,001 44.03±11,25 45,8 (32,0-54-3) p=0,018

F4/80 47,46±3,61 47,2(44-51,2) 12, 76±3,28 12,20 (9,8-16,3) p=0,000 24.33±6,95 24,5(17,3-31,2) p=0,007 33,0±4,33 30,5 (30,5-38) p=0,011

Таблица 4. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на иммунофенотип дендритных клеток, генерированных из моноцитов периферической крови человека

Уровень Контроль TNF-a Фукоиданы

экспрессии, % Незрелые ДК (GM-CSF и IL-4) F. evanescens L. cichorioides L. japonica

М±сг M±a M±a M±a M±a

CD34 4,54±0,64 0,41±0,09 0,71±0,08 1,40±0,15 0,51±0,11

р=0,000 р=0,000 р=0,001 р=0,000

CD83 0,5±0,09 19,24±2,07 6,90±0,94 12,50±1,29 10,03±0,93

р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000

CD 14 31,40±2,18 12,40±1,32 14,24±1,69 16,91±1,03 17,30±1,09

р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,001

CDllc 19,10±2,10 30,05±2,71 21,03±2,22 41,20±3,36 29,60±2,87

р=0,005 р=0,335 р=0,000 р=0,000

CD86 18,50±1,80 32,81±3,17 25,22±2,54 36,80±3,78 29,71±2,92

р=0,002 р=0,02 р=0,001 р=0,004

HLA-DR 14,60±1,44 29,60±2,85 22,10±1,90 37,80±3,31 29,01 ±2,71

р=0,001 р=0,005 р=0,000 р=0,001

Примечание: М±о - средняя арифметическая±стандартное отклонение; р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем -незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента).

Характеристика профиля цнтокинов, продуцируемых дендритными клетками, под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей

При исследовании влияния сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на продукцию дендритными клетками цитокинов, определяющих направление дифференцировки и активацию субпопуляций эффекторных Т-клеток установлено (табл. 5), что фукоиданы из L. cichorioides и L. japónica увеличивали уровень продукции IL-12 (в 2,23 и 2,38 раза соответственно), IL-6 (в 3,37 и 2,69 раза соответственно), IL-ip (в 10,87 и 12,71 раз соответственно), TNF-a (в 5,58 и 5,93 раз соответственно) и IL-10 (в 5,95 и 4,56 раза) по сравнению с незрелыми ДК.

Аналогичные результаты получены и при исследовании дендритных клеток, генерированных из моноцитов периферической крови человека in vitro (табл. 6). Установлено, что фукоиданы из F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica достоверно увеличивают продукцию IL-12 (в 2,83; 2,76 и 3,0 раза), IL-6 (в 2,36; 1,58 и 2 раза), TNF-a (в 1,75; 2,0 и 1,67) и IL-10 (в 2,84; 2,98 и 2,2 раза соответственно) по сравнению с контролем, но не оказывают влияние на продукцию IL-4.

Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей обладают индуцирующим действием на функциональную активность дендритных клеток, которые синтезируют широкий спектр Th-1 и Th-2 цитокинов (IL-12, IL-ip, IL-6, TNF-a, INFy, IL-10). Выраженное увеличение продукции иммунорегуляторных (IL-12 и IFN-y) и провоспалительных (IL-ip, IL-6, TNF-a) цитокинов свидетельствуют о потенциале ДК поляризовать развитие иммунного ответа по Thl типу, и является необходимым условием для активации и дифференцировки Т-лимфоцитов.

Таблица 5. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на продукцию цитокинов дендритными клетками,

генерированными из костного мозга мышей линии СБА (пкг/мл)

ДК 1Ь-1р 1Ь-2 1Ь-4 1Ь-6 1Ь-10 1Ы2 ТОТ-а

(п=30)

М±а М±ст М±а М±а М±а М±а М±а М±а

Незрелые ДК 1,03+0,29 11,52+1,21 18,78+0,33 14,31+1,52 2,32+0,42 34,20+2,11 33,40+2,31 3,41+0,70

W=0,78 W=0,97 W=0,89 W=0,99 \¥=0,92 W=0)99 W=0,99 У/=0,97

15,78+1,81 11,71+1,3 7,08+0,64 56,3+3,21 13,4+1,22 116,5+5,5 240,14+4,3 7,18+1,13

р=0,000* р=0,855 р=0,000* р=0,000* р=0,000* р=0,000* р=0,000* р=0,007*

W=0,98 W=0,99 W=0,95 \У=0,98 W=0,86 W=0,99 \У=0,98 \У=0,97

Ь. с1с1юг1ос1е5 11,21+1,32 12,8+1,6 12,16+1,22 48,18+3,44 13,67+0,54 76,40+4,64 186,32+5,82 5,26+0,51

р=0,000* р=0,324 р=0,001* р=0,000* р=0,000* р=0,000* р=0,000* р=0,019*

W=0,97 W=0,98 W=0,94 W=0,99 W=0,89 Ш=0,98 W=0,99 \¥=0,87

Ь.)аротса 13,12±0,81 10,58±1,5 13,75±1,54 38,31±2,81 10,51±2,73 81,31±5,35 198,04±6,40 4,49±1,20

р=0,000* \У=0,87 р=0,466 W=0,97 р=0,005* W=0,94 р=0,000* W=0,98 р=0,007* W=0,99 р=0,000* \У=0,99 р=0,000* W=0,99 р=0,244 W=0,98

Примечание: М±а - средняя арифметическая±стандартное квадратичное отклонение; *р - достоверность полученных значений по сравнению с незрелыми ДК (ТЧез!, критерий Стьюдента); - ЗИартоДУИк - уровень значимости, соответствующий данному критерию W (при <0,05 параметр имеет отклонение от нормального распределения).

Таблица 6. Влияние фукоиданов на продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированных из моноцитов периферической крови человека (пкг/мл)

ДК (п=10) IL-ip IL-4 IL-6 IL-10 IL-12 TNFa

М±ст Me (LQ-UQ) М±ст Me (LQ-UQ) M±a Me (LQ-UQ) M±g Me (LQ-UQ) M±o Me (LQ-UQ) M±a Me (LQ-UQ)

Незрелые ДК 1,31 ±0,31 1,28 (0,95-1,8) W=0,94 4,05±0.77 3,92 (2,96-4,9) W=0,94 16,84±4,96 15,36(41,5-54,24) W=0,96 2,63±0,58 2,48 (2,0-3,21) W=0,93 17,65±2,75 18,38(14,2-20,73) W=0,93 20,59±3,94 20,08 (16,5-25,72) W=0,92

TNF 1,94±0.28** 1,92 (1,6-2,38) p'<0,05 W=0,96 2,81±0,75* 2,98(1,96-3,73) p'=0,138 W=0,92 46,23±5.03*** 45,93 (40,5-52,15) p'<0,05 W=0,93 6,74±0,41*** 6,75 (6,3-7,2) p'<0,05 W=0,97 58.82±4,79*** 59,95 (51,8-64,56) p'<0,05 W=0,98 59,72±5,41*** 59,41 (53,38-67,4) p'<0,05 W=0,98

F. evanescens 1,28±0,27 1,24 (0,98-1,72) p'=0,893 W=0,90 3,72±0,65 3,97 (2,97-4,31) p'=0,500 W=0,95 39,82±3.87*** 40,15 (34,84-44,5) p'<0,05 W=0,97 7,47±0,56*** 7,33 (6,9-8,05) p'<0,05 W=0,97 49.91±4,57*** 50,58 (45,4-54,96) p'<0,05 W=0,97 36,19±5,0*** 35,42 (30,8-42,59) p'<0,05 W=0,93

L. cichorioides 1,33±0.37 1,31 (0,87-1,9) p'=0,685 W=0,92 3,78±0,57 3,82 (2,97-4,48) p'=0,500 W=0,98 26,64±5.33*** 26,1 (20,36-34,42) p'<0,05 W=0,98 7,83±0,93*** 8,00± (6,9-8,8) p'<0,05 W=0,88 48.71±3,38*** 49,52 (44,95-52,4) p'<0,05 W=0,88 42,72±4,82*** 41,75 (37,57-49,3) p'<0,05 W=0,94

L. japonica 1,73±0.26* 3,40±0,86 35,21±4.05*** 5,81±0,5*** 54.72±5,32*** 34.33±4,20***

1,79(1,35-2,0) p'<0,05 W=0,93 3,61 (2,22-4,5) p'=0,345 W=0,98 34,83 (30,2-40,0) p'<0,05 W=0,95 5,97 (5,29-6,3) p'<0,05 W=0,94 55,84 (47,43-60,3) p'<0,05 W=0,94 34,72 (29,8-39,95) p'<0,05 W=0,94

Примечание: М±а - средняя арифметическая± стандартное отклонение; Me - медиана; LQ-UQ - нижний и верхний квартили; р - достоверность полученных значений по сравнению с незрелыми ДК (критерий Стьюдента), * р<0,05, ** р<0,01, ***р<0,001; р1- Wilcoxon Test (p-level<0,05); W -Shapiro-Wilk - уровень значимости, соответствующий данному критерию W (при <0,05 параметр имеет отклонение от нормального распределения).

Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на клетки-эффекторы врожденного иммунитета и развитие адаптивного иммунного ответа

При исследовании субпопуляционного состава MJI селезенки мышей установлено, что как при однократном, так и пятикратном внутрибрюшинном введении фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica снижается количество CD8+, не изменяется количество CD3+ и CD4+ Т-клеток, но увеличивается содержание В-клеток (CD19) по сравнению с контролем (табл. 7).

Об активации сульфатированными полисахаридами процессов пролиферации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов свидетельствовало выраженное увеличение маркеров CD25 в среднем в 5,1 и 7,4 раза, NK 1.1. - в 7,5 и 9,2 раз и NKT-клеток (CD3+/NK) в 2,8 и 4,3 раза соответственно.

Результаты исследования влияния сульфатированных полисахаридов на экспрессию антигенпредставляющих молекул показали, что как при однократной стимуляции, так и при введении в течение 5 дней, фукоиданы не оказывали влияния на экспрессию МНС I, но увеличивали уровень МНС II класса в 2,26 и 2,4 раза, а экспрессию TCR в 1,65 и 1,74 раза. Увеличение экспрессии МНС II класса и TCR свидетельствует о влиянии фукоиданов на процессы пролиферации и дифференцировки Т-клеток за счет взаимодействия комплекса антигенного пептида с молекулой МНС II класса и рецепторным комплексом TCR/CD3/CD4.

Кроме того, все сульфатированные полисахариды способствовали увеличению экспрессии TLRs на поверхности клеток. Наибольшим индуцирующим действием обладал фукоидан из F. evanescens. Установлено, что однократное и многократное введение фукоидана из F. evanescens увеличивало экспрессию TLR-2 в 4,1 и 4,5 раза по сравнению с контролем, а фукоиданов из L. cichorioides и L. japónica - в среднем в 3,2 и 3,7 раза соответственно. Аналогичные результаты получены и при исследовании TLR-4. Установлено, фукоидан из F. evanescens увеличивал 3KcnpeccHioTLR-4 в 2,85 и 4,07 раза по сравнению с контролем, а фукоиданы из L. cichorioides и L. japónica в среднем в 1,79 и 2,4 раза соответственно.

Таким образом, сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica способствуют процессам дифференцировки

иммунокомпетентных клеток и активации механизмов клеточного и гуморального

иммунного ответа, что необходимо для формирования адаптивного иммунного ответа.

Таблица 7. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на уровень экспрессии поверхностных молекул МЛ селезенки мышей линии СВА.

CD (%) Фукоиданы (5 мг/кг)

Контроль F. evanescens L. cichorioides L. japónica

М±ст 'М±а/ 2М±а 1М±а/ 2М±ст 'М±а/ 2М±а

CD3 19,64±2,19 19.6±2.14: о=0.984 19,2±2,55; р=0,836 20.07±2.58: р=0.838 19,97±2,32; р=0,868 19.38±1.82;р=0.885 19,00±2,45; р=0,755

CD4 26,31±2,62 26.25±2,84; р=0.977 26,54±2,8; р=0,922 25.12±3.19: р=0.643 25,87±3,7; р=0,871 26.01±2.47; d=0.890 26,23±3,21; р=0,975

CD8 10,53±2,0 7.67±1.3*: р=0.049 5,88±1,4*;р=0,03 6.0±1.38*:р=0.034 4,94±1,1*;р=0,013 6.54± 1.05* ;р=0,038 5,43±1,25*; р=0,02

CD19 14,87±1,92 24.4±2.74*: р=0.008 27,6±2,28*; р=0,049 27.76±2.5*: р=0.002 30,12±3,2*;р=0,019 25.90±2.4*; р=0.003 28,93±2,83* ;р=0,031

CD25 0,99±0,1 5.10±0.2*:р=0.000 4.85±0.35*: р=0.000 5.24±0.3*: р=0.000

7,37±1,38*; р=0,000 7,0±1,16*;р=0,000 7,67±1,53*;р=0,000

NK1.1. 1,26±0,25 7.22±1.26*: d=0.000 8,75±1,44*; р=0,000 6.47±1.41*: р=0,000 9,81±1,58*;р=0,000 6.34±1,30*: р=0,000 8,39±1,36*;р=0,000

CD3/ NK 1,07±0,14 3.75±0.51*:р=0.000 4,81±0,2*; р=0,000 3.0±0.2*:р=0.000 4,77±0,37*; р=0,000 3.29±0,62* ;р=0.000 4,29±0,4*; р=0,000

МНС I 0,37±0,06 0.47±0.05:р=0.101 0,53±0,05*; р=0,024 0.5±0.05:р=0,116 0,5±0,0*;р=0,016 0.4±0.0:р=0.374 0,47±0,05; р=0,101

МНС II 18,84±2,65 41.18±4.26* ;р=0,001 42.34±4,1*: р=0.001 44.43±4,55*; =0.000

44,0±4,9*; р=0,001 45,6±5,67*; р=0,002 47,96±5,4*;р =0,001

TCR 0,37±0,06 0.67±0,11*: р=0,003 0.6±0.1*:р=0.024 0.57±0.05*: р=0.013

0,7±0,1*;р=0,003 0,63±0,05*; р=0,005 0,6±0,1*;р=0,007

TLR-2 0,17±0,05 0.7±0.1*:р=0.001 0.57±0,05*; р=0.001 0.53±0.05*: р=0.002

0,77±0,05*; р=0,001 0,67±0,05*; р=0,001 0,53±0,11*;р=0,001

TLR-4 0,27±0,05 0.77±0,05*; р=0.001 1,1±0,17*;р=0,001 р'<0,05 0.5±0.1*: р=0.025 0,7±0,1*;р=0,002 0.47±0.05*;р=0.013 0,6±0,1*;р=0,007

---^--1-2-

Примечание: М±а - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; М±о/ М±о - однократное и

пятикратное введение фукоиданов;*р - достоверность значений по сравнению с контролем (T-test,

критерий Стьюдента); р1 - достоверность значений между сульфатированными полисахаридами.

Влияние фукоиданов из бурых водорослей на морфологическую характеристику лимфоидных органов мышей

Результаты морфологического исследования показали, что под действием сульфатированных полисахаридов в красном костном мозге мышей линии СВА (рис. 6 -

А) происходит процесс активного кроветворения. Определяются все промежуточные формы миелоидного кроветворения и многочисленные мегакариоциты (Б).

Рисунок 6. Влияние сульфатированных полисахаридов на красный костный мозг. Примечание: А — красный костный мозг интактных мышей, Б — красный костный мозг мышей после введения фукоидана, окр. по Ван Гизону; ув. 600.

В дольках тимуса, по сравнению с интактными животными (рис. 7-А), площадь коркового вещества расширена, а мозговое вещество имеет вид вкраплений (Б). Определяются крупные тельца Гассаля (Г) многочисленные Мф, клетки стромы (Д) и

полнокровные сосуды крупных размеров (В).

Рисунок 7. Влияние сульфатированных полисахаридов на структуру тимуса. Примечание: А — тимус интактных мышей: Б, В, Г, Д — тимус, после введения фукоидана; А, В, Г— окр. гематоксилином и эозином, Б, Д - окр. по Ван Гизону; А. Б - ув. 100; В, Д - ув. 200; Г - ув. 1000.

В селезенке происходит увеличение площади белой пульпы, лимфоидные узелки сливаются в конгломераты (рис. 8-Б, В), различаются мантийная и маргинальная зоны, реактивные центры и расширенные периартериальные муфты (В, Г). В красной пульпе выявляются многочисленные лимфоциты, Мф и плазматические клетки, а эритроциты

находятся как внутри, так и вне венозных синусов (В, Г, Д).

Рисунок 8. Влияние сульфатированных полисахаридов на структуру селезенки. Примечание; А - селезёнка интактных животных; Б, В, Г, Д - селезёнка мышей после введения фукоидана; А, Б, Д - окр. гематоксилином и эозином; В, Г - окр. по Ван Гизону; А Б, В - ув. 100; Г -ув. 200; Д - ув. 400.

По сравнению с интактными животными (рис. 9-А), корковое вещество под действием фукоиданов занимает практически весь лимфатический узел, межузелковые пространства заполнены клетками лимфоидного ряда (В), Т- и В-зависимые зоны не различимы, так как периферическая кора и паракортикальная зона представляют собой единый конгломерат (Б). Субкопсулярный лимфатический (В, Г) и промежуточные синусы мозгового вещества содержат большое количество бластных форм (В), клеток макрофагального ряда (Г, Д) и большое количество жировых клеток (Б).

Рисунок 9. Влияние сульфатированных полисахаридов на структуру лимфатических узлов

Примечанием — лимфатический узел интактной мыши; А, В, Д — окр. гематоксилином и эозином; Б, Г - окр. по Ван Гизону; А - ув. 200; Б - ув. 100; Г - у в. 600; В, Д - ув. 1000.

Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют активации лимфоидного и миелоидного кроветворения в красном костном мозге, выраженной макрофагальной реакции и пролиферативным процессам в лимфоидной ткани первичных и вторичных органов иммуногенеза.

Влияние фукоиданов из бурых водорослей ex vivo на динамику продукции цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА

Результаты исследования в системе ex vivo показали, что фукоиданы из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica способствуют увеличению в динамике уровня как Thl-, так и Th2 цитокинов, что обеспечивает взаимосвязь между врожденным и адаптивным иммунитетом.

Показано, что фукоиданы увеличивали продукцию IL-2 через 2 и 4 часа после однократного и многократного введения (табл. 8-10). Максимальное увеличение TNF-а наблюдалось в течение 2 и 4 часов после введения полисахаридов, с последующим снижением продукции через 24 часа до значений в контроле.

Особое значение в механизме действия сульфатированных полисахаридов имеет их влияние на продукцию иммунорегуляторных цитокинов (IL-12 и IFN-y), которые способствуют активации эффекторных функций иммунокомпетентых клеток,

усиливают антимикробную и цитотоксическую активность и отвечают за развитие иммунного ответа по Thl типу. Показано, что полисахариды способствовали увеличению уровня IL-12 через 2-4 часа после введения, а пик продукции зарегистрирован через 24 и 72 часа. Наибольшим действием обладал фукоидан из L. japónica, максимальное увеличение IL-12 при однократном введении наблюдалось через 8-72 часа (в 30,4-17,8 раз соответственно), а при многократном введении через 24 и 72 часа (в 9,5 и 18 раз) по сравнению с контролем.

При изучении IFN-y установлено, что полисахариды способствуют увеличению его продукции по сравнению с контролем. Наибольшим действием обладал фукоидан из F. evanescens, максимальное увеличение IFN-y в 6,5 раз зарегистрировано через 8 часов после однократной стимуляции фукоиданом, а при введении в течение 5 дней через 24 и 72 часа (в 12,8 и 10 раз соответственно)

Изучение продукции IL-6 показало, что фукоидан из F. evanescens способствует его увеличению через 2 и 4 часа после однократной стимуляции (в 7,5 и 3,17 раза), а при многократном введении через 2, 4 и 24 часа (в 4,1-3 раза). Увеличение IL-6 под действием фукоиданов из L. japónica и L. cichorioides выявлено через 2 и 4 часа (в среднем в 3,98 и 1,98 раза и 3,3 и 1,95 раза соответственно). Следует отметить, что на фоне увеличения уровня IL-6 фукоиданы оказывают ингибирующее действие на синтез TGF-p, который играет важную роль в генерации клеток памяти и обладает мощным противовоспалительным действием.

При исследовании провоспалительного цитокина IL-17, который продуцируется Thl7 типа и обладает уникальным действием на Т-лимфопоэз установлено, что только 5-кратное введение фукоиданов из F. evanescens (в 1,87 и 5,74 раз), L. japónica (в 2,6 раза) и L. cichorioides (в 6,1 раз) способствует его увеличению на определенных этапах исследования по сравнению с контролем.

Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей оказывают индуцирующее действие на продукцию провоспалительных (IL-2, IL-6, IL-17, TNF-a) и иммунорегуляторных (IL-12, IFN-y) цитокинов, но ингибируют секрецию противовоспалительного цитокина (TGF-p), что свидетельствует об активации механизмов, поляризующих развитие иммунного ответа по Thl типу.

Время IL-2 TNF-a IL-12 IFN-y IL-6 TGF-p IL-17

исследования(ч) М±а М±ст М±а М±а М±а М±а М±ст

2 42,86±2,51* 385,4±5,13* 17,34±2,69* 12,34±1,75 417,8±2,64* 44,56±3,67*

р=0,000 р=0,000 р=0,034 р=0,218 р=0,000 р=0,001 -

4 38,72±2,9* 170,96±3,35* 25,68±2,99* 14,87±2,18 175,4±4,18* 34,68±2,69*

F. evanescens р=0,001 р=0,000 р=0,002 р=0,064 р=0,000 р=0,000 -

1-кратно 8 25,15±3,28 90,42±4,21* 52,12±3,47* 72,00±4,57* 120,8±2,95* 39,24±2,2*

(5 мкг/кг) р=0,348 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 -

24 22,98±1,16 51,84±3,36 109,24±3,57* 42,64±3,58* 115,5±2,67* 38,45±4,42*

р=0,761 р=0,942 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 -

72 23,44±1,83 64,38±3,0* 224,82±5,52* 35,28±2,79* 69,42±1,86* 45,02±3,91*

р=0,765 р=0,004 р=0,000 р=0,000 р=0,003 р=0,000 -

2 45,86±3,38* 180,1±5,06* 17,98±2,55* 12,42±1,04 227,58±3,8* 47,22±3,42* 20,0±1,8*

р=0,000 р=0,000 р=0,024 р=0,357 р=0,000 р=0,001 р=0,04

4 38,48±2,75* 143,5±3,97* 27,68±2,53* 26,12±3,33* 169,42±2,7* 28,54±2,24* 61,48±2,9

F. evanescens р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,002 р=0,000 р=0,000 р=0,004*

5- кратно 8 30,0±2,24* 92,65±2,24* 43,78±3,64* 61,28±3,12* 102,46±3,1* 26,52±3,99*

(5 мкг/кг) р=0,007 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 -

24 23,87±0,79 77,65±3,74* 108,48±4,35* 141,32±4,65* 174,86±2,2* 43,24±3,01*

р=0,276 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 -

72 23,84±1,58 65,38±3,32* 176,84±4,43* 110,54±3,24* 79,64±2,39* 42,32±3,38*

р=0,274 р=0,005 р=0,000 р=0,000 р=0,000 р=0,000 -

Контроль 23,21±1,79 52,91±2,62 12,22±1,78 11,02±1,36 55,29±3,14 65,48±2,33 10,7±0,9

Время исследования (ч) IL-2 TNF-a IL-12 IFN-y IL-6 TGF-P IL-17

М±с М±о М±о М±о М±а М±о М±а

L. japónica 1- кратно (5 мкг/кг) 2 41,44±1,79* р=0,000 343,96±5,64* р=0,000 30,76±1,97* р=0,000 12,22±0,67 р=0,224 231,75±3,08* р=0,000 46,48±2,7* р=0,000 -

4 31,98±1,88* р=0,004 126,98±4,55* р=0,000 157,92±4,12* р=0,000 12,82±1,10 р=0,129 102,96±1,83* р=0,000 51,62±2,32* р=0,002 -

8 24,35±3,46 р=0,436 53,84±3,14 р=0,781 371,48±3,63* р=0,000 23,12±2,79* р=0,002 59,80±1,52 р=0,127 32,38±3,62* р=0,000 -

24 23,08±2,55 р=0,610 53,27±2,24 р=0,923 224,85±5,45* р=0,000 28,52±2,35* р=0,000 86,85±3,63* р=0,000 28,56±4,19* р=0,000 -

72 23,98±1,60 р=0,784 52,84±2,75 р=0,658 210,23±3,37* р=0,000 12,34±1,63 р=0,234 62,38±2,02* р=0,028 24,22±3,39* р=0,000 -

L. japónica 5- кратно (5 мкг/кг) 2 42,26±3,04* р=0,000 176,5±4,15* р=0,000 20,72±1,81* р=0,002 12,44±0,68 р=0,205 209,3±3,7* р=0,000 40,82±4,27* р=0,000 28,5±2,2* р=0,044

4 36,72±4,26* р=0,008 102,7±2,92* р=0,000 44,26±3,32* р=0,000 25,68±2,67* р=0,001 115,9±4,34* р=0,000 21,34±2,63* р=0,000 -

8 27,16±2,62 р=0,061 60,28±1,73* р=0,014 84,9б±2,84* р=0,000 29,87±3,41* р=0,001 78,94±3,57* р=0,001 31,58±3,54* р=0,000 -

24 25,73±2,68 р=0,188 52,87±3,34 р=0,719 115,98±3,54* р=0,000 36,42±3,21* р=0,000 59,84±1,40 р=0,114 22,72±2,41* р=0,000 -

72 24,86±1,35 р=0,114 50,68±1,29 р=0,167 219,78±5,05* р=0,000 20,82±2,58* р=0,005 71,46±2,30* р=0,002 21,87±3,03* р=0,000 -

Контроль 23,21±1,79 52,91±2,62 12,22±1,78 11,02±1,36 55,29±3,14 65,48±2,33 10,7±0,9

Время 11.-2 таБ-а 1Ь-12 1Ш-у 11,-6 твг-р 1Ь-17

исследования (ч) М±о М±а М±а М±а М±а М±а М±а

2 34,87±2,24* 203,32±5,54* 14,86±1,34 12,24±0,82 79,54±5,02* 59,38±2,42* -

р=0,002 р=0,000 р=0,134 р=0,811 р=0,002 р=0,043

4 28,48±1,57* 102,47±4,15* 20,46±1,61* 19,48±2,64* 169,42±2,54* 40,92±2,91* -

Ь. скИогМскз р=0,02 р=0,000 р=0,002 р=0,007 р=0,000 р=0,000

1- кратно 8 23,72±2,83 62,98±3,41* 49,70±2,32* 20,72±2,16* 55,62±2,55 51,48±3,45* -

(5 мкг/кг) р=0,909 р=0,015 р=0,000 р=0,003 р=0,961 р=0,003

24 22,20±3,06 56,36±2,96 49,56±4,0* 12,36±1,93 52,48±1,81 35,96±2,76* -

р=0,697 р=0,138 р=0,000 р=0,164 р=0,244 р=0,000

72 23,42±2,06 51,28±3,61 126,76±4,62* 12,24±0,82 78,48±4,68* 33,27±2,59* -

р=0,902 р=0,678 р=0,000 р=0,354 р=0,002 р=0,000

2 39,86±3,73* 154,36±4,6* 13,98±1,48 12,00±1,29 182,7±3,83* 33,24±2,09* -

р=0,001 р=0,000 р=0,177 р=0,511 р=0,000 р=0,000

4 30,42±3,54* 104,34±5,2* 20,46±1,61* 12,24±0,73 107,98±3,4* 41,22±2,67* -

Ь. ЫсИогШскз р=0,035 р=0,000 р=0,002 р=0,317 р=0,000 р=0,000

5- кратно 8 25,62±2,48 61,3±2,53* 29,92±3,63* 29,12±2,24* 54,97±2,32 33,52±2,97* -

(5 мкг/кг) р=0,278 р=0,014 р=0,001 р=0,000 р=0,902 р=0,000

24 23,68±1,34 56,24±1,79 45,56±3,51* 14,72±2,67 60,86±3,54 31,44±2,68* 65,4±2,6*

р=0,879 р=0,126 р=0,000 р=0,077 р=0,085 р=0,000 р=0,000

72 23,73±1,97 49,26±2,75 95,72±3,18* 14,42±2,54 82,34±1,98* 31,11±2,71 * -

р=0,812 р=0,251 р=0,000 р=0,082 р=0,000 р=0,000

Контроль 23,21±1,79 52,91±2,62 12,22±1,78 11,02±1,36 55,29±3,14 65,48±2,33 10,7±0,9

Влияние сульфатированных полисахаридов на пролиферативную и цитотоксическую активность спленоцитов мышей линии СБА

Результаты исследования показали, что сульфатированные полисахариды в системах in vitro и ex vivo способствуют повышению пролиферативной активности спленоцитов мышей (табл. 11), о чем свидетельствует увеличение индекса стимуляции и преобладание в культуре бластных форм и крупных клеток типа пролимфоцитов. Наибольшим стимулирующим действием по сравнению с фукоиданами из L. cichorioides и L. japónica обладал фукоидан из F. evanescens.

Таблица 11. Пролиферативная активность сульфатированных полисахаридов

Фукоиданы Пролиферативная активность (бластные формы %)

М±а Me (LQ-UQ) ИС

in vitro

F. evanescens 100 мкг/мл 65,32±1,81*(р '<0,001) 65,60 (63,4-67,0) 3,94

50 мкг/мл 53,80±1,90*(р '<0,001) 54,0 (51,8-55,6) 3,25

10 мкг/мл 32,73±1,30* 32,80 (31,4-34,0) 1,98

L. cichorioides 100 мкг/мл 38,47±1,92* 38,80 (36,4-40,2) 2,32

50 мкг/мл 31,67±1,60* 31,80 (30,0-33,2) 1,91

10 мкг/мл 29,07±2,14* 28,60 (27,2-31,4) 1,76

L. japónica 100 мкг/мл 35,20±2,75* 34,60 (28,2 -32,8) 2,12

50 мкг/мл 30,53±2,12* 30,20 (28,6-32,8) 1,84

10 мкг/мл 21,67±2,53** 22,60(18,8-23,6) 1,31

ex vivo

F. evanescens 1 5 мг/кг 34,93±4,0* 36,40 (30,40-38,0) 2,12

L. cichorioides' 5 мг/кг 38,19±2,75* 38,40 (35,8-41,2) 2,31

L.japónica1 5 мг/кг 31,14±2,77* 31,40 (28,8-34,2) 1,88

F. evanescens 5 мг/кг 50,60±2,31 * р '<0,05 50,80 (48,2-52,8) 3,05

L. cichorioides 5 мг/кг 44,74±2,0* 44,60 (42,8-46,8) 2,70

L. japónica1 5 мг/кг 39,92±2,38* 39,20 (38,0-42,6) 2,41

Контроль 16,54±0,70* 16,60(15,80-17,2)

Примечание: М±а - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; Me - медиана средних значенийи; LQ-UQ - нижний и верхний квартили; р — достоверность значений по сравнению с контролем, *р<0,001 и ** р<0,05 (T-test, критерий Стьюдента); ИС - индекс стимуляции по отношению к М; 1 - однократное введение фукоиданов; 2 - пятикратное введение фукоиданов; р ' — достоверность различий между сульфатированными полисахаридами..

При исследовании цитотоксической активности в системах in vitro и ex vivo (табл. 12) выявлено, что фукоиданы дозозависимо повышают уровень цитотоксичности спленоцитов по отношению к NK-чувствительной линии клеток К562. Наибольшим стимулирующим действием обладает полностью сульфатированный фукоидан из L cichorioides, в структуре которого отсутствуют моносахаридные фрагменты и ацетильные группы, но достоверное различие в его действии установлено только по отношению к фукоидану из L. japónica.

Цитологическое исследование показало, что активированные фукоиданами спленоциты вызывают лизис и деструкцию клеток К562, что свидетельствует об увеличении их цитотоксического потенциала (рис. 10).

Таблица 12. Цитотоксическая активность сульфатированных полисахаридов

Фукоиданы Цитотоксическая активность (ЦИ, %)

М±а Me (LQ-UQ) Р

in vitro

F. evanescens 100 мкг/мл 64,47±3,68* 64,34 (60,86-68,22) 0,000

50 мкг/мл 55,39±2,62* 55,46 (52,74-57,98) 0,000

10 мкг/мл 49,62±3,06* 49,48 (46,64-52,76) 0,001

L. cichorioides 100 мкг/мл 70,70±3,39* (р '<0,05) 70,32 (67,52-74,28) 0,000

50 мкг/мл 60,55±3,64* (р'<0,05) 60,46 (56,97-64,24) 0,000

10 мкг/мл 49,97±2,64* 49,12 (47,86-52,94) 0,000

L. japónica 100 мкг/мл 59,92±2,74* 60,42 (56,94-62,38) 0,000

50 мкг/мл 52,36±2,32* 52,18 (49,78-54,42) 0,000

10 мкг/мл 47,19±3,32* 47,36 (43,78-50,42) 0,002

ex vivo

F. evanescens 5 мг/кг 64,68±3,0* 64,38(61,84-67,82) 0,000

L. cichorioides' 5 мг/кг 67,95±2,70* 67, 57 (65,24-70,68) 0,000

L. japónica' 5 мг/кг 61,36±1,92* 61,12(59,58-63,38) 0,000

F. evanescens 2 5 мг/кг 75,30±2,81* 74,38 (73,08-78,46) 0,000

L. cichorioides* 5 мг/кг 77,95±3,18* (р'<0,05) 77,19(75,23-81,44) 0,000

L. japónica¿ 5 мг/кг 69,34±2,71* 69,57 (66,53-71,92) 0,000

Контроль 29,41 ±2,76* 28,64 (27,12-32,48)

Примечание: М±а - средняя арифметическая±стандартное отклонение; Me - медиана значений; LQ-UQ - нижний и верхний квартили; р - достоверность значений по сравнению с контролем, *р<0,001 (T-test, критерий Стьюдента); ЦИ - цитотоксический индекс; 1 - однократное введение фукоиданов; 2 -пятикратное введение; р' — достоверность значений между фукоиданами.

V л V f ,

А Б В Г Д

Рисунок 10. Цитотоксическая активность сульфатированных полисахаридов. Примечание: клетки эритробластного лейкоза К-562 до (А) и после (Б) добавления спленоцитов мышей; клетки линии К-562 с добавлением спленоцитов мышей при введении ex vivo фукоиданов из L. japónica (В), F. evanescens (Г) и L. cichorioides (Д); соотношение клеток мишень/эффектор 1:5; микрофотографии культурапьной взвеси сделаны с использованием системы AxioVision4 (ув. 400).

Противовирусная активность фукоидана из бурой водоросли L. japónica в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 in vitro

Важным критерием противовирусной активности препаратов является их способность непосредственно влиять на инфекционные свойства вирусов. Показано, что фукоидан из L. japónica в дозах от 500 до 2500 мкг/мл не вызывает цитодеструктивных

изменений клеток СПЭВ и обладает вируеингибирующим действием, достоверно снижая титр вируса гриппа птиц A/H5N1 на 3,0-4,0 lg ТЦИД50 по сравнению с контролем, в зависимости от времени предварительного взаимодействия с вирусом (табл. 13).

Таблица 13. Вирусингибирующее действие фукоидана из L. japónica в отношении

вируса гриппа птиц A/H5N1

Время экспозиции вируса с фукоиданом Титр вируса A/H5N1 (lg ТЦИД50/мл)

Контроль вируса Ме±а Фукоидан (500 мкг/мл) Р

Ме±а

0 мин. 8,0 ± 0,5 8,0 ±0,29 0,643

5 мин. 5,0±0,57 0,003

10 мин. 4,5±0,50 0,001

30 мин 4,0±0,29 0,000

Примечание: Ме±0 - медиана значений и стандартное квадратичное отклонение; р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем (Т-1е51, критерий Стьюдента).

Исследование противовирусной активности фукоидана из L. japónica на культуре клеток СПЭВ показало (табл. 14), что предварительное взаимодействие полисахарида с монослоем клеток за час до заражения высокопатогенным вариантом вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/02/05 H5N1 в дозе 0,1 ТЦИД50 снижает титр вируса на 2,5-3,0 lg ТЦИД5о по сравнению с контролем (7,0 lg), а при одномоментном введении - на 1,5-2,5 lg ТЦИД5о. Протективного действия фукоидана при введении через час после заражения клеток не выявлено. При инфицировании вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50 установлено, что преинкубация клеток с фукоиданом в течение часа полностью ингибирует инфекционную активность вируса по сравнению с контролем (6,5 lg ТЦИД50), при одновременном введении - титр вируса снижается на 2,0-3,0 lg ТЦИД50, а в высокой концентрации фукоидан подавляет развитие инфекции. Эффективность действия высокой концентрации фукоидана выявлена и через час после инфицирования клеток.

Учитывая, что для вируса гриппа птиц A/H5N1 существенным является распознавание рецепторов галактозы и сульфатированных рецепторов [А.С. Гамбарян, 2007], а фукоидан из L. japónica отличается высоким содержанием галактозы, мы полагаем, что его противовирусное действие реализуется за счет связывания с определенными мембранными рецепторами на клеточной поверхности и конкурентного углеводспецифического взаимодействия с гликопротеином вируса гриппа птиц A/H5N1.

Таблица 14. Противовирусная активность фукоидана из L. japónica в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1

Время введения фукоидана в культуру клеток СПЭВ Титр вируса гриппа птиц A/H5N1 (lg ТЦИД50/мл)

Доза вируса (ТЦИД50) Контроль вируса Ме±а Концентрация фукоидана мкг/мл

125 250 500 1000 2500

Ме±а Ме±а Ме±а Ме±ст Ме±а

За 1 час до инфицирования 0,1 7,0±0,57 7,0±0,29 4,5±0,57** 4,0±0,57** 4,0±0,5*** 4,0±0,0***

0,01 6,5±0,5 6,5±0,29 0*** 0*** 0*** Q***

В момент инфицирования од 7,0±0,57 6,5±0,5 6,0±0,29* 5,5±0,5* 4,5±0,5** 4,5±0,29***

0,01 6,5±0,5 6,5±0,5 6,5±0,29 4,5±0,57** 3,5±0,5** о***

Через 1 час после инфицирования 0,1 7,0±0,57 7,0±0,29 6,5±0,29 6,5±0,5 6,0±0,5* 6,0±0,0*

0,01 6,5±0,5 6,5±0,29 6,5±0,5 6,0±0,5 6,0±0,0 0***

Примечание: Ме±ст - медиана значений ± стандартное квадратичное отклонение; р - достоверность полученных значений по сравнению контролем (T-test, критерий Стьюдента); * - р<0,05; ** - р<0,01; ♦** - р<0,001.

Противовирусная активность фукоиданов из бурых водорослей при экспериментальной хантавирусной инфекции

Предварительный скрининг биополимеров из морских гидробионтов на чувствительной к хантавирусу культуре клеток Vero Е6 дал основание для изучения противовирусного действия сульфатированных полисахаридов бурых водорослей. Установлено, что наибольшим действием обладал фукоидан из L. japónica, снижавший титр вируса при предварительной обработке клеток Vero Е6 и непосредственном взаимодействии с вирусом на 2,0-3,0 lg ТКИД50 (р=0,001 и 0,004) по сравнению с контролем (5,0 lg). Действие фукоидана из L. cichorioides составило 2,0-2,5 lg (р=0,003 и 0,013), а фукоидана из К evanescens - 1,5-2,0 lg ТКИД50 (р=0,004 и 0,011) соответственно.

На модели перитонеальных Мф (табл. 15) предварительное взаимодействие фукоидана из L. japónica с вирусом в течение 30 мин. и 1 часа снижало количество инфицированных клеток в 7,09 и 10,64 раз, а при экспозиции с Мф - в 3,37 и 3,32 раза по сравнению с контролем. Фукоидан из L. cichorioides подавлял адсорбцию вируса в 3,97 и 6,4 раз, а при контакте с Мф - в 2,57 и 3,46 раза. Наименьшим действием обладал фукоидан из F. evanescens (в 2,7 и 3,48 раза и 1,69 и 2,32 раза соответственно).

Таблица 15. Ингибирующее действие фукоиданов на адсорбцию хантавируса

Фукоиданы (1000 мкг/мл) Контроль Макрофаги Вирус

М±ст (СКК/100 Мф) M±cj (СКК/100 Мф) М±а (СКК/100 Мф)

Предварительная экспозиция 30 минут

L. japónica 31,65±5,16 9,43±1,53 (р=0,002) 4,45±2,05 (р=0,001)

L. cichorioides 12,34±2,28 (р=0,004) 7,99±1,36(р=0,001)

F. evanescens 18,72±3,47 (р=0,022) 11,80±2,53 (р=0,004)

Предварительная экспозиция 1 час

L. japónica 26,02±3,87 7,85±1,51 (р=0,001) 2,77±0,81 (р=0,000)

L. cichorioides 7,52±3,03 (р=0,002) 4,08±1,37(р=0,000)

F. evanescens 11,21 ±4,77 (р=0,013) 7,48±3,50 (р=0,003)

Примечание: М±п - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента); СКК/100 Мф - среднее количество антигенсодержащих светящихся клеток наЮО макрофагов.

Учитывая полученные результаты, для дальнейшего исследования антиадсорбционного действия, в зависимости от дозы полисахарида и времени взаимодействия, мы выбрали фукоидан из L. japónica. Количество антигнсодержащих Мф оценивали по ярко зеленому люминесцентному свечению клеток.

Установлено, что противовирусная активность полисахарида зависит от концентрации и времени его действия в процессе периода адсорбции хантавируса на клетках-мишенях (табл. 16). Наибольшее; ингибирующее действие выявлено при взаимодействии фукоидана с Мф и вирусом в концентрации 1000 мкг/мл, что способствовало ингибированию адсорбции в 7,52±0,75 и 3,54±0,55 раза соответственно по сравнению с контролем.

Таблица 16. Изучение ингибирующего действия фукоидана из L.japonica

Время взаимодействия с фукоиданом Контроль (СКК/ЮО Мф) L.japonica (концентрация - мкг/мл)

100 500 1000

М±а М±а М±а М±а

Макрофаги 15 мин. 37,60±8,88 15,67±1,04 р = 0,013 15,28±4,41 р = 0,017 9,04±2,23 р = 0,006

30 мин. 27,97±4,03 12,52±3,42 р = 0,007 10,78±3,21 р = 0,004 8,42±2,63 р = 0,002

1 час 21,87±4,64 9,64±0,95 р = 0,012 7,73±1,29 р = 0,007 6,98±1,92 р = 0,006

Вирус 15 мин. 37,60±8,88 8,74±0,77 р = 0,003 5,79±1,33 р = 0,004 5,07±1,74 р = 0,003

30 мин. 27,97±4,03 7,87±4,46 р = 0,004 5,02±2,42 р = 0,001 3,36±1,18 р = 0,000

1 час 21,87±4,64 6,34±3,41 р = 0,009 4,53±1,76 р = 0,003 3,20±1,91 р = 0,002

Примечание: М±о — средняя арифметическая ± стандартное отклонение; р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента); СКК/ЮО Мф - среднее количество антигенсодержащих светящихся клеток наЮО макрофагов.

Несмотря на то, что у инфицированных животных отмечается бессимптомное течение хантавирусной инфекции с длительной персистенцией вируса, представляло интерес изучить в динамике действие фукоиданов на инфекционный процесс. Установлено, что на начальном этапе инфекционного процесса фукоиданы из L. japónica и L. cichorioides способствуют снижению количества инфицированных Мф в 5,7 и 3,15 раза, а действие фукоидана из F. evanescens было не эффективно (табл. 17).

Выраженное ингибирующее действие всех полисахаридов выявлено через 4-6 часов после заражения. Так, фукоидан из L. japónica снижал количество инфицированных Мф в среднем в 2,2 раза, а фукоиданы из L. cichorioides и F. evanescens - в 1,64 и 1,5 раза. Результаты исследования инфекционного процесса в период выраженной виремии (с 7 по 21 день) показали, что фукоиданы из L. japónica и L. cichorioides способствуют снижению инфицированных Мф в среднем в 2,3 и 1,7 раза

соответственно, тогда как фукоидан из F. evanescens оказывает протективное действие только на 10 и 14 день (в 1,6 раз). В отдаленные сроки развития инфекции (на 35 день), снижение инфицированных Мф под действием фукоиданов из L. japónica и L. cichorioides составило 1,5 раза, а из F. evanescens - 1,2 раза по сравнению с контролем.

Таблица 17. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на показатель инфицирования макрофагов при хантавирусной инфекции

Время с момента инфицирования Контроль L. japónica L. cichorioides F. evanescens

Количество антигенсодержащих макрофагов (М±а)

30 минут 57,10±3,64 10,07±2,28* р=0,000 18,12±2,78* р=0,000 53,98±3,39 р=0,349

1 час 49,0±5,09 25,94±4,48* р=0,004 47,24±4,91 р=0,667 53,30±4,95 р=0,365

2 часа 16,25±2,68 11,00±2,30 р=0,062 19,27±3,15 р=0,271 10,34±2,43 р=0,047

4 часа 61,00±5,57 25,28±4,31* р=0,000 39,98±4,92* р=0,008 39,20±3,96* р=0,005

6 часов 50,24±3,68 26,32±3,19* р=0,001 28,45±3,52* р=0,002 36,16±3,62* р=0,009

24 часа 33,30±3,79 33,00±3,28 р=0,922 52,24±4,27* р=0,004 47,98±4,0* р=0,009

72 часа 24,10±4,37 19,98±4,04 р=0,307 21,12±4,13 р=0,445 27,00±4,42 р=0,461

7 дней 54,03±4,15 39,98±3,73* р=0,012 43,03±3,84* р=0,028 42,17±3,71* р=0,021

10 дней 59,00±4,95 20,50±4,0* р=0,000 33,38±4,76* р=0,003 33,44±4,73* р=0,002

14 дней 50,43±5,00 28,34±4,55* р=0,005 25,72±4,33* р=0,003 33,63±4,79* р=0,013

21 день 23,54±4,28 10,20±3,00* р=0,011 16,19±3,75 р=0,089 30,27±4,62 р=0,137

35 дней 35,42±4,84 23,37±4,20* р=0,031 22,54±4,12* р=0,024 29,31±4,54 р=0,186

Примечание: М±о - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; *р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).

Таким образом, ингибирующее действие фукоиданов может быть связано как с конкурентам лиганд-рецепторным взаимодействием с гликопротеинами хантавируса, так и за счет связывания с мембранными рецепторами Мф, что приводит к конформационным изменениям и является препятствием для адсорбции и пенетрации

хантавируса в клетки. Высокая противовирусная активность фукоиданов в разгар инфекционного процесса, по-видимому, связана с их иммуномодулирующим действием.

Следует отметить, что наибольшей противовирусной активностью обладают частично ацетилированнй фукоидан из L. japónica и полностью сульфатированный фукоидан из L. cichorioides, которые являются 1 -»З-а-Ь-фуканами. Фукоидан из F. evanescens отличается по типу связи между остатками фукозы и является низкосульфатированным, частично ацетилированным 1 —>3; 1 —>4-а-Ь-фуканом, что возможно оказывает влияние на противовирусную активность полисахарида.

Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов при экспериментальном клещевом энцефалите в системах in vitro и in vivo Результаты изучения противовирусной активности сульфатированных полисахаридов на культуре клеток СПЭВ, инфицированных высокопатогенным штаммом вируса клещевого энцефалита (КЭ) показали (табл. 18), что снижение титра вируса при предварительном взаимодействии в течение часа с фукоиданом из L. japónica в зависимости от концентрации составило от 4,7 до 3,0 lg ТЦИД50 по сравнению с контролем. Фукоидан из F. evanescens во всех исследуемых концентрациях способствовал снижению титра вируса на 4,7-4,0 lg ТЦИД50, а фукоидан из L. cichorioides только в дозе 1000 и 500 мкг/мл - на 3,0 lg. При предварительном взаимодействии клеток СПЭВ с фукоиданами из L. japónica и F. evanescens установлено, что полисахариды снижают титр вируса на 4,0 lg ТЦИД50 (1000 и 500 мкг/мл) и на 2,0 и 3,0 lg ТЦИД50 (100 мкг/мл). Снижение титра вируса под действием фукоидана из L. cichorioides составило 3,0 и 2,0 lg ТЦИД50 по сравнению с контролем.

Изучение способности полисахаридов защищать клетки СПЭВ от цитодеструктивного действия вируса КЭ (табл. 19) показало, что введение фукоиданов из F. evanescens и L. japónica через 1 час после инфицирования препятствовало развитию инфекционного процесса и снижало титр вируса на 4,0-3,0 lg по сравнению с контролем, а фукоидана из L. cichorioides на 1-2,0 lg.

Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей в системе in vitro обладают противовирусной активностью, способствуя статистически значимому ингибированию (Д>2 lg) цитодеструктивного действия вируса КЭ.

Таблица 18. Вирусингибирующее действие сульфатированных полисахаридов в отношении вируса клещевого энцефалита

Фукоиданы концентрация (мкг/мл) Титр вируса КЭ после предварительного взаимодействия с фукоиданами в течение 1 часа (Д, 1й ТЦД50/мл)

Вирус КЭ Культура клеток СПЭВ

М±а/Ме М±а/Ме

L. japónica 1000 мкг/мл 1,6±0,5*/2,0 (р=0,000) 2,0±1,0*2,0 (р=0,000)

500 мкг/мл 1,6±0,5*/2,0 (р=0,000) 2,3±0,3*/2,0 (р=0,001)

100 мкг/мл 3,3±0,5*/3,0 (р=0,003) 4,0±1,0*/4,0 (р=0,025)

L. cichorioides 1000 мкг/мл 3,0±1,0*/3,0 (р=0,007) 3,3±0,5*/3,0 (р=0,003)

500 мкг/мл 3,3±0,5*/3,0 (р=0,003) 3,3±0,5*/3,0 (р=0,003)

100 мкг/мл 5,3±0,5/5,0 (р=0,101) 4,0±1,0*/4,0 (р=0,025)

F. evanescens 1000 мкг/мл 1,6±0,5*/2,0 (р=0,000) 2,0±0,0*/2,0 (р=0,000)

500 мкг/мл 2,0±0,0*/2,0 (р=0,000) 2,0±1,0*/2,0 (р=0,003)

100 мкг/мл 2,3±0,5*/2,0 (р=0,001) 3,3±0,5*/3,0 (р=0,003)

Контроль 6,3±0,5/6,0

Примечание: М±а - средняя арифметическая ± среднее квадратичное отклонение; Me - медиана значений; *р - достоверность значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).

Таблица 19. Протективное действие сульфатированных полисахаридов в отношении вируса клещевого энцефалита через 1 час после инфицирования культуры клеток СПЭВ

Фукоиданы Титр вируса КЭ (Д, lg ТЦИД50/мл)

М±с/Ме

L. japónica 1000 мкг/мл 2,33±0,57*/2,0 (р=0,001)

500 мкг/мл 2,66±0,57*/3,0 (р=0,001)

100 мкг/мл 3,0±0,0*/3,0 (р=0,000)

L. cichorioides 1000 мкг/мл 3,66±0,57*/4,0 (р=0,005)

500 мкг/мл 4,33±1,0*/5,0 (р=0,013)

100 мкг/мл 5,33±0,57/5,0 (р=0,116)

F. evanescens 1000 мкг/мл 1,6±1,0*/2,0 (р=0,000)

500 мкг/мл 2,33±0,57*/2,0 (р=0,001)

100 мкг/мл 2,66±0,57*/3,0 (р=0,001)

Контроль вируса КЭ 6,3±0,5/6,0

Примечание: М±а - средняя арифметическая ± среднее квадратичное отклонение; Me - медиана значений; *р - достоверность значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).

Исследование противовирусной активности фукоиданов при экспериментальном КЭ мышей показало, что летальность животных в контрольной группе зараженной вирусом (10 LD50) на 11 день эксперимента составила 100%, а СПЖ=9,98 дней.

При изучении протективного действия фукоидана из L. japónica (табл. 20)

установлено, что 3-х и 5-кратное внутримышечное введение полисахарида в дозе 20 мг/кг через 1 час после инфицирования (лечебная схема), способствовало 20 и 30% выживаемости животных (а=0,045 и 0,041 соответственно), СПЖ=12,16 и 12,24 дней, а увеличение СПЖ (УСПЖ) составило 20,83%. Однократное введение фукоидана было не эффективным

При профилактической схеме введения фукоидана из L. japónica за 24 часа до инфицирования вирусом КЭ протективный эффект наблюдался в дозе 5 мг/кг. Однократное введение фукоидана способствовало 20% (а=0,044) выживаемости (СПЖ=12,7 дней, УСПЖ - 27,25%), а пятикратное введение - 30% (а=0,038) выживаемости животных (СПЖ=12,6 дней, УСПЖ=26,2%). В дозе 20 мг/кг фукоидан не оказывал защитного действия.

Исследование фукоидана из F. evanescens показало (табл. 21), что многократное введение полисахарида по лечебной схеме способствовало достоверной выживаемости животных на протяжении всего эксперимента. Так, 3-кратное введение полисахарида в дозе 20 мг/кг обеспечивало 40% (а=0,032) выживаемость (СПЖ=13,34 дней, УСПЖ=33,67%), а 5-кратное введение в дозе 5 и 20 мг/кг способствовало 30 и 40% (а=0,041 и 0,048) выживаемости (СПЖ=12,86 и 12,44 дней, а УСПЖ - 28,86 и 24,65% соответственно). Введение фукоидана в течение 10 дней было менее эффективным.

При профилактической схеме установлено, что обе схемы введения фукоидана из F. evanescens в дозе 5 мг/кг способствовали 40 и 30% (а=0,025 и 0,049) выживаемости животных (СПЖ=13,16 и 12,33 дней, УСПЖ=31,86 и 23,55%), а в дозе 20 мг/кг только многократное введение фукоидана способствовало 20% выживаемости мышей (СПЖ=12,16 дней и УСПЖ=21,84%).

В аналогичных исследованиях фукоидан из L. cichorioides не защищал инфицированных животных от цитодеструктивного действия вируса КЭ.

Следует отметить, что противовирусная активность фукоидана из F. evanescens была сопоставима с действием циклоферона, введение которого по лечебной схеме в концентрации 6 и 60 мг/кг способствовало 30 и 40% (а=0,039 и 0,012) выживаемости мышей (СПЖ=12,53 и 14,34 дней, УСПЖ=27,45 и 43,69%). Профилактическая схема введения показала, что только в концентрации 60,0 мг/кг препарат способствовал 30% (а=0,031) выживаемости животных (СПЖ=12,23 дня, УСПЖ=22,45%).

Протективное действие исследуемых фукоиданов установлено и при инфицировании животных меньшей дозой вируса КЭ. Летальность мышей в контрольной группе зараженной вирусом КЭ (5 LD50) к окончанию эксперимента составила 60%, а СПЖ=13,07 дней. Наибольшей противовирусной активностью обладал фукоидан из F. evanescens, который при введении по лечебной и профилактической схемам способствовал 90% выживаемости животных (СПЖ в среднем составила 18,9±3,07 и 19,05±0,22 дней, а УСПЖ - 44,61±3,87 и 45,75±1,73%).

При введении фукоидана из L. japónica эффективным было многократное введение полисахарида, что способствовало до 80% выживаемости животных (СПЖ в среднем составила 18,4±0,27 и 18,3±0,32 дней, а УСПЖ - 40,81±2,06 и 40,0±2,46%). Однократное введение было менее эффективным. Фукоидан из L. cichorioides только при многократном введении в концентрации 20 мг/кг оказывал протективное действие, (СПЖ=18,0±0,5 и 18,04±0,22 дней, а УСПЖ - 37,75±3,84 и 38,02±0,44%).

Мы полагаем, что противовирусная активность фукоиданов в системе in vitro при экспериментальном КЭ обусловлена конкурентным углевод-специфическим взаимодействием с гликопротеином вируса и рецепторами клеток, что препятствует адсорбции и слиянию клеточной и вирусной мембран, а в системе ex vivo -непосредственно и с активацией факторов врожденного и адаптивного иммунитета, способствующих формированию защиты у инфицированных животных.

Следует отметить, что наибольшим действием в отношении вируса КЭ обладают частично ацетилированные фукоиданы из F. evanescens и L. japónica, которые различаются по типу связи и моносахаридному составу. Возможно, что низкая противовирусная активность полностью сульфатированного фукоидана из L. cichorioides связана с отсутствием ацетильных групп, моносахаридных фрагментов и высокой молекулярной массой.

Таким образом, на трех экспериментальных вирусных инфекциях показано, что противовирусная активность сульфатированных полисахаридов бурых водорослей зависит от химического строения, совокупности факторов патогенности возбудителей, процессов их взаимодействия с клетками-мишенями и инфицирующей дозы вируса.

Таблица 20. Протективиое действия фукоидана из L. japónica при экспериментальном клещевом энцефалите

-t. u>

Фукоидан Выживаемость СПЖ(М±а) Лоранговый критерий - Z

Доза и кратность введения %±а

Лечебная схема

1- кратно 5 мг/кг 10±5,7 11,83±0,19; р=0,005* 2=1,555; а=0,121

1- кратно 20 мг/кг 10±5,7 11,39±0,32;р=0,017* Z=l,038; а=0,300

3-кратно 5 мг/кг 10±0 11,37±0,38; р=0,022* Z=l,315; а=0,189

3-кратно 20 мг/кг 20±0 12,16±0,36; р=0,004* Z=2,014; а=0,045**

5-кратно 5 мг/кг 10±5,7 11,59±0,81;р=0,046* Z=l,214; а=0,225

5-кратно 20 мг/кг 30±5,7 12,24±0,20; р=0,002* Z=2,051; а=0,041**

10-кратно 5 мг/кг 0±0 10,44±0,52; р=0,352 Z=0,350; а=0,726

L. japónica 10-кратно 20 мг/кг 20±5,7 11,74±0,67; р=0,024* Z=l,108; а=0,268

Профилактическая схема

1-кратно 5 мг/кг 20±5,7 12,70±0,68; р=0,005* Z=2,018; а=0,044**

1-кратно 20 мг/кг 0±0 10,78±0,14; р=0,067 Z=0,622; а=0,534

5-кратно 5 мг/кг 30±5,7 12,60±0,32; р=0,002* Z=2,075; а=0,038**

5-кратно 20 мг/кг 10±0 11,23±0,35; р=0,028* Z=l,101; а=0,271

10-кратно 5 мг/кг 20±5,7 11,97±0,64; р=0,014* Z=1,094; а=0,274

10-кратно 20 мг/кг 10±5,7 11,08±0,31; р=0,037* Z=0,711; а=0,477

Контроль (¡Cí'-'lg, 10 LD5O/0,2 мл) 0 0±0

Примечание: М — средняя арифметическая; а - стандартное отклонение; СПЖ — средняя продложительность жизни животных; *р — достоверность полученных значений СПЖ по сравнению с контролем (Т-1ез1, критерий Стьюдента); 7. - лоранговый критерий выживаемости с поправкой Иейтса (>1,960); **а- уровень достоверности различий между опытом и контролем (<0,05) при сравнении кривых выживаемости по С. Гланцу.

Таблица 21. Протективное действие фукоидана из F. evanescens при экспериментальном клещевом энцефалите

Фукоидан Доза и кратность введения Выживаемость %±а СПЖ(М±а) Лоранговый критерий - Z

Лечебная схема

1- кратно 5 мг/кг 10±5,7 10,94±0,56; р=0,100 Z =0,362; а=0,718

1- кратно 20 мг/кг 0±0 10,47±0,81; р=0,431 Z =0,374; а=0,709

3-кратно 5 мг/кг 20±0 11,54±0,60; р=0,03* Z=l,213; а=0,226

3-кратно 20 мг/кг 40±5,7 13,34±0,35; р=0,000* Z=2,151; а=0,032**

5-кратно 5 мг/кг 30±5,7 12,86±0,30; р=0,001* Z=2,051; а=0,041**

5-кратно 20 мг/кг 30±5,7 12,44±0,49; р=0,004* Z=l,983; а=0,048**

10-кратно 5 мг/кг 10±0 10,97±0,53; р=0,085 Z=0,803; а=0,423

F. evanescens 10-кратно 20 мг/кг 20±0 12,00±0,35; р=0,005* Z=1,792; а=0,074

Профилактическая схема

1-кратно 5 мг/кг 40±5,7 13,16±0,42; р=0,001* Z=2,248; а=0,025**

1-кратно 20 мг/кг 10±0 11,32±0,61; р=0,046* 2=0,871; а=0,384

5-кратно 5 мг/кг 30±5,7 12,33±0,47; р=0,005* ^=1,976; а=0,049**

5-кратно 20 мг/кг 20±0 12,16±0,49; р=0,007* Z=1,494; а=0,136

10-кратно 5 мг/кг 10±0 11,42±0,68; р=0,045* Z= 1,094; а=0,274

10-кратно 20 мг/кг 20 12,10±0,72; р=0,015* Z= 1,461; а=0,145

Контроль (Ю'-Чя, 10Ю5(/0,2мл) 0±0 0±0 -

Примечание: М - средняя арифметическая; а - стандартное отклонение; СПЖ - средняя продложительность жизни животных; *р - достоверность полученных значений СПЖ по сравнению с контролем (Т-1ей, критерий Стъюдента); Ъ - лоранговый критерий выживаемости с поправкой Иейтса (>1,960); **а - уровень достоверности различий между опытом и контролем (<0,05) при сравнении кривых выживаемости по С. Гланцу.

В свете современных представлений о врожденном иммунитете, полученные результаты диссертационной работы свидетельствуют о том, что сульфатированные полисахариды бурых водорослей индуцируют генетически детерминированные биохимические процессы, направленные на активацию эффекторных функций врожденного иммунитета и формирование развития адаптивного иммунного ответа (рис.11). Изучение и установление связи между структурой и функцией фукоиданов, определение специфических рецепторов для них на клетках иммунной системы способствуют детальному пониманию аспектов механизма их действия, и создает основу для создания новых иммунобиологических препаратов - модификаторов функций врожденного иммунитета, способствующих формированию защиты организма против патогенов различных таксономических групп.

Рисунок 11. Алгоритм механизмов активации клеток-эффекторов врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей.

Выводы

1. Комплексное изучение на молекулярном и клеточном уровнях различных по химической структуре фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica раскрывает механизмы активации системы врожденного иммунитета и является экспериментальным обоснованием возможности конструирования на их основе новых фармакологических субстанций и лекарственных препаратов.

2. Различные по химической структуре сульфатированные полисахариды бурых водорослей являются лигандами То11-рецепторов, о чем свидетельствуют:

- увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на дендритных клетках и мононуклеарных лейкоцитах селезенки мышей;

- активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB через МуБ88-зависимый путь и адаптерную пару TRIF/TRAM при специфическом взаимодействии с TLR-2, TLR-2/6 и TLR-4 человека;

отсутствие токсического действия и содержания эндотоксинов грамотрицательных бактерий в структуре фукоиданов является подтверждением специфического лигандрецепторного взаимодействия с TLRs.

3. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей являются индукторами созревания дендритных клеток, о чем свидетельствуют иммунофенотипические и морфлологические характеристики:

- ДК, генерированные из костного мозга мышей, характеризуются фенотипом: CD34"/+, CD38+, CD11с+, CD40+, CD86+, CD83+, МНС II+, F4/80; ДК, генерированные из моноцитов периферической крови человека: CD34"/+, CD14"/+, CD83+, CD1 lc+, HLA-DR+;

- созревшие ДК имеют округлую неправильную форму с эксцентрично расположенным ядром, вакуализированную цитоплазму, многочисленные цитоплазматические псевдоподии разнообразной формы по сравнению с незрелыми ДК.

4. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей усиливают продукцию созревшими дендритными клетками иммунорегуляторного (IL-12) и провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-6, TNF-a), экспрессию костимулирующих и антигенпредставлющих молекул, что является необходимым условием для активации и дифференцировки Т-лимфоцитов.

5. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют активации гемопоэза, выраженной макрофагальной реакции и пролиферации лимфоидных клеток в первичных и вторичных органах иммуногенеза.

6. Изменение субпопуляционного состава мононкулеарных лейкоцитов селезенки мышей под действием фукоиданов (экспрессия CD 19, NK, NKT, CD25, МНС II, TCR, TLR-2, TLR-4), увеличение пролиферативной и цитотоксической активностей, продукции цитокинов (IL-2, IL-12, IL-6, IFNy, TNF-a) в системах in vitro и ex vivo свидетельствуют о процессах дифференцировки и активации эффекторных механизмов врожденного иммунитета и развитии адаптивного иммунного ответа по Thl типу.

7. При экспериментальных вирусных инфекциях (хантавирусная инфекция, клещевой энцефалит, грипп птиц) установлена противовирусная активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japónica, и показана связь их протективного действия с химической структурой:

установлено вирусингибирующее и протективное действие частично ацетилированного сульфатированного полисахарида из L. japónica, который отличается высоким содержанием галактозы, в отношении высокопатогенного варианта вируса гриппа птиц A/H5N1 распознающим рецепторы галактозы и сульфатированные рецепторы, что обеспечивает конкурентное углеводспецифическое взамодействие;

- на модели экспериментальной хантавирусной инфекции в системах in vitro и ex vivo показано, что фукоиданы различаются по степени ингибирующего действия на процесс адсорбции и развитие инфекционного процесса, наибольшей противовирусной активностью обладают сульфатированные полисахариды из L. japónica и L. cichorioides, которые являются 1-»3-а-Ь-фуканами.

- установлена вирусингибирующая активность и протективное действие фукоиданов при экспериментальном клещевом энцефалите, наиболее выраженное у частично ацетилированных, низкомолекулярных фукоиданов из F. evanescens и L. japónica, которые различаются по типу связи и моносахаридному составу.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активация эффекторных функций нейтрофилов биополимерами морских гидробионтов /Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д.. Гажа А.К., Кузнецова Т.А. Молчанова В.Н., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Эпштейн JI.M. // Медицинская иммунология. - 2003. - Том 5. - № 1-2. - С.149-156.

2. Study of marine polysaccharides effect to Hantaan virus adsorbtion / Kompanets G., Makarenkova I., Zvyagintceva Т., Zaporozhets T. //2004 International Symposium on Marine Drugs (ISMD 2004). - Proceedings 18-22 October 2004, Qingdao, China. - P..121.

3. Влияние полисахаридов морского происхождения на адсорбцию Хантавирусов in vitro / Компанец Г.Г., Макаренкова И.Д. //Тезисы докладов IV научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае», г. Владивосток. - 2004 г. -С. 90-91.

4. Study of effect of brown algae Fucoidans of Hantaan virus adsorbtion in vitro / Makarenkova I.. Kompanets G., Zvyagintceva T. //The 6Ш International Conference on Hantaviruses (HFRS and HPS). - 23-25.06.2004. - Seoul. Korea. - P. 106.

5. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических клетках / Макаренкова И.Д.. Компанец Г.Г., Запорожец Т.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3. - С. 121-125.

6. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияющих на адсорбцию вируса Хантаан / Макаренкова И.Д.. Компанец Г.Г., Беседнова H.H., Слонова P.A., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. // Вопросы вирусологии. - 2007. - № 2. - С. 29-32.

7. Ингибирующее действие фукоиданов на адсорбцию вируса Хантаан на модели перитонеальных макрофагов / Макаренкова И.Д.. Компанец Г.Г., Беседнова H.H., Шевченко Н.М. Звягинцева Т.Н. // Вопросы вирусологии. - 2008. - № 3. - С. 12-15.

8. Влияние сульфатированных полисахаридов из морских бурых водорослей на функциональную активность дендритных клеток, костномозгового происхождения / Макаренкова И.Д.. Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Беседнова H.H. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - № 2-3. - С. 122.

9. Противовирусная активность фукоиданов природного происхождения при экспериментальной инфекции, вызванной хантавирусом / Максема И.Г., Макаренкова И.Д. //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - № 2. - С. 86-89.

10. Антивирусное действие сульфатированных полисахаридов / Макаренкова И.Д., Беседнова H.H., Запорожец Т.С. // Антибиотики и химиотерапия. - Т.54. - № I-2. - 2009. - С. 56-62.

11. Антивирусное действие фукоидана из морской бурой водоросли L. japónica на вирус гриппа H5N1 in vitro / Макаренкова И.Д.. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Беседнова H.H., Звягинцева Т.Н.//Материалы международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней». 114-15 мая 2009 г. Новосибирск, Россия. С. 251-254.

12. Сульфатированные полисахариды из морских бурых водорослей - индукторы созревания дендритных клеток / Макаренкова И.Д.. Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Беседнова H.H., Звягинцева Т.Н. //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 3. - С. 36-39.

13. Протективное действие фукоидана из морской бурой водоросли L. japónica при экспериментальном клещевом энцефалите / Макаренкова И.Д.. Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Беседнова H.H., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 3. - С. 83-86.

14. Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой водоросли Laminaria japónica в отношении инфекции культур клеток, вызванной вирусом гриппа А птиц (H5N1) / Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г., Львов Д.К., Звягинцева Т.Н., Беседнова H.H. // Вопросы вирусологии. - 2010. - №1. - С. 41-45.

15. Продукция цитокииов дендритными клетками костного мозга мышей под воздействием сульфатированных полисахаридов из морских бурых водорослей / Макаренкова И.Д.. Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2010.

- № 5. - С. 34-39.

16. Биологически-активные вещества из морских гидробионтов - источник новых фармакологических субстанций и лекарств / Беседнова Н.Н., Крыжановский С.П., Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д. // Пробл. стандартизации в здравоохранении. -2011,- №9-10,- С. 27-33.

17. Исследование взаимодействия фукоиданов бупых водорослей с Толл-подобными рецепторами in vitro / Макаренкова И.Д., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Семенова И.Б., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П.// FAMILY HEALTH IN THE XXI CENTURE. Procceedings of the XV International Scientific Conference. Part II. Torremolinos (Spain) - Perm (Russia)/ - 2011. - P. 44-45.

18. Сульфатированные полисахариды водорослей - модификаторы функций врожденного иммунитета при бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях / Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. // Успехи современной биологии. - 2011.-Т. 131,- № 5. - С. 503-517.

19. Sulfated Polysaccharides of Brown Seaweeds are Ligands of Toll-Like Receptors / Makarenkova I.D.. Logunov D.Yu., Tukhvatulin A.I., Semenova I.B., Zvyagintseva T.N., Gorbach V.I., Ermakova S.P., Besednova N.N. // Biomedical Chemistry. - 2012. - Vol. 6. -№ l.-P. 75 80.

20. Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей при экспериментальном клещевом энцефалите: связь структуры и функции / Макаренкова И.Д.. Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Звягинцева Т.Н., Имбс Т.И., Ермакова С. П., Беседнова Н.Н. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - №1.

- С-61-63.

21 Изучение лиганд-рецепторного взаимодействия фукоиданов бурых водорослей с Толл-подобными рецепторами in vitro / Макаренкова И.Д.. Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Горбач В.И., Ермакова С.П., Беседнова Н.Н.//Сборник статей и тезисов X Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» г. Владивосток. - 2012 г. - С.66.

22. Anti-Inflammatory effects of sulfated polysaccharides Extracted from Brown Algae / Besednova N.N., Zaporozhets T.S., Makarenova I.D., Kuznetsova T.A., Kryzhanoskii S.P., Zvyagintseva T.N., Mel'nikov V.G. // Biology Bulletin Reviews. - 2012. - Vol. 2. - № 6. - P. 525 532.

23. Исследование пролиферативной и цитотоксической активности фукоиданов из бурых водорослей in vitro / Макаренкова И.Д., Семенова И.Б., Ахматова Н.К., ЗвягинцеваТ.Н., Ермакова С.П. // Международный журнал экспериментального образования. - 2012. - №6. - С. 16-17.

24. Interactions between sulfated polysaccharides from sea brown algae and Toll-like receptors on HEK293 eukaryotic cells in vitro / Makarenkova I.D.. Logunov D.Y., Tukhvatulin A.I., Semenova I.B., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N.//Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2012. - Vol. 154. - № 2. - P. 241-244.

25. Влияние фукоиданов из бурых водорослей на созревание дендритных клеток, генерированных из моноцитов периферической крови in vitro / Макаренкова И.Д.,

Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Беееднова H.H. // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т.6 (14). - №3 (1). - С.105-106.

26. Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей на пролиферативную и цитотоксическую активность спленоцитов мышей / Макаренкова И.Д., Семенова И.Б., Ахматова Н.К., Беееднова H.H., Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - №6. - С.6В-75.

27. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на динамику продукции цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА /Макаренкова И.Д. // Цитокины и воспаление. - 2012. - Т. 11. - № 4. - С.34-41.

28. Патент - «Средство, обладающее противовирусной активностью». Патент РФ № 2304443 от 20.08.2007. Авторы: Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беееднова H.H., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. Заявители и патентообладатели: Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. Per. № заявки 2006100574/15. Заявл. 10.01.2006. 0публ.20.08.2007. Бюлл. № 23.

Список сокращений

кДа - килодальтон - единица массы ЛПС - липополисахарид МЛ - мононуклеарные лейкоциты М.м. - молекулярная масса

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-1,5-дифенилтетразолия бромид Мф - макрофаги

ТЦИД50 - 50% инфекционная доза в тканевой культуре

CD - (cell differentiation antigen), антигены кластеров дифференцировки клеток GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор HLA-DR - (human leukocyte antigens), антигены лейкоцитов человека IFN - (interferon), интерферон IL - (interleukin), интерлейкин

LD50 - (lethal dose, 50%), полулетальная средняя доза, или доза вызывающая гибель половины испытуемой группы животных

МНС - (major histocompability complex), главный комплекс гистосовместимости NF-kB - (nuclear fator-kB), транскрипционный ядерный фактор NKT - Т-лимфоциты с функцией натуральных киллерных клеток

РАМР - (pathogen associated molecular pattern), патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (структуры)

TCR - (T-cell receptor), Т- клеточный рецептор

TNF - (tumor necrosis factor), фактор некроза опухолей

TGF - трансформирующий фактор роста

Th-1 и Th-2 - (T-helper-1 и 2), субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов (хелперов)

МАКАРЕНКОВА ИЛОНА ДАМИРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА СУЛЬФАТИРОВАННЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Зак. № 72п. Формат 60x84 '/,6. Усл. п. л. 2, 0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 11. 11.2013г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор». 690150, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50 тел.: (423) 232-70-49, 232-78-17 e-mail: press-dpr@rambler.ru, press-opz@rambler.ru