Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль фактора активации тромбоцитов и С-реактивного протеина в регуляции функциональной активности макрофагов

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ШЕБЗУХОВ ЮРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

РОЛЬ ФАКТОРА АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ И С-РЕАКТИВНОГО ПРОТЕИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ.

14.00.36 - аллергология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: кандидат медицинских наук, Мысякин Е.Б. доктор медицинских наук, Юдин С.М.

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................11

1.1. Взаимодействие местной и системной реакций организма на нарушение гомеостаза..............................................................................................................................................................................................................................11

1.2. Макрофаги - основное связующее звено между локальным воспалением, специфическим иммунитетом и острофазным ответом..........................14

1.3. ФАТ - основной регулятор локальной воспалительной реакции..............................16

1 .За. Структура и метаболизм ФАТ............................................................................................................................................16

1.36. ФАТ в качестве внутриклеточного регулятора....................................................................................19

1 .Зв. Рецепторы ФАТ..........................................................................................................................................................................................19

1.3г. Действие ФАТ на макрофаги................................................................................................................................................21

1.4. С-РП - главный реактант острофазного ответа человека........................................................24

1.4а. Структура и лигандная специфичность С-РП..........................................................................................24

1.46. Метаболизм С-РП....................................................................................................................................................................................27

1.4в. Рецепторы С-РП..........................................................................................................................................................................................28

1.4г. Действие С-РП на макрофаги..............................................................................................................................................29

1.5. Взаимодействие ФАТ и С-РП................................................................................................................................................31

СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................................................33

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ............................................................................................................................................................................39

3.1. Исследование влияния С-РП и ФАТ на фагоцитарную активность

макрофагов............................................................................................................................................................................................................................39

3.1а. Изучение действия С-РП на фагоцитарную активность макрофагов..............39

3.16. Изучение действия ФАТ на фагоцитарную активность макрофагов..............41

3.1в. Изучение совместного действия С-РП и ФАТ на фагоцитоз........................................45

3.2. Исследование влияния С-РП и ФАТ на продукцию макрофагами окиси

азота (N0)................................................................................................................................................................................................................................50

3.2а. Сравнительное изучение продукции N0 макрофагами мышей линии

ВАЬВ/с и мышей-гибридов (СВАхС57/В16)р1 под действием С-РП и ЛПС.... 50

3.26. Изучение возможного эффекта примесей ЛПС на индуцированную

С-РП продукцию N0............................................................................................................................................................................................54

3.2в. Выяснение роли индуцибельной >ТО-синтазы (¡N08) в активации

продукции N0 под действием С-РП..................................................................... 57

3.2г. Изучение зависимости уровня продукции N0 от степени активации

макрофагов............................................................................................................................................................................................................................59

3.2д. Изучение действия ФАТ на продукцию N0 макрофагами..............................................63

3.2е. Изучение совместного действия С-РП и ФАТ на продукцию N0........................68

3.3. Исследование влияния С-РП и ФАТ на экспрессию 1а-антигенов на

макрофагах и клетках линии РЗ 8 8Б1......................................................................................................................................71

3.3а. Изучение влияния С-РП на экспрессию 1а-антигенов..............................................................71

3.36. Изучение влияния ФАТ на экспрессию 1а-антигенов................................................................74

З.Зв. Изучение совместного влияния С-РП и ФАТ на экспрессию 1а-

антигенов..................................................................................................................................................................................................................................78

3.4. Исследование функциональной активности комплекса С-РП-ФАТ....................81

3.4а. Изучение влияния комплекса С-РП-ФАТ на продукцию N0......................................81

3.46. Изучение влияния комплекса С-РП-ФАТ на фагоцитарную активность 85 3.4в. Изучение влияния антагонистов ФАТ на фагоцитарную активность,

стимулированную комплексом С-РП-ФАТ..................................................................................................................86

3.5. Сравнительное исследование основных путей внутриклеточной сигнализации, опосредующих действие С-РП, ФАТ и комплекса С-РП-ФАТ 90 3.5а. Изучение влияния коклюшного токсина и генистеина на

индуцированную С-РП и комплексом С-РП-ФАТ продукцию N0......................................90

3.56. Изучение влияния коклюшного токсина и генистеина на фагоцитарную активность, стимулированную ФАТ и комплексом С-РП-ФАТ................................92

3.5в. Изучение влияния стауроспорина и Н-9 на индуцированную С-РП и

комплексом С-РП-ФАТ продукцию N0............................................................................................................................94

3.5г. Изучение влияния ЖЮА и индометацина на индуцированную С-РП и

комплексом С-РП-ФАТ продукцию N0............................................................................................................................98

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................................................................................................100

ВЫВОДЫ.........................................................................................................................................116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................................................................117

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ДАГ - диацилглицерин

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

КСФ - колониестимулирующий фактор

ЛПС - бактериальный липополисахарид

ЛТ - лейкотриен

ОП - острофазные протеины (белки острой фазы воспаления)

ПГ - простагландин

САП - сывороточный амилоид П

С-РП - С-реактивный протеин

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ФАТ-Р - рецептор фактора активации тромбоцитов

ФНО-а - фактор некроза опухоли - а, кахетин

ФХ - фосфохолин

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

[Ca2+]j - внутриклеточное содержание ионов Са2+

C-PS - соматический полисахарид клеточной стенки бактерий

Streptococcus рпеитопеае

FcyR - рецептор Fc-фрагмента иммуноглобулина G G-протеин - ГТФ-связывающий протеин

Ig G - иммуноглобулин G

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

МНС - главный комплекс гистосовместимости

LTA - липотейхоевая кислота

NDGA - нордигидрогуаяретовая кислота

N0 - окись азота, монооксид азота

РКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа, протеинкиназа А

РКС - Ca , липидзависимая протеинкиназа, протеинкиназа С

PL - фосфолипаза

РМА - форболмиристат ацетат

TGF-ß - трансформирующий ростовой фактор-ß

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Взаимодействие локального воспаления и острофазного ответа, обеспечивающее системную реакцию организма на различные нарушения гомеостаза, представляет собой одну из актуальных и до конца не исследованных проблем современной иммунологии [3,78,107]. Это взаимодействие может осуществляться на различных уровнях, одним из которых является система мононуклеарных фагоцитов. Макрофаги не только участвуют в развитии острофазного ответа путем высвобождения его индукторов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а), но одновременно служат объектом воздействия острофазных реактантов и медиаторов местного воспаления, что может обеспечивать координированную регуляцию реакций иммунитета, а также естественной резистентности организма к инфекции и опухолям [11,78]. Однако ассоциированное действие острофазных реактантов и медиаторов локального воспаления на функциональную активность макрофагов и внутриклеточные трансдукционные механизмы, опосредующие это действие, недостаточно исследованы.

С-реактивный протеин (С-РП) и фактор активации тромбоцитов (ФАТ) являются главными эффекторными молекулами, соответственно, острофазного ответа и местного воспаления [128,134]. Они способны взаимодействовать друг с другом, образуя устойчивый в физиологических условиях комплекс, функции которого остаются неизвестными [116]. Имеются данные о способности С-РП и ФАТ через соответствующие рецепторы взаимодействовать с макрофагами и модифицировать их функции [32,128]. Однако комбинированное действие

указанных медиаторов и, в особенности, свойства их комплекса практически не изучены.

Одной из наиболее важных функций макрофагов является фагоцитоз. Фагоцитарная функция относится к неспецифическим механизмам иммунитета, при этом являясь первым звеном последовательности событий ( фагоцитоз -процессинг антигена - представление антигена Т-хелперам ), необходимых для развития иммунных реакций. Известно, что ФАТ способен активировать фагоцитарную функцию макрофагов [29], тогда как действие С-РП рассматривалось до сих пор только с точки зрения его свойств неспецифического опсонина [128].

В последние годы из числа продуктов активированных макрофагов пристальное внимание исследователей сосредоточено на окиси азота (N0) -соединении, участвующем в обеспечении бактерицидных и цитотоксических свойств макрофагов, а также служащим межклеточным и внутриклеточным регулятором [124]. Установлено, что ФАТ может принимать участие в регуляции продукции N0 [19,36,137], тогда как влияние С-РП на этот феномен не исследовано.

Ключевым моментом в индукции иммунного ответа является представление макрофагами процессированного антигена Т-лимфоцитам, требующее экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса П (1а-антигенов). Известно, что ряд медиаторов воспаления (ФНО, ИФН-у, ПГЕг) способен регулировать экспрессию 1а-антигенов [127,144]. Действие ФАТ на этот феномен изучено недостаточно, а влияние С-РП на экспрессию 1а-антигенов вообще не изучалось.

Все сказанное выше определило цель и задачи настоящего исследования. Цель работы: Изучение влияния ФАТ и С-РП на основные параметры функциональной активности макрофагов, обеспечивающие их участие в регуляции неспецифической резистентности организма и индукции иммунного ответа, а также исследование функциональной активности комплекса С-РП-ФАТ.

Задачи работы:

1. Изучение действия ФАТ и С-РП на фагоцитарную активность макрофагов.

2. Исследование влияния ФАТ и С-РП на продукцию макрофагами окиси азота.

3. Изучение действия ФАТ и С-РП на экспрессию макрофагами 1а-антигенов.

4. Определение функциональной активности комплекса С-РП-ФАТ по сравнению со свойствами его компонентов.

5. Сравнительное исследование рецепторных и трансдукционных механизмов действия ФАТ, С-РП и комплекса С-РП-ФАТ на макрофаги.

Научная новизна работы.

В настоящей работе были получены новые данные о биологических свойствах С-РП и ФАТ. Впервые показано, что С-РП способен индуцировать продукцию N0 макрофагами, а ФАТ - принимать участие в регуляции этого процесса. Впервые исследовано влияние С-РП и ФАТ на экспрессию 1а-антигенов и продемонстрировано их разнонаправленное действие.

Впервые изучено совместное влияние С-РП и ФАТ на функциональную активность макрофагов. Показано, что С-РП способен отменять эффекты стимуляции фагоцитоза и усиления экспрессии Га-антигенов, вызванных ФАТ. Впервые были изучены функциональные свойства комплекса С-РП-ФАТ и выявлен эффект усиления действия исходных соединений. Впервые проведен

сравнительный анализ рецепторных и ранних трансдукционных механизмов активации макрофагов под действием С-РП и комплекса С-РП-ФАТ, выявлены их сходства и возможные различия.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В работе впервые было изучено функциональное взаимодействие основных эффекторных молекул острофазного ответа и локального воспаления - С-РП и ФАТ. Показано, что указанные медиаторы совместно способны регулировать важные параметры активности макрофагов, обеспечивающие их участие в реакциях неспецифической резистентности к инфекции и опухолям и иммунном ответе ( фагоцитоз, продукция N0, экспрессия 1а-антигенов ). При этом установлено, что С-РП и ФАТ стимулируют различные функции макрофагов. Вместе с тем, при комбинированном применении они способны отменять или модифицировать эффекты друг друга. Важным является тот факт, что действие исследованных медиаторов зависит от степени активации макрофагов. Для ФАТ более характерно стимулирующее влияние на резидентные макрофаги, тогда как эффекты С-РП более выражены при действии на стимулированные клетки. Было показано, что комплекс С-РП-ФАТ обладает свойствами его компонентов и более выраженной биологической активностью. В работе исследованы трансдукционные механизмы действия СРП и комплекса С-РП-ФАТ на макрофаги. Установлено, что в реализации их действия принимают участие ГТФ-связывающие протеины, тирозинкиназы,

2+

цАМФ-зависимая и Са , липидзависимая протеинкиназы, продукты липоксигеназного и циклооксигеназного путей метаболизма арахидоновой кислоты. Несмотря на наличие общих этапов передачи внутриклеточного

сигнала, имеется ряд особенностей в действии С-РП и комплекса С-РП-ФАТ, что позволяет сделать вывод о различиях в рецепторных и трансдукционных механизмах, опосредующих действие данных медиаторов.

Таким образом было показано, что система С-РП-ФАТ является важным и гибким механизмом управления функциональной активностью макрофагов, а с учетом свойств других связанных медиаторов (N0, эйкозаноиды, цитокины и т.д.), путем регуляции локального воспаления в целом. Поскольку направленность действия данной системы зависит как от количественного соотношения С-РП и ФАТ, так и от степени активации макрофагов, полученные данные следует учитывать при выборе стратегии терапии локального воспаления в соответствии с уровнем развития системного острофазного ответа. По этой же причине результаты работы могут быть использованы для разработки новых прогностических критериев оценки состояния макрофагально-фагоцитарной системы на основе определения уровня продукции исследованных медиаторов. Результаты настоящей работы указывают на перспективность дальнейшей разработки и использования в практике соединений, способных блокировать внутриклеточные функциональные сайты связывания ФАТ.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены

- на ХП Конференции Европейского Общества по изучению макрофагов (Париж, 1998);

- на УШ Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 1998);

- на конференции отдела иммунологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва, 1997).

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 14 рисунками. Библиографический указатель включает 160 наименований отечественных и зарубежных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Взаимодействие местной и системной реакций организма на нарушение гомеостаза.

Локальное воспаление, острофазный ответ и специфический иммунный ответ оказывают друг на друга сложное взаимное влияние, опосредованное набором растворимых медиаторов различной природы. Первичным событием является, несомненно, местная воспалительная реакция организма на проникновение инфекции, повреждение тканей в результате травмы или хирургического вмешательства, появление новообразований [11,78]. Активирующиеся в очаге локального воспаления клетки (лейкоциты, тучные и эпителиальные клетки) начинают секретировать соединения, действие которых направлено как на устранение причины воспалительной реакции (токсические формы кислорода и азота, гидролитические ферменты) и расширение локального процесса за счет привлечения в его очаг новых порций лейкоцитов (лейкотриены, ФАТ, лимфокины) [11], так и на придание реакции системного характера (цитокины: интерлейкин (ИЛ)-1, ИЛ-6, фактор некроза опухоли (ФНО)-а) [78]. Причем основными продуцентами перечисленных цитокинов являются макрофаги [78]. Процессы, протекающие в очаге локального воспаления приводят к развитию специфического иммунного ответа. Для этого необходимо представление чужеродного ан�