Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Репрограммирование клеточных ответов макрофагов: новая стратегия управления воспалительным процессом

На правах рукописи

МАЛЫШЕВА ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА

РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ОТВЕТОВ МАКРОФАГОВ: НОВАЯ СТРАТЕГИЯ УПРАВЛЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ПРОЦЕССОМ

14 00 16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2007

003066090

Работа выполнена в Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Александр Григорьевич Румянцев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Войнов Владимир Антипович, ГОУ ВПО ММА им И М Сеченова Росздрава

доктор медицинских наук, профессор Демуров Евгений Аркадьевич, ГОУ ВПО РУДН, Федеральное агентство по образованию

доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Автореферат разослан " "_2007 года

Защита диссертации состоится " "_2007 года в 14 часов.на заседании

Диссертационного совета Д208.040 08 в ГОУ ВПО ММА им И М Сеченова по адресу 119991, Москва, ул Трубецкая д 8 , строение 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им И М Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект 49)

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Профессор, д м н Миронов Андрей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Воспалительные реакции организма играют исключительно важную роль в развитии большого количества патологических состояний и серьезных социально значимых заболеваний, таких как сепсис, атеросклероз, диабет, злокачественные новообразования, ишемические повреждения сердца и нейродегенеративные нарушения функций мозга В связи с этим, понимание молекулярных и клеточных механизмов воспалительной реакции и возможности ее модулирования является одной из фундаментальных проблем современной биологии и медицины

Актуальность данной работы определяется тем, что она посвящена изучению основного клеточного звена воспалительной реакции - макрофагов, и репрограмированию их воспалительных, стрессорных и апоптотических/некротических ответов

Макрофаги играют центральную регуляторную роль в инициации и развитии воспалительных реакций организма Это обусловлено способностью макрофагов воспринимать ничтожно малые количества патогенных бактериальных и вирусных продуктов как сигнал к активации Активированные макрофаги продуцируют свободные кислородные радикалы, оксид азота (NO), цитокины, кемокины и другие медиаторы воспаления Благодаря этому макрофаги обезвреживают патогенные бактерии и запускают каскад иммунных реакций, определяющих специфику врожденного и адаптивного иммунных ответов организма В зависимости от типа и количества действующего инфицирующего фактора, интактные макрофаги альтернативно приобретают специфический функциональный фенотип провоспалительный или анти-воспалительный Провоспалительный функциональный фенотип характеризуется усиленной продукцией провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 (IL-1), IL-12, и фактор некроза опухолей-а (TNF-а) Антивоспалительный функциональный фенотип характеризуется сниженной продукцией провоспалительных цитокинов и усиленной продукцией NO и анти-воспалительных цитокинов, таких как IL-10 Процесс трансформации функциональный фенотипа макрофагов был обозначен термином «репрограммирование» (Zhang et al,

В фокусе воспаления макрофаги функционируют в неблагоприятных условиях Для того чтобы противостоять токсическим эффектам, свободных радикалов, бактериальных продуктов (таких как липополисахариды (ЛПС), цитокинов, и гипертермии, сопровождающей воспаление, макрофаги активируют самозащитный стресс-ответ (Knight, 2000, Ishn, et al, 1999) Ключевым компонентом стресс-ответа являются белки теплового шока HSP70 (Bachelet, et al, 1998) Однако длительное время жизни макрофагов и избыточная продукция медиаторов воспаления может инициировать развитие

1993)

разных заболеваний Для ограничения избыточного воспалительного ответа в макрофагах активируется апоптоз/некроз В регуляции стресс-ответа (Malyshev et al, 1999) и апоптоз/некроза (Albina et al, 1993) важную роль играет NO

Баланс между защитным стресс-ответом и апоптоз/некрозом определяет время жизни макрофагов и соответственно длительность их секреторной активности На начальных стадиях развития иммунного ответа, популяция макрофагов в организме неоднородна Она может состоять из макрофагов интактного, провоспалительного и антивоспалительного фенотипов Не исключено, что изменение баланса «стресс-ответ - апоптоз/некроз» в провоспалительных и антивоспалительных макрофагах играет важную роль в выборе между провоспалительным или антивоспалительным направлением суммарной активности всей популяции макрофагов, и, следовательно, развитием или предупреждением большого количества заболеваний Однако важный вопрос о специфике баланса «стресс-ответ - апоптоз/некроз» в разных фенотипах макрофагов не изучен

Клеточные ответы макрофагов контролируются NO В макрофагах, NO синтезируется индуцибельной NO-синтазой (iNOS) в цитоплазме и свободно проникает через клеточные мембраны, взаимодействуя на своем пути с различными биологическими структурами как внутриклеточными, так и внеклеточными Соответственно, можно предположить, что NO может проявлять различные эффекты на клеточные ответы в зависимости от того, на какие преимущественно мишени внеклеточные и на поверхности клеток или внутриклеточные он действует Однако и этот важный вопрос NO-зависимой регуляции воспалительной реакции макрофагов и других клеточных ответов также не изучен

Неадекватный воспалительный ответ является главным первоначальным звеном в развитии легочного саркоидоза, ревматоидного артрита и других болезней Воспалительная реакция всей популяции макрофагов зависит от соотношения в ней провоспалительных и антивоспалительных макрофагов В соответствии с этим, оценка фенотипа макрофагов вовлеченных в воспалительный процесс и возможность модулирования секреторной активности всей популяции макрофагов с помощью избирательной гибели конкретного «патогенного» фенотипа могло бы иметь большое научное и клиническое значение Однако эти вопросы до последнего времени также не были изучены

Обозначенные выше открытые вопросы регуляции воспалительной реакции ограничивают наше понимание развития иммунного ответа в целом и возможности коррекции неадекватного воспаления при развитии широкого спектра заболеваний

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования состояла в изучении стрессорных и апоптотических/некротических ответов разных фенотипов макрофагов, NO-зависимой регуляции этих клеточных ответов и возможности направленного модулирования воспалительной реакции макрофагов у больных людей

В рамках этой цели решались следующие основные задачи

1 Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз, индуцируемый ЛПС в интактном, про- и антивоспалительном фенотипах макрофагов,

2 Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз, индуцируемый S aureus в разных фенотипах макрофагов,

3 Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз, индуцируемый физическим фактором (тепловой шок) в интактном, про- и антивоспалительном фенотипах макрофагов,

4 Изучить роль внутри- и внеклеточного NO в стресс- и апоптоз/некроз-ответах разных фенотипов макрофагов при действии биологических (ЛПС и S aureus) или физических (тепловой шок) факторов,

5 Изучить возможности избирательного модулирования стресс-ответа и апоптоз/некроза в разных фенотипах мышиных макрофагов,

6 Идентифицировать фенотип макрофагов, пациентов с воспалительным заболеванием,

7 Оценить возможность избирательного запуска апоптоз/некроза в провоспалительных макрофагах пациентов с воспалительным заболеванием, с целью коррекции секреторной активности всего пула макрофагов

Научная новизна исследования

Впервые показано, что нативные и провоспалительные макрофаги последовательно индуцируют стресс-ответ и апоптоз/некроз в ответ на стимуляцию ЛПС Макрофаги, антивоспалительного фенотипа, напротив, блокируют эти ответы Блокирование стресс-ответа в макрофагах антивоспалительного фенотипа происходит на уровне фактора транскрипции HSF1

Впервые установлено, что в отличие от ЛПС, компонента мембран грамотрицательных бактерий, S aureus, грамположительная бактерия вызывает стресс-ответ и апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа

Впервые установлено, что в отличие от ЛПС, тепловой шок вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа

Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный пулы NO играют разную роль в регуляции ЛПС-индуцированного стресс-ответа

внутриклеточный NO потенциирует, а внеклеточный угнетает его Эти эффекты NO не зависят от фенотипа макрофагов

Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO играет дифференциальную роль в регуляции ЛПС-индуцированного апоптоз/некроза в интактном и провоспалительном фенотипах макрофагов внутриклеточный NO играет про-апототическую/некротическую роль, тогда как в антивоспалительном фенотипе - анти-апоптотическую/некротическую Внеклеточный NO защищает макрофаги от ЛПС-индуцированного апоптоз/некроза

Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO играет разную роль в регуляции индуцированного S aureus стресс-ответа внутриклеточный NO потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе, а внеклеточный NO ограничивает развитие индуцированного S aureus стресс-ответа

Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO играет анти-апоптотическую/некротическую роль при действии S aureus на антивоспалительный фенотип макрофагов В нативном и провоспалительном фенотипе, ни внутриклеточный, ни внеклеточный NO не вовлечены в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов макрофагов при действии S aureus

Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный пулы NO играют разную роль в регуляции индуцированного тепловым шоком стресс-ответа Внутриклеточный NO потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе макрофагов, а внеклеточный NO не оказывает влияния

Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO обладает анти-апоптотическим/некротическим действием при развитии индуцированного тепловым шоком апоптоз/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов В нативном и провоспалительном фенотипе, внеклеточный NO также играет анти-апоптотическую/некротическую роль и подавляет развитие индуцированного тепловым шоком апоптоз/некроза В нативном и провоспалительном фенотипе макрофагов, внутриклеточный NO не вовлечен в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов при действии теплового шока

Впервые показано, что ш vitro с помощью избирательного элиминирования провоспалительных макрофагов можно менять характер секреторной активности всей популяции макрофагов, выделенных от больных с легочным саркоидозом

Теоретическое значение работы

1) открытие генерализованного феномена репрограмирования стрессорного и апоптотического/некротического клеточных ответов макрофагов при смене фенотипа их секреторной активности,

2) определение специфической роли внеклеточного и внутриклеточного N0 в регуляции клеточных ответов активированных макрофагов разных фенотипов, и

3) построение концепции о роли макрофагов в формировании иммунного ответа, в котором регуляторная роль макрофагов во врожденном и адаптивном иммунитете обеспечивается пластичностью макрофагальных клеточных ответов, проявление которых зависит от фенотипа макрофагов, от природы патогенного фактора и от концентрации внеклеточного и внутриклеточного NO

Практическое значение работы

Результаты работы открывают перспективы разработки новой стратегии коррекции неадекватного воспалительного процесса с целью терапии широкого спектра заболеваний Существо новой стратегии состоит в том, чтобы обеспечивать необходимый характер секреторной активности макрофагов (антивоспалительный или провоспалительный) с помощью селективного удаления из популяции in vitro «патогенетического» фенотипа, про- или антивоспалительного

Положения, выносимые на защиту

1 ЛПС-зависимое репрограммирование фенотипа макрофагов обеспечивает специфическую перестройку механизмов, не только воспалительного, но и стресс- и апоптоз/некроз-ответов Благодаря такой перестройке обеспечивается пластичность макрофагов в модуляции своих ответов, проявление которых зависит как от фенотипа макрофагов, так и от природы активирующего фактора

2 Эффекты NO в регуляции клеточных ответов макрофагов зависят от их фенотипа, от modus operandi (внутри- или внеклеточного) и от природы действующего на макрофаги фактора

3 Избирательное элиминирование того или иного фенотипа макрофагов может быть одним из способов регуляции секреторной активности всей популяции макрофагов

Апробация работы Основные результаты проведенных исследований были представлены на 4 международной конференции «Hypoxia m medicine" (Geneva, Switzerland, 2001), на Всероссийском симпозиуме Физиологического общества (Казань, Россия, 2001), на Конференции в Cold Spring Harbor Laboratory «Molecular chaperones and the heat shock response» (Нью Йорк, США, 2002), на Российском конгрессе «Реактивные формы кислорода, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, Россия, 2005), на Международном Конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), на межлабораторных конференциях, на семинаре факультета фундаментальной медицины МГУ и на семинаре на кафедре патофизиологии лечебного факультета московского государственного медико-стоматологического университета Апробация работы проходила на заседании ученого совета ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунопатологии Росздрава

Личный вклад автора Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследовании, проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 200 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов, их обсуждения и выводов Список литературы содержит 308 источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты на макрофагах мышей

В экспериментах были использованы перитонеальные макрофаги мышей-самцов линии C3HeB/FeJ 8-12 недель Мыши были получены из лаборатории Джексона (The Jackson Laboratory, www jax org/jaxmice) Животные содержались в условиях аккредитованного вивария, не допускающих попадание патогенных микроорганизмов Мыши размешались в клетках со свободным доступом к воде и пище в условиях 12 часового «день-ночь» цикла

Выделение и культивирование мышиных макрофагов

За 4 дня до выделения макрофагов, мышам вводили в/б 2 мл 4% бульона тиогликолята В день выделения макрофагов, мышь умертвлялась и в области белой линии животному вкалывали 10 мл раствора Хенкса без ионов кальция и

магния (HBSS) Затем HBSS отбирался обратно вместе с перитонеальными макрофагами Суспензию макрофагов разливали по 6-луночным планшетам (Costar, MA) по 5х106 клеток в каждую лунку Культуру макрофагов инкубировали 1 час при 37°С в 5% СОг После этого планшеты промывали раствором ФСБ для удаления неприкрепившихся клеток («не-макрофагов») Дальше в каждую лунку добавляли RPMI-1640 с 10% сывороткой и антибиотиками и оставляли в течение 60 минут при 37°С в С02-инкубаторе После этого проводили эксперименты

ЛПС-зависимое репрограммирование макрофагов на провоспалительный или антивоспалительный фенотип

Для получения провоспалительного и антивоспалительного фенотипа макрофагов использовали методику Morrison (Zhang, Morrison, 1993) Макрофаги были разделены на три пула Один пул культивировали в течение 6 часов при 37°С, без каких либо воздействий в стандартных условиях Это был нативный пул макрофагов Второй пул инкубировали с субстимуляторными дозами ЛПС 0,5 нг/мл для получения провоспалительного фенотипа, а третий с 5 нг/мл ЛПС для получения антивоспалительного фенотипа Наивные и репрограммированные разными низкими дозами ЛПС макрофаги были, затем стимулированы высокими дозами ЛПС (500 нг/мл), S aureus, или тепловым шоком В ответ на действие высоких доз ЛПС (500 нг/мл), провоспалительный фенотип макрофагов характеризовался усиленной продукцией провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 (IL-1), IL-6, IL-12, и фактор некроза опухолей-а (TNF-а) Антивоспалительный фенотип характеризовался сниженной продукцией провоспалительных цитокинов и усиленной продукцией анти-воспалительных цитокинов, таких как IL-10

Факторы, используемые для активации макрофагов: ЛПС, S.aureus и тепловой шок

Для индукции стресс-ответа и апоптоз/некроза были использованы разные по природе факторы микробные - ЛПС в концентрации 500 нг/мл при 37°С в течение 72 часов и S aureus в соотношении к макрофагам как 200 1 при 37°С в течение 72 часов, и физический фактор - тепловой шок при 42°С, 1 час с последующим культивированием при 37°С в течение 71 часа Выбор этих активаторов обусловлен тем, что микробные факторы являются индукторами, тогда как гипертермия следствием воспалительного процесса ЛПС является компонентом мембран грамотрицательных бактерий, тогда как S aureus -представитель грамположительных бактерий ЛПС и S aureus взаимодействуют с макрофагами через рецепторы Однако, взаимодействие 5 aureus с макрофагом заканчивается фагоцитозом

Оценка воспалительного ответа макрофагов

Воспалительный ответ макрофагов оценивали по изменению содержания цитокинов в культуральной среде после 24 часов стимуляции с ЛПС TNF-a измеряли с помощью набора оценки цитотоксичности (Hirohashi, Morrison, 1996) Для определения IL-12, IL-6, и IL-10 была использована ELISA, и наборы полученные от Genzyme и от PharMingen Концентрацию цитокинов в тестируемых образцах рассчитывали по стандартной калибровочной кривой

Оценка стрессорного ответа макрофагов. Методики активации и ингибирования стресс-ответа макрофагов

Стресс-ответ оценивался по изменению активности и содержания HSF1 фактора транскрипции HSP70, содержания мРНК HSP70 и содержания белков HSP70 Для оценки активности фактора транскрипции HSF1 был использован метод TranSignalTM protein/DNA array (Panomics, USA, www panomics com), основанный на взаимодействии выделенных из ядра факторов транскрипции с иммобилизованными на мембране специфическими участками промотора О количестве факторов транскрипции судили по интенсивности хемилюминесцентного сигнала Изменение активности фактора транскрипции HSF1 было подтверждено вторым методом Вестерн-блоттингом Оценку содержания мРНК HSP70 проводили с помощью метода RT-PCR Макрофагальный пул РНК экстрагировался с помощью стандартного протокола с использованием Absolutely RNATM RT-PCR Miniprep Kit (Stratagene, www stratagene com) следуя инструкции производителя 1,0 мкг общей РНК были транскрибированы в кДНК с использованием олиго (dT)16 в качестве праймера и GeneAMP RNA PCR Kit (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) Полученная таким образом кДНК была амплифицирована с использованием специфических мышиных HSP70 праймеров (sense, остатки 1183-1203, GATGAAGGAGATCGCTGAGG, antisense, остатки 1678-1698, GATGCCCTCGAACAGAGAGT) Оценку содержания белка HSP70 и фактора транскрипции HSF1 проводили с помощью Вестерн-блоттинга Для этой цели макрофаги лизировали в буфере, содержащем 62,5 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 25% глицерол, 0,01% бромфеноловый синий 20 мкг белка электрофоретически разделялили с помощью SDS PAGE и переносили на PVDF мембрану (Bio-Rad) Затем блоты инкубировали с первичными мышиными моноклональными анти-HSFZO антителами (Stressgen, Cat # SPA-810) Для определения HSF1 блоты инкубировали с кроличьими анти-HSFl поликлональными антителами (Stressgen, Cat # SPA-901) Мембраны проявляли с помощью хемилюминесцентной системы детекции Вестерн-блоттинг Luminol Reagent (Santa Cruz, Cat # sc-2048) и экспонировали на пленку Kodak Scientific Imaging Film С целью ингибирования стрессорных ответов макрофагов был использован ингибитор синтеза HSP70 - ткверцетин (Nagai et al, 1995) в концентрации 50 мкМ

Оценка апоптоз/некроз ответа макрофагов

Апоптоз/некроз макрофагов оценивали по фрагментации ДНК Содержание фрагментированной ДНК оценивали по методу Nicoletti et al (1991) Макрофаги окрашивали пропидиум иодидом и анализировали с помощью метода проточной цитометрии на приборе Coulter EPICS XL-MCL (Couler, Hialeah, FL) Макрофаги с фрагментированной ДНК формировали сдвинутый влево на флуоресцентной гистограмме, субдиплоидный пик Площадь этого пика выражалась количественно и отражала процентное содержание макрофагов с фрагментированной ДНК Фрагментация ДНК является характерным признаком апоптотической гибели клеток Однако, известно, что фрагментация ДНК также может происходить и при некрозе клеток Поэтому используемый нами метод, по сути, позволял количественно оценить суммарную апоптотическую/некротическую гибель макрофагов С целью ингибирования апоптотических ответов макрофагов был использован ингибитор всех известных каспаз ZVAD-FMK (Amstad et al, 2001) в концентрации 25 мкМ ZVAD-FMK добавляли на этапе активации макрофагов

Оценка продукции NO

Продукция NO макрофагами оценивалась по содержанию нитритов в культуральной среде (после культивирования макрофагов) спектрофотометрически с помощью реакции Грисса относительно контроля при длине волны 540 нм С целью модулирования внутриклеточного и внеклеточного пулов N0 были использованы ингибитор индуцибельной NO-синтазы (iNOS) S-(2-aminoethyl)isothiourea (ITU) в концентрации 50 мкМ и непроникающая в клетки ловушка NO - 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline -l-oxyl-3-oxide, potassium salt (карбокси-РТЮ) в концентрации 100 мкМ (Maeda et al, 1995) ITU и карбокси-РТЮ добавляли на этапе активации макрофагов

Исследования на альвеолярных макрофагах людей

Исследование проводилось у 12 больных с острым легочным саркоидозом в возрасте от 37 до 55 лет Больные имели I и II стадии заболевания В группе было 5 женщин и 7 мужчин Диагноз заболевания был установлен на основе клинических, радиографических и гистологических критериев в соответствии с критериями Hunnxnghake et al, (1999)

Выделение альвеолярных макрофагов.

Альвеолярные макрофаги выделяли из бронхо-альвеолярной жидкости Для этого, с помощью оптического фибробронхоскопа в правую среднюю или в левую язычковую долю легкого вводили стерильный физиологический раствор После этого раствор отсасывали и фильтровали через стерильную

и

марлю Затем собранный раствор центрифугировали при 500 g и 4°С, в течение 10 минут Клетки подсчитывали в камере Горяева

Культивирование альвеолярных макрофагов.

Культивирование альвеолярных макрофагов проводили аналогично культивированию мышиных макрофагов Клеточную суспензию распределяли по 6-ти луночным планшетам по 5x106 клеток на каждую лунку Стимулирование макрофагов проводили с помощью ЛПС в концентрации 500 нг/мл в течение 24 часов После стимулирования культуральную среду, в которой находились макрофаги, собирали, центрифугировали и супернатанты хранили на -80°С до определения цитокинов

Определение TNF-o, IL-lß, IL-6, and DL-10 в культуральной среде моноцитов/макрофагов.

Секреторную активность культивируемых человеческих альвеолярных макрофагов определяли по количеству и типу цитокинов, высвобождаемых в ответ на стимуляцию ЛПС Концентрации TNF-a, IL-lß, IL-6, and IL-10 были измерены с помощью ELISA и специфических наборов Endogen, Inc, Wobum, MA Концентрация цитокинов измерялась в точном соответствии с инструкцией производителя

Методы избирательного элиминирования определенного фенотипа клеток из смешанного пула макрофагов пациентов.

Доминирующим фенотипом макрофагов при легочном саркоидозе является провоспалительный, который в частности характеризуется увеличенной продукцией TNF-a (Marques et al, 1999) Поэтому для снижения провоспалительной активности всего пула макрофагов (состоящих как из про-, так и из антивоспалительных) необходимо было селективно активировать апоптоз/некроз в провоспалительном фенотипе Для этого мы использовали культивирование макрофагов с ЛПС и ловушкой NO, карбокси-РТЮ

Статистическая обработка результатов

Все данные представлены в форме M ± ш Достоверность различий в группах определялась с помощью теста Стьюдента Различия в группах принимались как достоверные, при значении Р < 0,05 Изменения в уровне цитокинов анализировались с помощью one-way ANOVA

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

('«программирование воспалительного фенотипа макрофагов сопровождается репрограммнроВДнцём стресс орноп» и апоптотнческо го/не Крит ического ответов на действие бактериальных (ЛИС и Ямигеих) и физических (тепловой шок) факторов.

Стресс-ответ и апотпоз/некроз в разных фенотипах макрофагов при действии ЛИС

ЛИС в концентрации 500 иг/мл вызывал существенную активацию стресс-ответа и иатнвноМ Й п ровос л ал ш ел ь но м фсиогипс макрофагов н практически не вызывал - к антивоспалительно^ фенотипе (Рисунок I). Содержание активного Н3?1, Н8Р70тРНК и НЙР70 белка (характеризующих стресс-отпет) в Л11С-етнмулированных п роаослал шел ьн ых макрофагах было намного больше, чем в анти воел ал иге л ь ном. Таким образом, Л1 ГС-зависимая активация стресс-ответа в макрофагах имеет фенотип-шецифичеекн й характер.

Ií иIпактом и про воспалительном фенотипах инкубирование с высокими дозами ЛПС приводило к фрагментации ДИК в 18% макрофагах. 11 тоже время ЛИС совсем не вызывал апоптоз/йекроз в макрофагах антивоспалительного фенотипа (Рис. 2 и таблица 1).

I ^ ИГП1> I

Н$1"70иРНК . ...............III".: и ,.

.М г-1.1:. Fjl.il ||IIл м\ ■

Я Ш

кТ-РСК)

Нити ни ый (/кно тип

З-О

Провоспалительн ыи фен огни и

Л чти в осп ил и тел ь а ми фен от и п □

СТИМУЛЯЦИЯ ЛI I: :II МММ

4 | 3 II М 11Б1*™ 1> II Л А 7£

( ГЦ мул И11114 ЛПС. "I СптуЛЯЦЕЕИ ЛПС. ч

Рисунок 1. Активация фактора гран скрипни и белков теплового шока ЬкП. накопление НЗР70 мРНК н Iбелка в разных фенотипах макрофагах в ответ на стимуляцию с помощью ЛПС.

Таблица I. Влияние J! M С (500 нг/мл) на количество клеток с фрагмент ированной ДИК и разных фен от ипах макрофагов и эффекты кверцитина (50 мкМ) и ZVAD-FMK (25мкМ)

Ь'{1ЛМЧГСТ!Ш клеток с t' 1'.Г ,Г«11ТЕ1р1ГВЛШП)Й ДНК, ' '

II. лпг-р II ЛИС-Р. 6ч ЛПС-Р. (¡4 ЛПС П. 6ч

6ч 6ч 72ч + ЛПС-С, -нлпс-с+gt. +1ЛПС r+ZVAD

7Z4 72ч 1МК1 72-i

НФ <0.5 <0.5 2+] ГеП.()5 I5+.1 p-rfjiïs 43+10 58+12'

МВФ <0,5 M 05 1Й4-.1 Р<0.М 47+1Ï 62+9*

ЛИФ <0.5 Р>П05 Ij.) Prfi.fPS 54+Я 42+7*

И нормальные условия. 11Ф - иативный фенотип, ПВФ - провоспалитсльный фенотип, АВФ - a i i n 1 во с п îlm ] не,11 ь и ы и феногин, 37°С; ЛПГ-Г' - стадия ЛИС рспрограммирования. ЛПС-С стадия ЛИС стимулирования; О - кверцитин; (JI11Ç-C+Q) - кверщегин добавленный только на стадии ЛПС стимулирования. (ЛПС-С+ZVaD FM К) ингибитор каспаз ZVAD-FMK добавленный только на стадии ЛПС стимулирования. * ■ достоверные отличия oi группы (ЛТIC-P, + ЛПС-С, 72ч), pcO.OS

□ ЛПС □ ЛПС*0 □nne+ZVAO-fmk |

ИФ ПВФ АВФ

Рисунок 2. Влияние ЛПС (500 вг/мл) па количество клеток с фрагм енти рован н ом ДНК в разных фенотипах макрофагов и эффекты кверцитина (Q: 50 чкМ) и ZVAD-FMK (25 мкМ) на действие ЛПС. Рисунок построен по результатам таблицы I.

Таким образом, ЛПС-зависимая активация апоптоз/некроза в макрофагах имеет фен от и п - спец и ф и ч ее кий характер. при этом макрофаги с

антивоспалительным фенотипом проявляли антиапоптотические свойства при действии высоких доз ЛПС

Апоптоз/некроз развивался в тех фенотипах, в которых в ответ на действие ЛПС накапливалось много HSP70 Эти данные на первый взгляд не согласуются с хорошо известными антиапоптотическими свойствами HSP70 (Beere, 2005) Однако, оказалось, что кверцетин (50 мкМ) устраняя ЛПС-индуцированное накопление HSP70, потенцировал ЛПС-вызванную фрагментацию ДНК в макрофагах (Рис 2, таблица 1) Это подтверждает гипотезу о важной роли HSP70 в устойчивости макрофагов к апоптоз/некрозу

Другой интересный момент состоял в том, что ингибитор каспаз ZVAD-FMK не только не устранял, но даже потенцировал ЛПС-индуцированный апоптоз/некроз во всех фенотипах (Рис 2, таблица 1) Это означает, что апоптоз/некроз макрофагов при действии высоких доз ЛПС является каспазо-независимым

Стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов при действии S. aureus

На рисунке 3 видно, что фагоцитирование S aureus индуцировало выраженный стресс-ответ в антивоспалительных макрофагах Это проявлялось увеличением содержания HSP70 В провоспалительном фенотипе, стресс-ответ начинал проявляться лишь через 24 часа, при этом интенсивность стресс-ответа была существенно ниже, чем в антивоспалительном фенотипе В нативном фенотипе, стресс-ответ при инкубации макрофагов с S aureus практически не развивался

Провоспапительный фенотип Антивоспапительный фенотип Интактный фенотип

Рисунок 3. Влияние S aureus на активацию синтеза HSP70 в разных фенотипах макрофагов

S aureus вызывал фрагментацию ДНК в 17% макрофагах антивоспалительного фенотипа, и достоверно не влиял на интактный и провоспапительный фенотипы (Рис 4 и таблица 2)

Таким образом, развитие стресс-ответа и апоптоз/некроза в макрофагах зависит как от фенотипа макрофагов, так и от природы индуцирующего

........ .тшшиин. ^^швдйкш

•Ядазадар w*"™«- ЧГСВЩЩЩУ

*•«■«► шт w—*

I 0 12 24 48 72 S aureus, часы

фактора ЛПС индуцирует стресс-ответ и апоптоз/некроз в нативном и провоспалительном фенотипах, тогда как S aureus индуцирует выраженный стресс-ответ и апоптоз/некроз только в антивоспалительном фенотипе

Таблица 2. Влияние S aureus на количество клеток с фрагментированной ДНК в разных фенотипах макрофагов

_Количество клеток с фрагментированной ДНК, %

_Н, 6ч ЛПС-Р 6ч Н, 72ч ЛПС-Р, бч+SA, 72ч

НФ <0 5 <0 5 2+1 р>оо5 9+3*

ПВФ <0 5 РХ>05 7+3

АВФ <0 5 Р<005 17+3

Н - нормальные условия, НФ - нативный фенотип, ПВФ - провоспалительный фенотип, АВФ - антивоспалительный фенотип, ЛПС-Р - стадия ЛПС репрограммирования, SA -5 aureus

* - достоверные отличия от группы (Н), р<0 05

S Aureusj

Количество клеток с фрагментированной ДНК, % э СЛ О ОП о 1 3 мш

ИФ ПВФ АВФ

Рисунок 4. Влияние S aureus на количество клеток с фрагментированной ДНК в разных фенотипах макрофагов Рисунок построен по результатам таблицы 2

Стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов при действии теплового шока

На рисунке 5 видно, что тепловой шок индуцировал выраженный стресс-ответ в макрофагах антивоспалительного фенотипа, но не провоспалительного и нативного фенотипов

гШР70| 0 12 24 48 72 50нг 1-

Провоспалительный фенотип Антивоспалительный фенотип Интактный фенотип

посче теплового шока, часы

Рисунок 5. Влияние теплового шока на активацию синтеза Н8Р70 в разных фенотипах макрофагов

Тепловой шок (42°С, 1 час) вызывал фрагментацию ДНК в 31% макрофагах антивоспалительного фенотипа, и не влиял на целостность ДНК нативного и провоспалительного фенотипов (Рисунок 6) Ингибитор каспаз ТУАБ-БМК (25мкМ) никак не ограничивал индуцированный тепловым шоком апоптоз/некроз в антивоспалительном фенотипе, но существенно усиливал фрагментацию ДНК при тепловом шоке в наивном и провоспалительном фенотипах (Рис 6 и таблица 3)

Таблица 3. Влияние теплового шока (42°С, 1 час) на количество клеток с фрагментированной ДНК в разных фенотипах макрофагов

Количество клеток с фрагментированной ДНК, %

н, 6ч ЛПС-Р, 6ч Н, 72ч ЛПС-Р, 6ч+ТШ+ Н, 37°С, 72ч ЛПС-Р, 6ч+ТШ+ Н, 37°С, 72ч+гУАО-РМК

НФ <1 <1 4+1 Р>005 5+1 р<005 39+7

ПВФ <1 Р>005 4+1 р<005 41+5

АВФ <1 р<оо5 31+4 р>005 52+8

Н - нормальные условия, НФ - нативный фенотип, ПВФ - провоспалительный фенотип, АВФ - антивоспалительный фенотип, 37°С, ЛПС-Р - стадия ЛПС репрограммирования, ТШ - тепловой шок при 42°С в течение 1 часа

Рисунок 6. Влияние теплового шока на количество клеток с фрагментированной ДНК в разных фенотипах макрофагов Рисунок построен по результатам таблицы 3

Таким образом, тепловой шок в отличие от ЛПС, индуцировал стресс-ответ и апоптоз/некроз в антивоспалительном фенотипе, но не в нативном и провоспалительном При этом эксперименты с ингибитором каспаз показали, что при действии теплового шока, так же как и при действии ЛПС, апоптоз/некроз в макрофагах развивается по каспазо-независимому пути

В макрофагах проапоптотическому действию ингибитора каспаз ZVAD-FMK предшествовало накопление HSP70 Эти данные, на первый взгляд, не согласуются с хорошо известными антиапоптогенными свойствами HSP70, доказанными на других клеточных линиях Вместе с тем ингибитор синтеза HSP70 кверцетин (50 мкМ), устраняя накопление HSP70, увеличивал количество макрофагов с фрагментированной ДНК, культивируемых совместно с ZVAD-FMK после теплового шока (с 39+7 до 67+8%) Эти данные свидетельствуют о том, что активация синтеза, HSP70 в макрофагах, культивируемых совместно с ZVAD-FMK после теплового шока, является защитной реакцией, направленной на ограничение апоптоз/некроза

Главный вывод состоит в том, что стрессорные и

апоптотические/некротические ответы макрофагов являются фенотип-зависимыми

Разные бактериальные (ЛПС и S aureus) и физические (температура) факторы обладают специфической способностью индуцировать стресс-ответ в разных фенотипах макрофагов Это означает, что репрограммирование фенотипа макрофагов обеспечивает специфическую перестройку стресс-сенсорного механизма, благодаря чему макрофаги проявляют высокий уровень пластичности прямых и перекрестных стресс-ответов, проявление которых

зависит как от фенотипа макрофагов, так и от природы стресс индуцирующего фактора Взаимоотношения между механизмами стресс-ответа и воспалительными реакциями макрофагов, очевидно, могут играть важную роль в развитии приобретенного иммунного ответа к инфекциям Мы можем предположить, что HSF1-HSP70 система за счет избирательной защиты того или иного фенотипа макрофагов и за счет этого регуляции продукции цитокинов и N0 может вносить вклад в формирование цитокинового микроокружения ThO клеток Участвуя в формировании цитокинового микроокружения ThO клеток, HSF1-HSP70 может влиять на развитие подходящего Т-специфического иммунного ответа

Данные представленные в этой работе показывают, что развитие апоптоз/некроза, так же как и развитие стресс-ответа является фенотип-зависимым, и в частности ЛПС индуцирует апоптоз/некроз в провоспалительном фенотипе, но не в антивоспалительном ЛПС может индуцировать апоптоз макрофагов посредством увеличения экспрессии рецепторов смерти и их лигандов (Halaas et al, 2000, Navarre, Zychlinsky, 2000, Caroleo et al, 2001) В апоптотические эффекты ЛПС вносят вклад также TNF-а (Xaus et al, 2000) TNF-а-зависимая активация каспазы-3 является одним из ранних ЛПС-индуцированных апоптотических событий в макрофагах (Karahashi, Amano, 1999, Zhang et al, 2006) С другой стороны, ЛПС может активировать белок ингибитор апоптоза (Cui et al, 2000) или Bcl-xL, анти-апоптотического члена семейства (Okada et al, 1998) Антивоспалительные цитокины IL-4, IL-10, TGF-b (Bingisser et al, 1996) и PGE2 (Zamora, Bult, Herman, 1998), продукция, которых увеличивается при действии ЛПС, могут ограничивать развитие ЛПС-индуцированного апоптоза Таким образом, тонкое равновесие вежду проапоптотическими и антиапоптотическими механизмами контролирует результирующее состояние и исход действия ЛПС на макрофаги

При развитии апоптоз/некроза в разных фенотипах макрофагов есть еще один интересный аспект Мы показали, что высокие дозы ЛПС активируют апоптоз/некроз в провоспалительном фенотипе макрофагов Однако когда мы в качестве апоптоз/некроз-индуцирующего фактора использовали тепловой шок, то оказалось, что апоптоз/некроз развивался в антивоспалительном фенотипе, а не в провоспалительном Полученные результаты позволяют сделать важный вывод активация апоптоз/некроза в макрофагах, зависит не только от их фенотипа секреторной активности, но и от природы действующего на макрофаги фактора При этом существование противоположных ответов на действие разных апоптоз/некроз-индуцирующих факторов в одном и том же фенотипе макрофагов, позволяет сделать предположение ЛПС-зависимое репрограммирование усиливает как проапоптотические, так и антиапоптотический потенциал макрофагов, а действующий фактор среды, в зависимости от своей природы, может

альтернативно активировать или проапоптотическую или антиапоптотическую программу

Способность разных по природе апоптоз/некроз-индуцирующих факторов селективно элиминировать тот или иной фенотип макрофагов может обеспечить выбор наиболее подходящей ориентации (провоспалительной или антивоспалительной) иммунного ответа при действии конкретного фактора бактериальной или физической природы Очевидно, что первый этап специализации иммунного ответа на провоспалительный или антивоспалительный может быть связан с репрограммированием макрофагов допороговыми концентрациями бактериальных продуктов на самых ранних стадиях инфекции Однако здесь необходимо учитывать, что в условиях возрастающих концентраций бактериальных продуктов одна часть пула наивных макрофагов может быть репрограммирована на провоспалительный фенотип, а другая на антивоспалительный В этом случае, можно предположить, что на втором этапе действующий фактор (высокие дозы ЛПС или гипертермия) за счет избирательного удаления «ненужного» фенотипа макрофагов, окончательно предопределяет характер иммунного ответа Эти данные позволяют предположить некоторые механизмы пластичности иммунитета Кроме того, феномен избирательной гибели функционального фенотипа иммунных клеток может быть использован как при коррекции иммунологических нарушений, так и быть инструментом при изучении функциональной роли разных фенотипов макрофагов

Роль N0 в регуляции клеточных ответов макрофагов зависит от фенотипа макрофагов, природы стимулирующего фактора и от локализации N0 (внутри- или внеклеточная).

Роль экстраклетночного и внутриклеточного N0 в регуляции ЛПС-индуцированного стресс-ответа и апоптоз/некроза в разных фенотипах макрофагов

На рисунке 7 представлены результаты ингибирования ^ОБ и связывания внешнего N0 на стресс-ответ разных фенотипов макрофагов Видно, что ингибитор 1Ж)8 - ГГО (50 цМ), добавленный вместе с ЛПС в концентрации 500 нг/мл, полностью блокировал ЛПС-индуцированную активацию синтеза Н8Р70 во всех фенотипах макрофагов Напротив, ловушка N0, с-РТЮ (100 цМ), добавленная к культуре макрофагов, для того чтобы нейтрализовать экстраклеточный пул N0, существенно потенцировала ЛПС-индуцированный синтез НБР70 При этом ни ГШ, ни сагЬоху-РТЮ, сами по себе ни как не влияли синтез Н8Р70 ни в одном из фенотипов макрофагов

О ЛПС ЛПС+ ЛПС+ с-РТЮ ГШ

Рисунок 7. Влияние с-РТЮ и ITU на ЛПС-индуцированную активацию синтеза HSP70 в разных фенотипах макрофагов

Таким образом, экстраклеточный и внутриклеточный пулы N0 по-разному регулируют молекулярные механизмы, контролирующие стресс-ответ макрофагов, а именно внутриклеточный N0 потенцирует стресс-ответ, тогда как экстраклеточный N0 - подавляет его

Ингибитор гЫОБ ГШ ограничивал развитие ЛПС-индуцированного апоптоз/некроза в провоспалительном фенотипе макрофагов в 2 раза и в тоже время увеличивал апоптоз/некроз в антивоспалительном фенотипе в 4 раза (Рис 8 и таблица 4)

Таблица 4. Влияние ЛПС на количество клеток с фрагментированной ДНК и эффекты carboxy-PTIO, непроникающей в клетки ловушки NO, и ITU, селективного iNOS ингибитора на действие ЛПС

Количество клеток с фрагментированной ДНК, %

Н, ЛПС-Р Н ЛПС-Р, 6ч ЛПС-Р, 6ч ЛПС-Р, 6ч

6ч 6ч 72ч +ЛПС-С, +(ЛПС-С +(ЛПС-С

72ч +CPTIO), 72ч +ITU), 72ч

НФ <0 5 <0 5 1+1 20+2 34+4 15+2

ПВФ <0 5 22+3 32+3 12+2

АВФ <0 5 2+1 4+1 8+1

Н - нормальные условия, НФ - нативный фенотип, ПВФ - про-,и АВФ - антивоспалительный фенотип, ЛПС-Р - стадия ЛПС репрограммирования, ЛПС-С - стадия ЛПС стимулирования

НФ ПВФ АВФ

Рисунок 8. Влияние ЛИС на количество клеток с фрагмвотированной ДНК в разных фенотипах макрофагов и эффекты с-PTIO и ГШ на действие ЛПС. Рисунок построен по результату таблицы 4.

Отсюда следует вывод: и провоспалительном фенотипе макрофагов внутриклеточный NO продуцируемый /NOS и грает про-, тогда как н антивоспалительном фенотипе - анти-апоптотическую/пекротическуЮ роль.

Экстраклеточная лйвушка N0. c-PTIQ увеличивала ano птоз/некроз во всех фенотипах. Это означает, что внешний N0, синтезируемый макрофагами защищает и\ от Л П С - и иду ц и ро пан и о го ai lóiiroV некроза. líe исключено, что этом механизм может составлять один из компонентов ауто крик ной защиты макрофагов а очаге воспаления.

Важно отметить, что ни ITU. ни с-PTIO, сами по себе не индуцировали фрагментацию ДНК ни и одном из фенотипов.

Роль экетраклетиочного и внутриклеточного NO в регуляции индуцированного S.aureus стресс-ответа и апоптоЫнекроза о разных ф еноты пах. чакрофагов

В провоспалительном и пативном фенотипах макрофагов, пи ITU. ни с-РТЮ, ни как не влияли па способность S.auteus индуцировать стресс-ответ в лих фенотипах (Рнс. 9). В аг / ги МОСШлн гель ном фенотипе макрофагов, где 5.ан retís сам по ссбс индуцировал стресс-ответ, блокирование внутриклеточного синтеза NO привело к полному подавлению стресс-ответа. Снижение коипентрщ ши внеклеточного NO вокруг макрофагов анти воспалительного фенотипа, за счет его связывания с карбокси-РТЮ, напротив привело к существенному потенцированию стресс-ответа при действии S.aureits (Рис. 9). Таким образом, роль N0 в регуляции стресс-ответ а,

индуцируемого S aureus в антивоспалительном фенотипе макрофагов, строго зависит от локализации N0 внутриклеточный NO, по-видимому, является ключевым медиатором S ¿шге/и-индуцируемого стресс-ответа, тогда как внеклеточный N0 оказывает ингибирующее действие на развитие этого типа ответа макрофагов

HSP70-HSP70-

HSP70-

SA SA+ SA+ с-РТЮ ITU

Рисунок 9. Влияние с-РТЮ и ITU на индуцированную S aureus (SA) активацию синтеза HSP70 в антивоспалительном фенотипе макрофагов

Анализ роли NO в регуляции S аигег«-индуцированного апоптоз/некроза в разных фенотипах макрофагов можно провести по результатам, представленным на рисунке 10 и таблице 5 Видно, что ингибитор «NOS ITU увеличивал развитие S аигеил-индуцированного апоптоз/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов в 4 раза, не влиял на апоптоз/некроз в провоспалительном фенотипе и достоверно потециировал проапоптотическое действие S aureus в нативном фенотипе макрофагов Также видно, что связывание экстраклеточного N0 с помощью ловушки N0, карбокси-РТЮ, приводило к двукратному увеличению апоптоз/некроза в антивоспалительном фенотипе и не влияло на развитие апоптоз/некроза в провоспалительном и нативном фенотипах

Таким образом, можно сделать два вывода в нативном и антировоспалительном фенотипе макрофагов внутриклеточный NO продуцируемый iNOS играет антиапототическую роль, тогда как в провоспалительном фенотипе, S aureus не вызывает апоптоз/некроз и внутриклеточный NO никак не вовлечен в антиапоптотические свойства провоспалительного фенотипа макрофагов

Таблица 5. Влияние S.aureus fia количество клеток с фрагмспгировапной ДНК в раинДх фенотип Щ макрофагов и эффекты carboxy-PTIO, lien рои икаю щей и клетки ловушки NO. и ITU. селективного ÎNGS ингибитора па действие S.aureus.

Количество клеток с фршхешировашюЦ Д| Ж. %

н. ЛПС-Р H ЛПС-Р. 6ч лпе-р, бч ЛПС-Р. 6ч

6ч 6ч 72ч +SA. 72ч +SA+L-1'"!IO-72ч +ISA+ITU). 72ч

1}Ф <0.5 <0„5 2±1 ¿'-•А® Ç+:Î 15+4 B^tW 22+3

пв4> <0.5 1 *>:. 7+3 Р>Г).Г15 10-4-3 ivi.i)5 9+ 2

ЛВЧ> <0.5 PiO.05 i 7+ 1 P<1).C1S ЗГМ MIÎIÎ 61+5

il - нормальные условия, НФ нативный фенотип, 11ВФ - провоспалйтельный фенотип, ЛИФ - анти воспел тень нйЙ фсаотиги ДПС-Р стадия ДПС ре программирования; SA - S aurais.

□ S.Aureus в S.Aureus+c-FTIO О S. Au reus+ITU

Рисунок 10. Влияние S.ciurcus на количество клеток с фрагмен тирован ной ДНК в разных фенотипах макрофагов и эффекты с-РТЮ. непроникшощей в клетки ловушки N0, и ITIJ. селективного ¡NOS ингибитора па действие S.aureus. Рисунок построен по результатам таблицы 5.

Экстраклеточный NO, синтезируемый макрофагами антивоспалительного фенотипа защищает их от S аига«-индуцированного апоптоз/некроза Не исключено, что этот механизм может составлять один из компонентов аутокринной защиты антивоспалительных макрофагов в очаге инфекции, вызванной S aureus В то же время экстраклеточный N0 не вовлечен в механизмы повышенной устойчивости к S амгемх-индуцированному апоптоз/некрозу макрофагов нативного и провоспалительного фенотипов

Роль экстраклетночного и внутриклеточного NO в регуляции индуцированного тепловым шоком стресс-ответа и апоптоз/некроза в разных фенотипах макрофагов

Данные представленные на рисунке 11 показывают, что ингибитор индуцибельной NOS, ITU (50 (iM) только частично снизил индуцированное тепловым шоком накопление HSP70 в макрофагах антивоспалительного фенотипа На этом же рисунке видно, что непроникающая в клетки ловушка внеклеточного NO с-РТЮ (ЮОрМ) не оказывала влияния на индуцированный тепловым шоком синтез HSP70 в антивоспалительных макрофагах

Эти данные означают, что внутриклеточные механизмы, регулируемые внутриклеточным N0 могут быть вовлечены в индуцированный тепловым шоком синтез HSP70, тогда как экстраклеточный NO, по-видимому, не играет роли в развитии стресс-ответа макрофагов

HSP70

Антивоспалительный фенотип

О ТШ ТШ+ ТШ+ с-РТЮ ITU

Рисунок 11. Влияние с-РТЮ и ITU на индуцированную тепловым шоком (ТШ) активацию синтеза HSP70 в антивоспалительном фенотипе макрофагов В нативном и провоспалительных макрофагах активации синтеза HSP70 не происходило ни на ТШ, ни на карбикси-РТЮ и ITU

Данные представленные на рисунке 12 и таблице 6 показывают, что ингибирование iNOS с помощью 50 рМ ITU приводило к двукратному увеличению макрофагов антивоспалительного фенотипа, в которых происходила фрагментация ДНК при тепловом шоке

При этом ITU ни как не влиял на провоспалительный и интактный фенотипы макрофагов, ни в контроле, ни при тепловом шоке Экстраклеточная ловушка NO, carboxy-PTIO (ЮОцМ) увеличивала индуцированные тепловым шоком повреждения ДНК во всех фенотипах макрофагов

Таблица 6. Влияние геплового шока (42 С, I чае) па количество клеток е фрагментирован ной Д1IK в разных фенотипах макрофагов и эффекты carboxy-РТЮ, непроникающей п клетки лопушки NO. и ITU, селективного ¡NOS ингибитора на действие теплового шока.

Количества kjil'tok с фрвгмйнгнровашой ДНК, %

н, лпс H ЛПС-Р, 6ч ЛПС-Р. 6ч ЛПС-Р. 6ч

бч -Р 72ч +ТШ+ -КТШ+сРТЮ), +(ТШ+П'Ш,

6ч Н.37°С. +CPT1D, 37ЛС. + l'IU.37l,C.

72ч 72ч 72ч

НФ <1 <1 4+1 5+1 12+2 6+3

ПР.Ф cl 4+1 13+3 5+3

ЛПФ <] 31+4 68+8 58+7

11 -- нормальные условия. 11Ф - иагивный фенотип, 11ВФ про-, н АНФ -аигивоспалительщй фекопш, 37"С; ЛПС-Р стадия JII (Срепрограммирования; ТП! -ici ¡ловли шок прй42°С, ! часа.

п Тепловой m о к е Тепловой шок~с-РТЮ □ Тепловой шок->Гги

ПВФ

Ригу но к 12. Влияние г ШЛО во го шока (42 С, I чЩ) ни количество клеток с фрагмен тирован ной ДИК в разных фенотипах макрофагов к эффекты C-PTIO и !TU па действие теплового шока.

Обобщая данные этого раздела работы, мы обнаружили, что экстраклеточный и внутриклеточный пулы NO по-разному контролируют ЛПС-индуцированный стресс-ответ, а именно внутриклеточный NO потенцирует стресс-ответ, тогда как экстраклеточный N0 - подавляет его Эти данные, в частности позволяют предположить, почему в антивоспалительном фенотипе макрофагов подавлен ЛПС-индуцированный стресс-ответ Макрофаги синтезируют NO, прежде всего для того чтобы он обеспечивал цитотоксический эффект против патогенов Для этого N0 должен как можно быстрее выделиться из макрофагов в экстраклеточное пространство, а не оставаться внутри Поэтому вокруг антивоспалительных макрофагов, которые характеризуются более высокой, по сравнению с провоспалительными макрофагами, продукцией NO (Zhang, Morrison, 1993) имеется и более высокая концентрация NO, которая, по непонятному пока механизму, препятствует развитию ЛПС-индуцированного стресс-ответа

Мы также обнаружили, что экстраклеточный и внутриклеточный пулы NO по-разному контролируют ЛПС-индуцированный апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов Поскольку ЛПС-индуцированная активация синтеза HSP70 в провоспалительном фенотипе контролируется NO, резонно предположить, что производимый макрофагами NO может играть двойственную роль в регуляции про- и анти-апоптотических/некротических ответов ЛПС-стимулированных макрофагов Действительно, NO может способствовать или активировать апоптотические события, действуя внутриклеточно, а с другой стороны, NO через активацию антиапоптотических HSP70 и благодаря действию на экстраклеточные мишени, может опосредовать увеличение резистентности к апоптоз/некрозу Баланс между двумя этими разнонаправленными, контролируемыми NO ответами в конечном итоге будет определять резистентность ЛПС-стимулированных макрофагов к апоптоз/некрозу

Мы показали, что в отличие от ЛПС, S aureus вызывает стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе и практически не вызывает в провоспалительном Интересно, что инактивация внешнего NO, как в случае с ЛПС, так и в случае с S aureus, приводило к усилению стресс-ответа Ограничение внутриклеточной продукции NO, приводило к блокированию стресс-ответа, в независимости от того вызван ли стресс-ответ действием ЛПС или грамположительных бактерий А отсюда важное обобщение при взаимодействии макрофагов с бактериями, в независимости от механизма индукции стресс-ответа (рецепторный или рецепторно-фагоцитарный), внутриклеточный NO опосредует развитие стресс-ответа, тогда как, внеклеточный NO сдерживает или полностью блокирует его

S aureus вызывал апоптоз/некроз в антивоспалительном фенотипе макрофагов, тогда как ЛПС в провоспалительном Однако, вне зависимости от того, какой тип бактерий (грамположительный или грамотрицательный) индуцировал апоптоз/некроз и вне зависимости от того, в каком фенотипе это

произошло, инактивация внешнего NO приводило к усилению апоптоз/некроза Отсюда следует вывод биологическая значимость внеклеточного N0, состоит не только в том, чтобы обеспечить цитотоксическую функцию, но и в том, чтобы аутокринным образом защитить макрофаги в агрессивной среде

Сравнивая эффекты блокирования iNOS на апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов при действии ЛПС и S aureus, можно сделать вывод о дифференциальной специфической роли внутриклеточного N0 в отношении апоптоз/некроза макрофагов Действительно при ЛПС-индуцированном апоптоз/некрозе провоспалительного фенотипа макрофагов, блокатор iNOS существенно ограничивал развитие апоптоз/некроза Очевидно, что в этом случае внутриклеточный NO играет про-апототическую/некротическую роль Результаты данной работы показывают, что при S aureus-индуцированном апоптоз/некрозе антивоспалительного фенотипа макрофагов, блокатор ¡NOS значительно усиливал апоптоз/некроз А это значит, что в этом случае внутриклеточный N0 играет анти-апототическую/некротическую роль

Перспектива этих исследования определяется, тем, что возможность селективного влияния на стрессорные и апоптотические/некротические ответы в разных фенотипах макрофагов с помощью препаратов влияющих на разные пулы NO может помочь исследователям в разработке новых подходов для лечения заболеваний связанных с инфекцией

Далее мы обнаружили, что внутриклеточный NO только частично опосредует индуцированную тепловым шоком активацию синтеза HSP70 и потенцирует механизмы защиты ДНК в антивоспалительном фенотипе макрофагов Вместе с тем, внеклеточный NO, по-видимому, не вовлечен в регуляцию синтеза HSP70 при тепловом шоке, но защищает все фенотипы макрофагов от индуцированных тепловым шоком повреждений ДНК

Наша интерпретация этих результатов состоит в том, что в антивоспалительном фенотипе внутриклеточная NO-зависимая защита ДНК может быть опосредована через активацию синтеза защитных HSP70, тогда как экстраклеточная NO-зависимая защита ДНК в этом и других фенотипах обусловлена другими механизмами, которые не вовлекают активацию синтеза HSP70 Природа внутриклеточных путей ведущих от активации (NOS к механизмам, контролирующим целостность ДНК остается пока непонятной Вместе с тем уже сейчас можно предположить, что как при действии бактериальных факторов (ЛПС и S aureus), так и при действии теплового шока экстраклеточный NO, синтезируемый макрофагами является компонентом аутокринной защиты и защищает ДНК макрофагов от повреждающего действия как бактериальных, так и физических факторов В то же время внутриклеточный NO проявляет фенотип-специфичный и зависимый от природы действующего фактора эффект на повреждающее действие факторов среды на ДНК

В реальной ситуации в организме, повышение температуры тела может быть обусловлено бактериальной инфекцией Соответственно можно предположить следующую последовательность событий На ранних этапах инфицирования, нативные макрофаги подвергаются действию низких субстимуляторных доз ЛПС, и в результате происходит их репрограммирование или на антивоспалительный, или на провоспалительный фенотип На следующем этапе прогрессирование инфекционного процесса приводит к увеличению концентрации ЛПС и последующему повышению температуры Мы показали, что ЛПС, в отличие от теплового шока, вызывает стресс-ответ в провоспалительном фенотипе и не вызывает в антивоспалительном В случае ЛПС, стресс-ответ индуцируется благодаря взаимодействию ЛПС с рецепторами на поверхности макрофагов и в результате интернализации, тогда как в случае теплового шока, стресс-ответ индуцируется благодаря денатурации внутриклеточных белков Связывание внешнего N0, в случае с ЛПС приводило к усилению стресс-ответа, а в случае теплового шока ни как не влияло на стресс-ответ макрофагов Ограничение внутриклеточной продукции NO, приводило к блокированию стресс-ответа, в независимости от того вызван ли стресс-ответ действием ЛПС, или тепловым шоком А отсюда следует важное обобщение При действии на макрофаги бактериальных или физических факторов, в независимости от механизма индукции стресс-ответа (рецепторный или денатурация внутриклеточных белков), внутриклеточный NO опосредует развитие стресс-ответа, тогда как внеклеточный N0 блокирует его развитие при действии бактериальных факторов и не влияет на развитие стресс-ответа при действии физических факторов

ЛПС вызывал апоптоз/некроз в провоспалительном фенотипе, тогда как тепловой шок в антивоспалительном Однако вне зависимости от того, какой фактор индуцировал апоптоз/некроз (биологический или физический) и вне зависимости от того, в каком фенотипе это произошло, связывание внешнего NO приводило к усилению апоптоз/некроза Отсюда следует еще один важный вывод Биологическая значимость секретируемого макрофагами N0, состоит не только в том, чтобы обеспечить цитотоксический эффект макрофагов, но и в том, чтобы аутокринным образом защитить макрофаги от агрессивного действия физических и биологических факторов

Сравнивая эффекты блокирования «NOS на апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов при действии ЛПС и теплового шока, можно сделать вывод о дифференциальной специфической роли внутриклеточного NO в отношении апоптоз/некроза макрофагов

Действительно при ЛПС-индуцированном апоптоз/некрозе провоспалительного фенотипа макрофагов, блокатор «NOS существенно ограничивал развитие апоптоз/некроза Очевидно, что в этом случае внутриклеточный NO играет про-апототическую/некротическую роль При индуцированном тепловом шоке апоптоз/некрозе антивоспалительного

фенотипа макрофагов, блокатор «NOS значительно усиливал апоптоз/некроз А это значит, что в этом случае внутриклеточный NO играет анти-апототическую/некротическую роль

Таким образом, NO представляет собой мультимодальный сигнал, который может активировать разные клеточные ответы в зависимости от своей внутриклеточной или внеклеточной локализации и концентрации, природы действующего фактора и фенотипа макрофагов

В целом можно сделать очень важный вывод с помощью модулирования концентрации NO можно селективно усиливать или ослаблять апоптоз/некроз в том или ином фенотипе макрофагов Именно такой подход будет использован для решения важной практической задачи оценить возможность избирательного запуска апоптоз/некроза в провоспалительных макрофагах, выделенных от людей с воспалительным заболеванием, с целью коррекции секреторной активности всего пула макрофагов Результаты этих экспериментов представлены ниже

Избирательная индукция апоптоз/некроза как способ регуляции воспалительной активности пула макрофагов

Воздействия, с помощью которых можно регулировать соотношение продуцируемых макрофагами провоспалительных и антивоспалительных цитокинов, могут обладать значительным терапевтическим потенциалом в лечение заболеваний связанных с воспалением Первый важный этап проверки этой гипотезы состоит в том, чтобы показать, что действительно существует принципиальная возможность регулировать соотношение продуцируемых макрофагами провоспалительных и антивоспалительных цитокинов При решении этого этапа надо иметь ввиду две важные предпосылки 1) при развитии воспалительного заболевания, популяция макрофагов в организме неоднородна, а состоит из макрофагов разных фенотипов, продуцирующих преимущественно провоспалительные или антивоспалительные цитокины и 2) мы показали, что с помощью ITU, селективного ингибитора «NOS, и carboxy-РТЮ, NO ловушки, которая не проникает в клетку (Maeda et al, 1995) можно избирательно усиливать ЛПС-индуцированный апоптоз/некроз или только в провоспалительном фенотипе макрофагов, или напротив только в антивоспалительном фенотипе и таким образом соответственно снижать продукцию провоспалительных цитокинов, или антивоспалительных цитокинов

Мы провели исследование на альвеолярных макрофагах больных легочным саркоидозом, которые в условиях культуры обладают выраженной провоспалительной активностью (Moller et al, 1996, Tong et al, 2003) Нарушение баланса провоспалительных и антивоспалительных цитокинов играет основную роль в исходах легочного саркоидоза (Marques et al, 1999, Tong et al, 2003)

Цель работы состояла в том, чтобы in vitro с помощью селективного усиления апоптоз/некроза провоспалительных макрофагов изменить соотношение продуцируемых провоспалительных и антивоспалительных циюкинов в пользу антивоспалительных, и таким образом снизить чрезмерную патогенную провоспалительную активность макрофагов, выделенных от больных с легочным саркоидозом

Характеристика секреторной активности популяции альвеолярных моноцитов/макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом.

Саркоидоз - мультиорганное заболевание с неизвестной этиологией Это заболевание характеризуется формированием в органах Т-клеточных мононуклеарных инфильтратов и гранулем и искажением нормальной микроархитектуры ткани (Costabel, 2001) В ходе саркоидного альвеолита, производится большое количество цитокинов, растворимых рецепторов цитокинов и растворимых молекул адгезии, которые способны привлекать и активировать иммуннокомпетентные клетки При развитии заболевания альвеолярные моноциты/макрофаги производят разнообразные цитокины, включая TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и трансформирующий фактор роста бета (Baughman et al, 1990, Minshall et al, 1997, Prior et al, 1996, Zheng et al, 1995, Girgis et al, 1995, Moller et al, 1996, Agostim et al, 1996,) При саркоидозе, TNF-a и другие цитокины играют критическую роль в формировании скопления воспалительных клеток, гранулем и фиброгенезе

Секреторную активность изолированных альвеолярных макрофагов оценивали по продукции провоспалительных цитокинов, таких как TNF-a, IL-ip и антивоспалительных, таких как IL-6 и IL-10 (Opal, DePalo, 2000, Xing et al, 1998) Для количественного описания соотношения провоспалительных и антивоспалительных цитокинов, мы ввели условный индекс, индекс воспалительной активности (ИВА)

[TNF а] + (IL Iß]

ива --—;—- xioo

[il 6| +[il-10]

Здесь [Y] - концентрация цитокина «Y» в пг/мл

Данные представленные в таблице 6 и на рисунке 13 характеризуют секреторную активность популяции альвеолярных моноцитов/макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом до и после стимуляции ЛПС (500 нг/мл) Видно, что стимуляция альвеолярных моноцитов/макрофагов с помощью ЛПС привела к увеличению как провоспалительных, так и антивоспалительных цитокинов При этом продукция провоспалительных

цитокинов ТОТ-а и 1Ь-1(3 увеличилась в 12 и 4,4 раза соответственно, тогда как продукция антивоспалительных цитокинов 1Ь-6 и 1Ь-10 увеличилась в 3,7 и 5 раз, соответственно

Таблица 6. Секреторная активность популяции альвеолярных моноцитов/макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом до (I) и в ответ на стимуляцию ЛПС (500 нг/мл) (II)

Измеряемые параметры Без ЛПС I ЛПС II

TNF-a, рг/мл 2232 ± 903 27157+5741**

IL-lp, рг/мл 2029 ± 790 8971 ±2067*

IL-6, рг/мл 11945 ±4013 44343 ±7310**

IL-10, рг/мл 957 ± 597 4864 ± 1435*

Индекс воспалительной 33,03 73,42

активности

Достоверность отличий между группами * р<0 05, ** р<0 01

В результате значительного увеличения продукции провоспалительного цитокина TNF-a, по сравнению с антивоспалительными цитокинами, индекс воспалительной активности альвеолярных моноцитов/макрофагов при стимуляции ЛПС увеличился более чем в 2 раза, с 33,03 до 73,42 (Таблица 6)

Таким образом, альвеолярные моноциты/макрофаги, выделенные от больных острым легочным саркоидозом при стимуляции ЛПС имеют выраженную суммарную провоспалительную активность Наши данные представленные в таблице 1, согласуются с данными других авторов (Baughman et al, 1990, Prior et al, 1996, Zheng et al, 1995, Girgis et al, 1995)

□ -л пс ■ +г пс

■15М0

с 4МЖ0 I I Э5СОО

* 5. зоооо

п

| I КШ)

Т^-а 11.-1 11.-6 И-10

Рисунок 13. Секреторная активность популяции Альвеолярных моноцитов/макрофагов выделенных от больных острым легочным саршйдозом до (-ЛИС) и в ответ на стимуляцию ЛПС (500 ш/мл) (+Л ПС). (I рафик построен поданным Таблицы 6.)

Избирательный атптоз/некроз прпщспаиител ьног& фенотипа в смеси разных фенотипов альвеолярных моноцитов/макрофагов изменяет секреторную активность всего пула с проваспалитель ной на антивоспалительную.

Результаты изложенные выше показывают, что инкубирование макрофагов вместе с Л11С и карбокси-РТЮ- нс-првникающей в клетки ловушкой N0. вызывают существенную гибель макрофагов про воспалительного фенотипа. При этом и а нти воспалительном фенотипе лпоптоз/некроз не развивается. Таким образом, у нас были основания думать, что в смешанной попу.тяпии. состоящей как из про воспалительных» гак и ант и вое н ал ит%п,н ы х макрофагон, совместное культивирование с ЛПС и карбоксн-РТЮ, может обеспечить избирательное элиминирование части макрофагов про воспалительного фенотипа и. таким образом, снизить продукцию лровоепалительньй цигакипов.

Изолированные альвеолярные макрофаги выделенные от больные острым легочным саркоидозом были разделены на два пула. Один пул культивировали в течение 20 часов при 37 С, без каких либо воздействий в стандартных кулыуральных условиях. Что был контрольный пул макрофагов. Второй пул инкубировали с Л! 1С 500 кг/мл и с карбойёи-РПО 100 мкМ также в течение 20 часов, для избирательного удаления про воспалительного фенотипа. Эту процедуру мы назвали «ЛПС-РТЮ прекопдинионнрованием», После этого следовала процедура «отмывки» в геадние 4 часов, когда культуральная срсда

заменялась средой не содержащей ни ЛПС, ни карбокси-РТЮ После отмывки в обоих пулах макрофагов оценивали апоптоз/некроз и продукцию цитокинов Апоптотическую/некротическую гибель макрофагов подтверждали с помощью методики проточной цитометрии. Дальше оба пула макрофагов были стимулированы ЛПС в концентрации 500 нг/мл После этого в макрофагах оценивали апоптоз/некроз, а в культуральной среде - содержание провоспалительных и антивоспалительных цитокинов

Результаты представленные в таблице 7 и на рисунке 14 показывают, что инкубирование альвеолярных макрофагов больных острым легочным саркоидозом вместе с ЛПС приводит к гибели почти 6% клеток Инкубирование альвеолярных макрофагов вместе с ЛПС и сагЬоху-РТЮ, вызвало существенную гибель макрофагов, в этом случае погибло более 15% клеток При этом после ЛПС-РТЮ прекондиционирования стимуляция альвеолярных макрофагов ЛПС практически не увеличивает количество клеток с фрагментированной ДНК Важно отметить, что карбокси-РТЮ, сам по себе не индуцировал фрагментацию ДНК в альвеолярных макрофагах

Таким образом, также как на макрофагах мышей экстраклеточная ловушка N0, карбокси-РТЮ потенцировала ЛПС-индуцированный апоптоз/некроз альвеолярных макрофагов выделенных у больных острым легочным саркоидозом

Действительно ли при действии ЛПС и карбокси-РТЮ на альвеолярные макрофаги больных легочным саркоидозом элиминируется провоспалительный фенотип Данные таблицы 8 и рисунка 15 показывают, что это так

Таблица 7. Количество клеток с фрагментированной ДНК в популяции альвеолярных моноцитов/макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом, стимулированных ЛПС после ЛПС-РТЮ прекондиционирования (П)

Измеряемые параметры без ЛПС I ЛПС II без ЛПС послеП III ЛПС после П IV

Клетки с фрагментированной ДНК, % 1 1+02 5 9 + 16* 15 3 + 2 9* 16,1 ±3 2

Достоверность отличий между группами * - р<0,05 между I и II группами,т - р<0,01 между I и III группами

-ППС +ЛПС +П-ЛПС +П+ЛПС

Рисунок 14. Количество к лсток с фрашептиро ванной ДИК в популяции альвеолярных макрофагов выделенных от больных легочным саркоидозом, стимулированный Л ПС после 11 (график построен па основе данных Таблицы 7).

Видно, что прекондиционированае привело к снижению продукции 11 ровоспадительн ы х питокинов: TNF-й с 2232 ± 903 pi /мл до 1528 ± 581 pi /мл. a 1L-1B с 2029 ± 790 рг/мл до 1723 ± 483 рг/мл. Однако это снижение Проявлялось лишь в виде тенденции.

Таблица S. Секреторная активность популяции альвеолярных макрофагов выделенных от больных легочным саркоидозоч. стимулированных .ЛПС после Л11С-РТЮ п реко нд и шон игровая щ (I I).

Измеряемые параметры 6ïî лпе 1 лк: II 6«.ПК ппеле 11 III Л ПС u'iv.'v П IV

TNF-«, рг/мл 2232 ±903 27157± 574!** 1528 ± 581 ЧХ47 ± 1766"

П.-ф. prfe 2029 ±790 8971 ±2067* 172,1 ± 483 7303 ± 1470

IL-6. рг/мл 11945 i 40t3 44343± 7310s* 10(165 ± 3579 54107 ± 49R0

1L-IQ. pi/мл 457 ± 597 4Я64+ 1435s 80.1 i 275 }014 ± 704

Индекс впспз.'!» г. ükihuhucth .13,03 73,42 29,91 4(..2(»

Достоверность отличий между группами: 4 - р<0 05 между I и II i руппамл;4 - р<0,05 между И и IV группами

45000 40000

д 1 №000

| о. ЭОООО о. Ф 25000г | гоооо

? | 15000

5 £ 10000

3 5000 0

ТМР-а 1Ы 11.-6 1и-10

Рисунок 15- Секреторная активность популяции альвеолярных моноии гов/чакрофа! он выделенных от больных острым легочным саркоидозом, стимулированных ЛИС после апоптотичсского прекондипиониига (А 11 ). (График построен на основе данных Таблицы 8.)

11 ролу кция антивоспал ител ьньй цитокинов ТЬ-6 н Ц,-10 после прскондициопировапия. я отсутствии стимуляции ЛПС практически не изменилась. В результате индекс воспалительной активности снизился с 33.03 до 29.91 г>го снижение т акже надо рассматривать только как тенденцию.

Однако, после Л11С-РПО преко нди цко н и рован н я альвеолярных макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом произошли изменения н способности макрофагов к индукции провоспалительных и антивоспалительных цитокинов в ответ па действие ЛИС. Данные представлены в I аблииах 7, 8 и рисунке 15.

Видно, что пре^йпдициониронание привело к существенному снижению Л11С-ннд\ цированной продукции ТЫР-а альвеолярными макрофагами, выделенными от больных острым легочным саркоидозом. Так, без прекондпционировапни, н ответ на действие ЛПС продукции ТМР'-о увеличивалась в 12.17 раз. а после п ре кондиционирования лишь и 6,44 раза П абтица 9). На индукцию остальных цитокинов П.-11111_-6 и 1Ь-!0 с помощью Л11С, нрекопдиционнрование практически не повлияло (Таблица 9). В результате индекс воспалительной активности при действии ЛПС после аиопто1] пческого прекондиционировйшя снизился с 73.42 до 46.20.

Таким образом, можно предположить, что в результате инкубации альвеолярных макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом ь среде содержащей ЛПС и лопушку N0 карбокси-РТТО, апоптотической гибели подвергаются провоспалительный фенотип, Главный вывод, который следует из представленных результатов, еоегоит в том, что с

помощью ЛПС-РТЮ прекондиционирования можно коррегировать воспалительную активность всего пула макрофагов

Дальнейшее развитие и внедрение в клинику метода избирательного апоптоз/некроза определенного фенотипа макрофагов может оказаться весьма перспективным в лечении широкого круга заболеваний, связанных с воспалением

В целом, данные, полученные в этой диссертационной работе, позволяют дополнить существующую теоретическую концепцию о роли макрофагов в иммунитете, в которой регуляторная роль макрофагов в развитии врожденного и адаптивного иммунитета обеспечивается пластичностью макрофагальных секреторный ответов Наши данные позволяют предположить, что существует дополнительный уровень механизмов пластичности иммунного ответа, связанный с макрофагами Он реализуется благодаря избирательной негативной селекции «ненужного» фенотипа макрофагов в ходе врожденного иммунного ответа

Схематически предлагаемая нами концепция о роли макрофагов в механизмах пластичности иммунного ответа, представлена на рисунке 16

Первый механизм, который предопределяет пластичность иммунных ответов организма, реализуется на самых ранних этапах инфекции На этом этапе, в зависимости от концентрации бактериальных продуктов, происходит репрограммирование нативных макрофагов, либо в провоспалительные (ПВ-макрофаги) либо в антивоспалительные (АВ-макрофаги) Таким образом, уже на ранних этапах инфекции предопределяется направление развития врожденного (провоспалительный или антивоспалительный) и приобретенного (гуморальный или клеточный) иммунного ответов

Таблица 9. ЛПС-индуцированная стимуляция провоспалительных и антивоспалительных цитокинов популяцией альвеолярных макрофагов выделенных от больных острым легочным саркоидозом, в отсутствии и с предварительным ЛПС-РТЮ прекондиционированием (П) вызванного сочетанным инкубированием макрофагов с ЛПС и карбокси-РТЮ, непроникающей в клетки ловушки N0 (100 |дМ)

Степень увеличения продукции цитокинов, разы

Измеряемые параметры Стимуляция ЛПС без предварительного П Стимуляция ЛПС после предварительного П

'ШР-а, рг/мл 12 17 644

1Ь-1(3, рг/мл 4 42 4 24

1Ь-6, рг/мл 3 71 3 39

1Ь-10, рг/мл 5 08 3 75

Примечание Таблица 9 построена по результатам Таблицы 8

! 1а следующем этапе развития инфекции, концентрация патогенных микроорганизмов увеличивается, и могут начать действовать физические факторы, такие как гипертермия. 11а этом этапе происходит активации макрофагов и реализация врожденного иммунного ответа в соответствии с заданным ренрограммированием фенотипом макрофагом, а именно макрофаги выбрасывают цитокипы. N0 и другие медиаторы воспаления.

Начало инфекции, ре программирование

Врожденный иммунитет и кс га тин на я селекция мзкрофагоп

Приобретенный иммунитет

------фи^.чсский, ПВ-иАВ-

--"л- ______. макрэфааи

Гуморальный иммунный отует (Th2)

низкие высокие

дозы ДОЗЫ

патогена патогена

Естественный

КипПвр

ThO пичфоцит

Thl пич фонит Клеточный иммунный OTaar^Thl)

Рисунок 16. Роль макрофагов в механизмах пластичности иммунного ответа (объяснения н тексте). ПВ- и АВ-макрофаги: провоспали тельные и а! гги во спасительные макрофаги, соответственно; ГКГ-И - молекулы главного комплекса гистосовмсетимоста П класса.

На этапе врожденного иммунного ответа реализуется второй механизм пластичности иммунного ответа — негативная селекция макрофагов по их функциональному фенотипу секреторной активности. I !одобно тому, как происходит негативная селекция лимфоцитом в тимусе - с помощью ашптоз/некроза элиминируется «нецелесообразный» фенотип макрофагов.

Селективное развитие апоптоз/пекроза в том или ином фенотипе макрофагов зависит от I ) функциональной активности макрофага, 2) природы

действующего на макрофаг фактора (бактериальные или физические) и 3) концентрации внутриклеточного и внеклеточного N0

В этой работе, мы показали, что локализация и концентрация N0 играет важную роль в механизмах селективного элиминирования макрофагов Однако не исключено, что и продуцируемые макрофагами цитокины и другие медиаторы воспаления также могут играть роль в фенотип-зависимой индукции апоптоз/некроза Хотя в нашей работе этот вопрос не рассматривался, он, несомненно, заслуживает изучения

Негативная специфическая селекция макрофагов на этапе врожденного иммунного ответа, позволяет быстро подстроить секреторную активность всего пула макрофагов в зависимости от окружающих условий и специфики развития инфекционного процесса Модулирование секреторной активности, то есть обеспечение преимущественной продукции или провоспалительных, или антивоспалительных цитокинов, позволяет более точно и целесообразно задать направление развития приобретенного иммунного ответа - по гуморальному или клеточному типу

Предлагаемые нами дополнения в существующую концепцию пластичности иммунного ответа, несомненно, нуждаются в дальнейшей экспериментальной проверке, однако уже сейчас можно утверждать, что негативная специфическая селекция макрофагов, в зависимости от их функциональной активности, составляет новое и важное звено в механизмах пластичности иммунитета

выводы

1 Нативные и провоспалительные макрофаги в ответ на стимуляцию ЛПС последовательно индуцируют стресс-ответ и апоптоз/некроз При этом стресс-ответ в ЛПС-стимулированных макрофагах провоспалительного фенотипа играет анти-апоптотическую/некротическую роль Макрофаги антивоспалительного фенотипа напротив ингибируют эти клеточные ответы Ингибирование стресс-ответа в антивоспалительных макрофагах происходит за счет ограничения активации фактора транскрипции HSF1

2 В отличие от ЛПС, S aureus вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа Это означает, что бактериальные факторы, взаимодействующие с рецепторами макрофагов (ЛПС) и бактериальные факторы, индуцирующие кроме этого фагоцитарную активность макрофагов (5 aureus) обладают противоположной способностью индуцировать стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов

3 В отличие от ЛПС, тепловой шок вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа Это означает, что бактериальные факторы, взаимодействующие с рецепторами макрофагов (ЛПС) и физические (температура) факторы, вызывающие внутриклеточную денатурацию белков, обладают противоположной способностью индуцировать стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов

4 ЛПС-зависимое репрограммирование секреторной активности макрофагов обеспечивает высокий уровень пластичности макрофагов в модуляции своих стрессорного и апоптотического/некротического ответов, проявление которых зависит как от фенотипического потенциала макрофагов, так и от природы (бактериальная или физическая) активирующего фактора

5 Внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет противоположную роль в регуляции ЛПС-индуцированного стресс-ответа внутриклеточный NO потенциирует, а внеклеточный напротив угнетает его Эти эффекты NO не зависят от фенотипа макрофагов

6 Внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет дифференциальную роль в регуляции ЛПС-индуцированного апоптоза/некроза в нативном и провоспалительном фенотипах макрофагов внутриклеточный NO играет про-апототическую/некротическую роль, тогда как в антивоспалительном фенотипе - анти-апоптотическую/некротическую

Внеклеточный NO, синтезируемый макрофагами защищает их от ЛПС-индуцированного апоптоза/некроза

7 Внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет разную роль в регуляции индуцированного S aureus стресс-ответа внутриклеточный N0 потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе, а внеклеточный NO ограничивает развитие индуцированного S aureus стресс-ответа

8 Внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет анти-апоптотическую/некротическую роль при развитии индуцированного S aureus апоптоза/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов В нативном и провоспалительном фенотипе, ни внутриклеточный, ни внеклеточный N0 не вовлечены в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов макрофагов при действии S aureus

9 Внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет разную роль в регуляции индуцированного тепловым шоком стресс-ответа внутриклеточный N0 потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе макрофагов, а внеклеточный NO не оказывает влияния

10 Внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет анти-апоптотическую/некротическую роль при развитии индуцированного тепловым шоком апоптоза/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов В нативном и провоспалительном фенотипе, внеклеточный NO также играет анти-апоптотическую/некротическую роль и полностью подавляет развитие индуцированного тепловым шоком апоптоза/некроза В нативном и провоспалительном фенотипе макрофагов, внутриклеточный NO не вовлечен в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов при действии теплового шока

11 Эффекты NO в регуляции клеточных ответов макрофагов зависят от фенотипа секреторной активности макрофагов, от modus operandi (внеклеточного или внутриклеточного) и от природы действующего на макрофаги фактора

12 С помощью избирательного элиминирования провоспалительных альвеолярных макрофагов in vitro можно менять характер секреторной активности всей популяции альвеолярных макрофагов, выделенных от больных с легочным саркоидозом

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты данной работы открывают перспективу разработки новой практической стратегии борьбы с воспалительным процессом Суть этой стратегии состоит в изменении секреторной активности макрофагов с помощью селективного удаления из популяции патогенетического фенотипа (про- или антивоспалительного) Кроме того, создается перспектива создания новой генерации лекарств, способных блокировать внешний пул оксида азота в очаге воспаления с целью элиминирования провоспалительного фенотипа макрофагов из очагов избыточного воспаления И, наконец, в процессе культивирования клеток возможно формирование определенной секреторной активности клеток, то есть создание анти- или провоспалительного фенотипа всей клеточной культуры, для ее дальнейшего использования в лечении воспалительных заболеваний

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Малышева Е.В., Замотринский А В , Малышев И Ю Роль белков теплового шока в формировании стрессустойчивости у разных генетических линий животных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1994 - Т 7 - С 11-13

2 Малышева Е.В., Замотринский А В , Малышев И Ю Развитие феномена адаптационной стабилизации структур и адаптационная защита сердца у крыс разных генетических линий роль белков теплового шока hsp 70 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1994 - Т 8 - С 126129

3 Malyshev I, Malysheva Е. Differential stress and adaptive responses in rats of different genetic lines the role of hsp 70 //J Mol Cell Cardiol - 1994 -

N 11 - Vol 26 -CCIX (abstr 46)

4 Malyshev I, Vanm A F, Mikoyan V D , Kubrina L N , Malysheva E., Manukhina E В Difference in heat-induced synthesis of nitric oxide in the heart and other organs of different genetic lines //J Mol Cell Cardiol - July 1995 -Vol 27 - N7 - abstr Tul58

5 Манухина E Б, Азаматов 3 3 , Малышева E.B., Малышев И Ю Гиперактивация эндотелия при тепловом шоке у крыс разных генетических линий // Физиологический журнал - 1996 - Т 82 - № 5-6 -С 60-66

6 Микоян В Д , Кубрина J1 Н , Манухина Е Б , Малышева Е.В., Малышев И Ю , Ванин А Ф Различия в стимуляции синтеза NO при тепловом шоке у крыс разных генетических линий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1996 - Т 6 - С 634-637

7 Malyshev I Yu, Malugin А V , Manukhina Е В , Larionov N Р, Malenyuk

Е В , Malysheva E.V., Mikoyan V D , Vanin A F Is HSP70 Involved in nitric oxide-induced protection of the heart9 // Physiology Research - 1996 - Vol 45 -P 267-272

8 Malyshev I Yu , Manukhina E В , Malenyuk E В , Malysheva E.V., Mikoyan V D , Vanm A F Nitric oxide activates HSP70 synthesis and protects heart against ischemia and reperfusion 1996, In "Adaptation Biology and Medicine" ed by В К Shmara, N Takeda, P К Ganguly and P К Smgal Narosa Publishing House, Vol 1, Narosa Publishing House, New Delhi, 1996, p 409-418

9 Malyshev I Yu , Manukhina E В , Malysheva E.V., Vanin A F The role of nitric oxide in activation of HSP70 synthesis and adaptive protection of the heart // Abstracts of 72 Fyziologicke dm, Bratislava, 5-7 February 1996 P 13

10 Malyshev I Yu , Malenyuk E В , Malysheva E.Y , Manukhina E В , Vanin A F NO activates HSP70 synthesis and protects the heart - In Second International Congress, Stockholm, August, 29-30, 1997 NO in cardiovascular regulation and intensive care 1997, P 73

11 Малышев И Ю , Малышева Е.В. Белки теплового шока и защита сердца // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1998 - Т 126 - № 12-С 604-611

12 Малышев И Ю, Круглое С В, Бахтина JIЮ, Малышева Е.В., Зубин М, Норкин М Стресс-ответ и апоптоз/некроз в про- и антивоспалительном фенотипе макрофагов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2004 - Т 138 - № 8 - С 162-165

13 Малышев И Ю , Пшенникова М Г , Шимкович М В , Малышева Е.В Ингибитор каспаз Z-VAD-FMK потенцирует индуцированный тепловым шоком апоптоз/некроз и синтез HSP70 в макрофагах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2004 - Т 138 - № 9 -С 261-264

Воспалительные реакции организма играют исключительно важную роль в развитии большого количества патологических состояний и серьезных социально значимых заболеваний, таких как сепсис, атеросклероз, диабет, злокачественные новообразования, ишемические повреждения сердца и нейродегенеративные нарушения функций мозга. В связи с этим, понимание молекулярных и клеточных механизмов воспалительной реакции и возможности ее модулирования является одной из фундаментальных проблем современной биологии и медицины.

Актуальность данной работы определяется тем, что она посвящена изучению основного клеточного звена воспалительной реакции - макрофагов, и репрограмированию их воспалительных, стрессорных и апоптотических/некротических ответов.

Макрофаги играют центральную регуляторную роль в инициации и развитии воспалительных реакций организма. Это обусловлено способностью макрофагов воспринимать ничтожно малые количества патогенных бактериальных и вирусных продуктов как сигнал к активации. Активированные макрофаги продуцируют свободные кислородные радикалы, оксид азота (N0), цитокины, кемокины и другие медиаторы воспаления. Благодаря этому макрофаги обезвреживают патогенные бактерии и запускают каскад иммунных реакций, определяющих специфику врожденного и адаптивного иммунных ответов организма. В зависимости от типа и количества действующего инфицирующего фактора, нативные макрофаги альтернативно приобретают специфический фенотип: или провоспалительный или анти-воспалительный. Провоспалительный фенотип характеризуется усиленной продукцией провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 (IL-1), IL-12, и фактор некроза опухолей-а (TNF-а). Антивоспалительный фенотип характеризуется сниженной продукцией провоспалительных цитокинов и усиленной продукцией N0 и анти-воспалительных цитокинов, таких как IL-10. Процесс трансформации фенотипа макрофагов был обозначен термином «репрограммирование» (Zhang et al., 1993).

В фокусе воспаления макрофаги функционируют в неблагоприятных условиях. Для того чтобы противостоять токсическим эффектам цитокинов, свободных радикалов, бактериальных продуктов, таких как липополисахариды (ЛПС) и гипертермии, сопровождающей воспаление, макрофаги активируют самозащитный стресс-ответ (Knight, 2000; Ishii, et а!., 1999). Ключевым компонентом стресс-ответа являются белки теплового шока HSP70 (Bachelet, et al., 1998). Однако длительное время жизни активированных макрофагов и избыточная продукция медиаторов воспаления может инициировать развитие разных заболеваний. Для ограничения избыточного воспалительного ответа в макрофагах активируется апоптоз или они гибнут в результате некроза. В регуляции стресс-ответа (Malyshev et al., 1999) и регулируемой гибели клеток (Albina et.al., 1993) важную роль играет NO.

Баланс между защитным стресс-ответом и апоптозом/некрозом определяет время жизни макрофагов и соответственно длительность их секреторной активности. На начальных стадиях развития иммунного ответа, популяция макрофагов в организме неоднородна. Она может состоять из макрофагов нативного, провоспалительного и антивоспалительного фенотипов. Не исключено, что изменение баланса «стресс-ответ - апоптоз/некроз-ответ» в провоспалительных и антивоспалительных макрофагах играет важную роль в выборе между провоспалительным или антивоспалительным направлением суммарной активности всей популяции макрофагов, и, следовательно, развитием или предупреждением большого количества заболеваний. Однако важный вопрос о специфике баланса «стресс-ответ -апоптоз/некроз-ответ» в разных фенотипах макрофагов не изучен.

Большое количество данных свидетельствует о том, что клеточные ответы макрофагов контролируются N0. Основными молекулярными мишенями N0 являются SH-группы разных белков (Molina у Vedia et al., 1992; Gomez-Vargas et al., 1999; Galigniana, Piwien-Pilipuk, Assreuy, 1999) и железосодержащие белки (H'ibbs et al., 1988). NO индуцирует прямую модификацию белков через нитрозилирование, или опосредованно оказывает влияние на метилирование и рибозилирование. В макрофагах, N0 синтезируется индуцибельной NO-синтазой (/NOS) в цитоплазме и свободно проникает из клетки в клетку через клеточные мембраны, взаимодействуя на своем пути с различными биологическими структурами как внутриклеточными, так и внеклеточными. Было показано, что в ядре N0 вызывает мутации генов (Juedes, Wogan, 1996) и ингибирование ферментов репарации ДНК (Kwon, Stuehr, Nathan, 1991; Lepoivre et al., 1991). В цитоплазме N0 может активировать гуанилатциклазу (Levonen et al., 2001) и ингибировать /'NOS (Han et al., 2001) и некоторые митохондриальные ферменты (Brooks, Hargreaves, Bates et al., 2000; Park et al., 1999). Экстраклеточный NO может, по-видимому, нитрозилировать SH-группы экстраклеточных доменов мембранных рецепторов (Galigniana,

Рмлеп-РШрик, Аэзгеиу, 1999) и, следовательно, интерферировать со специфическими сигнальными путями.

Соответственно, можно предположить, что N0 может проявлять различные эффекты на клеточные ответы в зависимости от того, на какие преимущественно мишени внеклеточные (включая мишени на поверхности клеток) или внутриклеточные он действует. Однако и этот важный вопрос 1ЧО-зависимой регуляции воспалительной реакции макрофагов и других клеточных ответов не изучен.

Неадекватный воспалительный ответ является главным первоначальным звеном развития таких заболеваний как коронарная недостаточность, диабетическая ангиопатия, инсульт, инфаркт миокарда, почечная недостаточность, легочной саркоидоз и др. Воспалительная реакция всей популяции макрофагов зависит от соотношения в ней провоспалительных и антивоспалительных макрофагов. В соответствии с этим, оценка фенотипа макрофагов вовлеченных в воспалительный процесс и возможность модулирования секреторной активности всей популяции макрофагов с помощью избирательной гибели конкретного «патогенного» фенотипа могло бы иметь большое научное и медицинское значение.

Обозначенные выше открытые вопросы регуляции воспалительной реакции ограничивают наше понимание развития иммунного ответа в целом и возможности коррекции неадекватного воспаления при развитии широкого спектра заболеваний.

Цель настоящей работы состояла в изучении стрессорных и апоптотических/некротических ответов провоспалительных и антивоспалительных фенотипов макрофагов, МО-зависимой регуляции этих клеточных ответов и возможности направленного модулирования воспалительной реакции макрофагов.

Для достижения этой цели решались следующие основные задачи:

1. Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз-ответ, индуцируемый бактериальным ЛПС в нативном, провоспалительном и антивоспалительном фенотипах макрофагов;

2. Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз-ответ, индуцируемый

S.aureus в нативном, провоспалительном и антивоспалительном фенотипах макрофагов;

3. Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз-ответ, индуцируемый физическими факторами (тепловой шок) в нативном, провоспалительном и антивоспалительном фенотипах макрофагов;

4. Изучить роль внутриклеточного и внеклеточного NO в стрессорных и апоптотических/некротических ответах нативного, провоспалительного и антивоспалительного фенотипов макрофагов при действии факторов биологической (бактериальный ЛПС и

S.aureus) и физической природы (тепловой шок);

5. Изучить возможности избирательного модулирования стресс-ответа и апоптоза/некроза в нативном, провоспалительном и антивоспалительном фенотипах мышиных макрофагов;

6. Идентифицировать фенотип моноцитов/макрофагов, выделенных от людей с воспалительным заболеванием;

7. Оценить возможность избирательного запуска апоптоза/некроза в провоспалительных макрофагах, выделенных от людей с воспалительным заболеванием, с целью коррекции секреторной активности всего пула моноцитов/макрофагов.

Научная новизна исследования заключается в следующем:

Впервые показано, что нативные и репрограммированные на провоспалительный фенотип макрофаги последовательно индуцируют стресс-ответ и апоптоз/некроз в ответ на длительную стимуляцию ЛПС. Макрофаги репрограмированные на антивоспалительный фенотип напротив полностью блокируют эти ответы. При этом стресс-ответ в ЛПС-стимулированных макрофагах провоспалительного фенотипа играет анти-апоптотическую/неротическую роль: а именно, за счет активации синтеза HSP70, задерживает развитие апоптоза/некроза и ограничивает его интенсивность. Блокирование стресс-ответа в макрофагах антивоспалительного фенотипа происходит на уровне сигнальных путей активации фактора транскрипции HSF1.

Впервые установлено, что в отличие от ЛПС, компонента мембран грамотрицательных бактерий, S.aureus, грамположительная бактерия вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа. Это означает, что бактериальные факторы (ЛПС), взаимодействующие с рецепторами макрофагов и бактериальные факторы (S.aureus), взаимодействующие с рецепторами и индуцирующие фагоцитарную активность макрофагов обладают противоположной способностью индуцировать стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов.

Впервые установлено, что в отличие от ЛПС, тепловой шок вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа. Это означает, что бактериальный ЛПС и физические (температура) факторы обладают противоположной способностью индуцировать стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов.

Впервые установлено, что внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет противоположную роль в регуляции ЛПС-индуцированного стресс-ответа: внутриклеточный N0 потенциирует, а внеклеточный напротив угнетает его. Эти эффекты N0 не зависят от фенотипа макрофагов.

Впервые установлено, что внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет дифференциальную роль в регуляции ЛПС-индуцированного апоптоза/некроза: в нативном и провоспалительном фенотипах макрофагов внутриклеточный N0 продуцируемый ¡ЫОв играет про-апототическую/некротическую роль, тогда как в антивоспалительном фенотипе - анти-апоптотическую/некротическую. Внеклеточный N0, синтезируемый макрофагами защищает их от ЛПС-индуцированного апоптоза/некроза.

Впервые установлено, что внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет разную роль в регуляции индуцированного Э.аигеиБ стресс-ответа: внутриклеточный N0 потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе, а внеклеточный NO ограничивает развитие индуцированного S.aureus стресс-ответа.

Впервые установлено, что внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет антиапоптотическую/некротическую роль при развитии индуцированного S. aureus апоптоза/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов. В нативном и провоспалительном фенотипе, ни внутриклеточный, ни внеклеточный N0 не вовлечены в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов макрофагов при действии S.aureus.

Впервые установлено, что внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет разную роль в регуляции индуцированного тепловым шоком стресс-ответа: внутриклеточный NO потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе макрофагов, а внеклеточный N0 не оказывает влияния.

Впервые установлено, что внеклеточный и внутриклеточный NO, продуцируемый макрофагами играет антиапоптотическую/некротическую роль при развитии индуцированного тепловым шоком апоптоза/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов. В нативном и провоспалительном фенотипе, внеклеточный N0 также играет анти-апоптотическую/некротическую роль и полностью подавляет развитие индуцированного тепловым шоком апоптоза/некроза. В нативном и провоспалительном фенотипе макрофагов, внутриклеточный NO не вовлечен в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов при действии теплового шока.

Впервые показано, что in vitro с помощью избирательного апоптотического/некротического элиминирования провоспалительных альвеолярных макрофагов можно менять характер секреторной активности всей популяции альвеолярных макрофагов, выделенных от больных с легочным саркоидозом.

Теоретическое значение работы заключается:

1) в открытии генерализованного феномена репрограмирования стрессорного и апоптотического/некротического клеточных ответов макрофагов при смене фенотипа их секреторной активности;

2) в определении специфической роли внеклеточного и внутриклеточного NO в регуляции клеточных ответов активированных макрофагов разных фенотипов; и

3) в построении теоретической концепции о роли макрофагов в иммунитете, в которой регуляторная и триггерная роль макрофагов в развитии врожденного и адаптивного иммунитета обеспечивается пластичностью макрофагальных клеточных ответов, проявление которых зависит от фенотипического потенциала макрофагов, от природы патогенного фактора и от концентрации внеклеточного и внутриклеточного NO.

Практическое значение работы состоит в том, что ее результаты открывают перспективы разработки новой стратегии коррекции неадекватного воспалительного процесса с целью терапии широкого спектра заболеваний. Существо новой стратегии состоит в том, чтобы обеспечивать необходимый (терапевтический) характер секреторной активности макрофагов, антивоспалительный или провоспалительный, с помощью удаления из популяции макрофагов in vitro «патогенетического» фенотипа, соответственно провоспалительного или антивоспалительного.

Положения, выносимые на защиту:

1. Альтернативное ЛПС-зависимое репрограммирование фенотипа макрофагов обеспечивает специфическую перестройку механизмов, контролирующих не только воспалительный, но и стрессорный и апоптотические/некротические ответы. Благодаря такой перестройке макрофаги проявляют высокий уровень пластичности в модуляции своих клеточных ответов, проявление которых зависит как от фенотипического потенциала макрофагов, так и от природы активирующего фактора.

2. Эффекты N0 в регуляции клеточных ответов макрофагов зависят от фенотипа секреторной активности макрофагов, от modus operandi (внеклеточного или внутриклеточного) и от природы действующего на макрофаги фактора.

3. Избирательное элиминирование того или иного фенотипа макрофагов может быть одним из способов регуляции секреторной активности всей популяции макрофагов.

Апробация работы: Основные результаты проведенных исследований были представлены на 4 международной конференции

Hypoxia in medicine" (Geneva, Switzerland, 2001), на Всероссийском симпозиуме Физиологического общества (Казань, Россия, 2001), на Конференции в Cold Spring Harbor Laboratory «Molecular chaperones and the heat shock response» (Нью Йорк, США, 2002); на Российском конгрессе «Реактивные формы кислорода, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, Россия, 2005), на Международном Конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), на межлабораторных конференциях в ГУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, на семинаре факультета фундаментальной медицины МГУ, на семинаре на кафедре патофизиологии лечебного факультета Московского Государственного Медико-стоматологического Университета и на семинаре в Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.

Работа выполнена в University of Missouri Kansas City (US) и в Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.

выводы

1. Нативные и провоспалительные макрофаги в ответ на стимуляцию ЛПС последовательно индуцируют стресс-ответ и апоптоз/некроз. При этом стресс-ответ в ЛПС-стимулированных макрофагах провоспалительного фенотипа играет анти-апоптотическую/некротическую роль. Макрофаги антивоспалительного фенотипа напротив ингибируют эти клеточные ответы. Ингибирование стресс-ответа в антивоспалительных макрофагах происходит за счет ограничения активации фактора транскрипции HSF1.

2. В отличие от ЛПС, S.aureus вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа. Это означает, что бактериальные факторы, взаимодействующие с рецепторами макрофагов (ЛПС) и бактериальные факторы, индуцирующие кроме этого фагоцитарную активность макрофагов (S.aureus) обладают противоположной способностью индуцировать стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов.

3. В отличие от ЛПС, тепловой шок вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа. Это означает, что бактериальные факторы, взаимодействующие с рецепторами макрофагов (ЛПС) и физические (температура) факторы, вызывающие внутриклеточную денатурацию белков, обладают противоположной способностью индуцировать стресс-ответ и апоптоз/некроз в разных фенотипах макрофагов.

4. Л ПС-зависимое репрограммирование секреторной активности макрофагов обеспечивает высокий уровень пластичности макрофагов в модуляции своих стрессорного и апоптотического/некротического ответов, проявление которых зависит как от фенотипического потенциала макрофагов, так и от природы (бактериальная или физическая) активирующего фактора.

5. Внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет противоположную роль в регуляции ЛПС-индуцированного стресс-ответа: внутриклеточный N0 потенциирует, а внеклеточный напротив угнетает его. Эти эффекты N0 не зависят от фенотипа макрофагов.

6. Внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет дифференциальную роль в регуляции ЛПС-индуцированного апоптоза/некроза: в нативном и провоспалительном фенотипах макрофагов внутриклеточный N0 играет про-апототическую/некротическую роль, тогда как в антивоспалительном фенотипе - анти-апоптотическую/некротическую. Внеклеточный N0, синтезируемый макрофагами защищает их от ЛПС-индуцированного апоптоза/некроза.

7. Внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет разную роль в регуляции индуцированного Э.аигеиз стресс-ответа: внутриклеточный N0 потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе, а внеклеточный N0 ограничивает развитие индуцированного Э.аигеиз стресс-ответа.

8. Внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет анти-апоптотическую/некротическую роль при развитии индуцированного S.aureus апоптоза/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов. В нативном и провоспалительном фенотипе, ни внутриклеточный, ни внеклеточный N0 не вовлечены в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов макрофагов при действии S.aureus.

9. Внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет разную роль в регуляции индуцированного тепловым шоком стресс-ответа: внутриклеточный N0 потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе макрофагов, а внеклеточный N0 не оказывает влияния.

10. Внеклеточный и внутриклеточный N0, продуцируемый макрофагами играет анти-апоптотическую/некротическую роль при развитии индуцированного тепловым шоком апоптоза/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов. В нативном и провоспалительном фенотипе, внеклеточный N0 также играет анти-апоптотическую/некротическую роль и полностью подавляет развитие индуцированного тепловым шоком апоптоза/некроза. В нативном и провоспалительном фенотипе макрофагов, внутриклеточный NO не вовлечен в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов при действии теплового шока.

11. Эффекты N0 в регуляции клеточных ответов макрофагов зависят от фенотипа секреторной активности макрофагов, от modus operandi (внеклеточного или внутриклеточного) и от природы действующего на макрофаги фактора.

12. С помощью избирательного элиминирования провоспалительных альвеолярных макрофагов in vitro можно менять характер секреторной активности всей популяции альвеолярных макрофагов, выделенных от больных с легочным саркоидозом.